附有dna修復抑制劑和核定位信號元件的納米顆粒的制作方法
【專利說明】附有DNA修復抑制劑和核定位信號元件的納米顆粒
[0001] 本發(fā)明涉及放療或化療增敏復合物，其包含納米顆粒和附著于所述納米顆粒的 DNA修復抑制劑和核定位信號元件（NLS)。這樣的復合物用于治療疾病，例如癌癥。
[0002] 納米技術代表了著眼于原子和分子操作的科學領域，其產(chǎn)生在納米標度范圍的新 結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)通常獲得獨特的和意外的性能。在癌癥納米技術中，焦點在于開發(fā)可以診 斷、輸送治療劑、和監(jiān)測癌癥治療進程的納米標度設備。理論上，任何成像或治療系統(tǒng)會專 門地靶向腫瘤細胞簇或腫瘤細胞的脈管系統(tǒng)，優(yōu)選地在惡性轉(zhuǎn)化的早期具有所述能力。過 去的幾十年，我們在基礎癌癥生物學和DNA損傷應答的理解上看到突出的進展（Risinger andGroden；CancerCell,6 ：539,2004 ；0rDriscollandJeggo；NatRevGenet；7 ：45, 2006,Girard,Kyselaetal；HumMolGenet13 ：1,2004,Weller,Kysela,Royetal； Science297:5527,2002)。然而這種進展沒有伴隨著與之相當?shù)呐R床進步。舉例來說，在 人類中的放射治療受益于技術進步和計算機化，而不是基于知識來操縱癌細胞對治療性放 射的生物學應答（Beggetal，Radiother0ncol，86:295,2008)。
[0003] 納米顆?？捎糜谝龑Р牧线M入細胞。所述細胞吞噬和攝取所述納米顆粒以及任何 附著于所述顆粒的組分。
[0004] 申請人認識到這具有促進引導化療增敏和放療增敏復合物進入細胞的潛力。這些 復合物許多需要靶向細胞核來起作用。因此申請人認識到也有一種需求，一旦復合物在所 述細胞內(nèi)，能夠靶向引導它們到細胞核。
[0005] 因此，本發(fā)明提供一種放療或化療增敏復合物，其包含納米顆粒和附著于所述納 米顆粒的（i)DNA修復抑制劑；和（ii)核定位信號元件（NLS);任選地，通過一個或多個接 頭部分附著。
[0006] 所述納米顆粒直徑通常低于100nm，通常為l-50nm、5-30nm或10_15nm。
[0007] 所述DNA修復抑制劑作用為使所述細胞對于射線或化學治療劑敏感。
[0008] 所述DNA修復抑制劑和NLS可以分別附著于所述納米顆粒，任選地，通過接頭部分 附著。也就是說，所述抑制劑和NLS可以附著于納米顆粒的不同部分?；蛘撸鯠NA抑制 劑可以通過，例如，接頭部分，附著于所述納米顆粒，并且所述NLS可以附著于所述DNA修復 抑制劑（如融合蛋白/肽）或附著于接頭部分的不同的部分，例如作為懸垂部分（pendant moiety)。或者，所述NLS可以通過，例如，接頭部分，附著于所述納米顆粒，并且所述DNA修 復抑制劑可以附著于所述NLS，或所述接頭部分（例如作為懸垂部分）。
[0009] 許多放射治療劑，例如y射線或x射線，和化學治療劑（例如融合蛋白如博來霉 素），損傷靶細胞，誘導DNA鏈斷裂。DNA雙螺旋的一半被斷裂即發(fā)生單鏈斷裂。這樣的單 鏈斷裂相對易于通過細胞內(nèi)的DNA修復系統(tǒng)而修復。然而，可能在彼此相對的DNA螺旋的 兩條鏈上發(fā)生的雙鏈斷裂更難修復。其對于細胞特別成問題，因為其可以導致基因組重排。 存在三種機制來修復雙鏈斷裂（DSB):非同源的末端連接、微同源介導的末端連接和同源 重組。如果鏈斷裂沒有被正確地修復或DNA雙鏈斷裂根本沒有修復，細胞經(jīng)常會在下次有 絲分裂時死亡。
[0010] 修復抑制劑是本領域眾所周知的。通常地，所述抑制劑可以是DNA雙鏈斷裂修復 的抑制劑，而如上討論的DSB可能殺死所述復合物所靶向的細胞或使其喪失能力。所述DNA抑制劑可以是NBS1(NijmegenBreakageSyndromel，Nibrin)。這是一種 754 個氨基酸的 蛋白質(zhì)，鑒定為NBSl/hMrell/RAD50雙鏈DNA斷裂修復復合體的成員。這個復合體識別DNA 損傷、迅速地重新定位到DSB位置并形成核焦點。典型的NBS1序列是KEESLADDL。
[0011] 也可以使用此抑制劑以及其他DNA修復抑制劑的片段，所述片段仍然保持DNA修 復抑制活性。
[0012] 所述DNA抑制劑可以是Ku70或其片段。Ku70是由XRCC6編碼的蛋白質(zhì)。蛋白 質(zhì)與Ku80 -起組成Ku異源二聚體，其結(jié)合到DBS端部并參與DNA修復?？梢允褂媚M所 述Ku80 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域的合成肽（EGGDVDDLDMI)KimetalJ.Pharmacol.Exp.Therap. (2002)303 ：353〇
[0013] PARP1 (聚[ADP-核糖]聚合酶-1)通過聚ADP-核糖基化修飾細胞核蛋白質(zhì)。它連 同BRCA參與DSB修復。另外，PARP1還參與單鏈DNA斷裂的修復?；蛘?，主要修復抑制劑可 以是Hlx或其片段。接頭組蛋白普遍存在于所有體細胞。參見，例如，PCT/GB2011/051180、 W0/2011/161457。
[0014] 還可以使用DNA磷酸激酶抑制劑。
[0015] 舉例來說，所述NLS可以是腺病毒或SV40NLS，或合成的序列例如M4靶向序列。 所述M4靶向序列可以是KKKKKKGGRGDMFG。所述腺病毒NLS可以是GGFSTSLRARKA。
[0016] 還可以使用合成NLS。NLS是在本領域眾所周知的。上述M4靶向序列是合成肽， 所述腺病毒NLS是天然存在的靶向序列。
[0017] 所述納米顆粒通常是金屬納米顆粒，例如過渡金屬顆粒。這些包括金、鉑或鈀，或 其混合物。舉例來說，鉑和金的優(yōu)點是這樣的顆?？梢酝ㄟ^產(chǎn)生光電子和俄歇電子增強電 離福射的效果（Zhengetal;Radiat.Res. (2008)，169:19，Hainfeldetal;Phys.Med. Biol. (2004)，49:N309,andBistonetal;CancerRes. (2004)，64:2317)?？梢詫⑺?電離輻射調(diào)節(jié)到允許產(chǎn)生這樣的電子，從而增加在所靶向的細胞上的放射效果。通過放 射產(chǎn)生的電子的效果依賴于靠近DNA，因為負責所述效果的次級電子的行進的預期距離短 (Zhengetal(Supra)和Regullaetal(Rad.Res. (1998) 150:92)。NLS的存在幫助使所 述納米顆粒祀向所述細胞核，從而幫助納米顆粒定位靠近DNA。
[0018] 基于肽的DNA修復抑制劑和/或NLS可以通過眾所周知的系統(tǒng)附著于所述納米顆 粒上。舉例來說，可以使用對金屬納米顆粒有親合力的接頭部分。這樣的接頭部分包括含硫 接頭例如硫辛酸、金結(jié)合肽 1(Brownetal，Nat.Biotech. (1997)，15 :269)、3R-GBP1 (其包 含3個MHGKTQATSGTIQS的結(jié)合到金和鉑表面的重復序列（Tamerleretal;Small(2006)2 : 1372))、CALNN肽（LevyR，J.Am.Chem.Soc. (2004) 126 (32)，10076-84)。
[0019] 也可以將一個或多個額外部分附著于所述復合物。舉例來說，所述額外部分可以 使用例如上述的接頭部分直接附著于所述納米顆粒，或二者選一地，附著于所述DNA修復 抑制劑、NLS和/或它們的接頭部分。舉例來說，一個或多個額外部分可以選自化學治療劑、 DNA交聯(lián)劑、顯像劑、造影劑和表面靶向劑。可以使用兩個或更多個額外類型的部分。
[0020] 舉例來說，化學治療劑可以是誘導DNA損傷（例如DNA單鏈或通常地雙鏈斷裂） 的藥劑。舉例來說，博來霉素是一種通過細菌輪枝鏈霉菌（Streptomycesverticillus)產(chǎn) 生的糖肽抗生素。已知為抗癌劑，化學治療的形式主要地是博來霉素A2和B2。它通過引起 DNA斷裂來起作用。
[0021] 所述化學治療劑也可以是阿霉素。阿霉素是一種蒽環(huán)類抗生素，其通常用于治療 廣泛的癌癥，并插入到DNA中。
[0022] 可以與其他化學治療劑（包括博來霉素和calichaemycin)組合使用。另一種化 學治療劑可以是喜樹堿。喜樹堿是一種細胞毒性的喹啉生物堿，其抑制DNA酶拓撲異構(gòu)酶 I。喜樹堿和兩種類似物（托泊替康和依立替康）已經(jīng)用于癌癥化學療法。也可以使用這 樣的復合物的類似物。其它的藥劑包括氮芥類、替莫唑胺和本領域眾所周知的交聯(lián)劑，包括 cis-platinin(Brown et. al, J.Am.Soc. (2012) 132,4676-84)〇
[0023] 所述顯像劑可以是本領域眾所周知的熒光染料，如熒光黃。
[0024] 所述造影劑可以是釓、氧化鐵、錳或其它的順磁性造影劑。這些造影劑允許復合物 靶向待確診的癌癥的位置。
[0025] 所述表面靶向劑可以能夠特異性附著于癌細胞的部分。舉例來說，該部分可以是 在癌細胞表面上發(fā)現(xiàn)的受體的配體。舉例來說，維生素受體，例如葉酸受體，一般在許多癌 癥細胞中過表達。因此舉例來說，所述細胞表面革G向劑可以是維生素，例如葉酸（Leamonet al，J.DrugTarget. (1999)7:157)。能夠使納米顆粒到祀向特定細胞的優(yōu)點是其幫助限制 對于正常細胞的毒副作用。舉例來說，通過受體介導的胞吞作用可以使連接維生素的分子 內(nèi)在化。已經(jīng)顯示了對眾所周知的葉酸遞送的細胞毒性藥物的攝取，并且它們具有在臨床 前研宄中有前景的效果。所述維生素例如葉酸可以通過，例如，標準固相化學，與肽綴合。
[0026] 本發(fā)明的復合物可以與一個或多個藥學上可接受的載體或稀釋劑組合使用。它可 以用作藥物，例如所述藥物用于治療癌癥。
[0027] 還提供了一種治療對象體內(nèi)癌癥的方法，其包括施用藥學有效量的本發(fā)明的復合 物。
[0028] 所述復合物可以靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或口服施用?？梢灾委熌X瘤，例如通過顱骨 灌注越過血腦屏障。
[0029] 可以對所述患者另外進行放射治療。舉例來說，當所述復合物包括金屬納米顆粒， 在施用所述復合物之后，所述患者可以用來自電離放射源的的放射療法來治療，所述電離 放射源調(diào)節(jié)到所述金屬納米顆粒的吸收限。如上面所討論的，這引起納米顆粒發(fā)射次級電 子。
[0030] 舉例來說，所述電離輻射源可以是X射線源或同步加速器源。
[0031] 舉例來說，本發(fā)明通過附著于同一顆粒的DNA損傷劑或通過經(jīng)由納米顆