。離心，取100 μ 1血漿，加入400 μ 1乙腈沉淀蛋白， 12000rpm離心10min，取上清液，用LC-MS測(cè)定樣品中DOX的濃度。
[0076] 圖3為實(shí)施例1中HA-DOX微粒的大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果表明： HA-DOX微粒在體內(nèi)比DOX原藥有更好的緩釋效果。
[0077] 實(shí)驗(yàn)例4 HA-DOX微粒的腫瘤細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)。將小鼠黑色素瘤細(xì)胞（B16F10,⑶44受體高表達(dá)） 接種在12孔板中，每孔I X IO5個(gè)細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，50U/ml青 霉素，50U/ml鏈霉素)在37°C 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞的單層覆蓋率達(dá)到80%。吸 去培養(yǎng)基，每孔分別加入1ml DOX原藥溶液或HA-DOX微粒混懸液(用培養(yǎng)基將濃度稀釋成 5 μ g/ml，按DOX濃度計(jì)算)。原藥組和微粒組各做三個(gè)復(fù)孔，另設(shè)三孔作為對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng) 2h后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗兩遍，用胰酶消化細(xì)胞。Imin后終止消化，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至2ml離 心管中離心，棄去上清，加入300 μ I PBS重懸，用流式細(xì)胞儀測(cè)定DOX的熒光強(qiáng)度。
[0078] 圖4為實(shí)施例1中HA-DOX微粒的腫瘤細(xì)胞攝取結(jié)果。結(jié)果表明：腫瘤細(xì)胞對(duì) HA-DOX微粒的攝取要明顯高于DOX原藥。這是因?yàn)镠A是腫瘤細(xì)胞表面CD44受體的配體， HA-DOX微?？梢员虎?4受體介導(dǎo)進(jìn)入到腫瘤細(xì)胞中。
[0079] 實(shí)驗(yàn)例5 HA-DOX微粒的腫瘤細(xì)胞攝取共聚焦實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞攝取2h后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗三次。 每孔加入1ml 4%多聚甲醛固定細(xì)胞，15min后棄去多聚甲醛，PBS洗三次。每孔加入1ml封 閉液(含1%胎牛血清的PBS)封閉30min，棄去，PBS洗三次。每孔加入100 μ I FITC標(biāo)記的 鬼筆環(huán)肽工作液，30min后棄去，PBS洗三次。每孔加入100 μ I DAPI染色液，5min后棄去， PBS洗三次。于激光共聚焦顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞對(duì)DOX原藥和HA-DOX微粒的攝取情況。
[0080] 圖5為實(shí)施例1中HA-DOX微粒的腫瘤細(xì)胞攝取共聚焦圖。結(jié)果進(jìn)一步表明，腫瘤 細(xì)胞對(duì)HA-DOX微粒的攝取要明顯高于DOX原藥。
[0081] 實(shí)驗(yàn)例6 HA-DOX微粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性測(cè)試。DOX原藥和HA-DOX微粒在B16F10細(xì)胞中的毒性 通過MTT法測(cè)定。首先將100 μ 1的細(xì)胞1640懸浮液（1640培養(yǎng)基中含10%胎牛血清，50U/ ml青霉素，50U/ml鏈霉素)鋪于96孔培養(yǎng)板中，使細(xì)胞的最終濃度為I X IO4個(gè)/孔，并 置于37°C 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使單層細(xì)胞的覆蓋率達(dá)到80%。吸掉培養(yǎng)基，向每孔中 加入100 μ 1不同濃度的DOX原藥溶液或HA-DOX微?；鞈乙?用培養(yǎng)基稀釋)。繼續(xù)培養(yǎng)24h 后，向每孔中加入20 μ I MTT溶液（5mg/ml)，并放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，使MTT與活細(xì)胞 作用。隨后棄去培養(yǎng)基，向每孔中加入150 μ I DMSO以溶解活細(xì)胞與MTT產(chǎn)生的紫色甲瓚 結(jié)晶，并使用酶標(biāo)儀測(cè)定每個(gè)孔在570nm處的吸收。細(xì)胞相對(duì)存活率與只有空白細(xì)胞的對(duì) 照孔在570nm處的吸收相比得到。
[0082] 圖6為實(shí)施例1中HA-DOX微粒的腫瘤細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果表明：HA-DOX微 粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷性明顯優(yōu)于DOX原藥。
[0083] 對(duì)比實(shí)驗(yàn) 目前對(duì)HA腫瘤靶向的應(yīng)用，絕大部分是將HA側(cè)鏈用疏水基團(tuán)修飾，使其變?yōu)閮捎H性 物質(zhì)，能在水中自組裝成為納米粒。然后再將抗腫瘤藥物包載到納米粒中，用于腫瘤靶向治 療。但是將HA進(jìn)行化學(xué)修飾，勢(shì)必會(huì)破壞HA的結(jié)構(gòu)，可能會(huì)影響其腫瘤靶向效果，而且修 飾后的HA其安全性也有待于評(píng)價(jià)。
[0084] 本發(fā)明中的HA-陽離子藥物離子對(duì)微粒完整地保留了 HA的結(jié)構(gòu)。為了研究HA的 結(jié)構(gòu)完整對(duì)其腫瘤靶向效果及安全性的影響，本發(fā)明特設(shè)置了對(duì)比實(shí)驗(yàn)，以比較本發(fā)明中 HA-陽離子藥物離子對(duì)微粒和其他大多數(shù)發(fā)明中經(jīng)疏水修飾的HA納米粒的優(yōu)劣。本發(fā)明選 擇與專利文獻(xiàn)CN104497171A的透明質(zhì)酸-賴氨酸甲酯-硫辛?；酆衔铮℉A-Lys-LA)納 米粒做對(duì)比，以阿霉素（DOX)為模型藥物。
[0085] (1)腫瘤細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn) 分別按照本發(fā)明實(shí)施例1中的方法和專利文獻(xiàn)CN104497171A的方法制備HA-DOX離子 對(duì)微粒和載DOX的HA-Lys-LA聚合物納米粒。按照本發(fā)明實(shí)驗(yàn)例4做B16F10細(xì)胞的攝取 實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖7。
[0086] 從圖7中可以看出，腫瘤細(xì)胞對(duì)HA-DOX離子對(duì)微粒的攝取比載DOX的HA-Lys-LA 聚合物納米粒要明顯增多，說明對(duì)HA結(jié)構(gòu)進(jìn)行化學(xué)修飾會(huì)降低HA的腫瘤靶向效果，進(jìn)一步 說明本發(fā)明的HA-陽離子藥物離子對(duì)微粒腫瘤靶向性要高于其他經(jīng)化學(xué)修飾的HA納米粒。
[0087] (2)對(duì)正常細(xì)胞的體外毒性實(shí)驗(yàn) 理想的腫瘤靶向載體應(yīng)只殺傷腫瘤細(xì)胞，而不應(yīng)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生影 響，否則就會(huì)產(chǎn)生毒副作用。本發(fā)明選擇人近曲小管上皮細(xì)胞（HK2 )作為正常細(xì)胞，按 照實(shí)驗(yàn)例6做MTT實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖8。
[0088] 從圖8中可以看出，HA-DOX離子對(duì)微粒對(duì)正常細(xì)胞的殺傷力要明顯低于載DOX的 HA-Lys-LA聚合物納米粒，說明對(duì)HA結(jié)構(gòu)進(jìn)行化學(xué)修飾會(huì)使HA產(chǎn)生毒性，進(jìn)一步說明本發(fā) 明的HA-陽離子藥物離子對(duì)微粒安全性要好于其他經(jīng)化學(xué)修飾的HA納米粒。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種透明質(zhì)酸-陽離子藥物離子對(duì)微粒，其特征在于以帶正電的藥物為疏水內(nèi)核， 帶負(fù)電的透明質(zhì)酸為親水外殼。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微粒，其特征在于透明質(zhì)酸的羧酸數(shù)與所載藥物的摩爾比為 1:5~20:1 ;優(yōu)選地，微粒粒徑為20nm~100Mm ;優(yōu)選地，透明質(zhì)酸的分子量為5, 000~1000, OOO Da03. -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的透明質(zhì)酸-陽離子藥物離子對(duì)微粒的制備方法，其特征 在于制備步驟如下： (1) 帶正電荷的陽離子藥物溶于水或有機(jī)溶劑中，得溶液I ; (2) 透明質(zhì)酸溶于水中，得溶液II ; (3) 將溶液I緩慢滴加至溶液II中，攪拌反應(yīng)即得。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的微粒的制備方法，其特征在于步驟（1)中，優(yōu)選將水不溶性陽 離子藥物溶解到乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑中，形成微粒后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、透析等方法除去有機(jī) 溶劑。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的微粒的制備方法，其特征在于步驟（1)或步驟（2)中可以加 入磷脂、吐溫80、F68、白蛋白、聚乙二醇-15-羥基硬脂酸酯等表面活性劑。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的微粒的制備方法，其特征在于步驟（3)中加入的透明質(zhì)酸的 羧酸數(shù)與所載活性藥物的摩爾比為1:5~20:1。7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的微粒的制備方法，其特征在于步驟（3)中攪拌反應(yīng)時(shí)間為 5min~72h〇8. -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的透明質(zhì)酸-陽離子藥物離子對(duì)微粒作為活性成分載體的 應(yīng)用，其特征在于活性成分為蛋白多肽類藥物，生物堿類藥物或抗腫瘤藥物。9. 一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的透明質(zhì)酸-陽離子藥物離子對(duì)微粒在制備具有被動(dòng)靶向 和主動(dòng)靶向雙靶向性的藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種透明質(zhì)酸-陽離子藥物離子對(duì)微粒及其制備方法和應(yīng)用，以帶正電的陽離子藥物為疏水內(nèi)核，帶負(fù)電的透明質(zhì)酸為親水外殼，具有主動(dòng)靶向和被動(dòng)靶向雙靶向性。
【IPC分類】A61K9/50, A61K47/48, A61K45/00, A61P35/00
【公開號(hào)】CN105125522
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510555003
【發(fā)明人】龔濤, 張志榮, 李文浩
【申請(qǐng)人】四川大學(xué)
【公開日】2015年12月9日
【申請(qǐng)日】2015年9月5日