專利名稱：包含環(huán)戊烯酮化合物作為活性組分的治療劑或預(yù)防劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含環(huán)戊烯酮酯作為活性組分的藥物組合物。
背景技術(shù)：
通常有多種藥物，包括烷化劑、抗代謝藥、制癌劑例如植物生物堿、抗生素、免疫增強劑和免疫調(diào)節(jié)劑用于臨床治療。然而，使用這些藥物的藥物療法尚不完善。
在這些藥物當(dāng)中，據(jù)報道在其5元環(huán)中有α，β-不飽和羰基的天然前列腺素，即前列腺素A和J能抑制DNA合成，這意味著它們能用作高度安全的制癌劑。已合成了多種它們的衍生物(參見JP-A 62-96438)。
發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是開發(fā)具有多種生理活性的環(huán)戊烯酮衍生物，以提供包含該化合物作為活性組分的藥物組合物。
在下文中將參照附圖詳細(xì)地解釋本發(fā)明的這些和其它目的以及優(yōu)點。
附圖簡述附

圖1是二異丁?；h(huán)戊烯酮的1H-NMR光譜。
附圖2是二甲氧基乙?；h(huán)戊烯酮的1H-NMR光譜。
附圖3是二甲基富馬酰基環(huán)戊烯酮的1H-NMR光譜。
附圖4是二甲基馬來?；h(huán)戊烯酮的1H-NMR光譜。
附圖5表明了環(huán)戊烯酮衍生物的給藥量與足水腫的增大比率之間的關(guān)系。
附圖6表明了環(huán)戊烯酮衍生物的給藥量與遲發(fā)型過敏反應(yīng)的增大比率之間的關(guān)系。
附圖7表明了二丙?；h(huán)戊烯酮的濃度與3H-胸腺嘧啶脫氧核苷攝取量之間的關(guān)系。
附圖8表明了二丙?；h(huán)戊烯酮的濃度與3H-胸腺嘧啶脫氧核苷攝取量之間的關(guān)系。
發(fā)明簡述為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明者們已經(jīng)作了大量研究，并且發(fā)現(xiàn)，通過將式[II]所示4，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮(下文中簡稱為環(huán)戊烯酮) 與羧酸和/或其反應(yīng)活性衍生物反應(yīng)而制得的式[I]環(huán)戊烯酮衍生物 其中R1和R2彼此之間可相同或不同，并且是氫、脂族基、芳基、或芳脂族基，具有很強的生理活性，例如免疫調(diào)節(jié)活性、抗炎活性、抑制腫瘤壞死因子生成的活性、抗真菌活性、和抑制細(xì)胞粘著的活性。因此，本發(fā)明已得以完成。
因此，本發(fā)明提供了藥物組合物，其中包含至少一種選自式[I]環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體、和其鹽的化合物作為活性組分，所述組合物可用于治療或預(yù)防下述疾病對于其治療或預(yù)防需要免疫調(diào)節(jié)的疾病，對于其治療或預(yù)防需要抑制炎癥的疾病，對于其治療或預(yù)防需要抑制腫瘤壞死因子生成的疾病，對于其治療或預(yù)防需要抑制真菌的疾病，對于其治療或預(yù)防需要抑制細(xì)胞粘著的疾病，或者對于其治療或預(yù)防需要誘導(dǎo)熱激蛋白的疾病。
發(fā)明詳述在本發(fā)明中使用的環(huán)戊烯酮包括在4-位和5-位具有呈順式構(gòu)型的羥基的異構(gòu)體和具有呈反式構(gòu)型的羥基的異構(gòu)體。環(huán)戊烯酮的順式或反式異構(gòu)體或順式和反式異構(gòu)體的混合物都可用于本發(fā)明。也可使用其旋光異構(gòu)體。
環(huán)戊烯酮的順式異構(gòu)體是依據(jù)化學(xué)合成方法[HelveticaChimica Acta，552838-2844(1972)]獲得的。環(huán)戊烯酮的反式異構(gòu)體是依據(jù)化學(xué)合成方法[Carbohydrate Res.，247217-222(1993)]，或通過加熱糖醛酸(例如葡萄糖醛酸)、糖醛酸衍生物(例如葡萄糖醛內(nèi)酯)或類似化合物(參見WO 98/13328)獲得的。含有環(huán)戊烯酮的這些加熱處理產(chǎn)物及其部分純化或純化產(chǎn)物可用于本發(fā)明。
例如，通過將1％D-葡萄糖醛酸(作為糖醛酸)溶液在121℃加熱4小時來制備在熱處理產(chǎn)物中的環(huán)戊烯酮。用溶劑提取熱處理產(chǎn)物中的環(huán)戊烯酮。將提取液濃縮。然后通過硅膠柱色譜法分離濃縮物。將含有環(huán)戊烯酮的洗脫級分濃縮。用氯仿從濃縮物中提取環(huán)戊烯酮。通過正相色譜法純化濃縮的提取液，由此分離出了熱處理產(chǎn)物中的環(huán)戊烯酮。
旋光異構(gòu)體(-)-4，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮和(+)-4，5-二羥基-2-環(huán)戊烯-1-酮可通過將由此分離到的環(huán)戊烯酮進行旋光拆分而獲得。當(dāng)然，也可將合成的環(huán)戊烯酮進行旋光拆分。
本發(fā)明式[I]環(huán)戊烯酮衍生物 或其旋光異構(gòu)體是通過將環(huán)戊烯酮和/或其旋光異構(gòu)體與具有氫、脂族基、芳基、或芳脂族基的羧酸和/或其反應(yīng)活性衍生物同時或順序反應(yīng)而在反應(yīng)混合物中制得的。
在本發(fā)明中使用具有氫、脂族基、芳基、或芳脂族基并且與式[I]環(huán)戊烯酮衍生物中的R1和R2相對應(yīng)的下述羧酸或其反應(yīng)活性衍生物。
甲酸可用作具有氫的羧酸。
具有烷基的羧酸和具有鏈烯基的羧酸可用作具有脂族基的羧酸。
具有直鏈或支鏈烷基的羧酸可用作具有烷基的羧酸。雖然可根據(jù)環(huán)戊烯酮衍生物的生物活性、溶解性等適當(dāng)?shù)剡x擇烷基鏈的長度，但是C1-30烷基是優(yōu)選的?？墒褂玫木哂兄辨溚榛聂人岬膶嵗ㄒ宜帷⒈?、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、正辛酸、壬酸、正癸酸、十一烷酸、月桂酸、十三烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕櫚酸、十七烷酸、硬脂酸、十九烷酸、二十烷酸、二十二烷酸、二十四烷酸、二十六烷酸、和三十烷酸。
可使用的具有支鏈烷基的羧酸的實例包括異丁酸、異戊酸、2-甲基丁酸、新戊酸、4-甲基戊酸、和1，2-二甲基戊酸。
具有直鏈或支鏈鏈烯基的羧酸可用作具有鏈烯基的羧酸。雖然可根據(jù)環(huán)戊烯酮衍生物的生物活性、溶解性等適當(dāng)?shù)剡x擇鏈烯基的鏈長、不飽和度和不飽和鍵的位置，但是優(yōu)選使用C2-30鏈烯基。
可使用的具有直鏈鏈烯基的羧酸的實例包括丙烯酸、乙烯基乙酸、巴豆酸、異巴豆酸、烯丙基乙酸、2-己烯酸、3-己烯酸、3-辛烯酸、4-癸烯酸、10-十一碳烯酸、棕櫚烯酸、巖芹酸、反油酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸、γ-亞麻酸、桐酸、二十碳三烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、巴西烯酸、芥酸、二十二碳六烯酸、西門木烯酸、和21-三十碳烯酸。
可使用的具有支鏈鏈烯基的羧酸的實例包括異丁烯酸、惕各酸、當(dāng)歸酸、和α-乙基巴豆酸。
具有烷基、并且所述烷基具有C1-4低級烷氧基作為取代基的羧酸例如甲氧基乙酸可用作具有取代的脂族基的羧酸。可使用具有鏈烯基、并且所述鏈烯基具有C2-5低級烷氧基羰基作為取代基的羧酸例如甲基馬來酸。
可使用的具有芳基的羧酸的實例包括苯甲酸、甲苯甲酸、氯苯甲酸、溴苯甲酸、硝基苯甲酸、鄰苯二甲酸、間苯二甲酸、對苯二甲酸、水楊酸、乙酰水楊酸、乙酰水楊酰水楊酸、氨基水楊酸、對羥基苯甲酸、氨基苯甲酸、甲氧基苯甲酸、乙酰氨基苯甲酸、香草酸、苔色酸、萘甲酸、辛可部酸、黃尿烯酸、奎尼酸和犬尿酸?？筛鶕?jù)欲制備的環(huán)戊烯酮衍生物的生物活性、溶解性等選擇使用的具有芳基的羧酸。
可使用的具有芳脂族基的羧酸的實例包括苯基乙酸、苯基丙酸、苯基乳酸、苯基丙酮酸、肉桂酸、阿托酸、和萘基乙酸?？筛鶕?jù)欲制備的環(huán)戊烯酮衍生物的生物活性、溶解性等選擇具有所使用的芳脂族基的羧酸。
所述脂族基、芳基、或芳脂族基可具有取代基，例如官能團(例如氨基、硝基、氧代基、羥基、硫羥基、或硫酸根)或鹵素(例如氟、氯、溴或碘)。
因此，式[I]中的R1和R2彼此之間可相同或不同，并且其實例包括氫、直鏈或支鏈C1-30烷基、直鏈或支鏈C2-30鏈烯基、C6-10芳基、和C1-30烷基C6-10芳基。所述基團可任選被至少一個選自下述基團的取代基取代C1-30烷基、C1-4烷氧基、C2-5烷氧基羰基、氨基、硝基、氧代基、羥基、硫羥基、硫酸根和鹵素(例如氟、氯、溴或碘)。
羧酸反應(yīng)活性衍生物的實例有酰鹵、酸酐、酸酯和鹽?？筛鶕?jù)使用目的制備所使用的羧酸的反應(yīng)活性衍生物。
可進行羧酸或其反應(yīng)活性衍生物與環(huán)戊烯酮之間的反應(yīng)，以使得環(huán)戊烯酮衍生物中的R1和R2彼此之間相同或不同。具體來說，可將具有不同基團(對于R1和R2)的羧酸與環(huán)戊烯酮同時反應(yīng)。或者可將它們順序反應(yīng)。對于后一種情況，通過將環(huán)戊烯酮的一個羥基保護，可以以高效率制得其中R1和R2彼此不同的環(huán)戊烯酮衍生物。
通過將環(huán)戊烯酮或其旋光異構(gòu)體與羧酸反應(yīng)而制得的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體具有免疫調(diào)節(jié)活性、抗炎活性、抑制腫瘤壞死因子生成的活性、抗真菌活性、抑制細(xì)胞粘著的活性等?？墒褂眠@些活性中的一種作為指數(shù)從反應(yīng)混合物中純化和分離環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體?？墒褂冒ɑ瘜W(xué)方法和物理方法在內(nèi)的已知純化/分離方法進行純化和分離?？陕?lián)合使用常規(guī)純化方法例如凝膠過濾、采用分子量分級膜的分級分離、溶劑提取、分餾以及各種色譜法，例如離子交換樹脂，以從反應(yīng)產(chǎn)物中純化和分離環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體。
例如，在本發(fā)明中使用的環(huán)戊烯酮衍生物是按如下所述制得的將環(huán)戊烯酮或其旋光異構(gòu)體、4-二甲基氨基吡啶和羧酸溶于二氯甲烷中，在冰冷卻下向其中加入N，N-二環(huán)己基碳化二亞胺來進行反應(yīng)?？赏ㄟ^硅膠薄層色譜法將產(chǎn)物純化以分離出所要的環(huán)戊烯酮衍生物。
此外，可從通過將環(huán)戊烯酮或其旋光異構(gòu)體與乙酸酐在無水吡啶中反應(yīng)而獲得的反應(yīng)產(chǎn)物中純化和分離二乙?；h(huán)戊烯酮。
在本發(fā)明中使用的環(huán)戊烯酮衍生物的旋光異構(gòu)體可通過下述方法分離到將外消旋混合物機械拆分，優(yōu)選結(jié)晶法，通過作為非對映異構(gòu)鹽或包含物通過結(jié)晶進行拆分，用酶或微生物進行動力學(xué)拆分，色譜分離等。
可采用使用適當(dāng)手性固定相的氣相色譜法、液相色譜法、薄層色譜法等進行色譜拆分。
使用手性固定相的方法、使用手性洗脫劑的方法、作為非對映異構(gòu)體分離等方法可用來通過液相色譜法進行旋光拆分。
酰胺型固定相、脲型固定相、配體交換型固定相、多糖或多糖衍生物固定相、蛋白固定相、聚異丁烯酸酯固定相、聚異丁烯酰胺固定相等可用作手性固定相。
根據(jù)所用的固定相，己烷型洗脫劑、醇型洗脫劑、水(緩沖液)洗脫劑等可適當(dāng)?shù)赜米飨疵搫?br> 在本發(fā)明中使用的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體的鹽包括可藥用鹽。可使用已知方法將其轉(zhuǎn)化成鹽。
在本發(fā)明中使用的環(huán)戊烯酮衍生物的代表性實例包括二乙?；h(huán)戊烯酮、二丙?；h(huán)戊烯酮、二丁?；h(huán)戊烯酮、二異丁?；h(huán)戊烯酮、二戊?；h(huán)戊烯酮、二己?；h(huán)戊烯酮、二辛酰基環(huán)戊烯酮、二癸?；h(huán)戊烯酮、二肉豆蔻酰基環(huán)戊烯酮、二(甲氧基乙酰基)環(huán)戊烯酮、二(甲基富馬?；?環(huán)戊烯酮、二(甲基馬來?；?環(huán)戊烯酮、二(2-己烯?；?環(huán)戊烯酮、二(3-辛烯?；?環(huán)戊烯酮、和二苯甲?；h(huán)戊烯酮。
在本發(fā)明中使用的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體、或其鹽具有免疫調(diào)節(jié)活性，例如抑制淋巴細(xì)胞芽生的活性、抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的活性、激活天然殺傷細(xì)胞的活性、激活癌細(xì)胞特異性淋巴細(xì)胞的活性；抗炎活性，例如抑制角叉菜膠誘導(dǎo)的水腫的活性、抑制遲發(fā)型過敏反應(yīng)的活性；抑制腫瘤壞死因子生成的活性；抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性；誘導(dǎo)熱激蛋白的活性；抑制細(xì)胞粘著的活性；抗真菌活性等。由于具有這些活性，因此本發(fā)明化合物可用作用于治療或預(yù)防下述疾病的藥物組合物對于其治療或預(yù)防需要免疫調(diào)節(jié)的疾病，對于其治療或預(yù)防需要抑制炎癥的疾病，對于其治療或預(yù)防需要抑制腫瘤壞死因子生成的疾病，需要抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的疾病，對于其治療或預(yù)防需要誘導(dǎo)熱激蛋白的疾病，對于其治療或預(yù)防需要抑制真菌生長的疾病，對于其治療或預(yù)防需要抑制細(xì)胞粘著的疾病等。因此，可使用至少一種選自環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體、和其鹽的化合物作為活性組分來制備免疫調(diào)節(jié)組合物、抗炎組合物、用于抑制腫瘤壞死因子生成的組合物、用于抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的組合物、用于誘導(dǎo)熱激蛋白的組合物、抗真菌組合物、和用于抑制細(xì)胞粘著的組合物。
腫瘤壞死因子是作為在腫瘤位點誘導(dǎo)出血性壞死的因子發(fā)現(xiàn)的。目前認(rèn)為腫瘤壞死因子是廣泛參與以炎癥為基礎(chǔ)的生物防御和免疫機制的細(xì)胞因子。腫瘤壞死因子生成調(diào)節(jié)機制中的障礙給宿主帶來了多種困擾。腫瘤壞死因子的過度生成或失控生成導(dǎo)致多種疾病。這些疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性脊髓炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、膿毒病、敗血癥性休克、內(nèi)毒素性休克、革蘭氏陰性菌膿毒病、中毒性休克綜合征、腦瘧疾、慢性肺炎、移植物對宿主反應(yīng)、同種移植物排斥、由于傳染病例如流感所致的發(fā)熱和肌痛、感染或惡性腫瘤的繼發(fā)性惡病質(zhì)、人獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的繼發(fā)性惡病質(zhì)、AIDS、與AIDS有關(guān)的綜合征、瘢痕瘤形成、潰瘍性結(jié)膜炎、多發(fā)性硬化、和自身免疫性疾病例如自身免疫性糖尿病和全身性紅斑狼瘡[Molecular Medicine，331010-1020，1182-1189(1986)]。抑制腫瘤壞死因子生成的本發(fā)明組合物可用于治療和預(yù)防由腫瘤壞死因子介導(dǎo)或被其加重的病癥，例如由腫瘤壞死因子引起的胰島素依賴型糖尿病[Nature，389610-614(1997)]。
本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子生成的方法，其中使用至少一種選自環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體和其鹽的化合物作為活性組分。此外，本發(fā)明還提供了用于改善由腫瘤壞死因子介導(dǎo)或被其加重的病癥的食品或飲料或者用于預(yù)防這類疾病的食品或飲料，其中包含至少一種選自環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體和其鹽的化合物。
本發(fā)明環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體或其鹽具有免疫調(diào)節(jié)活性，例如抑制淋巴細(xì)胞芽生的活性、和抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的活性。含有至少一種選自這些化合物的化合物作為活性組分的免疫調(diào)節(jié)組合物可用作用于治療或預(yù)防下述疾病的藥物組合物由于免疫系統(tǒng)或免疫因子異常所致的疾病，或者對于其治療或預(yù)防需要免疫增強的疾病。
淋巴細(xì)胞芽生是其中促細(xì)胞分裂劑在淋巴細(xì)胞表面上與受體結(jié)合以激活淋巴細(xì)胞并促進其分裂和增殖的反應(yīng)?；旌狭馨图?xì)胞反應(yīng)是這樣的反應(yīng)將從同種異體動物中獲得的淋巴細(xì)胞混合并培養(yǎng)，然后由于主要組織相容性抗原的不相容而誘使淋巴細(xì)胞激活，以促進淋巴細(xì)胞分裂和增殖。本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)組合物抑制這些反應(yīng)，并特別適用于治療和預(yù)防由淋巴細(xì)胞異常增多所引起的疾病，例如慢性腎炎、慢性結(jié)腸炎、I型糖尿病、和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，并還可用于抑制移植物排斥。
本發(fā)明環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體或其鹽具有抑制足中角叉菜膠水腫的活性。因此，含有至少一種選自這些化合物的化合物作為活性組分的抗炎組合物可用作用于治療或預(yù)防對于其治療或預(yù)防需要抑制炎癥的疾病的藥物組合物。
角叉菜膠誘導(dǎo)的足水腫模型是這樣的反應(yīng)通過將炎性劑角叉菜膠皮下注射到足底內(nèi)來誘導(dǎo)炎性細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞，由這些細(xì)胞產(chǎn)生的炎性因子提高了血管的滲透性，導(dǎo)致水腫。本發(fā)明抗炎組合物抑制水腫的活性可用于治療或預(yù)防對于其治療或預(yù)防需要抑制血管滲透性增加的疾病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
本發(fā)明環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體或其鹽具有抑制遲發(fā)型過敏反應(yīng)的活性。因此，含有至少一種選自這些化合物的化合物作為活性組分的抗炎組合物可用作用于治療或預(yù)防下述疾病的藥物組合物對于其治療或預(yù)防需要抑制由傳染病等引起的遲發(fā)型過敏反應(yīng)的疾病。
遲發(fā)型過敏反應(yīng)是依賴于由激活的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等介導(dǎo)的細(xì)胞免疫的炎性反應(yīng)。在炎性位點滲入的由這些細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子提高了血管滲透性，導(dǎo)致水腫、肉芽腫、纖維變性和壞死，從而引起嚴(yán)重的病癥。由遲發(fā)型過敏反應(yīng)引起的變應(yīng)性皮炎是導(dǎo)致大多數(shù)接觸性皮炎的原因。此外，遲發(fā)型過敏反應(yīng)還引起其中細(xì)菌、病毒或藥物起抗原作用的變態(tài)反應(yīng)。使用綿羊紅細(xì)胞作為抗原的小鼠模型通常被用來測定遲發(fā)型過敏反應(yīng)。在該模型中有效的化合物可用于治療或預(yù)防上述變應(yīng)性疾病。
本發(fā)明環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體或其鹽具有抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶II的活性。在正常細(xì)胞中，拓?fù)洚悩?gòu)酶II僅在分裂期間短暫表達。另一方面，當(dāng)細(xì)胞癌變時，它在整個細(xì)胞周期都高度表達。因此，含有至少一種選自這些化合物的化合物的抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的組合物可用作制癌劑。此外，使用至少一種選自這些化合物的化合物抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的方法可用于生化研究、篩分制癌劑等。
本發(fā)明環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體或其鹽具有抑制細(xì)胞粘著的活性。因此，本發(fā)明提供了含有至少一種選自這些化合物的化合物作為活性組分、用于抑制細(xì)胞粘著的組合物。本發(fā)明抑制細(xì)胞粘著的組合物可用作用于治療或預(yù)防對于其治療或預(yù)防需要抑制細(xì)胞粘著的疾病的藥物組合物。
例如，癌轉(zhuǎn)移是由于在癌原始發(fā)生部位生長的癌細(xì)胞釋放到血管中、遷移到轉(zhuǎn)移位點并浸滲到組織內(nèi)所致。其中，癌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘著是癌細(xì)胞從血管內(nèi)部遷移到轉(zhuǎn)移位點所必需的。已知在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的ICAM-1、VCAM-1和ELAM-1是參與癌轉(zhuǎn)移的粘著分子。已經(jīng)鑒定了癌細(xì)胞上各自的相應(yīng)配體LFA-1、VLA-4和唾液酸Lewis X。這些粘著分子通常在白血病細(xì)胞上表達，并被認(rèn)為參與白血病細(xì)胞的血管外浸滲。因此，預(yù)計本發(fā)明抑制細(xì)胞粘著的組合物可抑制由這些粘著分子介導(dǎo)的癌細(xì)胞粘著，從而抑制癌轉(zhuǎn)移。
環(huán)戊烯酮和由環(huán)戊烯酮制得的化合物以及在PCT/JP98/00815中描述的含SH基化合物也具有抑制細(xì)胞粘著的活性。因此，本發(fā)明提供了含有至少一種選自這些化合物的化合物作為活性組分、用于抑制細(xì)胞粘著的組合物。
本發(fā)明提供的抑制細(xì)胞粘著的組合物可用于抑制細(xì)胞粘著的方法。該方法可用于關(guān)于細(xì)胞粘著的生化研究，和篩分細(xì)胞粘著抑制劑或具有使細(xì)胞粘著的活性的活性劑。
本發(fā)明環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體或其鹽具有激活天然殺傷(NK)細(xì)胞的活性。因此，本發(fā)明提供了含有至少一種選自這些化合物的化合物作為活性組分、用于激活NK細(xì)胞的組合物。本發(fā)明激活NK細(xì)胞的組合物可用作用于治療或預(yù)防對于其治療或預(yù)防需要激活NK細(xì)胞的疾病的藥物組合物。
NK細(xì)胞識別被細(xì)菌或病毒感染的細(xì)胞和癌細(xì)胞，并通過細(xì)胞膜攻擊將這些細(xì)胞消除。激活NK細(xì)胞增強了活體中的免疫保護機制。因此，本發(fā)明激活NK細(xì)胞的組合物可用于治療或預(yù)防細(xì)菌或病毒性疾病和癌癥。
環(huán)戊烯酮和由環(huán)戊烯酮制得的化合物以及在PCT/JP98/00815中描述的含SH基化合物也具有激活NK細(xì)胞的活性。因此，本發(fā)明提供了含有至少一種選自這些化合物的化合物作為活性組分、用于激活NK細(xì)胞的組合物。
本發(fā)明提供的激活NK細(xì)胞的組合物可用于激活NK細(xì)胞的方法。該方法可用于關(guān)于免疫保護機制的生化研究，和篩分免疫保護劑。
本發(fā)明環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體或其鹽具有抗真菌活性。因此，可使用至少一種選自這些化合物的化合物作為活性組分與已知藥物載體制備抗真菌組合物。
通常有多種治療劑用于治療真菌感染，包括兩性霉素B、氟胞嘧啶、咪康唑和氟康唑。然而，這些治療劑有效力和毒性方面的問題，或者具有對它們有抗藥性的菌株。尤其是，具有低毒性、能有效治療近來有增加趨勢的系統(tǒng)感染的治療劑很少。本發(fā)明抗真菌組分用于具有低的毒性而可用作新型抗真菌劑。
本發(fā)明環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體或其鹽具有誘導(dǎo)熱激蛋白的活性。因此，通過使用至少一種選自這些化合物的化合物作為活性組分可制得誘導(dǎo)熱激蛋白的組合物?？山?jīng)由合適的途徑將該組合物給藥以治療或預(yù)防對于其治療或預(yù)防需要誘導(dǎo)熱激蛋白的疾病。
本發(fā)明環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體或其鹽具有誘導(dǎo)熱激蛋白例如70-kDa熱激蛋白(HSP70)的活性。它們具有抗RNA病毒和DNA病毒例如肝炎病毒、AIDS病毒、流感病毒、水皰性口炎病毒、和皰疹病毒的抗病毒活性。熱激蛋白參與腫瘤免疫。此外，這些化合物還具有生物防衛(wèi)活性例如抗炎活性。因此，通過施用本發(fā)明化合物或其旋光異構(gòu)體或其鹽，可預(yù)防或治療病毒性疾病例如由流感病毒引起的感冒。
熱激蛋白是當(dāng)使細(xì)胞或個體經(jīng)受溫度快速改變至比常溫高5-10℃的較高溫度時所誘導(dǎo)合成的蛋白的俗稱。熱激蛋白分布在多種生物體中，包括原核生物和高級真核生物。HSP90、HSP70、遍在蛋白、HP26等是已知的真核生物熱激蛋白。在這些熱激蛋白當(dāng)中，HSP70是一種分子伴侶蛋白，它結(jié)合折疊不完全的蛋白或不完全折疊蛋白，并幫助它們形成三維結(jié)構(gòu)。熱激蛋白的氨基酸序列在進化過程中很好地保存了下來。HSP70與大腸桿菌(Escherichia coli)DnaK蛋白類似。人體中存在大約10個HSP70基因。其中一些是組成性表達的，其余是由不同刺激誘導(dǎo)的。除了熱激以外，不同的化學(xué)物質(zhì)和細(xì)胞損傷例如氧化應(yīng)力也誘導(dǎo)熱激蛋白的合成。
C.Amici等人[Journal of Virology，686890-6899(1994)]報道在具有α，β-不飽和羰基的前列腺素A1存在下培養(yǎng)用仙臺病毒感染的動物細(xì)胞，誘導(dǎo)了HSP70和HSP90的合成，并且雖然誘導(dǎo)了HSP70的合成，但是病毒蛋白的合成被抑制了。A.Rossi等人[TheJournal of Biological Chemistry，27132192-32196(1996)]報道與前列腺素A1類似的2-環(huán)戊烯-1-酮誘導(dǎo)了HSP70的合成，并抑制了水皰性口炎病毒的蛋白合成。
例如，在1.25μM的濃度觀察到二異丁?；h(huán)戊烯酮—一種環(huán)戊烯酮衍生物誘導(dǎo)HSP70的能力。其誘導(dǎo)能力在2.5μM濃度最大。與需要以幾百μM濃度使用才能誘導(dǎo)HSP70的2-環(huán)戊烯-1-酮相比，二異丁?；h(huán)戊烯酮的誘導(dǎo)能力非常強。
本發(fā)明環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體或其鹽由于有著很高的誘導(dǎo)熱激蛋白的活性而具有抗DNA病毒、RNA病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和類病毒的抗病毒活性。上文中已經(jīng)舉例列舉了病毒和類病毒。
本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)組合物一般可這樣制得使用選自環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體和其鹽的化合物作為活性組分，并將其與可藥用液體或固體載體和任選使用的溶劑、分散劑、乳化劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、賦形劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑等混合來進行配制。制劑可呈固體制劑形式，例如片劑、粒劑、粉劑、撒粉劑和膠囊，或者液體制劑例如標(biāo)準(zhǔn)溶液劑、懸浮劑和乳劑。此外，可將組合物配制成干燥制劑，其可在使用前通過加入適當(dāng)載體來重新配制成液體制劑。
可依據(jù)上述特定給藥途徑和劑型選擇藥物載體。對于口服制劑，可使用例如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露醇、羧甲基纖維素、玉米淀粉、無機鹽等。在口服制劑中還可使用粘合劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑、助流劑、矯味劑、著色劑、增香劑等。
非胃腸道給藥制劑可這樣制得依據(jù)常規(guī)方法，將本發(fā)明活性組分，即選自環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體和其鹽的化合物溶解或懸浮在稀釋劑中。稀釋劑包括可注射蒸餾水、生理鹽水、葡萄糖水溶液、可注射植物油、芝麻油、花生油、豆油、玉米油、丙二醇和聚乙二醇。可任選將滅菌劑、穩(wěn)定劑、滲透調(diào)節(jié)劑、光滑劑等加到這種溶液或懸浮液中。
經(jīng)由適于組合物劑型的途徑施用本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)組合物。給藥途徑不限于具體一種。本發(fā)明組合物可內(nèi)用或外用(或局部施用)或通過注射施用。注射劑可例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、真皮內(nèi)等施用。外用制劑包括栓劑。
根據(jù)具體劑型、給藥途徑和目的、以及欲治療患者的年齡、體重和身體狀況來適當(dāng)?shù)卮_定本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)組合物的劑量，并且劑量可隨著這些因素的不同而變化。對于成人，按制劑中包含的選自環(huán)戊烯酮或其旋光異構(gòu)體和其鹽的化合物的量計，日劑量一般為0.1μg-200mg/kg。當(dāng)然，劑量可隨各種因素而變。因此，在某些情況下，低于上述劑量范圍的劑量可能就足夠了，但是在另一些情況下，可能需要超過上述劑量范圍的劑量。本發(fā)明藥物組合物可口服給藥，或者既然如此可通過將其加到所選擇的食品和飲料中來每天服用。
可依據(jù)與上述配制本發(fā)明免疫調(diào)節(jié)組合物所用的方式相同的方式配制本發(fā)明抑制腫瘤壞死因子生成的組合物、抗炎組合物、抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的組合物、抑制細(xì)胞粘著的組合物、誘導(dǎo)熱激蛋白的組合物和抗真菌組合物?？山?jīng)由適于所治療疾病的途徑施用這些組合物。當(dāng)然，組合物劑量可隨各種因素而變。因此，在某些情況下，低于上述劑量范圍的劑量可能就足夠了，但是在另一些情況下，可能需要超過上述劑量范圍的劑量。本發(fā)明藥物組合物可口服給藥，或者既然如此可通過將其加到所選擇的食品和飲料中來每天服用。
在本發(fā)明中使用的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體或其鹽可由環(huán)戊烯酮和任一種羧酸或其反應(yīng)活性衍生物高效率地制得。
依據(jù)上述制備方法，提供了二異丁酰基環(huán)戊烯酮(環(huán)戊烯酮與異丁酸酐之間的反應(yīng)產(chǎn)物)、二(甲氧基乙?；?環(huán)戊烯酮(環(huán)戊烯酮與甲氧基乙酸之間的反應(yīng)產(chǎn)物)、二(甲基富馬?；?環(huán)戊烯酮、和二(甲基馬來?；?環(huán)戊烯酮(環(huán)戊烯酮與甲基馬來酸之間的反應(yīng)產(chǎn)物)。
這些化合物具有制癌活性、抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性等。通過使用這些化合物或其旋光異構(gòu)體或其鹽作為活性組分可制得藥物組合物例如制癌組合物。
制備含有依據(jù)本發(fā)明獲得的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體或其鹽作為活性組分的食品和飲料的方法不限于具體一種?？墒褂萌我夥椒ǎㄅ腼?、加工、和生產(chǎn)食品與飲料的其它常用方法，只要所得食品和飲料包含有效量的具有生理活性的選自環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體和其鹽的化合物即可?？捎纱酥频霉δ苁称坊蝻嬃侠缑庖哒{(diào)節(jié)食品或飲料。
當(dāng)施用生理有效量的依據(jù)本發(fā)明獲得的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體或其鹽時，沒有觀察到毒性作用。例如，當(dāng)以100mg/kg的單次劑量將二丙酰基環(huán)戊烯酮、二己酰基環(huán)戊烯酮、二(2-己?；?環(huán)戊烯酮、二異丁酰基環(huán)戊烯酮、二苯甲?；h(huán)戊烯酮或它們的旋光異構(gòu)體或其鹽對小鼠口服給藥時，沒有觀察到死亡。
如上所述，本發(fā)明環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體或其鹽可方便地制得，并且由于具有多種生理功能，它們非常適用于包括醫(yī)藥和食品在內(nèi)的多種領(lǐng)域。
下述實施例進一步詳細(xì)地舉例說明了本發(fā)明，但是不應(yīng)當(dāng)將其理解為對本發(fā)明范圍的限制。實施例中的百分比(％)是指重量百分比。
將該萃取液進行硅膠BW-300SP柱色譜(2×28cm，F(xiàn)ujiSylysia)純化。使用乙酸丁酯∶乙酸∶水＝3∶2∶2的上層混合物作為洗脫劑、在0.2kg/cm2壓力下、用壓縮機以5ml/分鐘的流速進行分離。每一級分含有10ml分級洗脫液。通過薄層色譜法分析每一級分的一部分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第61到第80個級分含有高程度環(huán)戊烯酮。合并這些級分，并減壓濃縮。用40ml氯仿提取該濃縮物。將該提取液減壓濃縮，獲得了10mg環(huán)戊烯酮。
通過使用Palpack Type S柱的正相HPLC分離該制備物，并根據(jù)在215nm的紫外線吸收度進行檢測。該操作證實了該制備物的純度為98％。
將113.9mg依據(jù)上述方法制得的環(huán)戊烯酮溶于2.85ml乙醇中。向該乙醇溶液中加入3.85ml己烷/乙醇(94/6)，獲得了17mg/ml的環(huán)戊烯酮溶液。將該溶液經(jīng)由0.5μm濾器過濾，獲得了用于旋光拆分HPLC的樣本溶液。
將該樣本溶液在下述條件下進行旋光拆分HPLC操作。分別從前峰和后峰收集含有環(huán)戊烯酮(-)異構(gòu)體和(+)異構(gòu)體的級分。將級分減壓蒸發(fā)至干，獲得了43.2mg環(huán)戊烯酮(-)異構(gòu)體和43.0mg環(huán)戊烯酮(+)異構(gòu)體。旋光拆分HPLC所采用的條件柱Chiralpack AS(Dicel Chemical Industries)2.0cm×25.0cm；柱溫40℃；流動相己烷/乙醇(94/6)；流速14.0m1/分鐘；檢測UV 210nm；進樣量150μl(2.55mg)。
因為所得環(huán)戊烯酮(-)異構(gòu)體和(+)異構(gòu)體都含有約1％濃度的對映異構(gòu)體，所以在上述條件下將它們再次旋光拆分。結(jié)果從由前峰獲得的30.0mg(-)異構(gòu)體中獲得了不含對映異構(gòu)體的19.7mg(-)異構(gòu)體。從由后峰獲得的37.4mg(+)異構(gòu)體中獲得了不含對映異構(gòu)體的27.7mg(+)異構(gòu)體。對于(-)異構(gòu)體，旋光拆分HPLC中的洗脫時間為33分鐘，對于(+)異構(gòu)體，洗脫時間為40分鐘。
(2)將1ml無水吡啶(Nacalai Tesque，295-26)和0.1ml乙酸酐(Nacalai Tesque，002-26)加到29.6mg如實施例1-(1)所述獲得的環(huán)戊烯酮中。將該混合物在室溫攪拌3小時。用氯仿提取該反應(yīng)混合物，獲得了36mg二乙?；h(huán)戊烯酮。
用DX302質(zhì)譜儀(Nippon Denshi)將所得二乙?；h(huán)戊烯酮進行質(zhì)譜分析。此外，將二乙?；h(huán)戊烯酮溶于CDCl3，并用核磁共振儀JNM-A500(Nippon Denshi)通過NMR進行結(jié)構(gòu)分析。所得結(jié)果如下所示。1H-NMR中的化學(xué)位移值是假定氯仿的化學(xué)位移值為7.24ppm表示的。
MS m/z 199(M+H)+1H-NMRδ2.12(3H，S，-OCOCH3)，2.16(3H，S，-OCOCH3)，5.16(1H，d，J＝3.0Hz，H-5)，5.89(1H，m，H-4)，6.40(1H，d-d，J＝1.5，6.5 Hz，H-2)，7.43(1H，d-d，J＝2.5，6.5Hz，H-3).
(3)用15.9mg如實施例1-(1)所述制得的環(huán)戊烯酮(-)異構(gòu)體如實施例1-(2)所述進行反應(yīng)，獲得了15.1mg二乙?；h(huán)戊烯酮(-)異構(gòu)體。當(dāng)如實施例1-(2)所述通過質(zhì)譜法和核磁共振對該異構(gòu)體進行結(jié)構(gòu)分析時，獲得了與實施例1-(2)中的結(jié)果相類似的結(jié)果。
(4)用16.7mg如實施例1-(1)所述制得的環(huán)戊烯酮(+)異構(gòu)體如實施例1-(2)所述進行反應(yīng)，獲得了18.8mg二乙?；h(huán)戊烯酮(+)異構(gòu)體。當(dāng)如實施例1-(2)所述通過質(zhì)譜法和核磁共振對該異構(gòu)體進行結(jié)構(gòu)分析時，獲得了與實施例1-(2)中的結(jié)果相類似的結(jié)果。
(5)將44.3mg苯甲酸(Nacalai Tesque，041-20)、7.5mg二甲基氨基吡啶(DMAP；Tokyo Kasei Kogyo，D1450)、51.0mg N，N′-二環(huán)己基碳化二亞胺(DCCPeptide Institute，1001)和5ml氯仿加到13.8mg環(huán)戊烯酮中。將該混合物在冰上攪拌4小時。將該反應(yīng)混合物過濾，將濾液施加到硅膠柱(75ml)上，用氯仿洗脫，獲得了含有二苯甲?；h(huán)戊烯酮的級分。將級分中的溶劑減壓除去，把殘余物溶于乙醇中，通過硅膠薄層色譜法分離該溶液，用99∶1的氯仿和甲醇混合物作為展開溶劑。將在Rf＝0.45-0.55處的硅膠從該薄層上刮掉，并用氯仿提取，獲得了3.2mg二苯甲?；h(huán)戊烯酮。
如實施例1-(2)所述通過質(zhì)譜法和核磁共振對由此獲得的二苯甲?；h(huán)戊烯酮進行結(jié)構(gòu)分析。所得結(jié)果如下所示。
MS m/z 323(M+H)+1H-NMRδ5.56(1H，d，J＝3.0 Hz，H-5)，6.30(1H，m，H-4)，6.54(1H，d-d，J＝1.5，6.5Hz，H-2)，7.44(4H，m，芳環(huán)上的氫)，7.58(2H，m，芳環(huán)上的H)，7.64(1H，d-d，J＝2.0，6.5Hz，H-3)，8.06(4H，m，芳環(huán)上的H).
(6)用22.1mg環(huán)戊烯酮(-)異構(gòu)體、71.9mg苯甲酸、12.1mgDMAP和80.3mg DCC如實施例1-(5)所述進行反應(yīng)，獲得了19.2mg二苯甲?；h(huán)戊烯酮(-)異構(gòu)體。當(dāng)如實施例1-(5)所述通過質(zhì)譜法和核磁共振對該異構(gòu)體進行結(jié)構(gòu)分析時，獲得了與實施例1-(5)中的結(jié)果相類似的結(jié)果。
(7)用20.4mg環(huán)戊烯酮(+)異構(gòu)體、65.6mg苯甲酸、11.0mgDMAP和74.3mg DCC如實施例1-(5)所述進行反應(yīng)，獲得了21.4mg二苯甲?；h(huán)戊烯酮(+)異構(gòu)體。當(dāng)如實施例1-(5)所述通過質(zhì)譜法和核磁共振對該異構(gòu)體進行結(jié)構(gòu)分析時，獲得了與實施例1-(5)中的結(jié)果相類似的結(jié)果。
(8)將30mg環(huán)戊烯酮、10mg DMAP和153mg己酸(NacalaiTesque，070-26)溶于5.9ml二氯甲烷中。向其中加入108mg DCC，同時在冰上冷卻。反應(yīng)1小時后，通過硅膠薄層色譜法分離和純化該反應(yīng)混合物，用氯仿作為展開溶劑。將在Rf＝0.3-0.4處的硅膠從該薄層上刮掉，并用氯仿提取，獲得了11mg二己酰基環(huán)戊烯酮。
將由此獲得的二己酰基環(huán)戊烯酮溶于CDCl3，用核磁共振儀JNM-EX270(Nippon Denshi)通過核磁共振(NMR)證實其結(jié)構(gòu)。1H-NMR中的化學(xué)位移值是假定四甲基硅烷的化學(xué)位移值為0ppm表示的。
所得結(jié)果如下所示。
1H-NMRδ7.44(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝1.98Hz，H-3)，6.42(1H，dd，J2-3＝6.27 Hz，J3-4＝1.32 Hz，H-2)，5.91(1H，m，H-4)，5.16(1H，d，J4-5＝2.97 Hz，H-5)，2.42(2H，t，J＝7.26Hz)，2.38(2H，t，J＝7.76Hz)，1.65(4H，m)，1.26(8H，m)，0.88(6H，t).
(9)將30mg環(huán)戊烯酮、10mg DMAP和301mg肉豆蔻酸(TokyoKasei Kogyo，M0476)溶于5.9ml二氯甲烷中。向其中加入108mgDCC，同時在冰上冷卻。反應(yīng)1小時后，通過硅膠薄層色譜法分離該反應(yīng)混合物，用氯仿作為展開溶劑。將在Rf＝0.45-0.55處的硅膠從該薄層上刮掉，并用氯仿提取，獲得了53mg二肉豆蔻?；h(huán)戊烯酮。
如實施例1-(8)所述通過核磁共振對由此獲得的二肉豆蔻酰基環(huán)戊烯酮進行結(jié)構(gòu)分析。所得結(jié)果如下所示。
1H-NMRδ7.45(1H，dd，J2-3＝5.94Hz，J3-4＝2.31Hz，H-3)，6.42(1H，dd，J2-3＝5.31Hz，J3-4＝1.32Hz，H-2)，5.92(1H，m，H-4)，5.16(1H，d，J4-5＝2.64Hz，H-5)，2.42(2H，t，J＝7.26Hz)，2.38(2H，t，J＝7.91Hz)，1.63(4H，m)，1.2 6(32H，m)，0.88(6H，t).
(10)將30mg環(huán)戊烯酮、10mg DMAP和190mg辛酸(NacalaiTesque，071-11)溶于5.9ml二氯甲烷中。向其中加入108mg DCC，同時在冰上冷卻。反應(yīng)1小時后，通過硅膠薄層色譜法分離該反應(yīng)混合物，用氯仿作為展開溶劑。將在Rf＝0.25-0.35處的硅膠從該薄層上刮掉，并用氯仿提取，獲得了27mg二辛酰基環(huán)戊烯酮。
如實施例1-(8)所述通過核磁共振對由此獲得的二辛?；h(huán)戊烯酮進行結(jié)構(gòu)分析。所得結(jié)果如下所示。
1H-NMRδ7.44(1H，dd，J2-3＝6.1 Hz，J3-4＝2.16 Hz，H-3)，6.41(1H，dd，J2-3＝6.1Hz，J3-4＝1.48Hz，H-2)，5.92(1H，m，H-4)，5.16(1H，d，J4-5＝2.97Hz，H-5)，2.42(2H，t，J＝7.59Hz)，2.38(2H，t，J＝7.91Hz)，1.65(4H，m)，1.29(16H，m)，0.88(6H，t).
(11)將30mg環(huán)戊烯酮、10mg DMAP和190mg 3-辛烯酸(TokyoKasei Kogyo，00070)溶于5.9ml二氯甲烷中。向其中加入108mgDCC，同時在冰上冷卻。反應(yīng)1小時后，通過硅膠薄層色譜法分離該反應(yīng)混合物，用氯仿作為展開溶劑。將在Rf＝0.25-0.35處的硅膠從該薄層上刮掉，并用氯仿提取，獲得了25mg二(3-辛烯?；?環(huán)戊烯酮。
如實施例1-(8)所述通過核磁共振對由此獲得的二(3-辛烯?；?環(huán)戊烯酮進行結(jié)構(gòu)分析。所得結(jié)果如下所示。
1H-NMRδ7.44(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝2.32Hz，H-3)，6.42(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝1.49Hz，H-2)，5.91(1H，m，H-4)，5.55(4H，m)，5.16(1H，d，J4-5＝2.97Hz，H-5)，3.12(4H，dd，J＝12.85Hz，J＝6.59Hz)，2.04(4H，m)，1.33(8H，m)，0.89(6H，t).
(12)將30mg環(huán)戊烯酮、10mg DMAP和115mg正丁酸(TokyoKasei Kogyo，B0754)溶于5.9ml二氯甲烷中。向其中加入108mgDCC，同時在冰上冷卻。反應(yīng)1小時后，通過硅膠薄層色譜法分離該反應(yīng)混合物，用氯仿作為展開溶劑。將在Rf＝0.20-0.30處的硅膠從該薄層上刮掉，并用氯仿提取，獲得了16mg二丁?；h(huán)戊烯酮。
如實施例1-(8)所述通過核磁共振對由此獲得的二丁?；h(huán)戊烯酮進行結(jié)構(gòu)分析。所得結(jié)果如下所示。
1H-NMRδ7.45(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝2.13Hz，H-3)，6.42(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝1.65Hz，H-2)，5.91(1H，m，H-4)，5.16(1H，d，J4-5＝2.64Hz，H-5).
(13)將30mg環(huán)戊烯酮、10mg DMAP和226mg正癸酸(TokyoKasei Kogyo，D0017)溶于5.9ml二氯甲烷中。向其中加入108mgDCC，同時在冰上冷卻。反應(yīng)1小時后，通過硅膠薄層色譜法分離該反應(yīng)混合物，用氯仿作為展開溶劑。將在Rf＝0.35-0.45處的硅膠從該薄層上刮掉，并用氯仿提取，獲得了35mg二癸?；h(huán)戊烯酮。
如實施例1-(8)所述通過核磁共振對由此獲得的二癸?；h(huán)戊烯酮進行結(jié)構(gòu)分析。所得結(jié)果如下所示。
1H-NMRδ7.44(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝1.97Hz，H-3)，6.42(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝1.3Hz，H-2)，5.91(1H，m，H-4)，5.15(1H，d，J4-5＝2.97Hz，H-5)，2.42(2H，t，J＝7.24Hz)，2.38(2H，t，J＝7.91Hz)，1.65(4H，m)，1.26(24H，m)，0.88(6H，t).
(14)將30mg環(huán)戊烯酮、16mg DMAP、66mg三乙胺(Tokyo KaseiKogyo，T0424)和122mg正戊酸酐(Tokyo Kasei Kogyo，V0006)溶于5.9ml二氯甲烷中。將該混合物在冰上反應(yīng)1小時。通過硅膠薄層色譜法分離該反應(yīng)混合物，用氯仿∶甲醇＝200∶1作為展開溶劑。將在Rf＝0.7-0.8處的硅膠從該薄層上刮掉，并用氯仿提取，獲得了39mg二戊酰基環(huán)戊烯酮。
如實施例1-(8)所述通過核磁共振對由此獲得的二戊?；h(huán)戊烯酮進行結(jié)構(gòu)分析。所得結(jié)果如下所示。
1H-NMRδ7.45(1H，dd，J2-3＝6.11Hz，J3-4＝1.66Hz，H-3)，6.42(1H，dd，J2-3＝6.11Hz，J3-4＝1.66Hz，H-2)，5.91(1H，m，H-4)，5.16(1H，d，J4-5＝2.97Hz，H-5)，2.43(2H，dd，J＝7.59，7.59Hz)，2.39 2H，dd，J＝7.59，7.59Hz)，1.65(4H，m)，1.38(4H，m)，0.93(6H，dd，J＝7.26，7.26Hz).
(15)將30mg環(huán)戊烯酮、16mg DMAP、66mg三乙胺和86mg丙酸酐(Tokyo Kasei Kogyo，P0513)溶于5.9ml二氯甲烷中。將該混合物在冰上反應(yīng)1小時。通過硅膠薄層色譜法分離該反應(yīng)混合物，用氯仿∶甲醇＝200∶1作為展開溶劑。將在Rf＝0.5-0.6處的硅膠從該薄層上刮掉，并用氯仿提取，獲得了31mg二丙?；h(huán)戊烯酮。
如實施例1-(8)所述通過核磁共振對由此獲得的二丙?；h(huán)戊烯酮進行結(jié)構(gòu)分析。所得結(jié)果如下所示。
1H-NMRδ7.45(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝2.15Hz，H-3)，6.42(1H，dd，J2-3＝6.27Hz，J3-4＝1.49Hz，H-2)，5.91(1H，m，H-4)，5.16(1H，d，J4-5＝2.97Hz，H-5)，2.46(2H，dd，J＝15.01，7.59Hz)，2.42(2H，dd，J＝15.01，7.59Hz)，1.18(6H，dd，J＝7.59，7.59Hz).
(16)將2g環(huán)戊烯酮、733mg DMAP、4.1ml反式-2-己烯酸(TokyoKasei Kogyo，H0383)和5.57g DCC溶于200ml二氯甲烷中。將該混合物在室溫反應(yīng)2小時。通過硅膠柱色譜法純化該反應(yīng)混合物，用己烷∶乙酸乙酯＝8∶1洗脫，獲得了在硅膠薄層色譜中僅產(chǎn)生一個點的級分。將該級分減壓濃縮，獲得了900mg二(2-己烯?；?環(huán)戊烯酮，為油狀物。
如實施例1-(8)所述通過核磁共振對由此獲得的二(2-己烯酰基)環(huán)戊烯酮進行結(jié)構(gòu)分析。所得結(jié)果如下所示。
1H-NMRδ0.92(6H，m，11-H+11′-H)，1.48(4H，m，10-H+10′-H)，2.18(4H，m，9-H，9′-H)，5.22(1H，d，J＝3.0Hz，5-H)，5.85(2H，m，7-H+7′-H)，5.98(1H，m，4-H)，6.41(1H，dd，J＝1.0，6.0 Hz，2-H)，7.04(2H，m，8-H+8′-H)，7.47(1H，dd，J＝2.0，6.0 Hz，3-H).
從羰基開始計起，連在環(huán)戊烯酮5-位上的2-己烯?；刑嫉奈恢枚x為6-位-11-位。從羰基開始計起，連在環(huán)戊烯酮4-位上的2-己烯酰基中碳的位置定義為6′-11′-位。
(17)將1.2g環(huán)戊烯酮溶于200ml二氯甲烷中。向其中加入1.7ml異丁酸酐(Nacalai Tesque)、427mg DMAP和1.46ml三乙胺(Nacalai Tesque)。將該混合物在室溫反應(yīng)1小時，并減壓濃縮。將該殘余物溶于乙酸乙酯中，并用10％檸檬酸和飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌。將該溶液減壓濃縮。通過硅膠柱色譜法純化該濃縮物，用己烷∶乙酸乙酯＝8∶1洗脫，獲得了在硅膠薄層色譜中在Rf＝0.2有一個點的級分(用己烷∶乙酸乙酯＝6∶1作為展開溶劑)。通過減壓蒸發(fā)除去該級分中的溶劑，獲得了470mg含有高純度二異丁?；h(huán)戊烯酮的油狀物。
如實施例1-(2)所述通過核磁共振對溶于重氯仿中的由此獲得的二異丁?；h(huán)戊烯酮進行結(jié)構(gòu)分析。所得結(jié)果如下所示。
1H-NMRδ1.18(12H，m，7-H，8-H，10-H，11-H)，2.61(2H，m，6-H，9-H)，5.10(1H，d，J＝3.0Hz，5-H)，5.88(1H，m，4-H)，6.39(1H，dd，J＝1.5，6.0 Hz，2-H)，7.41(1H，dd，J＝2.5，6.0Hz，3-H).
NMR結(jié)果是假定重氯仿的殘留質(zhì)子的化學(xué)位移值是7.24ppm來表示的。
二異丁?；h(huán)戊烯酮的1H-NMR光譜如附圖1所示。在附圖1中，橫軸代表化學(xué)位移值(ppm)，縱軸代表信號強度。
用于1H-NMR中信號標(biāo)識的編號如下式[III]所示。 (1 8)將1.5g環(huán)戊烯酮溶于200ml二氯甲烷中。向其中加入2.7g甲氧基乙酸(Nacalai Tesque)、794mg DMAP和5.36g二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC；Nacalai Tesque)。將該混合物在室溫反應(yīng)2小時，并減壓濃縮。將該殘余物溶于乙酸乙酯中，并用10％檸檬酸和飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌。將該溶液減壓濃縮。通過硅膠柱色譜法純化該濃縮物，用己烷∶乙酸乙酯＝2∶3洗脫，獲得了在硅膠薄層色譜中在Rf＝0.34有一個點的級分(用己烷∶乙酸乙酯＝1∶1作為展開溶劑)。通過減壓蒸發(fā)除去該級分中的溶劑，獲得了300mg含有高純度二(甲氧基乙?；?環(huán)戊烯酮的油狀物。
如實施例1-(2)所述通過核磁共振對溶于重氯仿中的由此獲得的二(甲氧基乙?；?環(huán)戊烯酮進行結(jié)構(gòu)分析。所得結(jié)果如下所示。
1H-NMRδ3.45(6H，s，7-H，9-H)，4.13(4H，m，6-H，8-H)，5.30(1H，d，J＝3.0Hz，5-H)，5.99(1H，m，4-H)，6.44(1H，dd，J＝1.5，6.5Hz，2-H)，7.46(1H，dd，J＝2.0，6.5Hz，3-H).
NMR結(jié)果是假定重氯仿的殘留質(zhì)子的化學(xué)位移值是7.24ppm來表示的。
二(甲氧基乙?；?環(huán)戊烯酮的1H-NMR光譜如附圖2所示。在附圖2中，橫軸代表化學(xué)位移值(ppm)，縱軸代表信號強度。
用于1H-NMR中信號標(biāo)識的編號如下式[IV]所示。 (19)將1.1g環(huán)戊烯酮溶于200ml二氯甲烷中。向其中加入3.4g甲基馬來酸、610mg DMAP和4.12g二環(huán)己基碳化二亞胺。將該混合物在室溫反應(yīng)2小時，并減壓濃縮。將該殘余物溶于乙酸乙酯中，并用10％檸檬酸和飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌。將該溶液減壓濃縮。通過硅膠柱色譜法純化該濃縮物，用己烷∶乙酸乙酯＝3∶2洗脫，獲得了在硅膠薄層色譜中在Rf＝0.6有一個點的級分和在Rf＝0.45有一個點的級分(用己烷∶乙酸乙酯＝1∶1作為展開溶劑)。
通過減壓蒸發(fā)除去該級分中的溶劑，由Rf＝0.6級分獲得了300mg含有高純度二(甲基富馬酰基)環(huán)戊烯酮的固體，由Rf＝0.45級分獲得了300mg含有高純度二(甲基馬來?；?環(huán)戊烯酮的油狀物。
如實施例1-(2)所述通過核磁共振對溶于重氯仿中產(chǎn)物進行結(jié)構(gòu)分析。所得結(jié)果如下所示。
1H-NMR二(甲基富馬?；?環(huán)戊烯酮δ3.80(6H，s，10-H，15-H)，5.31(1H，d，J＝3.0Hz，5-H)，6.03(1H，m，4-H)，6.48 1H，dd，J＝1.0，6.0 Hz，2-H)，6.90(4H，m，7-H，8-H，12-H，13-H)，7.50(1H，dd，J＝2.0，6.0Hz，3-H).二(甲基馬來?；?環(huán)戊烯酮
δ3.76(6H，s，10-H，15-H)，5.31(1H，d，J＝3.0Hz，5-H)，6.07(1H，m，4-H)，6.31(4H，m，7-H，8-H，12-H，13-H)，6.44(1H，dd，J＝1.5，6.0Hz，2-H)，7.58(1H，dd，J＝2.0，6.0Hz，3-H).
NMR結(jié)果是假定重氯仿的殘留質(zhì)子的化學(xué)位移值是7.24ppm來表示的。
二(甲基富馬酰基)環(huán)戊烯酮的1H-NMR光譜如附圖3所示。二(甲基馬來酰基)環(huán)戊烯酮的1H-NMR光譜如附圖4所示。在附圖3和4中，橫軸代表化學(xué)位移值(ppm)，縱軸代表信號強度。
用于二(甲基富馬?；?環(huán)戊烯酮1H-NMR中信號標(biāo)識的編號如下式[V]所示。 用于二(甲基馬來?；?環(huán)戊烯酮1H-NMR中信號標(biāo)識的編號如下式[VI]所示。 (20)將100μl1M環(huán)戊烯酮水溶液和500μl200mM谷胱甘肽(還原的；Nacalai Tesque，170-10)水溶液(pH 3.0)混合在一起。將該混合物在60℃反應(yīng)5小時。將該反應(yīng)混合物經(jīng)由0.5-μmCosmonice濾器過濾，并在下述條件下通過HPLC分離柱TSKgel 0DS-80Ts(5μm)20mm×25cm；流動相A0.1％TFA水溶液；B含有0.1％TFA/50％乙腈的水溶液；流速7.5ml/分鐘；梯度流動相A(10分鐘)→流動相A到A∶B＝1∶1(55分鐘)→A∶B＝1∶1到流動相B(15分鐘)；檢測在220nm的吸收度。
將200μl該反應(yīng)混合物進行HPLC分離。收集在保留時間35.7分鐘和36.1分鐘的峰值級分，并減壓蒸發(fā)至干，獲得了5.5mg干燥的固體。
分析該干燥固體的結(jié)構(gòu)。分別用JNM-A500(Nippon Denshi)測定核磁共振(NMR)光譜，用DX302質(zhì)譜儀(Nippon Denshi)測定質(zhì)譜(MS)，用UV-2500分光光度計(Shimadzu)測定紫外(UV)吸收光譜，用FTIR-8000PC紅外分光光度計(Shimadzu)測定紅外吸收(IR)光譜。所得結(jié)果如下所示。
1H-NMRδ2.09(2H，m，5′-H)，2.28(1H，dd，J＝13.0，20.0Hz，5-H)，2.44(2H，m，4′-H)，2.78(1H，dd，J＝8.5，14.0，1′-H)，2.85或2.89(1H，dd，J＝3.0，6.0Hz，5-H)，2.92或2.95(1H，dd，J＝1.0，5.5Hz，1′-H)，3.86(2H，S，9′-H)，3.95(2H，m，4-H，6′-H)，4.46(1H，m，2′-H)，6.47或6.49(1H，d，J＝3.0Hz，3-H).
將樣本溶于0.1N DCl在重水中的溶液。所得結(jié)果是假定HOD的化學(xué)位移值為4.65ppm來表示的。
13C-NMRδ26.3(5′-C)，31.7(4′-C)，31.9或32.1(1′-C)，39.3(4-C)，41.9(9′-C)，42.2或42.3(5-C)，53.3(6′-C)，54.1(2′-C)，133.5(3-C)，154.4(2-C)，around 173(3′-C，7′-C，8′-C，10′-C)，205.8(1-C).
將樣本溶于0.1N DCl在重水中的溶液。所得結(jié)果是假定二氧雜環(huán)己烷的化學(xué)位移值為67.4ppm來表示的。
用于1H-NMR和1C-NMR中峰標(biāo)識的編號如下式[VII]所示。 FAB-MSm/z 404(M+H)+，426(M+Na)+使用甘油作為基質(zhì)。UVλmax251nm(水)IRνKBrmaxcm-12949，1710，1660，1539，1404，1203。
依據(jù)漫反射方法進行測定。
這些結(jié)果表明，該干燥的固體是2-羥基-4-谷胱甘肽-S-基-2-環(huán)戊烯-1-酮(下文簡稱為GM)。
將稀釋至不同濃度的10μl二異丁?；h(huán)戊烯酮、二(甲氧基乙?；?環(huán)戊烯酮、二(甲基富馬?；?環(huán)戊烯酮或二(甲基馬來酰基)環(huán)戊烯酮在70％乙醇/水中的溶液加到5ml上述懸浮液中。在5％CO2存在下將該混合物在37℃培養(yǎng)24小時。使用10μl放線菌素D(Sigma)水溶液(0.5mg/ml)(誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡的已知試劑)代替樣本，將該混合物在相同條件下培養(yǎng)以證實。
用光學(xué)顯微鏡檢查培養(yǎng)的細(xì)胞。對于加入樣本和放線菌素D培養(yǎng)的細(xì)胞，觀察到細(xì)胞核縮合、細(xì)胞收縮并且形成了細(xì)胞程序死亡體。對于加入10μl70％乙醇水溶液培養(yǎng)的對照細(xì)胞，沒有觀察到任何這種現(xiàn)象。
此外，用0.4％臺盼藍將一部分如上所述培養(yǎng)的細(xì)胞染色，并在光學(xué)顯微鏡下檢查。計數(shù)沒有被染色的活細(xì)胞數(shù)目和被染成藍色的死亡細(xì)胞的數(shù)目。確定導(dǎo)致50％存活率的各樣本的濃度(存活50(μM))。
表1

如上所述，每一種化合物都表現(xiàn)出抗腫瘤細(xì)胞的抗增殖活性和誘導(dǎo)細(xì)胞程序死亡的活性。此外，各化合物的旋光異構(gòu)體和其鹽表現(xiàn)出類似活性。
實施例3(1)將2μl拓?fù)洚悩?gòu)酶II(TopoGEN；2單位/ul)、2μl10倍濃縮緩沖液
、2μl 1％牛血清白蛋白(TakaraShuzo)、11μl蒸餾水和2μl蒸餾水(對照)或2μl不同濃度的二丙?；h(huán)戊烯酮、二異丁酰基環(huán)戊烯酮、二苯甲?；h(huán)戊烯酮、二己?；h(huán)戊烯酮、二(2-己烯?；?環(huán)戊烯酮、二(甲氧基乙?；?環(huán)戊烯酮、二(甲基富馬酰基)環(huán)戊烯酮或二(甲基馬來?；?環(huán)戊烯酮水溶液混合在一起。向其中加入1μl0.25μg/μlpBR322 DNA(TakaraShuzo)。將所得混合物在37℃反應(yīng)。反應(yīng)30分鐘后，向其中加入2μl含有1％十二烷基硫酸鈉、50％甘油和0.02％溴酚藍的水溶液以終止反應(yīng)。
將20μl反應(yīng)混合物施加到1％用瓊脂糖L03(Takara Shuzo)和TAE緩沖液[40mM Tris，5mM乙酸鈉，1mM乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)；用乙酸調(diào)節(jié)至pH 7.8]制備的瓊脂糖凝膠上，并在TAE緩沖液中電泳。電泳后，將凝膠浸泡在1μg/ml溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓水溶液中。將凝膠置于紫外線下，以顯形DNA的電泳模式。對于加入水的對照，DNA形狀從超螺旋型完全改轉(zhuǎn)變成松弛型，而如果拓?fù)洚悩?gòu)酶II的活性被抑制的話，則從超螺旋型到松弛型的轉(zhuǎn)變被部分或完全抑制。
結(jié)果是，對于加入水的對照，DNA形狀從超螺旋型完全改轉(zhuǎn)變成松弛型。另一方面，DNA形狀從超螺旋型到松弛型的轉(zhuǎn)變被下述濃度的化合物部分抑制或完全抑制濃度為0.1μM或更高的二丙?；h(huán)戊烯酮、濃度為1μM或更高的二異丁酰基環(huán)戊烯酮、濃度為1μM或更高的二苯甲酰基環(huán)戊烯酮、濃度為10μM或更高的二己?；h(huán)戊烯酮、濃度為10μM或更高的二(2-己烯?；?環(huán)戊烯酮、濃度為50μM或更高的二(甲氧基乙?；?環(huán)戊烯酮、濃度為10μM或更高的二(甲基富馬?；?環(huán)戊烯酮、或濃度為5μM或更高的二(甲基馬來?；?環(huán)戊烯酮，這證實了各環(huán)戊烯酮衍生物抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶II的活性。
(2)如實施例3-(1)所述測定各環(huán)戊烯酮衍生物抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I的活性，只是使用拓?fù)洚悩?gòu)酶I(TopoGEN；0.01單位/ul)代替拓?fù)洚悩?gòu)酶II，并使用含有100mM Tris-HCl(pH 7.9)，10mM EDTA，1mM亞精胺和50％甘油的溶液作為10倍濃縮緩沖液。
結(jié)果是，對于加入水的對照，DNA形狀從超螺旋型完全改轉(zhuǎn)變成松弛型。另一方面，DNA形狀從超螺旋型到松弛型的轉(zhuǎn)變被下述濃度的化合物部分抑制或完全抑制濃度為1000μM或更高的二丙?；h(huán)戊烯酮、濃度為500μM或更高的二異丁酰基環(huán)戊烯酮、濃度為50μM或更高的二苯甲酰基環(huán)戊烯酮、濃度為1000μM或更高的二己?；h(huán)戊烯酮、濃度為500μM或更高的二(2-己烯?；?環(huán)戊烯酮、濃度為1000μM或更高的二(甲氧基乙酰基)環(huán)戊烯酮、濃度為1000μM或更高的二(甲基富馬?；?環(huán)戊烯酮、或濃度為1000μM或更高的二(甲基馬來?；?環(huán)戊烯酮，這證實了各環(huán)戊烯酮衍生物抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I的活性。
如上所述，上述每一種環(huán)戊烯酮衍生物以及在實施例1中描述的其它環(huán)戊烯酮衍生物都表現(xiàn)出抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶II的活性。在正常細(xì)胞中，拓?fù)洚悩?gòu)酶II僅在分裂期間短暫表達，而當(dāng)細(xì)胞癌變時，它在整個細(xì)胞周期都高度表達。這些環(huán)戊烯酮衍生物對拓?fù)洚悩?gòu)酶II的抑制活性比對拓?fù)洚悩?gòu)酶I(在癌變時拓?fù)洚悩?gòu)酶I的表達水平或活性增加)的抑制活性強。
此外，各化合物的旋光異構(gòu)體或其鹽也表現(xiàn)出對拓?fù)洚悩?gòu)酶II有特異性的類似活性。
實施例4(1)將含有10％胎牛血清和濃度為2×105個細(xì)胞/ml的HL-60(ATCC CCL-240)細(xì)胞的5ml RPMI 1640培養(yǎng)基置于6-孔板的各個孔中。將該6-孔板在在5％CO2存在下于37℃培養(yǎng)24小時。然后向其中加入終濃度為0、0.63、1.3、2.5、5、10或20μM的二丙酰基環(huán)戊烯酮、二異丁?；h(huán)戊烯酮或二(2-己烯?；?環(huán)戊烯酮。繼續(xù)培養(yǎng)6小時。
培養(yǎng)后，計數(shù)細(xì)胞數(shù)目。通過離心收獲細(xì)胞，用PBS洗滌，以制備用一種樣本處理的細(xì)胞。還制備在45℃加熱10分鐘后以相同方式培養(yǎng)的細(xì)胞。
依據(jù)在Molecular Cloning[Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)]中描述的方法將這些處理的細(xì)胞進行SDS-PAGE。將處理的細(xì)胞以2.5×106個細(xì)胞/ml的濃度懸浮在SDS-PAGE緩沖液中。將細(xì)胞懸浮液在100℃處理10分鐘。將5μl每一細(xì)胞懸浮液施加到兩個SDS-PAGE凝膠(5％堆積凝膠，10％分離凝膠)上，并進行電泳。將其中一個凝膠進行考馬斯染色。把另一凝膠點在聚二氟乙烯遷移膜(ImmobilomTM，Millipore，Cat.#IPVH000-10)上。用Block Ace(Dainippon Pharmaceutical，Cat.#UK-B25)將該膜在4℃阻斷。
將該阻斷的膜與單克隆抗體HSP72/73(Ab-1)(Oncogene ResearchProducts，Cat.#HSP01)反應(yīng)，其中該單克隆抗體能特異性地與熱-誘導(dǎo)70-kDa熱激蛋白反應(yīng)。用含有0.05％吐溫20的TBS洗滌該膜，然后用TBS洗滌。之后將該膜與綴合有過氧化物酶的第二抗體HRP-兔抗-小鼠IgG(H+L)(Zymed Laboratories，Inc.，Cat.#61-6520)反應(yīng)，然后如上所述進行洗滌。將與第一和第二抗體反應(yīng)過的該膜與致化學(xué)發(fā)光試劑RenaissanceTM(Dupont NEN，Cat.#NEL-100)反應(yīng)。然后將該膜露置于X-射線底片上以證實誘導(dǎo)70-kDa熱激蛋白。
結(jié)果觀察到了熱激蛋白。誘導(dǎo)程度如表2所示。在表2中，+代表誘導(dǎo)水平。+的增加數(shù)目表示增加的誘導(dǎo)。-表示沒有觀察到任何誘導(dǎo)。±表示觀察到輕微誘導(dǎo)。
表2

未處理對照的結(jié)果是-，在45℃加熱10分鐘后培養(yǎng)的細(xì)胞的結(jié)果是++。如上所述，每一化合物都在較低濃度下表現(xiàn)出誘導(dǎo)熱激蛋白的活性。此外，各化合物的旋光異構(gòu)體及其鹽表現(xiàn)出類似活性。另外，其它環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體或其鹽表現(xiàn)出類似活性。
實施例5使用二丙?；h(huán)戊烯酮、二異丁酰基環(huán)戊烯酮和二(2-己烯?；?環(huán)戊烯酮來測定它們抗白色念珠菌(Candida albicans)TIMM0136的抗真菌活性。
將白色念珠菌細(xì)胞在含有0.67％Yeast Nitrogen Base(Difco)和1.0％葡萄糖的YNBG培養(yǎng)基中培養(yǎng)(接種培養(yǎng))。然后用新鮮的Yeast Nitrogen Base培養(yǎng)基將該培養(yǎng)物稀釋至濃度為1×106個細(xì)胞/ml 。將100μl該稀釋液分散到96孔微量滴定板的每一孔中。
將10μl二丙?；h(huán)戊烯酮、二異丁酰基環(huán)戊烯酮或二(2-己烯?；?環(huán)戊烯酮在70％乙醇中的溶液以100μg/ml或500μg/ml的濃度加到孔中，或者將10μl 70％乙醇溶液加到孔中。將該微量滴定板在不振搖的情況下于30℃培養(yǎng)48小時(主要培養(yǎng))。
二丙酰基環(huán)戊烯酮、二異丁酰基環(huán)戊烯酮和二(2-己烯?；?環(huán)戊烯酮以500μg/ml的濃度抑制了白色念珠菌的生長。每一種化合物的最小生長抑制濃度都是500μg/ml。因此，這些化合物可用作抗真菌組合物的活性組分。此外，這些環(huán)戊烯酮衍生物的旋光異構(gòu)體和其鹽表現(xiàn)出類似活性。
實施例6將人血管內(nèi)皮細(xì)胞(Sanko Junyaku出售)以1×105個細(xì)胞/ml的濃度懸浮在含有10％FCS(HyClone)的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco)中。將該懸浮液以100μl/孔的量接種到96孔微量滴定板中。
在5％CO2恒溫箱中于37℃培養(yǎng)2天后，將100U/ml人重組TNF-α(Promega)加到單層血管內(nèi)皮細(xì)胞中。將該微量滴定板在5％CO2恒溫箱中于37℃培養(yǎng)6小時，以制備用TNF-α刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞。
另一方面，將環(huán)戊烯酮、GM或二丙酰基環(huán)戊烯酮以不同濃度加到以1×106個細(xì)胞/ml的濃度懸浮在含有10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基中的HL-60細(xì)胞中。將細(xì)胞在5％CO2恒溫箱中于37℃培養(yǎng)3小時。培養(yǎng)后，向其中加入熒光劑5-羧基熒光素二乙酸酯、6-羧基熒光素二乙酸酯、琥珀酰亞胺酯(Molecular Probe)，并在37℃反應(yīng)10分鐘。將細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌2次，并懸浮在含有10％FSC的RPMI-1640培養(yǎng)基中。
將熒光標(biāo)記的HL-60細(xì)胞以100μl/ml的量鋪在用TNF-α刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞上。向其中以不同濃度加入環(huán)戊烯酮、GM或二丙?；h(huán)戊烯酮。將該微量滴定板在5％CO2恒溫箱中于37℃培養(yǎng)20分鐘，以使血管內(nèi)皮細(xì)胞與HL-60細(xì)胞之間發(fā)生粘著反應(yīng)。
粘著反應(yīng)后，洗滌該板以除去未粘著的細(xì)胞。向其中加入1％Triton X(Nacalai Tesque)以破壞粘著的細(xì)胞。用濾器測定在485/22nm(激發(fā))和530/25nm(發(fā)射)的熒光強度。
將1×105個熒光標(biāo)記細(xì)胞的熒光強度定義為100％，來確定代表與血管內(nèi)皮細(xì)胞粘著的細(xì)胞比率的粘著比率。
結(jié)果如表3所示。當(dāng)用TNF-α刺激時，血管內(nèi)皮細(xì)胞與HL-60粘著的比率增加了。環(huán)戊烯酮、GM或二丙酰基環(huán)戊烯酮在10-7-10-4M濃度范圍內(nèi)以劑量依賴方式抑制了該增加。因此，環(huán)戊烯酮、GM和二丙?；h(huán)戊烯酮都抑制了癌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的粘著，這是抑制癌轉(zhuǎn)移所必需的。此外，各化合物的旋光異構(gòu)體和其鹽表現(xiàn)出類似活性。
另外，其它環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體或其鹽也表現(xiàn)出類似活性。
表3

實施例7將購自Japan SLC的ddY小鼠(雌性，7周大小)在用于實驗前預(yù)飼養(yǎng)1周。
將1×106個Ehrlich腹水癌細(xì)胞腹膜內(nèi)接種到每一小鼠中。在接種后這天給小鼠腹膜內(nèi)施用10mg/kg環(huán)戊烯酮、30mg/kg GM或10mg/kg二丙?；h(huán)戊烯酮。給對照小鼠施用鹽水。
用癌細(xì)胞接種10天后，從小鼠中取出脾臟，細(xì)細(xì)地切碎，并懸浮在含有10％FCS(HyClone)的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco)中，以獲得一個細(xì)胞懸浮液。除去細(xì)胞懸浮液中粘著在塑料陪替氏培養(yǎng)皿上的粘著細(xì)胞，將未粘著細(xì)胞用作脾臟淋巴細(xì)胞。
將脾臟淋巴細(xì)胞以2×106/ml的濃度懸浮在含有10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基中。將該懸浮液以100μl/孔的量接種到微量滴定板中。
如下所述制備受刺激細(xì)胞。將絲裂霉素C(Kyowa Hakko Kogyo)以50μg/ml的濃度加到以2×106個細(xì)胞/ml的濃度懸浮在RPMI-1640培養(yǎng)基中的Ehrlich腹水癌細(xì)胞中。將細(xì)胞在37℃處理30分鐘，洗滌2次，然后懸浮在含有10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，以制備濃度為2×106個細(xì)胞/ml的受刺激細(xì)胞。
將100μl由此制得的受刺激細(xì)胞鋪在已經(jīng)加入100μl/孔脾臟淋巴細(xì)胞的微量滴定板的每一孔上。將該板在5％CO2恒溫箱中于37℃培養(yǎng)5天。在培養(yǎng)結(jié)束的前一天，向孔中加入37 kBq3H-胸腺嘧啶脫氧核苷(Daiichi Pure Chemicals)以脈沖標(biāo)記細(xì)胞。培養(yǎng)結(jié)束后，將細(xì)胞收獲到玻璃濾器上，以測定放射性。
所得結(jié)果如表4所示。通過用癌細(xì)胞刺激，顯著地促進了從施用環(huán)戊烯酮、GM或二丙?；h(huán)戊烯酮的小鼠中獲得的脾臟淋巴細(xì)胞的生長，這意味著誘導(dǎo)了淋巴細(xì)胞與癌細(xì)胞的特異性反應(yīng)。此外，各化合物的旋光異構(gòu)體及其鹽表現(xiàn)出類似活性。
另外，其它環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體或其鹽也表現(xiàn)出類似活性。
表4

實施例8將購自Japan SLC的ddY小鼠(雌性，7周大小)在用于實驗前預(yù)飼養(yǎng)1周。
將1×106個Ehrlich腹水癌細(xì)胞腹膜內(nèi)接種到每一小鼠中。在接種后這天給小鼠腹膜內(nèi)施用10mg/kg環(huán)戊烯酮、30mg/kg GM或10mg/kg二丙?；h(huán)戊烯酮。給對照小鼠施用鹽水。
用癌細(xì)胞接種10天后，從小鼠中取出脾臟，細(xì)細(xì)地切碎，并懸浮在含有10％FCS(HyClone)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，以獲得一個細(xì)胞懸浮液。除去細(xì)胞懸浮液中粘著在塑料陪替氏培養(yǎng)皿上的粘著細(xì)胞，將未粘著細(xì)胞用作NK細(xì)胞。
將NK細(xì)胞以6×106/ml的濃度懸浮在含有10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基中。將該懸浮液以100μl/孔的量接種到微量滴定板中。
如下所述制備靶細(xì)胞。將3700 kBq51Cr(Amersham)加到1×106YAC-1細(xì)胞(Dainippon Pharmaceutical)中。將細(xì)胞在37℃培養(yǎng)1小時以進行標(biāo)記。將標(biāo)記的細(xì)胞洗滌2次，并以2×105/ml的濃度懸浮在含有10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基中。
將100μl由此制得的靶細(xì)胞鋪在已經(jīng)加入NK細(xì)胞的微量滴定板的每一孔上。將該板在5％CO2恒溫箱中于37℃培養(yǎng)5小時。培養(yǎng)后，將該板以1500rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘。把100μl上清液收集在γ計數(shù)器管中。用自動γ計數(shù)器測定放射性(實驗值)。
將100μl培養(yǎng)基加到反應(yīng)系統(tǒng)中以代替NK細(xì)胞，測定放射性，以測定出從靶細(xì)胞自動釋放出的放射性(對照值)。
此外，當(dāng)把1％Triton(Nacalai Tesque)加到反應(yīng)系統(tǒng)中以溶解51Cr標(biāo)記的YAC-1細(xì)胞時，測定釋放到上清液中的放射性，以測定出反應(yīng)系統(tǒng)中包含的總放射性(總放射性值)。
依據(jù)下述方程可確定由NK細(xì)胞特異性介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(％)。細(xì)胞毒性(％)＝[(實驗值-對照值)/(總放射性值-對照值)]×100結(jié)果如表5所示。在施用環(huán)戊烯酮、GM或二丙酰基環(huán)戊烯酮的小鼠中觀察到了NK細(xì)胞的激活。施用這些化合物增強了活體中的免疫保護機制和抗癌細(xì)胞的細(xì)胞毒害活性。此外，各化合物的旋光異構(gòu)體及其鹽表現(xiàn)出類似活性。
另外，其它環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體或其鹽也表現(xiàn)出類似活性。
表5

實施例9從Seac Yoshitomi購買Lewis大鼠(雄性，9周大小，體重約為250g)。
在開始實驗前將大鼠禁食18小時。將溶于橄欖油(NacalaiTesque)中的二丙酰基環(huán)戊烯酮、二己酰基環(huán)戊烯酮、二(2-己烯酰基)環(huán)戊烯酮、二異丁酰基環(huán)戊烯酮或二苯甲?；h(huán)戊烯酮以1或10mg/10ml/kg的劑量對大鼠(每組4只)口服給藥。
施用測試物0.5小時后，將100μl 1％λ-角叉菜膠(Wako PureChemical)在鹽水(Otsuka Pharmaceutical)中的懸浮液注射到大鼠右爪的足底內(nèi)，以誘導(dǎo)足水腫。注射角叉菜膠3小時后，用測定足體積的裝置(Ugo Basile)測定大鼠右足的體積。測定結(jié)果以增加比率表示，其中增加比率是基于施用角叉菜膠前測定的每只大鼠右足體積計算的。
所得結(jié)果如附圖5所示。附圖5表示的是環(huán)戊烯酮衍生物的給藥量與足水腫增大比率之間的關(guān)系。橫軸代表劑量(mg/ml)，縱軸代表增大比率(％)。
當(dāng)以1mg/kg的劑量施用二丙?；h(huán)戊烯酮時，觀察到了抑制足水腫的趨勢。以10mg/kg的劑量施用導(dǎo)致了顯著抑制。以1或10mg/kg的劑量施用二己酰基環(huán)戊烯酮或二(2-己烯?；?環(huán)戊烯酮導(dǎo)致了顯著抑制。當(dāng)以1mg/kg的劑量施用二異丁?；h(huán)戊烯酮或二苯甲酰基環(huán)戊烯酮時，觀察到了抑制足水腫的趨勢。以10mg/kg的劑量施用導(dǎo)致了顯著抑制。此外，各化合物的旋光異構(gòu)體及其鹽表現(xiàn)出類似活性。
另外，其它環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體或其鹽也表現(xiàn)出類似活性。
在附圖5中，標(biāo)記*和**分別代表與對照組相比p＜0.05和p＜0.01的顯著性差異。
實施例10從Japan SLC購買C57BL/6小鼠(雄性，7周大小，體重約為25g)，并在實驗前預(yù)飼養(yǎng)1周。
用鹽水(Otsuka Pharmaceutical)將用作提高抗原的綿羊紅細(xì)胞(Shimizu Laboratory Supplies)洗滌3次，并將其以1×109個細(xì)胞/ml的濃度懸浮在鹽水中。將200μl該懸浮液腹膜內(nèi)注射到小鼠體內(nèi)以用抗原致敏。致敏5天后，將40μl類似制得的抗原注射到右爪的足底內(nèi)，以進行抗原誘導(dǎo)來誘使足水腫。
從用抗原致敏當(dāng)天開始，將溶于鹽水中的二丙?；h(huán)戊烯酮以不同濃度對小鼠(每組5只)腹膜內(nèi)給藥或口服給藥，每天給藥一次，給藥3天?？乖T導(dǎo)2天后，用測定足體積的裝置(Ugo Basile)測定大鼠右足的體積，并用作DTH的指數(shù)。測定結(jié)果以增加比率表示，其中增加比率是依據(jù)下述公式基于抗原誘導(dǎo)前測定的每只大鼠右足體積計算的。增加比率＝(抗原誘導(dǎo)后右足體積-抗原誘導(dǎo)前右足體積)/抗原誘導(dǎo)前右足體積所得結(jié)果如附圖6所示。在附圖6中，縱軸代表抗原誘導(dǎo)所致的足體積增加比率(％)。當(dāng)以1mg/kg的劑量腹膜內(nèi)施用二丙?；h(huán)戊烯酮時，觀察到了抑制足水腫的趨勢。以10mg/kg的劑量腹膜內(nèi)給藥或者以30mg/kg的劑量口服給藥導(dǎo)致了顯著抑制。此外，該環(huán)戊烯酮衍生物的旋光異構(gòu)體及其鹽表現(xiàn)出類似活性。
另外，其它環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體或其鹽也表現(xiàn)出類似活性。
在附圖6中，標(biāo)記*和**分別代表與對照組相比p＜0.05和p＜0.01的顯著性差異。
實施例11(1)從ddY小鼠(雄性，7周大小，購自Japan SLC)中取出脾臟，細(xì)細(xì)地切碎，并懸浮在含有10％FCS(HyClone)的RPMI-1640培養(yǎng)基中，以獲得一個細(xì)胞懸浮液。將該細(xì)胞懸浮液接種到塑料陪替氏培養(yǎng)皿中，并在CO2恒溫箱中于37℃培養(yǎng)2小時，以除去粘著在培養(yǎng)皿上的粘著細(xì)胞。將未粘著細(xì)胞用作脾臟淋巴細(xì)胞。將200μl該脾臟淋巴細(xì)胞懸浮液以2×106/ml的細(xì)胞濃度接種到96孔微量滴定板的每一孔中。向除了對照孔以外的每一孔中都加入不同濃度的二丙?；h(huán)戊烯酮。此外，向每一孔中加入5μgCon A(Nacalai Tesque)。將該板在CO2恒溫箱中于37℃培養(yǎng)1天。培養(yǎng)后，向每一孔中加入1μCi3H-胸腺嘧啶脫氧核苷。再培養(yǎng)1天后，用液體閃爍計數(shù)器測定攝取到細(xì)胞內(nèi)的3H-胸腺嘧啶脫氧核苷的量。
結(jié)果如附圖7所示。附圖7表示的是二丙酰基環(huán)戊烯酮的濃度與3H-胸腺嘧啶脫氧核苷攝取量之間的關(guān)系。橫軸代表二丙酰基環(huán)戊烯酮的濃度(μM)，縱軸代表3H-胸腺嘧啶脫氧核苷攝取量(CPM)。中空棒代表沒有刺激時3H-胸腺嘧啶脫氧核苷攝取量。陰影棒代表當(dāng)用Con A刺激細(xì)胞時3H-胸腺嘧啶脫氧核苷攝取量。從附圖7中可知，二丙?；h(huán)戊烯酮以劑量依賴方式表現(xiàn)出抗由促細(xì)胞分裂劑刺激的小鼠淋巴細(xì)胞增殖的抑制活性。在10μM濃度時，增殖幾乎被完全抑制。此外，該環(huán)戊烯酮衍生物的旋光異構(gòu)體及其鹽表現(xiàn)出類似活性。
另外，其它環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體或其鹽也表現(xiàn)出類似活性。
(2)從BALB/c小鼠(雄性，6周大小，購自Japan SLC)和C57BL/6小鼠(雄性，6周大小，購自Japan SLC)中取出脾臟，并依據(jù)如實施例11-(1)所述的方法制得脾臟淋巴細(xì)胞。將每一細(xì)胞懸浮液的濃度調(diào)節(jié)至2×106個細(xì)胞/ml，從各懸浮液中取出100μl并混合在一起，接種到96孔微量滴定板中。向除了對照孔以外的每一孔中都加入不同濃度的二丙酰基環(huán)戊烯酮，并將該板在CO2恒溫箱中于37℃培養(yǎng)4天。培養(yǎng)后，向每一孔中加入1μCi3H-胸腺嘧啶脫氧核苷，將該板再培養(yǎng)1天。用液體閃爍計數(shù)器測定攝取到細(xì)胞內(nèi)的3H-胸腺嘧啶脫氧核苷的量。
結(jié)果如附圖8所示。附圖8表示的是二丙酰基環(huán)戊烯酮的濃度與3H-胸腺嘧啶脫氧核苷攝取量之間的關(guān)系。橫軸代表二丙?；h(huán)戊烯酮的濃度(μM)，縱軸代表3H-胸腺嘧啶脫氧核苷攝取量(CPM)。中空棒代表當(dāng)取自其中一個細(xì)胞系的細(xì)胞獨立地使用時3H-胸腺嘧啶脫氧核苷攝取量。陰影棒代表當(dāng)取自兩個細(xì)胞系的細(xì)胞混合在一起時3H-胸腺嘧啶脫氧核苷攝取量。從附圖8中可知，二丙酰基環(huán)戊烯酮以劑量依賴方式表現(xiàn)出抗由同種抗原刺激的淋巴細(xì)胞激活的抑制活性。在1μM濃度時，該反應(yīng)幾乎被完全抑制。此外，該環(huán)戊烯酮衍生物的旋光異構(gòu)體及其鹽表現(xiàn)出類似活性。
另外，其它環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體或其鹽也表現(xiàn)出類似活性。
實施例12(1)用CDF1小鼠(8周大小，雌性，購自Japan SLC)建立敗血癥性休克模型。用蒸餾水(對照)、或10mg/kg二丙酰基環(huán)戊烯酮或二異丁?；h(huán)戊烯酮對小鼠皮下給藥。給藥30分鐘后，給每一小鼠腹膜內(nèi)施用20μg脂多糖(LPS；Sigma)。施用LPS 1.5小時后，從小鼠中采集血樣。使用市售ELISA用具(R&D)測定從采集的血樣分離出的血清中腫瘤壞死因子(TNF)-α的量。每組由4只小鼠構(gòu)成。
所得結(jié)果如表6所示。
表6

與施用蒸餾水的對照組相比，在施用10mg/kg二異丙酰基環(huán)戊烯酮或二異丁?；h(huán)戊烯酮的組中，TNF-α的生成被顯著抑制了。在表6中，標(biāo)記**和***分別代表與對照組相比p＜0.01和p＜0.001的顯著性差異。此外，該環(huán)戊烯酮衍生物的旋光異構(gòu)體及其鹽表現(xiàn)出類似活性。
另外，其它環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體或其鹽也表現(xiàn)出類似活性。
(2)通過給CDF1小鼠(8周大小，雌性)腹膜內(nèi)施用20μg LPS來建立敗血癥性休克模型。施用LPS前30分鐘，口服施用30或100mg/kg二丙?；h(huán)戊烯酮或二異丁?；h(huán)戊烯酮。施用LPS1.5小時后，從小鼠中采集血樣。使用市售ELISA用具測定從采集的血樣分離出的血清中TNF-α的量。每組由4只小鼠構(gòu)成。
所得結(jié)果如表7所示。與對照組相比，口服施用二丙?；h(huán)戊烯酮或二異丁?；h(huán)戊烯酮以劑量依賴方式抑制了TNF的生成。此外，該環(huán)戊烯酮衍生物的旋光異構(gòu)體及其鹽表現(xiàn)出類似活性。
另外，其它環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體或其鹽也表現(xiàn)出類似活性。
表7

*，**p＜0.05，0.01與對照比較實施例13(1)給7周大小的雌性DBA/2小鼠腹膜內(nèi)施用小鼠白血病P-388(1.1×106個細(xì)胞/小鼠)。施用后立即腹膜內(nèi)給予單次劑量的10mg/kg二丙?；h(huán)戊烯酮。另一方面，以類似方式給對照組腹膜內(nèi)施用鹽水。計算分別由8只小鼠構(gòu)成的2個組中的小鼠存活數(shù)目、平均存活天數(shù)和存活延長比率。
結(jié)果是，對于對照組，平均存活天數(shù)是10.1天。對于施用二丙酰基環(huán)戊烯酮的這一組，平均存活天數(shù)是13.9天。計算的存活延長比率為137.0％。因此，觀察到了顯著的存活延長作用。
以類似方式使用Meth A腫瘤細(xì)胞系統(tǒng)BALB/c小鼠進行測試。結(jié)果是，對于對照組，平均存活天數(shù)是13.4天。對于施用二丙酰基環(huán)戊烯酮的這一組，平均存活天數(shù)是16.9天。計算的存活延長比率為126.2％，這表明具有顯著的存活延長作用。
此外，該環(huán)戊烯酮衍生物的旋光異構(gòu)體及其鹽表現(xiàn)出類似活性。
另外，其它環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體或其鹽也表現(xiàn)出類似活性。
(2)將小鼠實體瘤Meth A(2×106個細(xì)胞/小鼠)皮下注射到8周大小的雌性BALB/c小鼠的背部內(nèi)。然后，在同一位點皮下注射二丙?；h(huán)戊烯酮，連續(xù)注射5天。以類似方式給對照組小鼠皮下注射鹽水。每組由8只小鼠構(gòu)成。
2周后，取出在小鼠背部形成的癌變組織，并測定該組織的重量。
結(jié)果如表8所示。對于對照組，癌變組織的平均重量為0.61g。對于施用二丙?；h(huán)戊烯酮的組，癌變組織的平均重量為0.05g。計算的抑制比率為92.3％。在施用二丙?；h(huán)戊烯酮這一組的8只小鼠當(dāng)中，有5只沒有形成癌變組織。此外，該環(huán)戊烯酮衍生物的旋光異構(gòu)體及其鹽表現(xiàn)出類似活性。
另外，其它環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體或其鹽也表現(xiàn)出類似活性。
表8

(3)使用兩種類型癌細(xì)胞-Ehrlich腹水癌(EAC)和Meth A測定二丙?；h(huán)戊烯酮和二異丁?；h(huán)戊烯酮抗不同腹水癌的制癌活性，其中測試物是以不同劑量腹膜內(nèi)給藥或口服給藥。腹膜內(nèi)移植的細(xì)胞數(shù)量和宿主動物如表9所示。
表9

從移植癌細(xì)胞后的這天開始，將二丙?；h(huán)戊烯酮或二異丁?；h(huán)戊烯酮腹膜內(nèi)給藥或口服給藥，連續(xù)給藥5天。以類似方式用可注射蒸餾水給對照組給藥。計算由8只小鼠構(gòu)成的每組的平均存活天數(shù)、存活延長比率、和存活30天的數(shù)目。
所得結(jié)果如表10-13所示。表10表示的是當(dāng)把各測試物對移植EAC的小鼠腹膜內(nèi)給藥時的存活延長作用。表11表示的是當(dāng)把各測試物對移植Meth A的小鼠腹膜內(nèi)給藥時的存活延長作用。表12表示的是當(dāng)把各測試物對移植EAC的小鼠口服給藥時的存活延長作用。表13表示的是當(dāng)把各測試物對移植Meth A的小鼠口服給藥時的存活延長作用。
二丙?；h(huán)戊烯酮和二異丁?；h(huán)戊烯酮在移植EAC的小鼠中表現(xiàn)出優(yōu)良的存活延長作用。尤其是，在兩個腹膜內(nèi)給藥組中都觀察到了存活30天的小鼠。二丙酰基環(huán)戊烯酮甚至在口服給藥時也表現(xiàn)出很強的作用。
此外，在通過對移植Meth A的小鼠腹膜內(nèi)給藥來治療的組中也觀察到了存活延長作用。在口服給藥二丙?；h(huán)戊烯酮的組中觀察到了存活30天的小鼠。
此外，該環(huán)戊烯酮衍生物的旋光異構(gòu)體及其鹽表現(xiàn)出類似活性。
另外，其它環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體或其鹽也表現(xiàn)出類似活性。
表10

表11

表12

表13

實施例14注射劑(1)將二異丁?；h(huán)戊烯酮、二丙酰基環(huán)戊烯酮或二甲氧基環(huán)戊烯酮以1％的濃度加到鹽水中，以制備注射劑。
(2)將二(甲基富馬?；?環(huán)戊烯酮或二(甲基馬來?；?環(huán)戊烯酮和甘草酸分別以0.5％和0.1％的濃度加到鹽水中，以制備注射劑。
實施例15片劑(1)制備每片含有100mg二異丁?；h(huán)戊烯酮或二丙?；h(huán)戊烯酮和適量微晶纖維素的片劑，并進行糖包衣。
(2)制備每片含有0.1mg二(甲基富馬?；?環(huán)戊烯酮、10mg甘草酸二鉀鹽和適量微晶纖維素的片劑，并進行糖包衣。
如上所述，本發(fā)明提供了具有生理活性，例如免疫調(diào)節(jié)活性、抗炎活性、抑制腫瘤壞死因子生成的活性、和抗真菌活性的環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體或其鹽。含有這些化合物作為其活性組分的藥物組合物可用于維持活體內(nèi)的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，和用作用于治療或預(yù)防下述疾病的藥物組合物對于其治療或預(yù)防需要免疫調(diào)節(jié)的疾病，對于其治療或預(yù)防需要抑制炎癥的疾病，對于其治療或預(yù)防需要抑制腫瘤壞死因子生成的疾病，對于其治療或預(yù)防需要抑制病理性微生物的疾病等。
權(quán)利要求
1.藥物組合物，其中包含至少一種選自式[I]環(huán)戊烯酮衍生物或其旋光異構(gòu)體和其鹽的化合物作為活性組分 其中R1和R2彼此之間可相同或不同，并且是氫、脂族基、芳基、或芳脂族基，所述組合物可用于治療或預(yù)防下述疾病對于其治療或預(yù)防需要免疫調(diào)節(jié)的疾病，對于其治療或預(yù)防需要抑制炎癥的疾病，對于其治療或預(yù)防需要抑制腫瘤壞死因子生成的疾病，對于其治療或預(yù)防需要抑制真菌的疾病，對于其治療或預(yù)防需要抑制細(xì)胞粘著的疾病，或者對于其治療或預(yù)防需要誘導(dǎo)熱激蛋白的疾病。
2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中R1和R2彼此之間可相同或不同，并且是氫、直鏈或支鏈C1-30烷基、直鏈或支鏈C2-30鏈烯基、C6-10芳基、和C1-30烷基C6-10芳基，所述基團可任選被至少一個選自下述基團的取代基取代C1-30烷基、C1-4烷氧基、C2-5烷氧基羰基、氨基、硝基、氧代基、羥基、硫羥基、硫酸根和鹵素。
3.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述式[I]環(huán)戊烯酮衍生物是二乙酰基環(huán)戊烯酮、二丙?；h(huán)戊烯酮、二丁?；h(huán)戊烯酮、二異丁酰基環(huán)戊烯酮、二戊?；h(huán)戊烯酮、二己?；h(huán)戊烯酮、二辛?；h(huán)戊烯酮、二癸?；h(huán)戊烯酮、二肉豆蔻酰基環(huán)戊烯酮、二(甲氧基乙?；?環(huán)戊烯酮、二(甲基富馬?；?環(huán)戊烯酮、二(甲基馬來?；?環(huán)戊烯酮、二(2-己烯?；?環(huán)戊烯酮、二(3-辛烯?；?環(huán)戊烯酮、或二苯甲?；h(huán)戊烯酮。
4.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述組合物是免疫調(diào)節(jié)組合物、抗炎組合物、用于抑制腫瘤壞死因子生成的組合物、抗真菌組合物、用于抑制細(xì)胞粘著的組合物、或用于誘導(dǎo)熱激蛋白的組合物。
全文摘要
用于治療或預(yù)防需要免疫調(diào)節(jié)的疾病、需要抑制炎癥的疾病、需要調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子生成的疾病、需要調(diào)節(jié)真菌生長的疾病、需要調(diào)節(jié)細(xì)胞粘著的疾病、或需要誘導(dǎo)熱激蛋白的疾病的治療劑或預(yù)防劑,其中包含至少一種選自通式[Ⅰ]環(huán)戊烯酮衍生物、其旋光異構(gòu)體和其鹽的化合物作為活性組分,其中R
文檔編號A61K31/215GK1323204SQ99812310
公開日2001年11月21日 申請日期1999年8月10日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月18日
發(fā)明者小林英二, 大野木宏, 佐川裕章, 富永隆生, 西山英治, 小山信人, 豬飼勝重, 加藤郁之進 申請人:寶酒造株式會社