專利名稱：用于治療癌癥的腺病毒－化療劑聯(lián)合應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及癌癥，以及用腺病毒結(jié)合化療劑來(lái)治療或預(yù)防癌癥的方法和組合物。
若干年來(lái)，人們一直嘗試用復(fù)制病毒對(duì)癌癥進(jìn)行病毒治療，但是，非常遺憾的是進(jìn)展極小。最著名的研究是二十世紀(jì)60和70年代間進(jìn)行的研究。其中之一是Southam和Moore的工作。見(jiàn)Southam,C.M.和Moore,A.E.Cancer 1952,vol.5,pp.1025-1034。在此研究中，作者用West Nile病毒，Egypt 101株來(lái)治療一些不同類型的癌癥。遺憾的是，在淋巴瘤患者中最有希望的研究表明表現(xiàn)出腫瘤退化的患者少于10％。此外，在90％的患者中此病毒引起病毒性貧血(viraemia)，并且很多人還表現(xiàn)出腦炎，這是就此病毒的親神經(jīng)特性的并不奇怪的作用。
第二個(gè)研究由Smith和Collins在1956年進(jìn)行。見(jiàn)Smith,R.等，Cancer(1956),vol.9,pp.1211-1218。他們?cè)?0位患者中檢測(cè)多種類型的腺病毒，這些患者患有惡化的子宮頸表皮樣腫瘤。通過(guò)腫瘤內(nèi)直接接種或通過(guò)動(dòng)脈灌注使用不同量的病毒。使用不同病毒的系列類型，且在接種病毒前檢測(cè)患者的抗腺病毒中和抗體的預(yù)存在性。在40個(gè)接病毒中，觀察到在注射的骨盆腫瘤中央部分的壞死區(qū)域得到約26個(gè)。還注意到對(duì)正常骨盆組織沒(méi)有損害。在多達(dá)30天內(nèi)發(fā)生腫瘤壞死，沒(méi)有腫瘤全部破壞的情況。注意到預(yù)存在抗腺病毒抗體的患者比對(duì)此病毒沒(méi)有免疫性的患者表現(xiàn)差。
第三個(gè)腫瘤癌癥的研究由Asada進(jìn)行。見(jiàn)Asada,Cancer(1974),vol.34,pp 1907-1928。在此研究中，用流行性腮腺炎病毒治療惡性腫瘤患者。給患不同腫瘤疾病的90位患者使用此病毒。90位患者中37位沒(méi)有觀察副作用或副作用極小，腫瘤消失或退化至原大小的一半以下。此外，在42位其它患者中觀察到很小的反應(yīng)。這些病毒似乎在兩個(gè)階段發(fā)生作用在第一個(gè)階段，在注射后幾天發(fā)生，病毒復(fù)制引起顯著的腫瘤破壞，而在第二個(gè)階段，在腫瘤再生長(zhǎng)為靜止期時(shí)沒(méi)有后來(lái)的時(shí)期。遺憾的是，正如在其它實(shí)驗(yàn)中觀察到的，在所有的病例中癌癥最終會(huì)再生長(zhǎng)。
考慮到在這些實(shí)驗(yàn)中病毒治療表現(xiàn)出的有限作用，基本上停止了此研究是不奇怪的，但是最近有兩個(gè)明顯的例外。第一個(gè)是Martuza等的工作，其涉及用單純皰疹病毒治療癌癥(見(jiàn)PCT/US96/08621)。其中策略是用復(fù)制-活性單純皰疹病毒，該病毒表達(dá)了腫瘤或細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，其有效地連接基本的單純皰疹病毒基因。此外，已嘗試通過(guò)適當(dāng)?shù)耐蛔兪共《緵](méi)有神經(jīng)毒性。遺憾的是，這些突變?nèi)员Ａ袅孙@著的殘留神經(jīng)毒性，且它們最終在癌癥治療中的效果如何尚不確定。
第二個(gè)研究描述于美國(guó)專利5677178，發(fā)明人McCormick。此研究利用癌細(xì)胞中腫瘤抑制因子蛋白損失的優(yōu)點(diǎn)。也許最顯著的此種腫瘤抑制因子蛋白是p53。p53的功能是通過(guò)在對(duì)DNA損壞反應(yīng)中的細(xì)胞循環(huán)來(lái)抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞的進(jìn)化。野生型腺病毒的elb p55蛋白與表達(dá)p53的腺病毒侵染細(xì)胞的p53結(jié)合并造成對(duì)p53功能的基本滅活。功能腺病毒elb p55蛋白是含功能p53細(xì)胞中腺病毒有效復(fù)制所必需的?；旧先狈Y(jié)合p53能力的腺病毒突變株在具有正常水平的功能p53的、非復(fù)制、非腫瘤細(xì)胞中是復(fù)制缺失的。但是，這些腺病毒突變株在p53功能缺陷細(xì)胞中表現(xiàn)出復(fù)制表型(例如，與基本缺失的p53等位基因純合的細(xì)胞，含基本上無(wú)功能的突變p53蛋白的細(xì)胞)，并因此引起這些細(xì)胞的死亡。在仍在進(jìn)行的臨床實(shí)驗(yàn)中，上述腺病毒突變株已顯示出了生物活性并在腦和頸部癌癥中引起部分腫瘤壞死。
60和70年代的病毒治療臨床實(shí)驗(yàn)雖然沒(méi)有明顯成功，但是為此領(lǐng)域的近期工作打下了基礎(chǔ)。如果病毒治療與癌癥治療如化療的標(biāo)準(zhǔn)用藥程式結(jié)合，在這些研究中觀察到的病毒抗癌效果可能提高。
本發(fā)明的第一個(gè)目的描述了治療癌癥的方法，該方法包括給需要此治療的患者結(jié)合化療使用復(fù)制腺病毒載體。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是治療癌癥的方法，該方法包括給需要此治療的患者結(jié)合化療使用復(fù)制腺病毒載體，其中該結(jié)合引起抗癌協(xié)同作用。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是治療扁平細(xì)胞癌癥的方法，包括給此癌癥直接注射腺病毒并使用化療以產(chǎn)生抗癌的協(xié)同作用。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是治療扁平細(xì)胞癌癥的方法，該方法包括給此癌癥直接注射腺病毒，并使用兩種化療劑順鉑和5-氟尿嘧啶以產(chǎn)生抗癌協(xié)同作用。
本發(fā)明的第五個(gè)目的描述了治療頭部和頸部的扁平細(xì)胞癌癥的方法，該方法包括給此癌癥直接注射腺病毒，并使用兩種化療劑順鉑和5-氟尿嘧啶，以產(chǎn)生抗癌的協(xié)同作用。
本發(fā)明的第六個(gè)目的描述了表現(xiàn)出抗癌協(xié)同作用的腺病毒和化療劑組成的組合物。
本發(fā)明的第七個(gè)目的描述了表現(xiàn)出抗癌協(xié)同作用的腺病毒和兩種化療劑順鉑和5-氟尿嘧啶組成的組合物。
在閱讀以下說(shuō)明書(shū)對(duì)本發(fā)明的不同方面的描述的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的這些和其它目的對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。本發(fā)明的上述和其它方面在以下給出的附圖
、發(fā)明詳述和實(shí)施例中詳述。
在此說(shuō)明書(shū)中提及的所有出版物和專利申請(qǐng)引入本文以供參考，就如同對(duì)每個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)?zhí)貏e并單獨(dú)指出其被引入以供參考一樣。
定義除非特別說(shuō)明，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員常規(guī)理解的相一致。一般來(lái)說(shuō)，本文中使用的名稱和以下描述的實(shí)驗(yàn)方法是熟知和本領(lǐng)域常規(guī)使用的。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于重組核酸方法、多核苷酸合成和微生物培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化(例如，電穿孔、脂侵染)。一般按照制造商的說(shuō)明進(jìn)行酶反應(yīng)和純化步驟。技術(shù)和方法一般按照本領(lǐng)域和多種參考文獻(xiàn)中的常規(guī)方法進(jìn)行(見(jiàn)Sambrook等，Mo1ecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.，將其引入作為參考)，其在此文件中提供了參考文獻(xiàn)的出處。本文中的命名和在分析化學(xué)、有機(jī)合成化學(xué)和下述藥物制劑中的實(shí)驗(yàn)室方法是本領(lǐng)域熟知和常規(guī)使用的。在化學(xué)合成、化學(xué)分析、藥物制劑和轉(zhuǎn)運(yùn)以及患者的治療中使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。
在整個(gè)公開(kāi)中，除非特別說(shuō)明，所用以下術(shù)語(yǔ)應(yīng)理解為具有以下含義術(shù)語(yǔ)“腺病毒”指從人、其它哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類中分離的40多種腺病毒亞型。見(jiàn)Strauss,"Adenovirus infections in humans",The Adenoviruses,Ginsberg編，Plenum Press,New York,NY,pp.451-596(1984)。此術(shù)語(yǔ)優(yōu)選兩個(gè)人血清型，Ada和Ad5。
“腫瘤細(xì)胞”或“瘤形成”指表現(xiàn)出相對(duì)的自主生長(zhǎng)的細(xì)胞，于是它們表現(xiàn)出異常生長(zhǎng)表型，其特征是細(xì)胞增殖的顯著失控。腫瘤細(xì)胞包括可以活性復(fù)制或處于暫時(shí)非復(fù)制休止態(tài)(G1或G0)的細(xì)胞；類似地，腫瘤細(xì)胞可以包括具有分化很好的表型、分化差的表型或兩種細(xì)胞類型混合物的細(xì)胞。因此，在給出的時(shí)間點(diǎn)并非所有的腫瘤細(xì)胞必然是正復(fù)制的細(xì)胞。將其定義為由良性瘤細(xì)胞和惡性(或癥狀明顯)腫瘤細(xì)胞組成腫瘤細(xì)胞。此處，癥狀明顯的腫瘤細(xì)胞常稱為癌癥或癌細(xì)胞，如果由內(nèi)胚層或外胚層組織來(lái)源的細(xì)胞產(chǎn)生則一般稱為癌，或者如果得自中胚層的細(xì)胞類型產(chǎn)生則稱為肉瘤。
“生理?xiàng)l件”或“生理溶液”指離子強(qiáng)度、pH和溫度基本類似于完整哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織空間或活哺乳動(dòng)物器官中的條件。一般生理?xiàng)l件包括含約150mM氯化鈉，pH6.5-7.6且溫度約22-37℃的水溶液?？傊?，生理?xiàng)l件是適于生物大分子的分子間的締合的結(jié)合條件。例如，150mM氯化鈉，pH7.4在37℃的生理?xiàng)l件一般是適宜的。
本文中化學(xué)術(shù)語(yǔ)按照本領(lǐng)域常規(guī)使用，由McGraw-HillDictionary of Chemical Terms(Parker,S.編，1985)例示，將其引入作為參考。
當(dāng)其功能彼此相關(guān)時(shí)，DNA區(qū)域是可操作連接的。例如，如果其控制序列的轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)子與編碼序列是可操作連接的；如果其定位以允許翻譯，核糖體與編碼序列是可操作連接的?？傊?，可操作連接指在前導(dǎo)序列中接觸，及在讀框中接觸。
復(fù)制腺病毒載體指能在癌癥細(xì)胞中復(fù)制的腺病毒或其突變體。其可以包括野生型腺病毒，或如下詳述的腺病毒、能在某些類型癌細(xì)胞中選擇復(fù)制的腺病毒突變體，優(yōu)選缺乏一種或多種癌癥抑制因子蛋白的那些。
對(duì)腺病毒和化療的協(xié)同作用活性的解釋不用囿于特定的理論，建議腺病毒和化療的優(yōu)選的結(jié)合，是腺病毒E1b-突變株與順鉑和5-氟尿嘧啶(5-Fu)的結(jié)合。
腺病毒值得一提的是當(dāng)本發(fā)明根據(jù)5型腺病毒描述時(shí)，對(duì)于其它類似腺病毒血清型也是可以實(shí)施的。腺病毒基因組的總結(jié)構(gòu)保存在血清型中，并類似地處于特定功能。此外，腺病毒5基因組登記為Genbank手冊(cè)#M73260，且此病毒由美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection),Rockbille,Maryland,U.S.A.提供，登記號(hào)VR-5。構(gòu)建腺病毒突變株的方法是本領(lǐng)域的一般知識(shí)。見(jiàn)Mittal,S.K.,Virus Res.,1993,vol 28,67-90頁(yè)。用于構(gòu)建腺病毒突變株的某些物質(zhì)和方法描述于Hanke,T.等，(1990)Virology,vol.177,437-444頁(yè)，及Bett,A.J.等，(1993)J.Virol.vol.67,5911-5921頁(yè)，以及PCT/CA96/00375。位于341 Bering Avenue,Toronto,Ontario Canada的MicrobixBiosystems,Inc.出售用于構(gòu)建腺病毒突變株的很多物質(zhì)，并提供如何制備的產(chǎn)品信息清單。
可以用來(lái)與化療結(jié)合以產(chǎn)生本文中所指的抗癌協(xié)同作用的優(yōu)選腺病毒突變株，是缺乏表達(dá)滅活p53的病毒蛋白能力的。這些蛋白至少由腺病毒基因組的E1B和E40RF6區(qū)域編碼。細(xì)胞磷蛋白p53的功能是通過(guò)細(xì)胞循環(huán)抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞的進(jìn)化。在具有p53的侵染細(xì)胞中，野生型腺病毒E1b p55蛋白結(jié)合p53，并產(chǎn)生對(duì)p53功能的基本滅活，類似于通過(guò)在滅活形式中螯合p53。功能性E1b p55蛋白是含功能性p53細(xì)胞中有效的腺病毒復(fù)制所必需的。因此，基本上缺乏結(jié)合p53能力的腺病毒突變株在具有正常水平的功能性p53的、非復(fù)制、非腫瘤細(xì)胞中是復(fù)制缺陷的。
人癌細(xì)胞常常對(duì)突變(例如，取代、缺失、移碼突變株)p53等位基因是純合或雜合的，并缺乏正?？刂萍?xì)胞循環(huán)需要的p53功能(Hollstein等，(1991),Science 253:49；Levine等，(1991)前面引證的，引入本文作為參考)。因此，很多腫瘤細(xì)胞是p53(-)的，這是因?yàn)樗鼈內(nèi)狈ψ銐蛩降膒53蛋白和/或因?yàn)樗鼈儽磉_(dá)的p53突變形式不具備基本的p53功能，且當(dāng)可能存在野生型p53時(shí)甚至可能基本上缺乏p53功能(例如，通過(guò)抑制功能性多聚體的形成)。一些腫瘤細(xì)胞可能含有編碼基礎(chǔ)野生型p53蛋白的等位基因，但是可能含有第二位點(diǎn)突變，其基本上廢除了p53功能，如使p53蛋白位于細(xì)胞質(zhì)而不是細(xì)胞核的突變；這些第二位點(diǎn)突變體也基本上缺乏p53功能。
據(jù)信缺乏復(fù)合p53能力但基本上保持其它基本表達(dá)復(fù)制功能的復(fù)制缺陷腺病毒種類會(huì)在細(xì)胞中表現(xiàn)出復(fù)制表型，其缺乏p53功能(例如，對(duì)基本上缺失p53等位基因是純合的細(xì)胞，包含基本上沒(méi)有功能的突變p53蛋白的細(xì)胞)，但是在非復(fù)制、非腫瘤細(xì)胞中會(huì)基本上不表現(xiàn)出復(fù)制表型。這些復(fù)制缺失腺病毒種類在本文中簡(jiǎn)稱為E1b-p53(-)復(fù)制缺失腺病毒。
細(xì)胞群落(如混合細(xì)胞培養(yǎng)物或癌癥病人)，其包括缺乏p53功能的腫瘤細(xì)胞的亞群落和表達(dá)了基本正常的p53功能的非腫瘤細(xì)胞的亞群落，可以在侵染條件下(即適于細(xì)胞群落的腺病毒侵染的條件，典型生理?xiàng)l件)接觸含侵染量的E1b-p53(-)復(fù)制缺失腺病毒的組合物。此接觸導(dǎo)致了此細(xì)胞群落被E1b-p53(-)復(fù)制缺失腺病毒侵染。此侵染在含缺乏p53功能的腫瘤細(xì)胞亞群落的細(xì)胞有效片斷中產(chǎn)生復(fù)制表型的優(yōu)先表達(dá)，但在具有基本正常p53功能的非腫瘤細(xì)胞的亞群落中不產(chǎn)生復(fù)制表型的實(shí)質(zhì)表達(dá)。在侵染的p53(-)細(xì)胞中，復(fù)制表型的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，如通過(guò)細(xì)胞病變作用(CPE)、細(xì)胞溶解、編程性細(xì)胞死亡等，導(dǎo)致細(xì)胞群落中腫瘤p53(-)細(xì)胞的選擇性除去。
一般來(lái)說(shuō)，適于選擇性殺死p53(-)腫瘤細(xì)胞的E1b-p53(-)復(fù)制缺失腺病毒構(gòu)建物包括突變(例如，缺失、取代、移碼)，其滅活E1bp55多肽有效結(jié)合p53蛋白的能力。此滅活突變一般發(fā)生在結(jié)合p53的p55區(qū)域。此突變E1b區(qū)域可選擇性地編碼和表達(dá)功能性p19蛋白，該蛋白由剩余的E1b區(qū)域編碼，而其在缺乏E1a多肽下腺病毒早期基因的反式激活中是功能性的。
用于本發(fā)明方法和組合物中的適宜的E1b-p53(-)復(fù)制缺陷腺病毒構(gòu)建物，包括但不限于下列實(shí)例(1)型2腺病毒d1 1520，其含有在核苷酸2022位的C至T突變，該突變產(chǎn)生位于AUG密碼子下游3個(gè)氨基酸的停止密碼子，該AUG密碼子用于啟動(dòng)p55蛋白的翻譯，并含有在2496和3323核苷酸之間的缺失，該缺失被小連接插入替代，而小連接插入在3336核苷酸產(chǎn)生第二個(gè)停止密碼子；p19蛋白的表達(dá)基本上沒(méi)有被影響(Barker and Berk(1987)Virology156:107，引入本文作為參考)，及(2)復(fù)合腺病毒構(gòu)建物，其含有2型腺病毒d1 1520，其含有至少2022位突變和/或2496-3323缺失突變，或其部分，以及在p19的其它突變以產(chǎn)生p19 cyt突變株；缺乏p55并含有p19 cyt突變的升高細(xì)胞病變作用的復(fù)合病毒構(gòu)建物。Ad2 d1 1520得自洛杉磯的Dr.A.Berk,University ofCalifornia,Los Angeles,CA，并在文獻(xiàn)中描述，包括文獻(xiàn)Barkerand Berk(1987)Virology 156:107。
優(yōu)選向這些腺病毒構(gòu)建物中摻入其它突變，以在腫瘤細(xì)胞中抑制侵染病毒顆粒的形成，否則它們會(huì)支持E1b-p53(-)突變體的復(fù)制。這些其它滅活突變優(yōu)選在治療過(guò)程中，在此過(guò)程中能傳播并侵染相鄰細(xì)胞的完全病毒復(fù)制形成侵染病毒顆粒是不需要的。這些完全滅活的突變體稱為非復(fù)制性E1b-p53(-)突變體。這些非復(fù)制性突變體包括即使在P53(-)RB(-)細(xì)胞中也防止侵染病毒顆粒形成的突變；這些突變一般是在基礎(chǔ)病毒顆粒蛋白或蛋白酶中的結(jié)構(gòu)突變。
但是，在很多用藥程式中，需要此突變病毒能復(fù)制并形成含突變病毒基因組的侵染病毒顆粒，該顆粒可以傳播并侵染其它細(xì)胞，因而放大突變病毒起始劑量的抗腫瘤作用。
由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)在E1b基因區(qū)域產(chǎn)生突變，該區(qū)域編碼p55多肽，表達(dá)突變p55多肽，在水性結(jié)合條件下讓突變p55多肽結(jié)合p53或結(jié)合p53的片斷，并鑒定突變E1b多肽，其非特異性地結(jié)合p53，將其作為適用于本發(fā)明的候選E1b(-)突變株，可以產(chǎn)生缺乏激活p53能力的其它E1b(-)突變體。
值得注意的是，不論所需的腺病毒是野生型還是其突變體，用描述于PCT/US96/01957的方法，或通過(guò)將組織特異性啟動(dòng)子構(gòu)建進(jìn)此病毒中(見(jiàn)PCT/US95/14461)，促進(jìn)一些前藥激活基因的表達(dá)(見(jiàn)PCT/GB95/00322)，改變其外部結(jié)合蛋白，從而將病毒靶向癌細(xì)胞可以提高相關(guān)細(xì)胞選擇性癌癥的殺傷。
制劑可以配制腺病毒包括腺病毒突變株以給患者治療性或診斷性使用。對(duì)于治療或預(yù)防應(yīng)用，給病人或獸類非人類患者使用含藥學(xué)有效量的腺病毒的滅菌組合物，以治療，例如，治療病癥。一般來(lái)說(shuō)，此組合物在含水懸浮液中含有約103至1015或更多的腺病毒顆粒。在此滅菌組合物中常使用藥用載體或賦形劑?？梢允褂枚喾N水溶液，例如，水、緩沖水溶液、0.4％鹽水、0.3％甘氨酸等。這些溶液是滅菌的并且除所需腺病毒載體外一般沒(méi)有其它顆粒物質(zhì)。這些組合物可以含有如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、毒性調(diào)節(jié)劑等，例如，醋酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等?？梢园ㄌ岣呦俨《靖腥炯?xì)胞的賦形劑。
本發(fā)明的腺病毒，或其中含有的DNA，還可以通過(guò)脂質(zhì)體或免疫脂質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤細(xì)胞中此轉(zhuǎn)運(yùn)可以根據(jù)存在于腫瘤細(xì)胞群落中的細(xì)胞表面性質(zhì)(例如，結(jié)合免疫脂質(zhì)體中免疫球蛋白的細(xì)胞表面蛋白的存在)，是選擇性靶向腫瘤細(xì)胞的。一般來(lái)說(shuō)，含病毒顆粒的含水懸浮液包封于脂質(zhì)體或免疫脂質(zhì)體中。例如，腺病毒病毒顆粒的懸浮液可以包封于微膠粒中以通過(guò)常規(guī)方法形成免疫脂質(zhì)體(美國(guó)專利5043164，美國(guó)專利4957735，美國(guó)專利4925661:Connorand Huang(1985)J.Cell Biol.101:582；Lasic DD(1992)Nature 355:279；Novel Drug Delivery(Prescott LF and NimmoWS編Wiley,New York,1989)；Reddy等，(1992)J.Immunol.148:1585頁(yè))。含與存在于個(gè)體癌細(xì)胞上的癌細(xì)胞抗原(如CALLA,CEA)特異性結(jié)合的抗體的免疫脂質(zhì)體可以用于將病毒顆?；虿《绢w粒DNA靶向這些細(xì)胞。
含本發(fā)明腺病毒或其混合物的組合物可以用于預(yù)防和/或治療腫瘤疾病。在治療應(yīng)用中，可以以足以治療或至少部分減輕癥狀及其并發(fā)癥的量，給已被特定治療疾病侵染的患者使用這些組合物，適于完成此目的的量定義為“治療有效量”或“有效量”。對(duì)此用途有效的量將依賴于病癥的嚴(yán)重性、患者的健康狀況及給藥途徑。
在預(yù)防應(yīng)用中，含本發(fā)明腺病毒或其混合物的組合物，給不存在腫瘤病癥的患者使用以提高該患者對(duì)癌癥復(fù)發(fā)的抵抗性或延長(zhǎng)緩解時(shí)間。此量定義為“預(yù)防有效量”。在此用途中，確切的量還是依賴于患者的健康狀況及免疫力的總體水平。
治療方法靶癌癥本發(fā)明的關(guān)鍵方面是發(fā)現(xiàn)腺病毒與某些化療劑聯(lián)合產(chǎn)生抗癌協(xié)同作用。因此，可以通過(guò)給患者結(jié)合化療使用腺病毒，其野生型或突變株，優(yōu)選E1b突變株，來(lái)進(jìn)行腫瘤疾病的治療。與腺病毒結(jié)合產(chǎn)生協(xié)同作用的化療劑的類型依賴于所治療癌癥的類型，并是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易確定的。例如，對(duì)于頭部和頸部癌癥，在實(shí)施例中詳細(xì)討論的，優(yōu)選的化療方案是用兩種化療劑，順鉑和5-氟尿嘧啶。
用本發(fā)明的腺病毒/化療劑聯(lián)合可以治療多種癌癥。例如，但不限于支氣管癌、鼻咽癌、喉癌、小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、肝膽管癌、胰腺癌、膀胱癌、直腸癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌或淋巴細(xì)胞白血病的患者，可以通過(guò)使用有效抗腫瘤量的腺病毒治療。優(yōu)選用本發(fā)明腺病毒/化療劑聯(lián)合治療的癌癥為扁平細(xì)胞癌實(shí)體瘤，更優(yōu)選為頭部和頸部癌癥。
在歐洲、北美和遠(yuǎn)東的發(fā)達(dá)國(guó)家中，頭部和頸部的扁平細(xì)胞癌每年困擾約125000患者。在美國(guó)，每年的發(fā)生率為45000例，其中15000例與死亡有關(guān)。已報(bào)告在45-70％的病例中，頭部和頸部癌癥包含p53突變；酒精和煙草的使用與這些突變有關(guān)。對(duì)這些局部疾病的主要治療是手術(shù)和輔助放療。
手術(shù)后約三分之一的患者中癌癥復(fù)發(fā)。在多數(shù)病例中，它們復(fù)發(fā)在原主要治療的區(qū)域并由于疼痛導(dǎo)致嚴(yán)重的發(fā)病率，并導(dǎo)致口咽和喉梗阻，并在吞咽和講話中帶來(lái)困難。一旦癌癥復(fù)發(fā)和/或轉(zhuǎn)移，該患者被認(rèn)為是無(wú)法治愈的。治標(biāo)的手術(shù)是困難的，且毀容，而進(jìn)一步的放療在幾個(gè)月內(nèi)并不總是有效。在頭部和局部的復(fù)發(fā)扁平細(xì)胞癌治療中已使用了幾種化療劑。聯(lián)合方案已顯示引起30-40％患者的反應(yīng)，但是此治療可能是毒性的并對(duì)存活的影響還不清楚。一旦患者的癌癥對(duì)化療和/或放療是頑固的，平均存活時(shí)間是3個(gè)月，而癌癥對(duì)第二種或第三種化療劑的反應(yīng)率≤15％。因此，本發(fā)明滿足了這些臨終患者對(duì)更有效的治療的需要。
侵染腺病毒顆粒的懸浮液可以通過(guò)多種途徑給腫瘤組織使用，包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腫瘤內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下和局部使用。每毫升含約103至1012或更多的病毒顆粒的腺病毒懸浮液可以以霧狀吸入(例如，對(duì)于肺轉(zhuǎn)運(yùn)以治療支氣管癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌或喉癌)或直接給癌癥擦拭(例如，支氣管癌、鼻咽癌、喉癌、宮頸癌)或者可以通過(guò)輸液給藥(例如，進(jìn)入腹膜以治療卵巢癌，進(jìn)入肝門(mén)靜脈和/或干動(dòng)脈以治療肝膽管癌或來(lái)自其它非肝臟原發(fā)癌的肝轉(zhuǎn)移癌)或其它適宜的途徑，包括直接注射進(jìn)癌癥實(shí)體(例如，乳腺癌)、灌腸(例如，直腸癌)或插管(例如，膀胱癌)。
為了得到腺病毒和化療的協(xié)同作用，優(yōu)選腺病毒在幾天內(nèi)連續(xù)給藥，更優(yōu)選在3至7天的時(shí)間內(nèi)每天給藥。在扁平細(xì)胞癌的情況下，例如對(duì)頭部和頸部癌癥，最優(yōu)選的給藥方案是5天內(nèi)連續(xù)給藥。但是，主要的是要注意確切的天數(shù)應(yīng)根據(jù)所治療的癌癥類型變化，且本領(lǐng)域技術(shù)人員從本文公開(kāi)的內(nèi)容中會(huì)容易地確定達(dá)到最大協(xié)同作用的最好給藥方案。
用本發(fā)明的腺病毒進(jìn)行的腺病毒治療，可以與其它抗腫瘤方法聯(lián)合，例如，基因治療。如上所述，用于本發(fā)明的腺病毒構(gòu)建物可表現(xiàn)出特異性癌細(xì)胞殺傷，優(yōu)選通過(guò)前藥激動(dòng)基因的表達(dá)傳動(dòng)組織特異性啟動(dòng)子。
對(duì)于本發(fā)明腺病毒載體，包括野生型和突變病毒，在宿主動(dòng)物體內(nèi)引起抑制其作用的免疫反應(yīng)的情況，它們可以與適當(dāng)?shù)拿庖咭种扑幬镆黄鸾o藥以達(dá)到最大的作用。
化療劑的給藥化療劑可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法給藥，包括系統(tǒng)的、癌癥直接注射或通過(guò)在癌癥位點(diǎn)通過(guò)將所需化療劑與適當(dāng)?shù)木忈屛镔|(zhì)結(jié)合局部給藥，或者在動(dòng)脈內(nèi)往腫瘤灌注。
優(yōu)選的化療劑是順鉑，而優(yōu)選的劑量可以由操作者根據(jù)所治療癌癥的特性，以及其它在使用順鉑時(shí)常規(guī)考慮的因素選擇。優(yōu)選，在3至6小時(shí)內(nèi)，以50-120mg/平方米的劑量靜脈內(nèi)使用順鉑。更優(yōu)選在4小時(shí)內(nèi)以80mg/平方米的劑量使用順鉑。此外，優(yōu)選在治療的第1天與腺病毒一起使用。
優(yōu)選與順鉑聯(lián)合給藥的第二種化療劑是5-氟尿嘧啶。5-氟尿嘧啶優(yōu)選的劑量是在5天內(nèi)連續(xù)每天使用800-1200mg/平方米(連續(xù)輸液)。
腺病毒/化療的協(xié)同作用本發(fā)明的一個(gè)方面是觀察到的腺病毒/化療聯(lián)合的抗癌作用比任一試劑單獨(dú)的作用大，即此作用大于加和作用。因此，腺病毒/化療聯(lián)合具有協(xié)同抗癌作用。表1表明在5個(gè)人的臨床實(shí)驗(yàn)中用化療治療的患者的復(fù)發(fā)頭部和頸部癌癥的反應(yīng)率。這些實(shí)驗(yàn)的平均反應(yīng)為37％，其由完全反應(yīng)(CR)和部分反應(yīng)(PR)組成。對(duì)此實(shí)驗(yàn)的討論見(jiàn)Paredes,J.等，《在頭部和頸部復(fù)發(fā)和/或轉(zhuǎn)移扁平細(xì)胞癌中高劑量順鉑和氟尿嘧啶輸液加或不加二硫代氨基甲酸二乙酯鈉的前瞻性隨機(jī)實(shí)驗(yàn)》，Journal of ClinicalOncology,6:955-962,1988；Jacobs,C.等，《比較順鉑和氟尿嘧啶作為單獨(dú)試劑和其聯(lián)合形式在頭部和頸部的惡化扁平細(xì)胞癌中的Ⅲ期隨機(jī)研究》，Journal of Clinical Oncology,10:257-263,1992；Forastiere,A等，《在頭部和頸部惡性扁平細(xì)胞癌中隨機(jī)比較順鉑加氟尿嘧啶和卡鉑加氟尿嘧啶與甲氨蝶呤西南部腫瘤學(xué)研究組研究》，Journal of Clinical Oncology,10:1245-1251,1992；Schrijvers,D.等，《在頭部和頸部癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移患者中用干擾素α-2b調(diào)節(jié)順鉑/氟尿嘧啶化療的Ⅲ期實(shí)驗(yàn)》，Journal of Clinical Oncology,16:1054-1059,1998；LHNOG A，《在頭部和頸部晚期扁平細(xì)胞癌中順鉑、甲氨蝶呤、順鉑+甲氨蝶呤和順鉑+5-FU的Ⅲ期隨機(jī)實(shí)驗(yàn)》，British Journal ofCancer,61:311-315,1990；Clavel,M.等，《在頭部和頸部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移扁平細(xì)胞癌中隨機(jī)比較順鉑、甲氨喋呤、博萊霉素和長(zhǎng)春新堿(CABO)與順鉑和5-氟尿嘧啶(CF)與順鉑(C)。EORTC頭部和頸部癌癥合作組的Ⅲ期研究》，Annals of Oncology,5:521-526,1994。表1復(fù)發(fā)頭部和頸部癌癥的Ⅲ期研究研究 年代 參與的患者 PR+CR CRLHNOG 199039 31％ 0FORASTERE 199287 32％ 6％JACOBS 199263 40％ 8％CLAVEL 199410834％ 0SCHRUVERS 199812247％ 11％共計(jì) 41937％與化療比較，單獨(dú)使用腺病毒時(shí)復(fù)發(fā)頭部和頸部癌癥的反應(yīng)率是26％。此反應(yīng)率還是表示完全和部分反應(yīng)。這些結(jié)果見(jiàn)表2。表2ONYX-015頭部和頸部癌癥研究對(duì)于復(fù)發(fā)、頑固性頭部和頸部癌癥的所有的單一試劑ONYX-015數(shù)據(jù)患者數(shù)目 CRPR 反應(yīng)率(％)23 2 4 26與化療或腺病毒單獨(dú)使用的反應(yīng)率相比，對(duì)于復(fù)發(fā)頭部和頸部癌癥來(lái)說(shuō)，對(duì)化療和腺病毒的反應(yīng)率為約90％，如在實(shí)施例中所詳述的。
下面的實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明特定實(shí)施方案及其不同用途的舉例說(shuō)明。其給出只是為了舉例目的，而不是作為本發(fā)明的限制。實(shí)施例治療頭部和頸部的扁平細(xì)胞癌頭部和頸部扁平細(xì)胞癌的患者接受腺病毒E1b突變株，dl1520(在本文中也稱為ONYX-015)和化療治療，如下所述。Dl 1520由Berk在Virology 156:107頁(yè)(1987)中描述并可以得自Dr.Arnold Berk,University of California,Los Angeles,California。
判斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)某些判斷標(biāo)準(zhǔn)在臨床實(shí)驗(yàn)中登記患者。癌癥必須是組織學(xué)確定的頭部和頸部扁平細(xì)胞癌，包括口腔、咽和喉。它必須是復(fù)發(fā)疾病，其中復(fù)發(fā)癌癥已先用化療劑治療。復(fù)發(fā)疾病指原來(lái)用手術(shù)和/或放療治療后發(fā)生的癌癥(即，包括原發(fā)性頑固性癌癥)。
對(duì)其原發(fā)性頭部和頸部癌癥(一種或多種)先接受了化療的患者以及此化療方案完成后4周內(nèi)沒(méi)有惡化的患者，也適合包括在內(nèi)。
此外，整個(gè)癌癥必須適于直接注射病毒，且此癌癥必須適合臨床檢測(cè)和/或放射照相。此癌癥還必須是手術(shù)(由主治手術(shù)醫(yī)生確定)或放療無(wú)法治愈的。
對(duì)于放射照相檢查的并且不能清楚評(píng)價(jià)的癌癥患者，進(jìn)行基礎(chǔ)CT掃描評(píng)價(jià)。如果癌癥經(jīng)CT掃描清楚評(píng)價(jià)與主要研究者的判斷相同，則給此患者登記。如果通過(guò)CT掃描無(wú)法檢查，在此位點(diǎn)進(jìn)行MRI掃描并隨后進(jìn)行評(píng)價(jià)。如果此癌癥無(wú)法通過(guò)CT掃描、MRI掃描或物理檢查鑒定，則不給此患者登記。
其它判斷標(biāo)準(zhǔn)為Karnofsky行為特征≥70％，而存活期≥3個(gè)月。
ONYX-015的給藥將ONYX-015在TRIS緩沖液(10mM TRIS pH7.4,1mM氯化鎂，150mM氯化鈉，10％甘油)中配制為滅菌病毒溶液。此ONYX-015溶液不含防腐劑。在使用前該病毒可以冷凍保存。所用的ONYX-015的總劑量為1010pfu每天，共5天。在第一天，在早晨常規(guī)開(kāi)始ONYX-015治療和化療。在第一天，化療開(kāi)始前使用ONYX-015。將病毒溶液解凍并用生理溶液開(kāi)始稀釋至適當(dāng)?shù)牡味?。在稀釋和操作期間，在2℃至8℃維持解凍的病毒，而在給藥前立即升溫至室溫。稀釋至適當(dāng)?shù)味群?，此病毒溶液再進(jìn)一步稀釋至最終體積等于要進(jìn)行注射的估計(jì)的癌癥體積的30％。癌癥體積由最大癌癥直徑、垂直的和估計(jì)高度的乘積除以2進(jìn)行估計(jì)。此評(píng)估用超聲波、MRI、CT掃描和/或臨床檢查進(jìn)行。對(duì)于已發(fā)生中心潰瘍的癌癥，通過(guò)減去潰瘍面積調(diào)整估計(jì)的癌癥體積(該潰瘍面積由潰瘍面積的最大直徑、其垂直和估計(jì)深度的乘積除以2進(jìn)行估計(jì))。恰在給癌癥注射前進(jìn)行稀釋。
將靶癌癥(一種或的多種)通過(guò)使用癌癥模板圖劃分為5個(gè)大小相等、體積相同的部分。在注射NOYX-015前，由研究者根據(jù)患者預(yù)先存在的疼痛或注射產(chǎn)生的疼痛，先給患者局部或系統(tǒng)使用止痛藥。每個(gè)治療周期的每天，在注射前一般嘗試給癌癥內(nèi)的中心壞死組織/流體進(jìn)行吸引術(shù)。在5個(gè)療程的每個(gè)療程中，給5個(gè)癌癥部分中的一個(gè)直接注射(用25號(hào)或更小的針頭)，且其方式為讓全部癌癥部分中分配等體積的病毒。當(dāng)注射病毒時(shí)，逐步抽出注射器以便沿著整個(gè)針頭軌跡分布相同的注射體積。重要的是，所用注射技術(shù)使病毒分布在癌癥的邊緣和深部。注射后，如果需要給注射后區(qū)域輕輕施壓2-3分鐘，以防止病毒溶液從注射點(diǎn)泄漏。
化療劑，順鉑和5-FU的給藥·80mg/平方米的順鉑Ⅳ給藥4小時(shí)(±1小時(shí))。如上所述，在第1天，在用ONYX-015治療的第一天后進(jìn)行順鉑治療。
·如果住院，則每天在不超過(guò)2升的鹽水溶液中進(jìn)行1000mg/平方米的5-FU的給藥，或如果不在醫(yī)院通過(guò)便攜泵在不超過(guò)0.5升的鹽水溶液中進(jìn)行給藥。在第1-5天給藥是Ⅳ連續(xù)輸液(即5000mg/平方米總劑量/循環(huán))。
重復(fù)治療如果經(jīng)至少2個(gè)循環(huán)的ONYX-015治療后在靶癌癥位點(diǎn)沒(méi)有惡化疾病的證據(jù)，患者以相同的劑量接受ONYX-015和順鉑、5-FU重復(fù)治療，共5個(gè)循環(huán)，每隔3周給藥(由前一個(gè)治療循環(huán)的的第1天開(kāi)始計(jì)算)。
癌癥反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)用下列標(biāo)準(zhǔn)，分別評(píng)價(jià)在注射后靶癌癥的反應(yīng)。在反應(yīng)和無(wú)惡化期間，確定存活時(shí)間。用經(jīng)典/標(biāo)準(zhǔn)截面癌癥檢測(cè)評(píng)價(jià)反應(yīng)，如下[最大癌癥直徑x垂直直徑]。從總面積中減去潰瘍的癌癥面積。用數(shù)碼成象分析進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助截面檢測(cè)。如果覺(jué)得在所給出的患者中對(duì)癌癥大小的物理檢查比放射照相掃描更準(zhǔn)確，則用物理檢查確定癌癥反應(yīng)。
將癌癥對(duì)病毒/化療治療的反應(yīng)如下分級(jí)完全反應(yīng)(CR)在評(píng)價(jià)位點(diǎn)癌癥完全消失部分反應(yīng)(PR)癌癥(一種或多種)消退超過(guò)50％但小于100％較小反應(yīng)(MR)癌癥消退少于50％。
對(duì)于PR的情況，截面積的計(jì)算機(jī)輔助計(jì)算不包括癌癥的壞死面積。最后，在其被正確分類前，對(duì)治療的所有反應(yīng)必須持續(xù)4周。
結(jié)果表3給出了用ONYX-015、順鉑和5-氟尿嘧啶治療的10位患者的結(jié)果。表3對(duì)ONYX-015治療頭部和頸部，Ⅱ期結(jié)合化療的反應(yīng)的總結(jié)
從表3數(shù)據(jù)中明顯看出10位患者中有9位對(duì)治療有反應(yīng)?；陧樸K和5-氟尿嘧啶的原始反應(yīng)率37％(表1)和對(duì)腺病毒的單獨(dú)反應(yīng)率26％(表2)，此90％的反應(yīng)率表明了對(duì)靶頭部和局部癌癥的協(xié)同作用。
現(xiàn)在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了充分描述，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不背離后面的權(quán)利要求書(shū)的實(shí)質(zhì)和范圍前提下，很多變化和修飾是顯而易見(jiàn)的。
權(quán)利要求
1．組合物，其中含有腺病毒和至少一種化療劑。
2．權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述腺病毒是Onyx 015。
3．權(quán)利要求2的組合物，其中所述化療劑包括順鉑。
4．權(quán)利要求1的組合物，其中所述化療劑包括順鉑和5-氟尿嘧啶。
5．為需要的患者治療癌癥的方法，其包括如下步驟(a)讓所述癌癥與以足以基本消滅癌癥量的腺病毒和至少一種化療劑接觸且接觸時(shí)間足以消滅癌癥，且如果需要，重復(fù)步驟(a)以防止所述癌癥復(fù)發(fā)。
6．權(quán)利要求5的方法，其中所述癌癥是扁平細(xì)胞癌。
7．權(quán)利要求6的方法，其中所述扁平細(xì)胞癌在頭部和頸部。
8．權(quán)利要求7的方法，其中所述癌癥接觸腺病毒包括通過(guò)給所述患者的所述癌癥以約108-1012的空斑形成單位直接注射使用所述腺病毒。
9．權(quán)利要求5的方法，其中所述癌癥接觸腺病毒包括給所述患者靜脈使用所述腺病毒。
10．權(quán)利要求5所述的方法，其中所述接觸癌癥包括使用腺病毒后給所述患者使用所述化療劑。
11．權(quán)利要求5的方法，其中所述化療劑包括順鉑和5-氟尿嘧啶。
全文摘要
描述了治療和預(yù)防癌癥的組合物和方法,包括腺病毒和化療的聯(lián)合,此聯(lián)合協(xié)同消失或防止癌癥的生長(zhǎng),其中癌癥優(yōu)選是復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的扁平細(xì)胞癌。
文檔編號(hào)A61K35/76GK1301169SQ99806170
公開(kāi)日2001年6月27日 申請(qǐng)日期1999年4月19日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月15日
發(fā)明者D·克恩 申請(qǐng)人:昂尼克斯藥物公司