促進(jìn)p15植骨材料成骨的可吸收性生物膜的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種可促進(jìn)P15植骨材料周圍成骨的可吸收 性生物膜。
【背景技術(shù)】
[0002] 人工種植技術(shù)是牙列缺損、牙列缺失和頌面部缺損的有效修復(fù)手段，目前已作為 一種成熟可靠的修復(fù)方法廣泛應(yīng)用于臨床。在種植術(shù)中，由于拔牙窩直徑較大，導(dǎo)致種植體 上段與牙槽骨間存在間隙。如不處理將可能導(dǎo)致種植體與骨之間不能形成骨結(jié)合。引導(dǎo)骨 組織再生術(shù)是在骨缺損區(qū)防止屏障膜，利用不同牙周組織生長(zhǎng)及修復(fù)速度不同，引導(dǎo)骨細(xì) 胞優(yōu)先長(zhǎng)入缺損區(qū)，同時(shí)組織結(jié)締組織細(xì)胞向缺損區(qū)生長(zhǎng)，為成骨細(xì)胞的表達(dá)及骨再生創(chuàng) 建良好的環(huán)境，促進(jìn)骨整合。
[0003] 可引導(dǎo)組織再生的生物膜主要用于修復(fù)組織缺損時(shí)的組織再生術(shù)，用其作為物理 屏障，可以阻止周邊組織長(zhǎng)入缺損區(qū)域，同時(shí)作為一種保護(hù)膜將缺損區(qū)域保護(hù)起來(lái)，為缺損 區(qū)的組織生長(zhǎng)預(yù)留空間。
[0004] P15植骨材料是德國(guó)登士柏公司（Dentsply，GE)生產(chǎn)的一種植骨材料，其在植骨 材料的無(wú)機(jī)載體表面復(fù)合有生物活性肽P15 (氨基酸序列為GTPGPQGIAGQRGVV)，P15通過(guò)增 強(qiáng)活性細(xì)胞的粘附和通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)目和組織結(jié)構(gòu)。目前P15植骨材料 廣泛應(yīng)用于我國(guó)口腔醫(yī)療中，具有明顯的促進(jìn)骨性祖細(xì)胞結(jié)合、迀移、增殖、分化以及最終 成骨作用。
[0005] 隨著種植體、植骨材料以及生物膜的聯(lián)合應(yīng)用，使三者達(dá)到最佳的成骨效果，提高 手術(shù)成功率成為廣大口腔醫(yī)療科研工作者的主要研究目標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種促進(jìn)P15植骨材料周圍成骨的可吸收性生物膜，其 由高分子膜材料和具有促進(jìn)成骨功能的藥物組成，所述高分子膜材料為I型膠原蛋白和硫 酸軟骨素；所述藥物優(yōu)選為維生素 D和杯莧甾酮。
[0007] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述高分子膜材料和藥物的重量比為1~100 :1，優(yōu) 選為10 :1。
[0008] 在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述高分子膜材料中，I型膠原蛋白和硫酸軟骨素重 量比為1 :1。
[0009] 在本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物中，維生素 D和杯莧留酮的重量比為1~ 100 :1，優(yōu)選為 5 :1。
[0010] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述可吸收性生物膜的制備方法，具體步驟如下：
[0011] 1)將I型膠原蛋白加入到0. 2% -0. 6%的乙酸溶液中，以每分鐘16000r-20000r 高速攪拌，配置成膠原乙酸溶脹液；
[0012] 2)在配置好的膠原乙酸溶脹液中加入硫酸軟骨素，攪拌配置成膠原-硫酸軟骨素 漿液；
[0013] 3)向膠原-硫酸軟骨素漿液中加入維生素 D和杯莧留酮，以每分鐘16000r-20000r 高速攪拌均勻，然后倒入不銹鋼凍干盤中，置于真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行第一次真空冷凍干 燥；
[0014] 4)將第一次真空冷凍干燥后的膠原-硫酸軟骨素漿液利用壓膜機(jī)壓制成膠原復(fù) 合薄膜；
[0015] 5)在兩層膠原復(fù)合薄膜中噴涂一層膠原-硫酸軟骨素漿液，放入到真空冷凍干燥 機(jī)內(nèi)進(jìn)行第二次真空冷凍干燥；
[0016] 6)將第二次真空冷凍干燥后的膠原復(fù)合薄膜進(jìn)行高溫真空交聯(lián)；
[0017] 7)將交聯(lián)后的膠原復(fù)合薄膜進(jìn)行環(huán)氧乙烷滅菌，得到可吸收性生物膜。
[0018] 在本發(fā)明進(jìn)一步地實(shí)施方案中，在將攪拌均勻的膠原-硫酸軟骨素漿液倒入不銹 鋼凍干盤中時(shí)，倒入后的厚度為5_±0. 5_。所述經(jīng)壓膜機(jī)壓制成的膠原復(fù)合薄膜的厚度 為 1~3mm〇
[0019] 在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述高溫真空交聯(lián)為在60°C -80°C的高溫真空干燥 箱中進(jìn)行高溫真空交聯(lián)，交聯(lián)時(shí)間為24_36h。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面將進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。需要指出的是，以下說(shuō)明僅僅是對(duì)本發(fā)明要求 保護(hù)的技術(shù)方案的舉例說(shuō)明，并非對(duì)這些技術(shù)方案的任何限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍以所附 權(quán)利要求書記載的內(nèi)容為準(zhǔn)。
[0021] 實(shí)施例1添加藥物與P15肽對(duì)體外細(xì)胞成骨作用考察
[0022] MG-63細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中用MEM/EBSS培養(yǎng)基培養(yǎng)（其中含10%的胎牛血清（FBS) 和非必需氨基酸（NEAA))。當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中貼壁融合達(dá)80~90 %左右時(shí)傳代。將MG-63 細(xì)胞按2000個(gè)/孔接種于96孔板細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)，添加 P15和藥物培養(yǎng)基溶液，各組中， 對(duì)照組添加等量培養(yǎng)基，各給藥組的劑量一致，但藥物組合物中的化合物配比存在不同。
[0023] 各給藥組的劑量分別如下：
[0025] 細(xì)胞在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天后，進(jìn)行MTT試驗(yàn)。具體結(jié)果如下：
[0026]
[0027] 經(jīng)過(guò)one-way ANOVA檢驗(yàn)，組I-5較對(duì)照組具有顯著的促進(jìn)細(xì)胞增值作用 (p〈0. 01)，組5較其他給藥組具有顯著的促進(jìn)細(xì)胞增值作用（p〈0. 01)。
[0028] 另外，將MG-63細(xì)胞按2X IO5個(gè)/孔接種于24孔板細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)，血清饑餓 12小時(shí)后，余下處理與上述增殖試驗(yàn)相同。在細(xì)胞培養(yǎng)7天后，檢測(cè)堿性磷酸酶（ALP)活 性，在細(xì)胞培養(yǎng)21天后，用茜素紅染色吸光度值評(píng)估礦化結(jié)節(jié)的形成狀況，具體結(jié)果如下：
[0030] 經(jīng)過(guò)one-way ANOVA檢驗(yàn)，組1-5較模型組具有顯著的提高ALP活性作用 (p〈0. 01)，組5較其他給藥組具有顯著的提高ALP活性作用（p〈0. 01)。
[0031] 實(shí)施例2可吸收性生物膜制備
[0032] 1)將I型膠原蛋白加入到0. 3%的乙酸溶液中，以每分鐘16000r-20000r高速攪 拌，配置成膠原乙酸溶脹液，膠原蛋白含量為0.3% ;
[0033] 2)在配置好的膠原乙酸溶脹液中（30ml)加入90mg硫酸軟骨素，以每分鐘 16000r-20000r高速攪拌配置成膠原-硫酸軟骨素漿液；
[0034] 3)向膠原-硫酸軟骨素衆(zhòng)液中加入15mg維生素 D和5mg杯莧甾酮，以每分鐘 16000r-2000