一種制備帶多分支通道的組織器官前體的方法及專用模具的制作方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于生物體復(fù)雜組織器官的人工制造
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種制備帶多分支通道的組織器官前體的方法及專用模具?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]世界上每年患有組織缺損或器官衰竭的病人逾千萬(wàn)，所以，人體病損組織和器官的修復(fù)和替代是一項(xiàng)亟需解決的科學(xué)難題，也是本世紀(jì)令人矚目的科學(xué)前沿。由于活體組織器官移植存在供體短缺以及免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)大等固有弊端，難以成為解決該問(wèn)題的有效途徑。據(jù)此，以提高此類疾患治療水平為目的的組織工程(TissueEngineering)應(yīng)運(yùn)而生，組織工程是綜合應(yīng)用生物學(xué)、材料學(xué)和工程學(xué)的原理，在體外構(gòu)建細(xì)胞和材料的三維結(jié)構(gòu)體，通過(guò)適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)和訓(xùn)練后發(fā)展成具有和天然組織類似結(jié)構(gòu)和功能的可移植替代物。由于其重要的科學(xué)意義和潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，組織工程一直受到了世界各國(guó)的高度重視，在短短不到30年的時(shí)間里獲得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，并取得了諸多成果。但就其產(chǎn)品的應(yīng)用領(lǐng)域而言，目前主要集中在結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單的骨組織工程和皮膚組織工程等少數(shù)幾個(gè)領(lǐng)域。究其原因，很重要的一點(diǎn)就是，現(xiàn)有的組織工程結(jié)構(gòu)體的體外構(gòu)建方法(如電紡絲、3D打印法、溶模法等)難以構(gòu)建具有天然組織類似的復(fù)雜的血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而血管又是組織器官生長(zhǎng)中必不缺少的部分，可為組織器官生長(zhǎng)提供必要的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，研究表明，只有在血管周圍150-200μm范圍內(nèi)的細(xì)胞才能夠通過(guò)彌散作用獲得養(yǎng)分和氧氣(ColtonC.1mplantableb1hybridartificialorgans.CellTranslant,1955;4:415_436)，缺少?gòu)?fù)雜的血管網(wǎng)絡(luò)致使結(jié)構(gòu)體內(nèi)部的細(xì)胞存活率低，因此難以實(shí)現(xiàn)大塊組織的構(gòu)建。在組織工程中，常用的構(gòu)建血管的方法主要有依靠生長(zhǎng)因子緩慢釋放促進(jìn)血管形成，多細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)形成血管結(jié)構(gòu)，利用生物反應(yīng)器和微流體通道形成血管以及基于先進(jìn)成型技術(shù)的血管化等。[0003]此外，人體是由多種組織和器官組成的結(jié)構(gòu)體，體內(nèi)的生理過(guò)程以及各種組織器官的功能一般都是在神經(jīng)系統(tǒng)的直接和間接調(diào)控下相互進(jìn)行，孤立的器官不能實(shí)現(xiàn)生物學(xué)意義上的功能，而且神經(jīng)系統(tǒng)在人體對(duì)體內(nèi)外環(huán)境的變化做出迅速而完善的調(diào)整方面起著決定性的作用。所以在體外構(gòu)建具有特定功能的人體器官時(shí)，不可避免地要引入神經(jīng)系統(tǒng)。同血管分布類似，神經(jīng)在人體內(nèi)也是按照多級(jí)分支的網(wǎng)狀分布。此外，膽管、氣管以及尿管等也在人體中起著重要作用，所以在體外構(gòu)建含有多分支通道的組織器官前體是實(shí)現(xiàn)組織器官生物功能的關(guān)鍵一步。[0004]發(fā)明專利文獻(xiàn)(申請(qǐng)?zhí)?01110448154.3)提供了一種利用組合模具的分層灌注來(lái)成形含多分支血管結(jié)構(gòu)的復(fù)雜組織器官前體的方法。該發(fā)明將溶液灌注到含有不同直徑的中間模具的內(nèi)外模具之間，交聯(lián)處理后去除模具即得到組織器官前體。該發(fā)明的缺點(diǎn)在于內(nèi)部血管的結(jié)構(gòu)完全取決于中間模具的結(jié)構(gòu)，因此只能成型結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的血管結(jié)構(gòu)，對(duì)于構(gòu)建天然組織中復(fù)雜的分支血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)無(wú)能為力，此外，該方法利用環(huán)形中間模具包裹內(nèi)模具的成型方法，裝配操作難度大，拆卸過(guò)程中不可避免地?fù)p壞已成型的結(jié)構(gòu)體。[0005]發(fā)明專利(申請(qǐng)?zhí)?01210324600.4)提出了一種利用旋轉(zhuǎn)組合模具制備紡錘狀復(fù)雜器官前體的方法。該發(fā)明利用非牛頓流體的Weissenbery效應(yīng)，理論上可制備帶多分支血管的紡錘狀復(fù)雜器官前體，但是該方法的缺點(diǎn)是模具的旋轉(zhuǎn)速度和液體的爬升高度沒(méi)有明確的定量關(guān)系，實(shí)際操作時(shí)很難確定內(nèi)環(huán)模具的高度，且成形結(jié)構(gòu)單一，只能成形外形是紡錘狀的組織器官。此外，每次成形都形成了帶錐尖的紡錘體，故成形帶多級(jí)分支血管結(jié)構(gòu)時(shí)，第二級(jí)及其以上的內(nèi)環(huán)模具難以定位安裝在下一級(jí)支點(diǎn)上，此外該方法成形的器官形狀只能為單一的紡錘狀?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0006]本發(fā)明的目的是提供一種制備帶多分支通道的組織器官前體的方法及專用模具，旨在現(xiàn)有工作的基礎(chǔ)上，利用專用模具的分層組裝辦法成形具有分支通道的組織器官，以克服現(xiàn)有技術(shù)難以在組織器官內(nèi)部構(gòu)建具有復(fù)雜分支通道的弊端，同時(shí)避免了復(fù)雜的裝配操作。[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:[0008]—種制備帶多分支通道的組織器官前體的專用模具，其特征在于:所述專用模具包括底座模具、至少一級(jí)外模具和至少一級(jí)內(nèi)模具；所述底座模具內(nèi)部為從下至上依次變大的階梯狀，階梯數(shù)和外模具級(jí)數(shù)相同，底座模具底面為平面、凹面或者凸面，且分布有定位孔；每級(jí)外模具上均設(shè)有安裝孔和灌注口，外模具的外部尺寸和底座模具對(duì)應(yīng)級(jí)數(shù)的階梯所圍成面的尺寸完全相同，下一級(jí)外模具的內(nèi)腔和上一級(jí)外模具的內(nèi)腔平滑過(guò)渡，且外模具的內(nèi)腔具有和預(yù)設(shè)組織器官相同的輪廓，多級(jí)外模具的灌注口的中心線位于同一直線；每級(jí)內(nèi)模具包括至少一個(gè)分支狀結(jié)構(gòu)，其數(shù)目與對(duì)應(yīng)級(jí)外模具的安裝孔的數(shù)目相同，每個(gè)分支狀結(jié)構(gòu)包括總支管和分支管，每個(gè)分支狀結(jié)構(gòu)的總支管與對(duì)應(yīng)級(jí)外模具的安裝孔形成配合關(guān)系，最上級(jí)內(nèi)模具的分支管的數(shù)目為1，下一級(jí)內(nèi)模具的總支管尺寸與相鄰上一級(jí)內(nèi)模具的分支管尺寸完全相同。[0009]所述的一種制備帶多分支通道的組織器官前體的專用模具，其特征在于:所述底座模具和外模具的材料為硬質(zhì)合成高分子材料或者金屬材料；內(nèi)模具是由無(wú)生物毒性材料制成的實(shí)心管狀，具體材料包括但不局限于合成纖維、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯和聚氨酯。[0010]利用專用模具制備帶多分支通道的組織器官前體的方法，其特征在于該方法包括如下步驟:[0011]I)制備質(zhì)量體積濃度為1%?30%的水凝膠溶液作為基質(zhì)溶液，提取或購(gòu)買動(dòng)物細(xì)胞制成細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞懸浮液密度為IX16?5X107個(gè)/ml，將基質(zhì)溶液與細(xì)胞懸浮液按體積比I?9:9?I混合制成含細(xì)胞的基質(zhì)溶液，將合成高分子材料溶于有機(jī)溶劑中制成質(zhì)量百分濃度為1%?30%的合成高分子溶液；[0012]2)利用三維打印技術(shù)制備專用模具，將第一級(jí)內(nèi)模具的總支管安裝在第一級(jí)外模具的安裝孔上，將第一級(jí)外模具套在底座模具的第一級(jí)臺(tái)階上，第一級(jí)內(nèi)模具分支管安裝在底座模具底面的定位孔中，將含細(xì)胞的基質(zhì)溶液從第一級(jí)外模具的灌注口倒入模具中，填充實(shí)第一級(jí)外模具和底座模具間隙后采用物理或化學(xué)交聯(lián)或聚合方法，使模具中含細(xì)胞的基質(zhì)溶液交聯(lián)，交聯(lián)完成后依次去除第一級(jí)外模具和第一級(jí)內(nèi)模具，形成穩(wěn)定的第一層細(xì)胞基質(zhì)層，其中含有由第一級(jí)內(nèi)模具所形成的第一級(jí)分支通道；[0013]3)將第二級(jí)內(nèi)模具的總支管安裝在第二級(jí)外模具的安裝孔上，將第二級(jí)外模具套在底座模具的第二級(jí)臺(tái)階上，第二級(jí)內(nèi)模具的分支管對(duì)準(zhǔn)成形完的第一層細(xì)胞基質(zhì)層上的通道，將含細(xì)胞的基質(zhì)溶液從第二級(jí)外模具的灌注口倒入模具中，填充實(shí)第二級(jí)外模具和第一層細(xì)胞基質(zhì)層間隙后采用物理或化學(xué)交聯(lián)或聚合方法，對(duì)含細(xì)胞的基質(zhì)溶液進(jìn)行交聯(lián)，交聯(lián)完成后依次去除第二級(jí)外模具和第二級(jí)內(nèi)模具，形成穩(wěn)定帶有第二級(jí)通道的第二層細(xì)胞基質(zhì)層；[0014]4)重復(fù)步驟3)，分別形成第三層至最上層的細(xì)胞基質(zhì)層，得到層間通道相互貫通的帶多分支通道的多層細(xì)胞基質(zhì)層；[0015]5)將合成高分子溶液噴灑到所成形的多層細(xì)胞基質(zhì)層表面，經(jīng)萃取后形成合成高分子層，去除底座模具，即形成帶多分支通道的組織器官前體。[0016]所述的帶多分支通道的組織器官前體的制備方法，其特征在于:帶多分支通道的組織器官前體中的通道在組織器官前體培養(yǎng)過(guò)程中形成血管、神經(jīng)、膽管、氣管或尿管。[0017]所述的帶多分支通道的組織器官前體的制備方法，其特征在于:將所述通道形成為血管的具體方法為，制備含內(nèi)皮細(xì)胞的基質(zhì)溶液，成形前先在內(nèi)模具表面涂敷一層含內(nèi)皮細(xì)胞的基質(zhì)溶液，采用物理或化學(xué)交聯(lián)或聚合方法，對(duì)含內(nèi)皮細(xì)胞的基質(zhì)溶液進(jìn)行交聯(lián)，隨后依次噴灑內(nèi)皮細(xì)胞懸浮液和合成高分子溶液，萃取后在內(nèi)模具表面形成含內(nèi)皮細(xì)胞的基質(zhì)層-內(nèi)皮細(xì)胞層-合成高分子層三層結(jié)構(gòu)，成形完成細(xì)胞基質(zhì)層小心拔出內(nèi)模具，將該三層結(jié)構(gòu)留在通道四周。[0018]所述的帶多分支通道的組織器官前體的制備方法，其特征在于:將所述通道形成為神經(jīng)的具體方法為，制備含血旺細(xì)胞的基質(zhì)溶液，直接將含血旺細(xì)胞的基質(zhì)溶液灌注進(jìn)通道。[0019]所述的帶多分支通道的組織器官前體的制備方法，其特征在于:所述的水凝膠為明膠、纖維蛋白原、膠原、殼聚糖、海藻酸鈉、透明質(zhì)酸和纖維連接蛋白中的一種或幾種。[0020]所述的帶多分支通道的組織器官前體的制備方法，其特征在于:所述的合成高分子材料當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 4