肝郁脾虛型功能性消化不良大鼠模型的造模方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)療評價、檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種動物模型的造模方法，具體涉及一 種肝郁脾虛型功能性消化不良大鼠模型的造模方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 功能性消化不良（functional dyspepsia, FD)是典型的身心疾病，心理-社會因 素對發(fā)病起著重要的影響因素，情志、心理、社會和各種生物因素相互作用，共同參與了 FD 的發(fā)生。近年來，F(xiàn)D的發(fā)病率呈增長趨勢，流行病學(xué)調(diào)查表明，歐美國家患病率在20%~ 25%，亞洲國家發(fā)病率約為8% -23%，我國FD的患病率總體偏高，調(diào)查上海18歲以上有 消化不良癥狀的782名患者，發(fā)現(xiàn)FD患者占69%。高發(fā)病率及反復(fù)發(fā)作或慢性迀延的癥 狀，降低了生活質(zhì)量，對身體和精神心理造成了負面影響。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對FD的治療主要釆用 對癥治療和綜合治療，多采用促進胃腸動力藥，取得了一定的臨床療效，但其對心律失?；?者、腫瘤化療患者及低鉀血癥患者都可能加重癥狀，且藥物經(jīng)過肝腎代謝，對于長期肝腎功 能不全者不宜使用，所以其具有一定的局限性。中醫(yī)認為情志刺激是功能性消化不良發(fā)病 的重要因素，肝郁脾虛證是其主要病機，且大量臨床上報道說明中醫(yī)辨證論治治療功能性 消化不良具有顯著的臨床療效。
[0003] 根據(jù)病因病機的分型論治是中醫(yī)的治療大法，通?？蓪D的證型分為肝郁氣滯 型、肝郁脾虛型、脾胃虛寒型、脾氣虛弱型、胃虛飲停型五類，而根據(jù)病因病機制作不同證型 的動物模型則更為重要，其中，肝郁脾虛證主要以情志刺激為主，現(xiàn)有的肝郁脾虛型FD臨 床常見的中醫(yī)證型動物模型制備方法有：陳蘇寧等采用改良郭海軍等的夾尾刺激法制備 FD肝郁脾虛模型，即每日用長海綿鑷子鉗夾大鼠尾巴末端1/3處，令其尖叫掙扎但不破皮 為度，使其暴怒并與其他大鼠撕打，每次持續(xù)30分鐘，每日2次，連續(xù)刺激3周，造模期間， 各組大鼠自由進食及飲水，大鼠出現(xiàn)躁動等緊張、焦慮反應(yīng)，且進食量明顯減少等，則認為 造模成功；張國萍等以復(fù)合慢性束縛法制作肝郁脾虛大鼠模型，模型組大鼠束縛于特制的 束縛框內(nèi)，將大鼠的頭和尾巴固定于框的兩頭，使大鼠在束縛期間不能隨意翻轉(zhuǎn)身體而活 動，每天束縛3小時，早上8 :00~11 :00,14 :00將模型大鼠放于盛有溫水（22±1) °C的大 塑料桶中游泳，時間為10分鐘，飲食失節(jié)采用隔日喂食法（隔日禁食，隔日給足量食），連 續(xù)3周；韓秋艷等先將攻擊組大鼠每籠放一只，用尖端包裹紗布和大彎止血鉗，夾住攻擊鼠 的尾巴，大鼠暴怒，令其與其它大鼠撕打，每次刺激30分鐘，一日3次，3日后開始用大黃灌 胃，每日2次，夾尾改為一日2次，每次15分鐘，灌胃加夾尾同時進行共10天，造模共計13 天。
[0004] 上述的現(xiàn)有針對肝郁脾虛型FD模型研究存在不少缺陷：模型制作方法比較單一， 比如大量的文獻報道制備肝郁脾虛模型都是運用郭海軍等的夾尾激怒刺激法；某些模型缺 乏造模成功的客觀檢測標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)中醫(yī)理論和消化不良的病因?qū)W理論模擬的FD動物模型， 應(yīng)必須符合FD的診斷標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)D模型動物不但應(yīng)具有消化不良的癥候而且該動物須無其他 器質(zhì)性病變；此外，亦缺乏不同造模方法的優(yōu)劣對比研究，同時對于具體的分組匹配，以及 成功率和死亡率都交代不清或沒有交代。
[0005] 隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化的發(fā)展，有關(guān)中醫(yī)藥作用機制的動物實驗研究也越來越多，符 合中醫(yī)證型的動物模型制備成為關(guān)鍵。因此在日后的研究中要加強查漏補缺，逐步完善中 醫(yī)證型動物模型制備的研究，以便更好的開展中藥的藥理藥效研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種肝郁脾虛型功能性消化不良大鼠 模型的造模方法，該方法以郭海軍等的夾尾激怒刺激法為基礎(chǔ)，進行改進，主要采取以夾尾 刺激、過度疲勞、飲食失調(diào)的手段復(fù)合進行造模，且通過體重、電生理活動、胃排空、腸推進 及分子生物學(xué)的檢測，達到所造肝郁脾虛型FD模型與肝郁脾虛型FD理論診斷標(biāo)準(zhǔn)相符合 的目的，使臨床與基礎(chǔ)研究達到一致性。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，采用以下的技術(shù)方案予以實現(xiàn)：
[0008] -種肝郁脾虛型功能性消化不良大鼠模型的造模方法，包括以下具體步驟：
[0009] (1)常規(guī)飼養(yǎng)
[0010] 取體重180g-220g的健康Wistar雄性大鼠，在室內(nèi)溫度20°C -28°C、相對濕度在 45-65%的飼養(yǎng)室常規(guī)飼養(yǎng)7天，期間自由飲水、進食；
[0011] ⑵電極埋置術(shù)
[0012] 常規(guī)飼養(yǎng)7天后于無菌條件下行電極埋置術(shù)，術(shù)后分籠常規(guī)飼養(yǎng)，恢復(fù)一周；
[0013] ⑶記錄胃腸電活動
[0014] 術(shù)后一周當(dāng)天禁食不禁水18-24h，次日將電極導(dǎo)線與BL-420S生物技能實驗系統(tǒng) 相連，記錄正常大鼠胃腸肌電活動；
[0015] ⑷造模
[0016] ①用卵圓鉗夾大鼠尾巴中外1/3處，以大鼠憤怒反抗或撕咬為度，盡量不要夾破 尾部的皮膚，每次連續(xù)不斷刺激夾尾30min ;
[0017] ②夾尾刺激結(jié)束后將大鼠放在疲勞轉(zhuǎn)棒儀上，令其跑步lOmin，轉(zhuǎn)速35r/min ;
[0018] ③每天每隔3h重復(fù)步驟①和②的操作，每天進行4次，連續(xù)造模10天，同時在這 10天內(nèi)隔日給食，觀察大鼠的毛色、拱背、嗜倦怠、乏力、易激惹情況，并記錄體重、體溫、食 量、飲水量、大鼠胃腸肌電活動、糞便情況，至符合FD理論診斷標(biāo)準(zhǔn)，造模結(jié)束，即得到肝郁 脾虛型FD模型大鼠，造模結(jié)束后再一次記錄電生理活動。
[0019] 所述的電極埋置術(shù)是在無菌條件下操作，術(shù)前自制針狀電極，并配置0.3%戊巴比 妥鈉麻藥，實驗當(dāng)天腹腔注射麻醉大鼠 lml/100g，將腹部及頸背部剃毛并用0.5%碘伏常 規(guī)消毒，鋪消毒洞巾，劍突下腹正中線切口，取出胃、十二指腸，將2對自制針狀電極分別埋 置于胃竇及十二指腸漿膜下肌層。第一對電極埋置于胃竇處，距幽門上約lcm，第二對電極 置于十二指腸距幽門l-2cm處，雙極電極沿胃竇及腸管縱向排列，間距5mm，電極導(dǎo)線沿皮 下走行至頸背部穿出固定，腹腔滴數(shù)滴青霉素注射液以防止腹腔感染，逐層縫合創(chuàng)口，術(shù)后 用無菌0. 9% NaCl注射液配置青霉素注射液0. 8萬U/ml，每只大鼠 Iml腹腔注射，每天1 次，連續(xù)注射3天，以防止腹腔感染。
[0020] 所述步驟⑷中，夾尾刺激一定要在大鼠尾巴中外1/3處，盡量避免夾尾巴根部， 夾尾巴根部可能夾到尾椎，強烈的刺激可能使大鼠出現(xiàn)的局部癱瘓，出現(xiàn)糞尿失禁的可能， 從而無法建立正確的模型。
[0021] 所述步驟（4)_②中，夾尾刺激結(jié)束后，實驗者對大鼠先進行訓(xùn)練，再使其在疲勞 轉(zhuǎn)棒儀上自行跑步。
[0022] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：⑴采取以單只夾尾刺激、過度疲勞和飲食 失調(diào)的手段復(fù)合進行造模，且通過體重、電生理活動、胃排空、腸推進及分子生物學(xué)的客觀 檢測，達到所造肝郁脾虛型FD模型與肝郁脾虛型FD理論診斷標(biāo)準(zhǔn)相符合的目的，使臨床與 基礎(chǔ)研究達到一致性；⑵彌補了郭海軍等的造模方法只能形成單純的肝郁模型的缺陷，使 肝郁脾虛型FD模型的造模方法進一步完善和提高，得到的肝郁脾虛型FD模型動物不但具 有消化不良的癥候，而且無其他器質(zhì)性病變。
【附圖說明】
[0023] 圖1本發(fā)明實施例中實驗大鼠正常組胃慢波和腸慢波檢測結(jié)果；
[0024] 圖2本發(fā)明實施例中實驗大鼠正常組胃快波和腸快波檢測結(jié)果；
[0025] 圖3本發(fā)明實施例中實驗大鼠模型組胃慢波和腸慢波檢測結(jié)果；
[0026] 圖4本發(fā)明實施例中實驗大鼠模型組胃快波和腸快波檢測結(jié)果；
[0027] 圖5本發(fā)明實施例中實驗大鼠血清胃促生長素（Ghrelin)的ELISA檢測結(jié)果；
[0028] 圖6本發(fā)明實施例中實驗大鼠瘦素（Leptin)的ELISA檢測結(jié)果；
[0029] 圖7本發(fā)明實施例中實驗大鼠