專利名稱：神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體的制作方法
1．發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)受體并提供編碼GDNF受體(GDNFR)的核酸序列和氨基酸序列。本發(fā)明亦涉及治療GDNF應(yīng)答性疾病的治療技術(shù)。
2．發(fā)明背景神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子最初神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)是做為增強(qiáng)中腦多巴胺能神經(jīng)元存活的有效神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子從大鼠B49細(xì)胞分離和克隆的(Lin等，Science,260,1130-1132,1993)。近期的研究表明該分子表現(xiàn)出各種各樣的其它生物學(xué)活性，這些活性對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)的幾種類型的神經(jīng)元有影響。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中，已顯示GDNF防止軸突切開術(shù)誘導(dǎo)的哺乳動(dòng)物面部和脊柱的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡(Li等，Proceedings Of The National Academy Of Sciences,U.SA.,92,9771-9775,1995；Oppenheim等，Nature,373,344-346,1995；Yan等，Nature,373,341-344,1995；Henderson等，Science,266,1062-1064,1994；Zurn等，Neuroreport,6,113-118,1994)、并從自然程序細(xì)胞死亡拯救發(fā)育中的鳥類運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(Oppenheim等，1995見上述)。已顯示GDNF局部給藥保護(hù)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元免受軸突切開術(shù)誘導(dǎo)的變性(Kearns和Gash,Brain Research,672,104-111,1995；Beck等，Nature,373,339-341,1995)或神經(jīng)毒素誘導(dǎo)的變性(Sauer等，Proceedings Of The NationalAcademy Of Sciences U.S.A.,92,8935-8939,1995；Tomac等，Nature,373,335-339,1995)。另外，已顯示GDNF局部給藥誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元生長(zhǎng)、提高多巴胺、去甲腎上腺素、5-羥色胺水平、并改進(jìn)運(yùn)動(dòng)行為(Tomac等，1995見上述)。
最近，已報(bào)道GDNF是大腦去甲腎上腺素能神經(jīng)元和浦肯野細(xì)胞的潛在營(yíng)養(yǎng)因子。移植異位表達(dá)GDNF的成纖維細(xì)胞防止6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的變性和體內(nèi)促進(jìn)成人去甲腎上腺素能神經(jīng)元的表型(Arenas等，Neuron,15,1465-1473,1995)，而外源應(yīng)用的GDNF有效地促進(jìn)胚性浦肯野細(xì)胞體外生存和形態(tài)分化(Mount等，Proceedings Of TheNational Academy Of Sciences U.S.A.,92,9092-9096,1995)。在外周神經(jīng)系統(tǒng)中，已顯示GDNF促進(jìn)結(jié)節(jié)狀、睫狀和交感神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元以及脊神經(jīng)節(jié)(DRG)和三叉神經(jīng)節(jié)胚胎感覺神經(jīng)元小群體的生存(Trupp等，Joumal Of Cell Biology,130,137-148,1995；Ebendal等，Journal OfNeuroscience Research,40,276-284,1995；Oppenheim等，1995見上述；Yan等，1995見上述；Henderson等,1994見上述)。亦有報(bào)道GDNF增強(qiáng)培養(yǎng)上頸神經(jīng)節(jié)(SCG)神經(jīng)元中血管活性腸肽和前速激肽原-AmRNA表達(dá)，并因此影響SCG神經(jīng)元表型和誘導(dǎo)束狀生長(zhǎng)(Trupp等，1995見上述)。
已在神經(jīng)系統(tǒng)的多種不同細(xì)胞類型和結(jié)構(gòu)中觀察到GDNF表達(dá)。在CNS中，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)已在發(fā)育中的和成熟的大鼠紋狀體(黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)支配的主要靶)和其它廣泛區(qū)域(包括海馬、皮層、丘腦、隔膜、小腦、脊髓和延髓)中已觀察到GDNF mRNA的表達(dá)(Arenas等，見上述1995；Poulsen等，Neuron,13,1245-1252,1994；Spinger等，Experimental Neurology,127,167-170,1994；Stroemberg等，Experimental Neurology,124,401-412,1993；Schaar等，Experimental Neurology,124,368-371,1993)。在人體中，也已在紋狀體檢測(cè)到GDNF轉(zhuǎn)錄物，在尾中水平最高而在核殼中水平最低。在海馬、皮層和脊髓中亦發(fā)現(xiàn)可檢測(cè)的水平，但在小腦中沒有(Schaar等，Experimental Neurology,130,387-393,1994；Sprnger等，1994見上述)。在外周神經(jīng)中，已在出生后1天大鼠的DRG和SCG、坐骨神經(jīng)和新生兒許旺細(xì)胞的原始培養(yǎng)物中報(bào)道GDNF mRNA表達(dá)(Trupp等，1995見上述；Hoffer等，Neuroscience Letters,182,107-111,1994；Henderson等，1994見上述；Springer等，1994見上述)。另外，近期研究顯示GDNF轉(zhuǎn)錄物亦于周圍非神經(jīng)元器官中廣泛表達(dá)，包括出生后睪丸和腎臟、胚胎須墊、胃和皮膚?？梢栽谂咛ゼ∪狻⒛I上腺和肢芽和在出生后肺、肝和卵巢中檢測(cè)到低水平的表達(dá)(Trupp等，1995見上述；Henderson等，1994見上述)。然而，迄今不清楚GDNF非神經(jīng)元表達(dá)的生物學(xué)重要性。
GDNF蛋白產(chǎn)物的制備和表征的詳細(xì)描述可以參見于1994年5月23日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)08/182,183和其原申請(qǐng)(亦可參見于1992年9月17日申請(qǐng)的PCT/US92/07888,WO93/06116和歐洲專利申請(qǐng)92921022.7，公告EP610254號(hào))，其說(shuō)明書通過(guò)引用結(jié)合到本文中。在于1995年9月28日申請(qǐng)的未決美國(guó)專利申請(qǐng)08/535,681描述了其它GDNF蛋白產(chǎn)物，該申請(qǐng)的說(shuō)明書通過(guò)引用結(jié)合到本文中。本文使用的術(shù)語(yǔ)“GDNF蛋白產(chǎn)物”包括生物學(xué)活性的合成或重組GDNF蛋白和類似物以及其化學(xué)修飾衍生物。GDNF類似物包括諸如截短的GDNF蛋白的缺失變異體、以及GDNF的插入和置換變異體。亦包括與人GDNF蛋白基本同源的GDNF蛋白。GDNF療法GDNF療法有助于治療由損害一種或多種類型神經(jīng)細(xì)胞的生存和/或正常功能的疾病引起的神經(jīng)損害?？梢杂蓮V泛的各種不同的原因發(fā)生這種神經(jīng)損害。可以由以下原因使一種或多種類型的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生神經(jīng)損害(1)物理?yè)p傷，它導(dǎo)致?lián)p傷位點(diǎn)附近的軸索突起和/或神經(jīng)細(xì)胞體變性；(2)如在中風(fēng)中，血液至該神經(jīng)系統(tǒng)部分的流動(dòng)暫時(shí)或永久停止；(3)有意或意外對(duì)諸如治療腫瘤的化療劑(例如順鉑)或治療AIDS的二脫氧胞苷(ddC)的神經(jīng)毒素暴露；(4)慢性代謝病，例如糖尿病或腎功能障礙；或(5)神經(jīng)變性疾病，例如由特定神經(jīng)元群體變性引起的帕金森病、早老性癡呆和肌萎縮性側(cè)素硬化(ALS)。
幾項(xiàng)研究表明GDNF療法特別有助于治療神經(jīng)變性疾病，例如帕金森病中黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元變性。帕金森病目前唯一治療是治標(biāo)劑，目的在于增加紋狀體中多巴胺水平。GDNF療法的預(yù)期效果不僅僅是在紋狀體的多巴胺能神經(jīng)終端產(chǎn)生多巴胺能神經(jīng)傳遞增加(這將導(dǎo)致癥狀減輕)，而且減緩或甚至停止變性過(guò)程的進(jìn)程并修復(fù)黑質(zhì)紋狀體路徑并恢復(fù)其功能。GDNF亦可以用于治療人類病人多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的其它形式的損害或功能不正常。這種損害或機(jī)能失常可以發(fā)生于精神分裂癥和其它形式的精神病。目前對(duì)這種疾病的唯一治療是根據(jù)癥狀的并需要作用于多巴胺受體或多巴胺攝入位點(diǎn)的藥物，與神經(jīng)支配這些攜帶受體的神經(jīng)元群體的多巴胺能神經(jīng)元功能不正常參與該疾病過(guò)程的觀點(diǎn)一致。受體已經(jīng)表征和分子克隆許多介導(dǎo)與蛋白因子結(jié)合和對(duì)其應(yīng)答的受體，包括胰島素、血小板源生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子及其相關(guān)物、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、各種白介素、造血生長(zhǎng)因子受體和睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(U.S.5,426,177)的受體。研究結(jié)果表明，一些受體可以與多種(相關(guān))生長(zhǎng)因子結(jié)合，而在其它情況下同一因子可以結(jié)合并激活多種(相關(guān))受體(例如Lupu等，Science,249:1552-1555,1990；Dionne等，EMBOJ.,9:2685-2692,1990；Miki等，Science,251:72-75,1991)。大多數(shù)受體的廣義特征是具有負(fù)責(zé)特異性結(jié)合蛋白因子的胞外部分或結(jié)構(gòu)域、跨越細(xì)胞膜的跨膜域和一通常參與該蛋白因子結(jié)合至該受體的胞外部分時(shí)發(fā)動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)的胞內(nèi)域。盡管許多受體由一條多肽鏈組成，但其它受體明顯地需要兩個(gè)或更多的獨(dú)立亞基以與它們的蛋白因子以高親和性結(jié)合并在結(jié)合后允許功能性應(yīng)答(例如Hempstead等，Science,243:373-375,1989；Hibi等，Cell,63:1149-1157,1990)。
給定受體的胞外和胞內(nèi)部分可能與其它受體的對(duì)應(yīng)區(qū)域共享共同的結(jié)構(gòu)基序，提示在不同受體之間的進(jìn)化和功能關(guān)系。這些關(guān)系常?？赡苁窍嘞喈?dāng)遙遠(yuǎn)的并可能簡(jiǎn)單地反映某些一般域結(jié)構(gòu)的重復(fù)應(yīng)用。例如，與不相關(guān)因子結(jié)合的各種不同受體在它們的胞外部分中利用“免疫球蛋白”域，而其它受體則在其因子結(jié)合區(qū)使用“細(xì)胞因子受體”域(例如Akira等，The FASEB J.,4:2860-2867,1990)。很多具有獨(dú)特胞外結(jié)合域的受體(它因此結(jié)合不同的因子)含有編碼對(duì)因子結(jié)合應(yīng)答時(shí)被激活的酪氨酸特異性蛋白激酶的相關(guān)胞質(zhì)內(nèi)域(例如Ullrich和Schlessinger,Cell,61:203-212,1990)。對(duì)因子結(jié)合“激活”信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程的機(jī)制了解的很少，即使是在受體酪氨酸激酶的情況下。對(duì)胞內(nèi)域編碼未知功能域或結(jié)合組分與未知功能的第二個(gè)蛋白質(zhì)相聯(lián)系的其它受體(例如Hibi等，Cell,63:1149-1157,1990)而言，未有很好地表征信號(hào)傳導(dǎo)的激活。
在本領(lǐng)域中未清楚地闡明體內(nèi)GDNF作用的方式，部分是因?yàn)槿狈DNF受體的信息。兩個(gè)小組獨(dú)立地發(fā)現(xiàn)注射[125I]標(biāo)記的紋狀體可以被黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元逆行運(yùn)輸(Tomac等，Proceedings Of TheNational Academy Of Sciences Of The United States Of America.92,8274-8278,1995；Yan等，1995見上述)。亦觀察到由脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、DRG感覺神經(jīng)元和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)B層中的神經(jīng)元進(jìn)行的[125I]-GDNF逆行運(yùn)輸。這些逆行運(yùn)輸現(xiàn)象可以全部被100倍或更高濃度的未標(biāo)記GDNF特異性地抑制，提示一可飽和的、受體介導(dǎo)的運(yùn)輸過(guò)程。在體外，已顯示非常低濃度的重組GDNF增強(qiáng)培養(yǎng)的多巴胺能神經(jīng)元的生存和促進(jìn)其多巴胺攝入。觀察到的GDNF對(duì)這些神經(jīng)元的半最大有效濃度(EC50)是0.2-1.6pM(Lin等，1993見上述)。亦已顯示GDNF在低濃度下支持分離的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的生存。據(jù)報(bào)道GDNF對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的EC50范圍是5-10fM，甚至比對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的EC50還低(Henderson等，1994見上述)。
綜合來(lái)看，這些觀察表明在這些細(xì)胞中表達(dá)的GDNF受體具有非常高的配基結(jié)合親和性。與TGF-β家族的成員類似，GDNF的廣泛多樣化組織分布和對(duì)不同細(xì)胞群體的各種生物學(xué)功能提示可能存在GDNF的不同受體類型或受體復(fù)合體。[125I]-GDNF與E10雞交感神經(jīng)元的飽和穩(wěn)態(tài)和競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合已顯示這些神經(jīng)元表達(dá)的GDNF結(jié)合位點(diǎn)不同于在多巴胺能神經(jīng)元和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中觀察到的結(jié)合位點(diǎn)。GDNF對(duì)這些結(jié)合位點(diǎn)的半最大飽和濃度和半最大抑制濃度的范圍是1-5nM(Trupp等，1995見上述)。類似地，據(jù)報(bào)道GDNF支持P1大鼠SCG的交感神經(jīng)元生存的EC50亦在毫微摩爾范圍內(nèi)(Trupp等，1995見上述)。
為更好地理解GDNF激活信號(hào)傳導(dǎo)以對(duì)細(xì)胞施加影響的機(jī)制，鑒別介導(dǎo)與該蛋白因子結(jié)合并對(duì)其應(yīng)答的受體可能是有益的。對(duì)GDNF療法亦可能有益的是鑒別提供或增強(qiáng)GDNF信號(hào)傳導(dǎo)的輔助分子并使該輔助分子的生產(chǎn)成為可能。另外，GDNF的蛋白受體的鑒別將為診斷用途提供強(qiáng)大的應(yīng)用，例如做為輔助手段確定個(gè)體是否能從GDNF蛋白療法獲益。另外，GDNF的蛋白受體可能是鑒別其它與該受體結(jié)合并產(chǎn)生所需生物學(xué)活性的分子的檢測(cè)中的關(guān)鍵組分。
發(fā)明概述本發(fā)明提供編碼具有圖2和圖4(SEQ ID NO:2和4)描述的氨基酸序列的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白及其生物學(xué)等效類似物的核酸序列。本文將本發(fā)明的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白和蛋白產(chǎn)物稱為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體(GDNFR)蛋白和蛋白產(chǎn)物。所述新GDNFR的功能特征為特異性地并以高親和性與GDNF結(jié)合的能力、以及做為介導(dǎo)或增強(qiáng)GDNF信號(hào)傳導(dǎo)作用的分子復(fù)合體的部分起作用。通常以可溶性受體蛋白和基本純化的形式提供GDNFR蛋白產(chǎn)物。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供通過(guò)重組遺傳工程技術(shù)生產(chǎn)GDNFR蛋白產(chǎn)物。在另一實(shí)施方案中，通過(guò)化學(xué)技術(shù)、或重組和化學(xué)技術(shù)的結(jié)合合成所述GDNFR蛋白。
在本發(fā)明的另一方面，可以以糖基化或非糖基化形式制備所述GDNFR蛋白。GDNFR蛋白的衍生物通常涉及將該GDNFR蛋白連接至水溶性聚合物。例如，可以將該GDNFR蛋白結(jié)合至一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇分子，以減少該GDNFR蛋白產(chǎn)物在水溶性環(huán)境中的沉淀。
本發(fā)明的再一方面包括編碼GDNFR蛋白的各種多核苷酸。這些核酸序列用于在真核或原核宿主細(xì)胞中表達(dá)GDNFR，其中該表達(dá)產(chǎn)物或其衍生物的特征在于與GDNF結(jié)合并因此形成能夠介導(dǎo)GDNF活性的能力(例如增加多巴胺能細(xì)胞的多巴胺攝入)的復(fù)合體。所述多核苷酸亦可以用于細(xì)胞治療或基因治療應(yīng)用。適合的核酸序列包括那些在附圖中具體描述的序列以及簡(jiǎn)并序列、自然發(fā)生的等位基因變異和在本發(fā)明基礎(chǔ)上的修飾序列。
典型的核酸序列包括編碼神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白及其生物學(xué)等效類似物的序列，該蛋白包含圖2和圖4(SEQ ID NO.2和4)描述的氨基酸序列，并能夠與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)復(fù)合和介導(dǎo)對(duì)GDNF的細(xì)胞應(yīng)答。這種序列包括(a)在

圖1(SEQ ID NO.1)中陳述的包含編碼Met1至Ser465的核苷酸或圖3(SEQ ID NO.3)中陳述的包含編碼Met1至Ser468的核苷酸的序列，該序列編碼能與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)復(fù)合并介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)GDNF應(yīng)答的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體(GDNFR)；(b)一核酸序列，它(1)與(a)的互補(bǔ)序列雜交并(2)編碼具有GDNFR活性的氨基酸序列；和(c)一核酸序列，它若不是遺傳密碼的簡(jiǎn)并性將會(huì)與(a)的互補(bǔ)序列雜交并(2)編碼具有GDNFR活性的氨基酸序列。本文亦公開了這種核酸序列的載體，其中所述序列通常可操作地與一個(gè)或多個(gè)能夠?qū)崿F(xiàn)該核酸序列擴(kuò)增或表達(dá)的操作元件連接。亦考慮了含有這種載體的宿主細(xì)胞。該宿主細(xì)胞通常選自諸如分別為COS-7細(xì)胞或大腸桿菌的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞。
本發(fā)明的又一方面涉及含有編碼GDNFR蛋白的可操作地連接至擴(kuò)增和/或表達(dá)控制序列的多核苷酸的載體。原核和真核宿主細(xì)胞都可以用這種載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染，以表達(dá)GDNFR蛋白。本發(fā)明另外包括GDNFR蛋白的重組生產(chǎn)，其中將這種轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞生長(zhǎng)于合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，并可選地所述該宿主細(xì)胞和/或該營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基分離由所述細(xì)胞表達(dá)的GDNFR。本發(fā)明另外包括編碼GDNFR的多核苷酸和含有這種多核苷酸的載體在基因治療或細(xì)胞治療中的用途。
亦可以根據(jù)對(duì)人類植入物的合適性選擇宿主細(xì)胞，其中該植入細(xì)胞表達(dá)和分泌本發(fā)明的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體。亦可以將該宿主細(xì)胞封閉于適于人類植入的半透膜中?？梢噪x體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染該宿主細(xì)胞。治療神經(jīng)損害的典型裝置包括(a)適于植入的半透膜；和(b)包在該膜內(nèi)的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞表達(dá)并分泌本文公開的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體。從可透過(guò)該神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白但不能透過(guò)對(duì)所述囊封的細(xì)胞有害的物質(zhì)的材料選擇該膜。
亦公開了重組生產(chǎn)本發(fā)明神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體的方法。典型的方法包括(a)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞含有的核酸序列編碼本發(fā)明神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體或其生物學(xué)等效類似物，例如圖2和4(SEQ ID NO.2和4)描述的氨基酸序列，該序列可以與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)復(fù)合并介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)GDNF應(yīng)答；(b)將所述宿主細(xì)胞保持于適于所述宿主細(xì)胞表達(dá)所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體的條件下；和(c)可選地，分離由所述宿主細(xì)胞表達(dá)的所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體。該宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。如果涉及細(xì)菌表達(dá)，該方法還可以包括重折疊該神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體的步驟。
本發(fā)明包括分離和純化的蛋白或其生物學(xué)等效類似物，該蛋白包含圖2和4(SEQ ID NO.2和4)描述的氨基酸序列，該序列能夠與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)復(fù)合并介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)GDNF應(yīng)答。典型的類似物包括(但不限于)包含如圖2(SEQ ID NO:2)描述的Ser18-Pro446、Asp25-Leu447和Cys29-Cys442的氨基酸序列的蛋白以及如圖4(SEQ ID NO:4)描述的Met17-Pro449和Cys29-Cys443的氨基酸序列的蛋白。本發(fā)明的蛋白可以糖基化或非糖基化，并可以用重組技術(shù)或化學(xué)合成生產(chǎn)。本發(fā)明另外包括編碼包含這種氨基酸序列的受體蛋白的核酸序列。
本文亦公開包含本發(fā)明受體蛋白與藥學(xué)上接受載體載體的藥用組合物?？梢杂酶鞣N其它配制材料以促進(jìn)生產(chǎn)、儲(chǔ)存、處理、輸送和/或功效。
本發(fā)明的另一方面包括GDNFR基因和蛋白的治療用途。例如，循環(huán)性或可溶性GDNFR蛋白產(chǎn)物可以單獨(dú)使用或與GDNF聯(lián)用，通過(guò)提高GDNF跨膜信號(hào)發(fā)生的活性治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病或損傷。因此，本發(fā)明的蛋白和藥用組合物可以用于治療功能異常的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞、帕金森病、早老性癡呆和肌萎縮性側(cè)索硬化?；蛘?，可以將重組GDNFR基因插入可能從對(duì)GDNF較高的敏感性獲益的組織細(xì)胞中，例如患肌萎縮性側(cè)索硬化病人的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。在另一實(shí)施方案中，GDNFR可以用于在據(jù)信GDNF活性有害的情況下阻斷GDNF活性?？梢杂肎DNFR確認(rèn)觀察到的GDNF效果歸因于GDNFR。
在本發(fā)明的另一方面，GDNFR探針可以用于鑒別在正常或疾病狀態(tài)下對(duì)GDNF應(yīng)答的細(xì)胞和組織?；蛘撸撎结樋梢杂糜谠诨糋DNF相關(guān)疾病的病人中檢測(cè)GDNFR表達(dá)的異常。
在本發(fā)明的另一方面，包括核酸和抗體探針的GDNFR探針可以用于鑒別GDNFR相關(guān)分子。例如，本發(fā)明提供這種與GDNFR形成復(fù)合體并因此參與GDNFR功能的分子。做為另一例子，本發(fā)明提供與GDNFR同源或交叉反應(yīng)性抗原性但與GDNFR不同的受體分子。
本發(fā)明亦提供基于該受體的GDNF結(jié)合和功能檢測(cè)的開發(fā)。例如，檢測(cè)GDNF活性的檢測(cè)系統(tǒng)可以涉及表達(dá)高水平GDNFR、并因此對(duì)非常低濃度的GDNF或GDNF樣分子極端敏感的細(xì)胞。在再一實(shí)施方案中，可溶性GDNFR可以用于結(jié)合GDNF或GDNF樣分子或檢測(cè)GDNF或GDNF樣分子的存在。
另外，本發(fā)明提供研究GDNF生理作用的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ拖到y(tǒng)。這種系統(tǒng)包括涉及抗GDNFR抗體或寡核苷酸探針以及動(dòng)物模型的檢測(cè)，所述動(dòng)物模型例如為表達(dá)高水平GDNFR并因此對(duì)GDNF超敏感的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或用胚胎干細(xì)胞技術(shù)衍生的動(dòng)物，其中從其基因組中除去內(nèi)源GDNFR基因。抗GDNFR抗體將與所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白的肽部分結(jié)合。抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。或者，抗體已存在的免疫標(biāo)記可以連接至該GDNFR蛋白以協(xié)助檢測(cè)。這種標(biāo)記包括(但不限于)Flag序列(IBI/Eastman Kodak)和myc序列。諸如多聚組氨酸的其它標(biāo)記序列亦已用于檢測(cè)和在金屬螯合柱上的純化。
在考慮以下詳細(xì)描述本發(fā)明實(shí)踐的描述的情況下，本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點(diǎn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
附圖簡(jiǎn)述圖1描述編碼人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體(GDNFR)的核酸序列(SEQ ID NO:1)。該全長(zhǎng)GDNFR蛋白的氨基酸序列由核酸540-1934編碼。
圖2描述該全長(zhǎng)人GDNFR蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。
圖3描述編碼大鼠GDNFR的核酸序列(SEQ ID NO:3)。該全長(zhǎng)GDNFR蛋白的氨基酸序列由核酸302-1705編碼。
圖4描述該全長(zhǎng)大鼠GDNFR蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。
圖5描述在各種克隆中產(chǎn)生的GDNFR cDNA部分的直線排列和比較，以及人GDNFR的共有序列。
圖6描述表達(dá)GDNFR的Neuro-2A源細(xì)胞系的鑒定。
圖7A和7B描述[125I]GDNF與表達(dá)GDNFR的細(xì)胞平衡結(jié)合的結(jié)果。
圖8描述[125I]GDNF化學(xué)交聯(lián)至GDNFR的細(xì)胞中表達(dá)的GDNFR和Ret Expressed的結(jié)果。
圖9描述在表達(dá)GDNFR的細(xì)胞中GDNF誘導(dǎo)c-Ret自磷酸化的結(jié)果。
圖10描述GDNF和可溶性GDNFR誘導(dǎo)c-Ret自磷酸化的結(jié)果。
圖11描述Ret-Fc融合蛋白阻斷c-Ret自磷酸化的結(jié)果。
圖12描述運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中GDNF誘導(dǎo)c-Ret自磷酸化的結(jié)果。
圖13描述GDNFR和Ret介導(dǎo)的GDNF信號(hào)發(fā)生的模型。
本發(fā)明詳細(xì)說(shuō)明神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)是一對(duì)中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的各種細(xì)胞類型表現(xiàn)出廣譜生物學(xué)活性的有效神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。它是糖基化的二硫鍵連接的二聚體，與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)超家族有遙遠(yuǎn)的聯(lián)系(低于20％同源性)。GDNF增強(qiáng)多巴胺能神經(jīng)元和其它神經(jīng)元群體的能力證明了它治療帕金森病和其它形式的神經(jīng)損害或功能失常的治療潛力。
與對(duì)GDNF的分布和生物活性的廣泛研究相反，尚未有任何關(guān)于鑒別介導(dǎo)GDNF與細(xì)胞結(jié)合并因此介導(dǎo)胞內(nèi)信號(hào)發(fā)生和細(xì)胞應(yīng)答的一種或多種受體的報(bào)道。本發(fā)明基于在出生后大鼠的培養(yǎng)視網(wǎng)膜細(xì)胞表面首次發(fā)現(xiàn)的高親和性受體的發(fā)現(xiàn)。這些受體具有的估計(jì)GDNF結(jié)合親和性比得上在以下神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)的受體的親和性多巴胺能和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元；中腦多巴胺能神經(jīng)元(Lin等，1993見上述；Sauer等，1995見上述；Kearns和Gash,1995見上述；Beck等，1995見上述；Tomac等，1995a見上述)、面部和脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(Li等，1995見上述；Oppenheim等，1995見上述；Yan等，1995見上述；Zurn等，1994見上述；Henderson等，1994見上述)。該受體分子已被命名為GDNF受體(GDNFR)，因?yàn)樗荊DNF受體系統(tǒng)的第一個(gè)已知組分。本發(fā)明亦提供GDNFR蛋白的表達(dá)克隆和表征的首次描述。修飾以表達(dá)該重組受體的細(xì)胞以高親和性與GDNF結(jié)合。
使用多巴胺攝入檢測(cè)和[125I]-GDNF在培養(yǎng)細(xì)胞上的結(jié)合，在大鼠感光細(xì)胞表面檢測(cè)到GDNF的高親和性受體。正如在實(shí)施例中進(jìn)一步描述的，對(duì)感光細(xì)胞的研究導(dǎo)致通過(guò)GDNF受體的表達(dá)克隆分離cDNA克隆。GDNFR的核酸序列編碼一個(gè)具有468個(gè)氨基酸、31個(gè)半胱氨酸殘基和三個(gè)潛在N-糖基化位點(diǎn)的蛋白質(zhì)。接著，用該大鼠cDNA克隆的核酸序列分離其人同源物，發(fā)現(xiàn)該同源物在氨基酸水平上與該大鼠受體幾乎相同。該人GDNFR cDNA序列編碼一個(gè)具有465個(gè)氨基酸的蛋白，且其中所有半胱氨酸殘基和潛在N-糖基化位點(diǎn)相對(duì)于該大鼠受體都是保守的。一級(jí)序列的高度保守性表明該受體在GDNF生物學(xué)功能中的重要作用。
如上所述，許多受體有三個(gè)主結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)特異性結(jié)合蛋白因子的胞外或細(xì)胞表面域；跨越所述細(xì)胞膜的跨膜域；和一通常當(dāng)?shù)鞍滓蜃咏Y(jié)合至該受體的胞外域時(shí)參與發(fā)動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)的胞內(nèi)或胞質(zhì)域。然而，已確定GDNFR與任何已知蛋白的序列或結(jié)構(gòu)特征(例如在或者受體激酶或細(xì)胞因子受體中發(fā)現(xiàn)的共有序列)不相關(guān)、缺少胞質(zhì)域、缺少跨膜域的特征性C末端帶電荷殘基并通過(guò)糖基-磷脂酰肌醇(GPI)鍵連接錨定于細(xì)胞膜，正如以下更詳細(xì)地描述。盡管缺少胞內(nèi)催化域排除了在跨膜信號(hào)發(fā)生方面的直接作用，但該高度結(jié)合親和性和強(qiáng)進(jìn)化序列保守性進(jìn)一步提示該受體對(duì)GDNF功能的重要性。
因?yàn)镚DNFR缺少胞質(zhì)域，所以認(rèn)為該受體一定與一個(gè)或多個(gè)在跨膜信號(hào)發(fā)生中起作用的輔助分子聯(lián)合起作用。然后發(fā)現(xiàn)缺少GDNF基因的轉(zhuǎn)基因小鼠死亡并且沒有腎臟。發(fā)現(xiàn)缺少c-ret原癌基因的轉(zhuǎn)基因小鼠(Schuchardt等，Nature,367,380-383,1994)具有類似的表型。該c-ret原癌基因編碼正常功能尚未確定的受體酪氨酸激酶(RTK)。所有的RTK都具有類似的拓?fù)鋵W(xué)它們具有胞外配基結(jié)合域、跨膜域和含有該催化性蛋白-酪氨酸激酶域的胞質(zhì)部分。配基的結(jié)合導(dǎo)致該激酶域激活和所述細(xì)胞中介導(dǎo)胞內(nèi)信號(hào)發(fā)生的特定底物的磷酸化。本發(fā)明涉及發(fā)現(xiàn)GDNFR的可溶性形式可以用于介導(dǎo)GDNF與該c-ret原癌基因結(jié)合并因此引出對(duì)GDNF的細(xì)胞應(yīng)答以及修飾其細(xì)胞類型特異性。
類似的稱為“受體α”組分的物質(zhì)提供配基結(jié)合特異性，但不具有靠自己傳導(dǎo)信號(hào)的能力。在睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)和白介素-6(IL-6)受體系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)這種組分。與GDNFR類似并與IL-6受體相反，CNTF受體以高親和性與其配基結(jié)合、具有疏水性C末端、沒有胞質(zhì)域并靠GPI連接錨定于細(xì)胞膜(Davis等，1991)。為介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)，CNTF首先與CNTF受體結(jié)合，產(chǎn)生一個(gè)能夠與gp130結(jié)合的復(fù)合體。該無(wú)活性復(fù)合體然后與LIF受體結(jié)合以形成活性信號(hào)發(fā)生復(fù)合體(Davis等，Science,260,1805-1807,1993)。正如與本發(fā)明一樣，CNTF受體(配基特異性結(jié)合組分)必須存在以進(jìn)行信號(hào)發(fā)生，但它不必是膜結(jié)合的(Economides等，Science,270,1351-1353,1995)。
正如以下進(jìn)一步所述，GDNFR蛋白可以錨定于細(xì)胞表面，或它可以以可溶性形式提供。在這二種情況下，GDNFR蛋白與GDNF形成配基復(fù)合體，并且該配基復(fù)合體與細(xì)胞表面受體結(jié)合以實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)信號(hào)發(fā)生。因此，可以使用可溶性形式的GDNFR加強(qiáng)GDNF的作用和/或修飾其細(xì)胞類型特異性。
GDNFR與任何已知受體不相關(guān)。在GenBank和華盛頓大學(xué)-默克數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有相關(guān)序列的明顯相配物。在華盛頓大學(xué)-默克EST數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)表達(dá)的序列標(biāo)記(EST)顯示與GDNFR編碼區(qū)的一小部分(從該克隆5’端產(chǎn)生的序列的521個(gè)核苷酸的約340個(gè)核苷酸)有75％同源性。該克隆(GenBank登記號(hào)碼#H12981)系從寡聚-dT引物人嬰兒腦文庫(kù)分離并定向地克隆進(jìn)入Lafmid BA載體(Hillier,L.等，未出版數(shù)據(jù))。該#H12981克隆的3’端已被測(cè)序，但是它與該GDNFR的任何部分都沒有顯示出同源性。該#H12981克隆和GDNFR之間的在一短區(qū)上表現(xiàn)出同源性、然后該同源性消失，提示該#H12981克隆代表一未剪接轉(zhuǎn)錄物或克隆人工產(chǎn)物，而不是真正的cDNA轉(zhuǎn)錄物。
因此，本發(fā)明使能夠通過(guò)提供選擇表達(dá)GDNFR的靶細(xì)胞的方法克隆GDNFR蛋白。通過(guò)提供富集GDNFR編碼序列的手段，本發(fā)明還提供GDNFR蛋白的純化和GDNFR編碼DNA的直接克隆。該GDNFR核酸和氨基酸序列的現(xiàn)行描述提供復(fù)制這些實(shí)體以及各種GDNFR類似物的必要信息。有了該信息，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法分離或制備GDNFR蛋白產(chǎn)物。公開了重組或合成生產(chǎn)GDNFR蛋白的各種方法。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“GDNFR蛋白產(chǎn)物”包括生物學(xué)活性的純化的天然、合成或重組GDNFR、GDNFR類似物(即GDNFR同源物和涉及插入、置換和缺失變異的變異體)、及其化學(xué)修飾衍生物。GDNFR類似物基本上與圖2和4(SEQ ID NO:2和4)陳述的GDNFR氨基酸序列同源。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)活性”指該GDNFR蛋白產(chǎn)物表現(xiàn)出以高親和性地與GDNF結(jié)合并介導(dǎo)或增強(qiáng)GDNF誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)。使用本說(shuō)明書，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員有能力確定GDNFR多肽類似物是否具有與圖2和4中陳述的GDNFR蛋白產(chǎn)物基本相同的生物學(xué)活性。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“基本同源的”氨基酸序列指與圖2和4中陳述的GDNFR氨基酸序列有一定“類似”度或同源的氨基酸序列，使得該同源序列具有的生物學(xué)活性或功能與這些GDNFR氨基酸序列描述的類似。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，在一個(gè)氨基酸序列中有相當(dāng)多的單個(gè)或成組的氨基酸殘基可以被更換、交換位置(例如反向排列或重新排列)或完全缺失，而不影響該分子的三維構(gòu)象或活性。按照本說(shuō)明書，這種修飾完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。在以下更詳細(xì)地描述提供這種修飾序列的鑒別和方法?；就吹鞍?肽)的同源度優(yōu)選為不低于70％(即同源性范圍為70％-100％)。因此，一優(yōu)選的“基本同源的”GDNFR氨基酸序列與SEQ ID NO:2和4陳述的氨基酸序列的同源性可以大于或等于70％。該同源性更優(yōu)選地不低于85％。該同源性甚至更優(yōu)選地不低于90％，或該同源性最優(yōu)選地不低于95％。
本文描述的同源性百分比是以在一個(gè)蛋白序列中發(fā)現(xiàn)的氨基酸殘基與第二個(gè)蛋白序列中的相等或類似氨基酸殘基匹配的百分比計(jì)算的。因此，有關(guān)GDNFR的同源性，可以通過(guò)將欲比較分子的氨基酸殘基最佳地與參比GDNFR多肽(諸如陳述于SEQ ID NO:2和4的)或附圖中陳述的核酸序列編碼的氨基酸殘基匹配，以使這兩個(gè)序列之間達(dá)到殘基的最大匹配。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解這種匹配可以包括適當(dāng)?shù)谋Ｊ匕被嶂脫Q，并將按照需要通過(guò)引入間隙而不理睬該比較序列的截?cái)嗪蛢?nèi)部缺失或插入；參見例如Dayhoff，蛋白序列和結(jié)構(gòu)圖集(Atlas of Protein Sequence and Structure)第五卷，其中在100個(gè)氨基酸長(zhǎng)度中可以平均導(dǎo)入三或四個(gè)間隙以幫助匹配(第124頁(yè)，國(guó)立生化研究基金會(huì)，Washington,D.C.,1972；其說(shuō)明書通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。一旦這樣匹配后，將該比較多肽中的匹配殘基數(shù)量除以該比較多肽中的殘基總數(shù)確定百分比。另外考慮本發(fā)明的GDNFR序列可以用于形成一個(gè)具有至少部分GDNFR活性的融合蛋白或嵌合蛋白的部分。使用與GDNFR活性相關(guān)的該融合蛋白活嵌合蛋白部分確定這種蛋白的匹配和同源性。
這種基本同源GDNFR蛋白的來(lái)源包括預(yù)期與該人GDNFR蛋白有高度同源性的其它哺乳動(dòng)物的GDNFR蛋白。例如，大鼠GDNFR蛋白與本文公開的人GDNFR蛋白的同源性程度為約93％?；就吹腉DNFR蛋白可以借助與SEQ ID NO:2和4的氨基酸序列的抗體的交叉反應(yīng)性從這種哺乳動(dòng)物中分離?；蛘?，它們可以由通過(guò)與編碼SEQID NO:2和4的GDNFR的基因或基因區(qū)段雜交分離的核酸序列或與SEQ ID NO:2和4描述的核酸序列的互補(bǔ)序列雜交的核酸序列表達(dá)。在以下更詳細(xì)地描述合適的雜交條件。
通常分離和純化該新GDNFR蛋白產(chǎn)物，以形成基本上不含會(huì)減損本多肽用于預(yù)期目的的用途的不需要的物質(zhì)。例如，優(yōu)選的GDNFR蛋白產(chǎn)物可以基本上不含其它人(例如非GDNFR)蛋白性材料或病理因子。所述GDNFR蛋白產(chǎn)物優(yōu)選地約80％不含有因該GDNFR蛋白產(chǎn)物的生產(chǎn)中使用的生產(chǎn)技術(shù)而存在的其它蛋白。更優(yōu)選的是，所述GDNFR蛋白產(chǎn)物約90％不含有其它蛋白，特別優(yōu)選的是，約95％不含有其它蛋白，更優(yōu)選的是，約超過(guò)98％不含有其它蛋白。另外，本發(fā)明提供為同源性GDNFR蛋白生產(chǎn)提供多核苷酸序列的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。
考慮了各種GDNFR變異體，包括添加、缺失和置換變異體。例如，可以通過(guò)從該GDNFR蛋白的氨基和/或羧基末端除去一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基制造一系列缺失變異體。使用von Heijne描述的預(yù)測(cè)信號(hào)肽切割的法則(von Heijne,Nucleic Acids Research,14,4683-4690,1986)，該GDNFR蛋白的可能參與GDNF結(jié)合的第一個(gè)氨基酸殘基是Ser18，正如圖2(SEQ ID NO:2)中的人GDNFR全長(zhǎng)氨基酸序列描述的。氨基酸殘基Met1-Ser18位于氨基末端疏水區(qū)，該區(qū)有可能是信號(hào)肽序列的一部分，因此未被包括于該受體蛋白的成熟形式中。同樣地，該GDNFR蛋白的對(duì)GDNF結(jié)合有可能是必要的最后一個(gè)氨基酸殘基是Ser446。氨基酸殘基Leu447-Ser465位于參與該蛋白至所述細(xì)胞表面的GPI連接的羧基末端疏水性區(qū)。因此，考慮從Met1-Ser18和/或Leu447-Ser465(如圖2描述的(SEQ ID NO:2))任何殘基或所有殘基都可以從該蛋白中除去而不影響GDNF與該GDNFR蛋白結(jié)合，因此留下一個(gè)Ala19-Pro446的“核心”序列。使用已知分析技術(shù)，進(jìn)一步考慮N末端的截短可以包括除去一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基直至并包括Gly24。因此，GDNFR截短類似物亦可以包括從兩個(gè)末端之一或從兩個(gè)末端缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，使得Asp25-Pro446或Leu447的氨基酸序列形成核心分子的基礎(chǔ)?？紤]其它的GDNFR類似物，它們涉及如圖4(SEQ IDNO:4)的GDNFR氨基酸序列描述的Ser18-Pro449的氨基酸殘基，即從涉及做為氨基酸殘基Met1-Ser18和/或Pro449-Ser468描述的疏水性區(qū)的兩個(gè)末端之一個(gè)或兩個(gè)末端缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。
另外，考慮可以從氨基和羧基末端之一或這兩個(gè)末端除去一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基直至到達(dá)該全長(zhǎng)序列的第一個(gè)和最后一個(gè)半胱氨酸殘基。保持所述半胱氨酸殘基對(duì)該GDNFR蛋白的正確分子內(nèi)結(jié)合是有利的。正如圖2(SEQ ID NO:2)中人GDNFR全長(zhǎng)氨基酸序列中描述的，可以從該氨基末端除去Met1-Asp28的任何或所有氨基酸殘基，而不除去做為Cys29出現(xiàn)的第一個(gè)半胱氨酸殘基。類似地，可以從該羧基末端除去Gly443-Ser465的任何或所有氨基酸殘基，而不除去做為Cys442出現(xiàn)的最后一個(gè)半胱氨酸殘基。使用如圖4(SEQ ID NO:4)的GDNFR氨基酸序列中描述的氨基酸殘基Cys29-Cys443，可以制備其它GDNFR類似物，即除去做為氨基酸殘基Met1-Asp28和/或Ser444-Ser468描述的所有或部分該末端區(qū)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，由于相同的原因，考慮在不影響該GDNFR蛋白功能的情況下可以置換而不是缺失這些鑒定的氨基酸殘基。或者，可以通過(guò)殘基內(nèi)插入或末端添加修飾這些鑒定的氨基酸殘基，而不影響該GDNFR蛋白的功能。在再一實(shí)施方案中，可以制備一個(gè)或多個(gè)缺失、置換或添加的組合物。
所述GDNFR蛋白或核酸可以用于治療方法、或用于治療的藥物的生產(chǎn)方法。這種治療包括以GDNFR蛋白過(guò)量產(chǎn)生為特征的疾病，其中本GDNFR、特別是可溶性形式可以用于與這種過(guò)量的GDNF蛋白復(fù)合并因此將其失活。通過(guò)制備可溶性受體(例如使用該GDNF結(jié)合域)，或通過(guò)制備含有這種GDNFR的細(xì)胞群并將這種細(xì)胞移植入有此需要的個(gè)體可以完成這種治療。本GDNFR蛋白產(chǎn)物亦可以用于治療具有缺陷GDNF受體的那些患者。例如，可以通過(guò)制備并傳遞可溶性受體，或通過(guò)制備含有這種非缺陷GDNFR的細(xì)胞群，并將這種細(xì)胞移植入個(gè)體中治療具有缺陷GDNFR的個(gè)體?；蛘撸瑐€(gè)體具有的GDNF受體數(shù)量可能不足，可以將含有這種受體的細(xì)胞移植以增加個(gè)體可獲得的GDNF受體數(shù)量。這種組合物可以與GDNF傳遞聯(lián)用。亦考慮GDNFR蛋白產(chǎn)物可以用于治療對(duì)c-ret受體酪氨酸激酶應(yīng)答的疾病。
在本發(fā)明的再一方面，所述新組合物的另一優(yōu)點(diǎn)是使用GDNFR穩(wěn)定GDNF蛋白藥用組合物。在本發(fā)明的另一方面，可以使用GDNFR篩選拮抗劑活性化合物。
本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點(diǎn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。例如，其它的用途包括新檢測(cè)系統(tǒng)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和抗體生產(chǎn)。研究模型本發(fā)明提供檢測(cè)系統(tǒng)，其中由接觸肽或非肽化合物引起的GDNF活性或類似GDNF活性的活性，可以通過(guò)測(cè)定在表達(dá)本發(fā)明GDNFR分子的細(xì)胞或細(xì)胞系中引出的生理反應(yīng)而檢測(cè)。生理反應(yīng)可以包含GDNF的任何生物學(xué)效應(yīng)，包括(但不限于)多巴胺攝入、軸突伸展、細(xì)胞生存或生長(zhǎng)增強(qiáng)、以及某些核酸序列(例如啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件以及結(jié)構(gòu)基因)的轉(zhuǎn)錄激活、GDNF相關(guān)加工、轉(zhuǎn)譯、或磷酸化和誘導(dǎo)對(duì)由GDNF直接或間接誘導(dǎo)的過(guò)程應(yīng)答的二級(jí)過(guò)程，僅提及了幾個(gè)。
例如，可以創(chuàng)造模型系統(tǒng)，它可以用于研究過(guò)量GDNF活性的作用。在這種系統(tǒng)中，通過(guò)工程改造使該模型系統(tǒng)細(xì)胞上的GDNFR數(shù)量相對(duì)于未進(jìn)行這種修飾的細(xì)胞增加，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)GDNF的應(yīng)答。亦可以開發(fā)系統(tǒng)，以選擇性地提供正常表達(dá)GDNFR的細(xì)胞上增加量的GDNFR。為確保表達(dá)GDNFR，該GDNFR基因可以置于適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列的控制之下?？赡苄枰獙⒃揋DNFR基因置于組成型和/或組織特異性啟動(dòng)子(包括但不限于CNS神經(jīng)元特異性烯醇化酶、神經(jīng)微絲和酪氨酸羥化酶啟動(dòng)子)、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(例如金屬硫蛋白啟動(dòng)子)、人免疫缺陷病毒長(zhǎng)末端重復(fù)區(qū)的UV激活啟動(dòng)子(Valeri等，1988,Nature333:78-81)、或CMV啟動(dòng)子(亦包含于pCMX，見下述)或發(fā)育調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的控制之下。
通過(guò)增加細(xì)胞GDNFR的數(shù)量，可以增強(qiáng)對(duì)內(nèi)源GDNF的應(yīng)答。如果該模型系統(tǒng)幾乎不含或不含GDNF，可以將GDNF加入該系統(tǒng)。亦可能需要向該模型系統(tǒng)加入額外的GDNF，以評(píng)價(jià)過(guò)量GDNF活性的效果。過(guò)度表達(dá)GDNF(或分泌GDNF)可以是研究在已經(jīng)表達(dá)GDNFR的細(xì)胞上GDNF較高水平影響的方法。GDNFR療法在另一方面中，某些疾病可以從GDNF應(yīng)答性增強(qiáng)中獲益。因此，增加患對(duì)GDNF療法應(yīng)答疾病的病人中GDNFR數(shù)量或GDNFR的結(jié)合親和性可能是有益的。這可以通過(guò)基因治療達(dá)到，藉此達(dá)到在適當(dāng)?shù)募?xì)胞中選擇性表達(dá)重組GDNFR，例如，通過(guò)使用由組織特異性或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制的GDNFR基因或通過(guò)用攜帶重組GDNFR基因的復(fù)制缺陷型病毒產(chǎn)生局部感染。
預(yù)計(jì)將從GDNFR或聯(lián)合GDNF/GDNFR傳遞獲益的疾病包括(但不限于)包括肌萎縮性側(cè)索硬化的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病、糖尿病相關(guān)神經(jīng)病、帕金森病、早老性癡呆和亨廷頓舞蹈病。其它適于GDNFR或聯(lián)合GDNF/GDNFR傳遞用途的疾病以上已描述并另外包括以下疾病的治療青光眼或涉及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞變性的其它疾病和紊亂；由感覺神經(jīng)元損傷、受危害或變性引起的感覺神經(jīng)?。徊±硇约膊?，例如遺傳性視網(wǎng)膜變性和與年齡、疾病或損傷相關(guān)的視網(wǎng)膜病，其中發(fā)生感光體變性并導(dǎo)致失明；諸如為防止和/或治療因各種原因引起的聽力喪失的毛細(xì)胞和聽覺神經(jīng)元的內(nèi)耳感覺細(xì)胞的損傷或變性。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在另一方面，可以用重組GDNFR基因失活或“剔除”該內(nèi)源基因(例如通過(guò)同源重組)，并因此創(chuàng)造出GDNFR缺陷細(xì)胞、組織或動(dòng)物。例如，可以工程改造重組GDNFR基因使含有使GDNFR失活的插入突變。這種在適當(dāng)啟動(dòng)子控制下的構(gòu)建物可以通過(guò)任何常規(guī)技術(shù)(包括轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、注射等等)導(dǎo)入細(xì)胞，例如胚胎性干細(xì)胞。可以通過(guò)例如G418抗性選擇含有該構(gòu)建物的細(xì)胞。然后鑒別缺少完整GDNFR基因的細(xì)胞(例如通過(guò)Southern印跡法或Northem印跡法或表達(dá)檢測(cè))。然后將缺少完整GDNFR基因的細(xì)胞與早期胚胎細(xì)胞融合，以產(chǎn)生GDNFR缺陷的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。將這種動(dòng)物與不表達(dá)內(nèi)源GDNF的動(dòng)物比較將顯示或者這二種表型完全匹配或者它們不匹配，暗示其它GDNF樣因子或受體的存在?？梢杂眠@種動(dòng)物定義特定神經(jīng)元群體或通常依賴GDNF的其它體內(nèi)過(guò)程。因此，如果該動(dòng)物不表達(dá)GDNFR并因此不能對(duì)GDNF應(yīng)答，預(yù)期這些群體或過(guò)程會(huì)受影響。診斷應(yīng)用按照本發(fā)明，可以用GDNFR探針鑒別在正?；蚣膊顟B(tài)下對(duì)GDNF應(yīng)答的細(xì)胞和組織。本發(fā)明提供通過(guò)檢測(cè)這種細(xì)胞中的GDNFR鑒別對(duì)GDNF應(yīng)答的細(xì)胞的方法。可以通過(guò)GDNFR mRNA轉(zhuǎn)錄或產(chǎn)生GDNFR蛋白證實(shí)GDNFR表達(dá)。用鑒別GDNFR核酸或蛋白的探針檢測(cè)或通過(guò)檢測(cè)人工加入該GDNFR蛋白的“標(biāo)記”序列檢測(cè)GDNFR表達(dá)。
一種可以用于檢測(cè)GDNFR表達(dá)的探針是核酸探針，它可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法(包括但不限于原位雜交、Northern印跡分析或PCR相關(guān)技術(shù))用來(lái)檢測(cè)GDNFR編碼RNA。本發(fā)明的核酸產(chǎn)物可以用可檢測(cè)標(biāo)記物(例如放射性標(biāo)記和例如生物素的非同位素標(biāo)記)標(biāo)記并用于雜交過(guò)程，以在染色體圖譜中確定該人GDNFR基因的位置和/或任何相關(guān)基因家族的位置。它們亦可用于鑒別DNA水平上的人GDNFR基因疾病并做為鑒別相鄰基因及其疾病的基因標(biāo)記使用。本文亦考慮含有這種標(biāo)記材料的藥盒。
本發(fā)明的多肽產(chǎn)物可以通過(guò)與可檢測(cè)標(biāo)記物或標(biāo)記(例如放射性同位素、熒光或化學(xué)發(fā)光化學(xué)藥品、酶或其它對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員可得到的標(biāo)記)結(jié)合，而提供可以用于在固體組織和諸如血液或尿液的流體樣品中GDNF的檢測(cè)和定量的試劑。這種產(chǎn)物亦可用于檢測(cè)在正?；蚣膊顟B(tài)下對(duì)GDNF應(yīng)答的細(xì)胞和組織。
另一可能用于檢測(cè)測(cè)試樣品中GDNF的存在或篩選GDNF樣分子的存在的檢測(cè)法，涉及使該測(cè)試樣品接觸固定化于固相的GDNFR肽，因而產(chǎn)生GDNFR結(jié)合的GDNF。該GDNFR結(jié)合的GDNF可以可選地接觸檢測(cè)試劑，例如GDNF特異性標(biāo)記抗體，從而形成一個(gè)可檢測(cè)的產(chǎn)物。這種檢測(cè)法可以以分析測(cè)試樣品的檢測(cè)儀器的形式開發(fā)。在基本形式下，這種儀器包括含有或包被GDNFR的固相。分析測(cè)試樣品中GDNF存在的方法涉及將該樣品接觸包含GDNFR蛋白的檢測(cè)試劑，其中所述GDNFR蛋白與存在于該測(cè)試樣品中的GDNF反應(yīng)并產(chǎn)生表明GDNF存在的可檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物。
本文提供的檢測(cè)試劑亦可做為藥盒或生產(chǎn)的商品的部分體現(xiàn)?？紤]一包含包裝材料和一種或多種本文提供的核酸序列或氨基酸序列的制備物的生產(chǎn)商品。這種包裝材料將包含表明該制備物可以用于檢測(cè)生物學(xué)樣品中GDNF、GDNFR或GDNFR缺陷的標(biāo)簽。照這樣，該藥盒可以可選地包括進(jìn)行這種測(cè)試的材料，例如用于進(jìn)行血液、尿液或組織樣品中蛋白分析、DNA或RNA雜交分析或PCR分析的試劑?？笹DNFR抗體按照本發(fā)明，GDNFR蛋白或其片段或其衍生物可以做為產(chǎn)生抗GDNFR抗體的免疫原使用。為進(jìn)一步增加產(chǎn)生抗GDNFR免疫應(yīng)答的可能性，可以分析GDNFR的氨基酸序列，以鑒別可能與增強(qiáng)的免疫原性相關(guān)的分子部分。例如，可以對(duì)該氨基酸序列進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析，以鑒別代表計(jì)算機(jī)產(chǎn)生的GDNFR的親水性、表面概率、撓性、抗原指數(shù)、兩親螺旋、兩親片層和二級(jí)結(jié)構(gòu)的表面表位?；蛘?，可以比較來(lái)自不同物種的GDNFR的氨基酸序列并鑒別相對(duì)非同源區(qū)；這些非同源區(qū)更有可能在各種物種之間是免疫原性的。
亦包括僅復(fù)制GDNFR內(nèi)連續(xù)氨基酸序列或二級(jí)構(gòu)象的一部分的多肽片段，所述片段可以具有哺乳動(dòng)物GDNFR的一種活性(例如免疫學(xué)活性)而不具有其它活性(例如GDNF蛋白結(jié)合活性)。因此，抗體的生產(chǎn)可以包括抗肽抗體的生產(chǎn)。以下是用GDNFR序列合成的典型的肽
表1GDNFR肽SJP-6 H2N-QSCSTKYRTL-COOH人GDNFR,AA 40-49(SEQ IDNO:25)SJP-7 H2N-CKRGMKKEKN-COOH人GDNFR,AA 89-98(SEQ IDNO:26)SJP-8 H2N-LLEDSPYEPV-COOH人GDNFR,AA 115-124(SEQID NO:27)SJP-9 H2N-CSYEERERPN-COOH大鼠GDNFR,AA 233-242(SEQ ID NO:28)SJP-10H2N-PAPPVQTTTATTTT-COOH大鼠GDNFR,AA 356-369(SEQ ID NO:29)肽SJP-6、7和8在大鼠和人GDNFR中是相同的。肽SJP-9和10得自該大鼠序列，每種都有一個(gè)氨基酸與人不同。使用這些肽或GDNFR的其它部分，通過(guò)本領(lǐng)域已知方法可以制備多克隆抗體和單克隆抗體。
抗GDNFR的單克隆抗體可以通過(guò)任何已知的通過(guò)培養(yǎng)中的連續(xù)細(xì)胞系生產(chǎn)抗體分子的技術(shù)制備。例如，可以使用首先由Kohler和Milstein發(fā)展的產(chǎn)生單克隆抗體的技術(shù)(Nature,256:495-497,1975)、以及trioma技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等，Immunology Today4:72,1983)、EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等，載于“單克隆抗體和癌癥治療(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)”,Alan R.Liss,Inc.第77-96頁(yè)，1985)等等。
人單克隆抗體或嵌合人-鼠(或其它物種)單克隆抗體亦可以制備用于治療用途，并通過(guò)本領(lǐng)域已知的眾多技術(shù)的任何技術(shù)制備(例如Teng等，Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.,80:7308-7312,1983；Kozbor等，Immunology Today,4:72-79,1983；Olsson等，Meth.Enzymol.,92:3-16,1982)?？梢灾苽浜行∈罂乖Y(jié)合域與人恒定區(qū)的嵌合抗體分子(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.SA.,81:6851,1984；Takeda等，Nature,314:452,1985)。
亦可以用本領(lǐng)域已知的各種方法生產(chǎn)多克隆抗體。為生產(chǎn)抗體，可以通過(guò)注射GDNFR蛋白或其片段或其衍生物免疫各種宿主動(dòng)物，該宿主動(dòng)物包括(但不限于)兔子、小鼠、大鼠等。根據(jù)選擇的宿主物種，可以使用各種佐劑增強(qiáng)該免疫應(yīng)答。有用的佐劑包括(但不限于)弗氏(完全和不完全)佐劑、例如氫氧化鋁的無(wú)機(jī)凝膠、表面活性物質(zhì)例如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚陰離子、肽、油乳液、鑰孔_血藍(lán)蛋白、二硝基苯酚和人類佐劑，例如BCG(卡介菌)和粉刺丙酸菌。
亦可以通過(guò)已知技術(shù)制備GDNFR表位的抗體的分子克隆?？梢杂弥亟MDNA技術(shù)(參見例如Maniatis等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約，1982)構(gòu)建編碼單克隆抗體分子或其抗原結(jié)合區(qū)的核酸序列。
抗體分子可以通過(guò)已知方法純化，例如免疫吸附或免疫親和層析，諸如高壓液相色譜的層析方法或其組合。本發(fā)明提供抗體分子以及這種抗體分子的片段?？梢酝ㄟ^(guò)已知方法制備含有該分子個(gè)體基因型的抗體片段。例如，這種片段包括(但不限于)通過(guò)胃蛋白酶消化該抗體分子產(chǎn)生的F(ab’)2片段；通過(guò)還原該F(ab’)2片段的二硫橋產(chǎn)生的Fab’片段和通過(guò)用木瓜蛋白酶和還原劑處理該抗體分子產(chǎn)生的Fab片段。
這種選擇性結(jié)合分子本身可以做為GDNFR蛋白的替換物，并可以配制成藥用組合物。GDNFR蛋白的重組表達(dá)本發(fā)明提供編碼GDNFR蛋白的各種多核苷酸。該表達(dá)產(chǎn)物或其衍生物的特征在于這樣一種能力與GDNF特異性地并高親和性地結(jié)合，以便可以發(fā)生與信號(hào)發(fā)生分子的進(jìn)一步的相互作用，由此提供或增強(qiáng)諸如增加多巴胺能細(xì)胞的多巴胺攝入的GDNF活性。所述多核苷酸亦可以用于細(xì)胞治療或基因治療應(yīng)用中。
按照本發(fā)明，提供新GDNFR蛋白和編碼這種受體的全部或部分的DNA序列。本發(fā)明的新核酸序列包括用于在原核或真核宿主細(xì)胞中保證表達(dá)具有重組人GDNFR的至少一部分一級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象和一種或多種生物學(xué)性質(zhì)的多肽產(chǎn)物的序列?？梢约兓头蛛x所述核酸，使得所需編碼區(qū)可以用于產(chǎn)生本多肽?；蛘撸摵怂峥梢杂糜谠\斷目的，如以下更全面敘述的。本發(fā)明的典型DNA序列包含編碼圖2和4描述并由SEQ ID NO:2和4陳述的GDNFR氨基酸序列的核酸序列。另外，本發(fā)明公開的DNA序列具體包含(a)任何在圖1和圖3中描述的DNA序列(和互補(bǔ)鏈)；(b)與(a)小節(jié)中的DNA序列或其片段雜交(在以下的cDNA文庫(kù)篩選一節(jié)中公開的雜交條件下，或相當(dāng)?shù)臈l件或更嚴(yán)格的條件)的DNA序列；和(c)如果不是因?yàn)檫z傳密碼的簡(jiǎn)并性就將會(huì)與(a)小節(jié)中的DNA序列雜交的DNA序列。(b)和(c)具體地包括編碼人GDNFR等位基因變異體形式和/或編碼來(lái)自其它哺乳動(dòng)物物種的GDNFR的基因組DNA序列、和編碼GDNFR、GENFR片段和GDNFR類似物的制造DNA序列，所述序列可以加入在微生物宿主中促進(jìn)信使RNA轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯的密碼子。這種制造序列可以按照本領(lǐng)域已知的方法以及本文描述的方法容易地構(gòu)建。
可以用按照本文的描述或其它已知方法進(jìn)行的重組表達(dá)技術(shù)產(chǎn)生這些多核苷酸并表達(dá)所述各種GDNFR蛋白。例如，通過(guò)將編碼GDNFR蛋白的核酸序列插入適當(dāng)?shù)妮d體，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地生產(chǎn)大量的所需核酸序列。然后可以用所述序列產(chǎn)生檢測(cè)探針或擴(kuò)增引物?；蛘?，可以將編碼GDNFR蛋白的多核苷酸插入表達(dá)載體。通過(guò)將該表達(dá)載體導(dǎo)入適當(dāng)宿主，可以大量產(chǎn)生所需GDNFR蛋白。
如本文進(jìn)一步所述，有許多可以用于增殖核酸序列和/或生產(chǎn)GDNFR蛋白的宿主/載體系統(tǒng)。這些包括(但不限于)質(zhì)粒、病毒和插入載體、和原核和真核宿主。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以改造能增殖或表達(dá)異源DNA的宿主/載體系統(tǒng)，以生產(chǎn)或表達(dá)本發(fā)明的序列。
通過(guò)這種重組技術(shù)，可以容易地生產(chǎn)商業(yè)數(shù)量且較高純度的本發(fā)明的GDNFR蛋白。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，鑒于本說(shuō)明書，所述新核酸序列包括編碼附圖中具體陳述的GDNFR蛋白的簡(jiǎn)并核酸序列、編碼GDNFR蛋白變異體的序列、和那些最好是在嚴(yán)格雜交條件下與這些核酸序列的互補(bǔ)物雜交核酸序列(參見例如Maniatis等，分子克隆(實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))；冷泉港實(shí)驗(yàn)室，第387-389頁(yè)，1982)。典型的嚴(yán)格雜交條件是于62-67℃在4×SSC中雜交，接著于62-67℃在0.1×SSC中清洗約1小時(shí)?；蛘?，典型的嚴(yán)格雜交條件是于40-45℃在45-55％甲酰胺、4×SSC中雜交。本文亦包括在松弛的條件下與GDNFR蛋白的互補(bǔ)序列雜交并編碼本發(fā)明的GDNFR蛋白的DNA序列。這種松弛的嚴(yán)格雜交條件的例子是于45-55℃4×SSC或于40-45℃用30-40％甲酰胺雜交。制備編碼GDNFR的多核苷酸根據(jù)本發(fā)明的說(shuō)明書，通過(guò)各種方法，包括(但無(wú)限制性)化學(xué)合成、cDNA或基因組文庫(kù)篩選、表達(dá)文庫(kù)篩選和/或cDNA的PCR擴(kuò)增，可以容易地制備或獲得編碼全長(zhǎng)GDNFR多肽或其片段的核酸序列。這些方法和其它用于制備核酸序列的方法均為本領(lǐng)域已知并已由例如Sambrook等(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約，1989)、Ausubel等編輯(分子生物學(xué)現(xiàn)行方法，CurrentProtocols Press,1994)和Berger和Kimmel(酶學(xué)方法分子克隆技術(shù)指南，第152卷，Academic Press,Inc.,San Diego,CA,1987)陳述。優(yōu)選的GDNFR編碼核酸序列是哺乳動(dòng)物序列。
亦可以用本領(lǐng)域已知方法，例如Engels等陳述的方法(Angew.Chem.Intl Ed.,28:716-734,1989)，完成編碼GDNFR蛋白的核酸序列的化學(xué)合成。這些方法特別包括核酸序列合成的磷酸三酯、phosphoramidite和H-膦酸酯法。優(yōu)選的這種化學(xué)合成方法是用標(biāo)準(zhǔn)phosphoramidite化學(xué)的聚合物支持合成。通常，編碼目的多肽的DNA的長(zhǎng)度是數(shù)百堿基對(duì)(bp)或核苷酸。用這些方法可以以幾個(gè)片段合成超過(guò)100個(gè)核苷酸的核酸序列。然后可以將所述片段連接在一起，形成表達(dá)全長(zhǎng)GDNFR多肽或其部分的序列。
或者，通過(guò)篩選適當(dāng)?shù)腸DNA文庫(kù)(即從據(jù)信表達(dá)該蛋白的一種或多種組織源制備的文庫(kù))或基因組文庫(kù)(從總基因組DNA制備的文庫(kù))可以得到適當(dāng)?shù)暮怂嵝蛄?。該cDNA文庫(kù)源通常是據(jù)信以合理數(shù)量表達(dá)GDNFR的組織。該基因組文庫(kù)源通常是從據(jù)信包含GDNFR編碼基因的哺乳動(dòng)物物種的任何一種或多種組織?？梢杂靡环N或多種選擇性地與該文庫(kù)中存在的GDNFR cDNA或基因雜交的一種或多種核酸探針(例如基于本說(shuō)明書序列的寡核苷酸、cDNA或基因組DNA)，篩選該文庫(kù)中該GDNFR cDNA/基因的存在。通常用于這種文庫(kù)篩選的探針一般編碼與制備該文庫(kù)的物種相同或類似物種GDNFR核酸序列的一小區(qū)?；蛘撸鎏结樋梢允呛?jiǎn)并的，如本文所討論的。
通常通過(guò)將該寡核苷酸探針或cDNA在嚴(yán)格條件下退火至該文庫(kù)中的克隆完成文庫(kù)篩選，該條件防止非特異性結(jié)合，但允許與該探針或引物有顯著水平同源性的那些克隆的結(jié)合(雜交)。典型的雜交和清洗嚴(yán)格條件部分地取決于該cDNA或寡核苷酸探針的大小(即核苷酸長(zhǎng)度數(shù)目)以及該探針是否是簡(jiǎn)并的。在設(shè)計(jì)該雜交溶液時(shí)亦考慮了得到克隆的可能性(例如被篩選的是cDNA文庫(kù)還是基因組文庫(kù)；如果是cDNA文庫(kù)，目的cDNA存在的可能性處于較高水平)。
當(dāng)使用DNA片段做為探針時(shí)，典型的雜交條件包括那些在Ausubel等編輯(見上述)中所陳述的。雜交后，將含有該文庫(kù)的印跡在適當(dāng)嚴(yán)格條件下清洗，該適當(dāng)嚴(yán)格條件取決于幾個(gè)因素，例如探針大小、探針與克隆的預(yù)期同源性、被篩選文庫(kù)的類型、被篩選克隆的數(shù)量等等。嚴(yán)格清洗溶液(一般離子強(qiáng)度低并且使用于相對(duì)高溫)的例子如下述。一種這種嚴(yán)格清洗是于55-65℃的0.015M NaCl、0.005M檸檬酸鈉和0.1％SDS。另一這種嚴(yán)格緩沖液是于約40-50℃的1mMNa2EDTA、40mM NaHPO4,pH7.2和1％SDS。另一嚴(yán)格清洗是于約50-65℃的0.2×SSC和0.1％SDS。
亦有用寡核苷酸探針篩選cDNA或基因組文庫(kù)的嚴(yán)格清洗條件的典型方法。例如，第一種方法使用含有0.05％焦磷酸鈉的6×SSC,溫度為約35-62℃，取決于該探針的長(zhǎng)度。例如，14個(gè)堿基的探針于35-40℃清洗，17個(gè)堿基的探針于45-50℃清洗，20個(gè)堿基的探針于52-57℃、23個(gè)堿基的探針于57-63℃清洗。當(dāng)本底非特異性結(jié)合看起來(lái)高時(shí)，可將溫度升高2-3℃。第二個(gè)方法使用氯化四甲銨進(jìn)行(TMAC)清洗。一個(gè)這種嚴(yán)格清洗溶液是3M TMAC、50mM Tris-HCl,pH 8.0和0.2％SDS。
另一得到編碼GDNFR蛋白的核酸序列的適當(dāng)方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。在該方法中，從表達(dá)GDNFR的組織提取多聚(A)+RNA或總RNA。然后使用逆轉(zhuǎn)錄酶從該RNA制備cDNA(即RC-PCR)。然后將通常與GDNFR cDNA的兩個(gè)獨(dú)立區(qū)互補(bǔ)的兩個(gè)引物(寡核苷酸)與諸如Taq聚合酶的聚合酶一起加入該cDNA，該聚合酶擴(kuò)增在這兩個(gè)引物之間的cDNA區(qū)。
如果選擇制備編碼目的GDNFR蛋白的核酸序列的方法需要使用寡核苷酸引物或探針(例如PCR、cDNA或基因組文庫(kù)篩選)，則選擇做為探針或引物的寡核苷酸序列必須具有足夠的長(zhǎng)度并且充分明確，以將在文庫(kù)篩選或PCR擴(kuò)增中發(fā)生的非特異性結(jié)合量降至最低。所述探針或引物的實(shí)際序列通?；趤?lái)自另一生物體的相同或類似基因的保守或高度同源序列，例如本發(fā)明涉及的大鼠核酸序列。所述探針或引物可選地可以完全或部分簡(jiǎn)并，即含有探針/引物的混合物，它們都編碼同一氨基酸序列，但卻使用不同的密碼子。制備簡(jiǎn)并探針的替代方法是將一個(gè)肌苷置于一些或所有那些根據(jù)物種變化的密碼子位置?？梢园瓷鲜鐾ㄟ^(guò)DNA化學(xué)合成方法制備所述寡核苷酸探針或引物。
本發(fā)明的范圍亦考慮了基于編碼GDNFR的這些核酸序列及其突變體或變異體序列的GDNFR蛋白。突變體或變異體序列包括那些與野生型序列相比含有一個(gè)或多個(gè)核苷酸置換、缺失和/或插入并導(dǎo)致與野生型氨基酸序列相比表達(dá)氨基酸序列變異的序列。在某些情況下，因?yàn)樘烊坏任换蜃儺惖拇嬖冢赡艽嬖谧匀话l(fā)生的GDNFR氨基酸突變體或變異體。基于這種自然發(fā)生的突變體或變異體的GDNFR蛋白亦屬于本發(fā)明范圍。合成突變體序列的制備亦為本領(lǐng)域所熟知，并描述于例如Wells等(Gene,34:315,1985)和Sambrook等(見上述)。
在某些情況下，可能希望制備自然發(fā)生GDNFR的核酸和/或氨基酸變異體。核酸變異體(其中設(shè)計(jì)使一個(gè)或多個(gè)核苷酸不同于野生型或自然發(fā)生GDNFR)可以使用其引物具有目的點(diǎn)突變的定點(diǎn)誘變或PCR擴(kuò)增制備(有關(guān)誘變技術(shù)的描述，參見Sambrook等，見上述和Ausubel等，見上述)。使用Engels等描述的方法(見上述)的化學(xué)合成亦可以用于制備這種變異體。亦可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法。優(yōu)選的核酸變異體是那些含有在用于重組產(chǎn)生GDNFR的宿主細(xì)胞中構(gòu)成密碼子優(yōu)先的核苷酸置換的變異體。其它優(yōu)選的變異體是那些與野生型相比編碼保守氨基酸變化(例如其中自然發(fā)生的氨基酸側(cè)鏈的電荷或極性基本上未被不同氨基酸置換改變)的變異體，和/或那些設(shè)計(jì)使其或者在GDNFR上產(chǎn)生新糖基化位點(diǎn)和/或磷酸化位點(diǎn)的變異體、或那些設(shè)計(jì)以在GDNFR上缺失一已有的糖基化位點(diǎn)和/或磷酸化位點(diǎn)的變異體。載體將編碼目的GDNFR蛋白的cDNA或基因組DNA插入一個(gè)載體，以進(jìn)一步克隆(擴(kuò)增該DNA)或表達(dá)。適當(dāng)?shù)妮d體已有市售或可以具體構(gòu)建該載體?？赡艿妮d體包括(但不限于)粘粒、質(zhì)粒或修飾病毒，但該載體系統(tǒng)必須與選擇的宿主細(xì)胞匹配。這種載體包括(但不限于)諸如λ衍生物的噬菌體、或諸如pBR322、pUC或Bluescript_質(zhì)粒衍生物(Stratagene,La Jolla CA)的質(zhì)粒。可以通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染、電穿孔或其它已知技術(shù)將所述重組分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
例如，將所述GDNFR編碼核酸序列插入克隆載體，該載體用于轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或感染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞以產(chǎn)生許多拷貝的該核酸序列。這可以通過(guò)將DNA片段連接入具有互補(bǔ)粘性末端的克隆載體而完成。如果用于片段化該DNA的互補(bǔ)限制位點(diǎn)不存在于該克隆載體，可以對(duì)所述DNA分子的末端進(jìn)行酶法修飾。亦可證明將限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)加入用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的寡核苷酸引物中，以促進(jìn)將得到的核酸序列插入載體中的優(yōu)越性。或者，通過(guò)將核苷酸序列(接頭)連接至該DNA末端可以產(chǎn)生任何需要的位點(diǎn)；這些連接的接頭可以包含編碼限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列的特定化學(xué)合成寡核苷酸。在一替代方法中，可以通過(guò)同源聚合加尾修飾該酶切的載體和GDNFR編碼核酸序列。在具體的實(shí)施方案中，用加入分離GDNFR基因、cDNA或合成DNA序列的重組DNA分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞使得能夠產(chǎn)生多拷貝的該基因。由此，通過(guò)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化體、從所述轉(zhuǎn)化體分離所述重組DNA分子并在需要時(shí)從該分離的重組DNA回收該插入基因，可以大量地得到該GDNFR編碼核酸序列。
該適當(dāng)載體的選擇或構(gòu)建將取決于1)它將用于DNA擴(kuò)增還是DNA表達(dá)，2)欲插入該載體的DNA的大小，和3)欲用該載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(例如哺乳動(dòng)物、昆蟲、酵母、真菌、植物或細(xì)菌細(xì)胞)。每個(gè)載體根據(jù)其功能(DNA擴(kuò)張或DNA表達(dá))和它與預(yù)期宿主細(xì)胞的相容性含有各種組分。對(duì)于DNA表達(dá)，所述載體組分可以包括(但不限于)下述一種或多種信號(hào)序列、復(fù)制起點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)選擇或標(biāo)記基因、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止序列等等。這些組分可以通過(guò)已知方法從天然來(lái)源得到或合成。本發(fā)明的載體涉及編碼目的GDNFR蛋白的核酸序列，該序列可操作地連接至一個(gè)或多個(gè)擴(kuò)增、表達(dá)控制、調(diào)節(jié)或能夠在選擇的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)、控制或者實(shí)現(xiàn)該GDNFR編碼核酸序列的擴(kuò)增或表達(dá)的類似操作元件。
含有GDNFR核酸序列插入物的表述載體可以通過(guò)三個(gè)常規(guī)方法鑒別(a)DNA-DNA雜交；(b)“標(biāo)記”基因功能的存在或缺乏和(c)插入序列的表達(dá)。在第一種方法中，可以通過(guò)使用包含與插入的GDNFR編碼核酸序列同源的序列的探針的DNA-DNA雜交，檢測(cè)插入表達(dá)載體中的外源核酸序列的存在。在第二個(gè)方法中，可以根據(jù)由外源核酸序列插入該載體引起的某些“標(biāo)記”基因功能(例如胸苷激酶活性、對(duì)抗生素抗性、轉(zhuǎn)化表型、桿狀病毒中閉合體(occlusion body)的形成等)的存在或缺失，鑒定和選擇該重組載體/宿主系統(tǒng)。例如，如果將GDNFR編碼核酸序列插入該載體的該標(biāo)記基因序列，則可以通過(guò)該標(biāo)記基因功能的喪失鑒定含有該GDNFR插入物的重組體。在第三個(gè)方法中，重組表達(dá)載體可以通過(guò)檢測(cè)由該重組核酸序列表達(dá)的外源蛋白產(chǎn)物鑒定。這種檢測(cè)可以基于該表達(dá)的GDNFR蛋白產(chǎn)物的物理性質(zhì)或功能性質(zhì)，例如通過(guò)該GDNFR蛋白與GDNF結(jié)合或與直接識(shí)別GDNFR的抗體結(jié)合。信號(hào)序列信號(hào)序列可以是該載體的一個(gè)組分，或是插入該載體的GDNFRDNA的部分。天然GDNFR DNA編碼一個(gè)位于該蛋白氨基末端的信號(hào)序列，該序列在該蛋白的轉(zhuǎn)譯后加工時(shí)被切割以形成成熟GDNFR蛋白。本發(fā)明范圍包括具有該天然信號(hào)序列的GDNFR多核苷酸以及其中該天然信號(hào)序列缺失并用異源信號(hào)序列取代的GDNFR多核苷酸。該選擇的異源信號(hào)序列應(yīng)是由該宿主細(xì)胞識(shí)別和加工(即被信號(hào)肽酶酶切)的信號(hào)序列。對(duì)于不能識(shí)別和加工該天然GDNFR信號(hào)序列的原核宿主細(xì)胞，該信號(hào)序列被選自例如堿性磷酸酶、青霉素酶或熱穩(wěn)定腸毒素Ⅱ前導(dǎo)序列的原核信號(hào)序列置換。對(duì)于酵母分泌，該天然GDNFR信號(hào)序列可以被酵母轉(zhuǎn)化酶、α因子或酸性磷酸酶前導(dǎo)序列置換。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)中，該天然信號(hào)序列是滿意的，盡管其它哺乳動(dòng)物信號(hào)序列可能是適當(dāng)?shù)?。?fù)制起點(diǎn)表達(dá)載體和克隆載體一般包括一使該載體能夠在一種或多種選擇的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。在克隆載體中，該序列通常是使得該載體獨(dú)立于宿主染色體DNA復(fù)制的序列并包括復(fù)制起點(diǎn)或自主復(fù)制序列。各種細(xì)菌、酵母和病毒的這種序列是眾所周知的。來(lái)自質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)適于大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌，各種起點(diǎn)(例如SV40、多形瘤、腺病毒、VSV或BPV)可以用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的克隆載體。一般而言，哺乳動(dòng)物表達(dá)載體不需要復(fù)制起點(diǎn)組分(例如經(jīng)常使用SV40起點(diǎn)僅僅是因?yàn)樗性缙趩?dòng)子)。選擇基因表達(dá)載體和克隆載體可以含有選擇基因。該基因編碼一個(gè)“標(biāo)記”蛋白，該蛋白對(duì)所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中生存或生長(zhǎng)是必需的。未用該載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞將不含有該選擇基因，因此在該培養(yǎng)基中不能生存。典型的選擇基因編碼下述蛋白，所述蛋白(a)賦予對(duì)抗生素或其它毒素(例如氨芐青霉素、新霉素、氨甲蝶呤或四環(huán)素)的抗性；(b)互補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)缺陷；或(c)提供不能從該培養(yǎng)基中得到的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)。
其它選擇基因可以用于擴(kuò)增將要表達(dá)的基因。擴(kuò)增是一過(guò)程，其中極度需要的用于產(chǎn)生對(duì)生長(zhǎng)關(guān)鍵的蛋白的基因在重組細(xì)胞連續(xù)世代的染色體中串聯(lián)重復(fù)。適于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的選擇標(biāo)記的例子包括二氫葉酸還原酶(DHFR)和胸苷激酶。將哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)化體置于選擇壓力下，只有轉(zhuǎn)化體由于載體中該標(biāo)記的存在而獨(dú)一無(wú)二地適應(yīng)該壓力而生存。通過(guò)將該轉(zhuǎn)化體細(xì)胞在培養(yǎng)基中選擇試劑的濃度持續(xù)改變的條件下培養(yǎng)而施加選擇壓力，由此導(dǎo)致該選擇基因和編碼GDNFR的DNA都擴(kuò)增。結(jié)果，從該擴(kuò)增DNA合成了較高量的GDNFR。
例如，首先通過(guò)將所有的轉(zhuǎn)化體在含有氨甲蝶呤(DHFR的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，鑒定用該DHFR選擇基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。使用野生型DHFR時(shí)，適當(dāng)宿主細(xì)胞是DHFR活性缺陷的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系(參見例如Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,77(7):4216-4220,1980)。然后將該轉(zhuǎn)化細(xì)胞暴露給提高水平的氨甲蝶呤。這導(dǎo)致合成多拷貝的DHFR基因，并同時(shí)合成該表達(dá)載體中多拷貝存在的其它DNA，例如編碼GDNFR蛋白的DNA。啟動(dòng)子本發(fā)明的表達(dá)載體和克隆載體將通常含有宿主生物體識(shí)別并可操作地連接至編碼該GDNFR蛋白的核酸序列的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子為位于結(jié)構(gòu)基因起始密碼子上游(5’)(一般在100-1000bp之內(nèi))的、控制諸如編碼GDNFR的特定核酸序列的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯的非轉(zhuǎn)譯序列。一般將啟動(dòng)子劃歸二類中的一類，即誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組成型啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在對(duì)培養(yǎng)條件中的某些變化(例如營(yíng)養(yǎng)的存在或缺失或溫度變化)響應(yīng)時(shí)，啟動(dòng)在其控制下的DNA的轉(zhuǎn)錄水平增加。由各種潛在宿主細(xì)胞識(shí)別的大量啟動(dòng)子是眾所周知的。通過(guò)限制性酶消化將啟動(dòng)子從源DNA取出并將目的啟動(dòng)子序列插入該載體，將這些啟動(dòng)子可操作地連接至編碼GDNFR的DNA。可以用天然GDNFR啟動(dòng)子序列指導(dǎo)GDNFR DNA的擴(kuò)增和/或表達(dá)。然而，如果異源啟動(dòng)子比該天然啟動(dòng)子提供更多的轉(zhuǎn)錄和該表達(dá)蛋白的更高產(chǎn)量，并且如果它與選擇使用的宿主細(xì)胞系統(tǒng)匹配，則最好是該異源啟動(dòng)子。
適用于原核宿主細(xì)胞的啟動(dòng)子包括β內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)；堿性磷酸酶，色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)；和雜種啟動(dòng)子例如tac啟動(dòng)子。其它已知的細(xì)菌啟動(dòng)子亦適用。它們的核苷酸序列已公開，因此使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使用需要用于提供需要限制位點(diǎn)的接頭或連接物，將它們連接至目的DNA序列。
適用于酵母宿主的啟動(dòng)序列亦是本領(lǐng)域眾所周知的。酵母增強(qiáng)子最好與酵母啟動(dòng)子一同使用。適用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的啟動(dòng)子是眾所周知，包括從諸如多形瘤病毒、鳥痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒和最優(yōu)選的猿猴病毒40(SV40)的病毒基因組得到的那些啟動(dòng)子。其它適用的哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子包括異源哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子，例如熱休克啟動(dòng)子和肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子?？赡苡糜贑HO細(xì)胞中GDNFR蛋白生產(chǎn)的啟動(dòng)子是SRa(參見Takebe等，Mol.Cell.Biol.,8(1):466-472,1988)。適合的表達(dá)載體是pDSRa2。含有適當(dāng)GDNFR cDNA的pDSRa2質(zhì)粒構(gòu)建物可以基本按照在共同擁有和共同未決的于1990年3月29日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)50l,904(亦可參見于1990年5月18日申請(qǐng)的歐洲專利申請(qǐng)90305433號(hào)、公告號(hào)EP398753和WO90/14363(1990))(其說(shuō)明書通過(guò)引用結(jié)合到本文中)中描述的方法制備。
可能有意用于控制GDNFR表達(dá)的其它啟動(dòng)子包括(但不限于)SV40早期啟動(dòng)子區(qū)(Bernoist和Chambon,Nature,290:304-310,1981)；CMV啟動(dòng)子；勞斯肉瘤病毒3’長(zhǎng)末端重復(fù)內(nèi)含的啟動(dòng)子(Yamamoto等，Cell,22:787-797,1980)；皰疹胸苷激酶啟動(dòng)子(Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,78:144-1445,1981)；金屬硫蛋白基因的調(diào)節(jié)序列(Brinster等，Nature,296:39-42,1982)；諸如β內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子的原核表達(dá)載體(Villa-Kamaroff等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,75:3727-3731,1978)；或tac啟動(dòng)子(DeBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80:21-25,1983)。亦有興趣的是下列動(dòng)物轉(zhuǎn)錄控制區(qū)，它們表現(xiàn)出組織特異性并已用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中在胰臟腺泡細(xì)胞中有活性的彈性蛋白酶Ⅰ基因控制區(qū)(Swift等，Cell,38:639-646,1984；Ornitz等，Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.50:399-409,1986；MacDonald,Hepatology,7:425-515,1987)；在胰臟β細(xì)胞中有活性的胰島素基因控制區(qū)(Hanahan,Nature,315:115-122,1985)；在淋巴細(xì)胞中有活性的免疫球蛋白基因控制區(qū)(Grosschedl等，Cell,38:647-658,1984；Adames等，Nature,318:533-538,1985；Alexander等，Mol.Cell.Biol.,7:1436-1444,1987)；在睪丸細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞中有活性的小鼠乳房腫瘤病毒控制區(qū)(Leder等，Cell,45:485-495,1986)，在肝臟中有活性的白蛋白基因控制區(qū)(Pinkert等，Genes and Devel.,1:268-276,1987)；在肝臟中有活性的甲胎蛋白基因控制區(qū)(Krumlauf等，Mol.Cell.Biol.,5:1639-1648,1985；Hammer等，Science,235:53-58,1987)；在肝臟中有活性的α1抗胰蛋白酶基因控制區(qū)(Kelsey等，Gene and Devel.,1:161-171,1987)；在骨髓細(xì)胞中有活性的β珠蛋白基因控制區(qū)(Mogram等，Nature,315:338-340,1985；Kollias等，Cell,46:89-94,1986)；在大腦少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中有活性的髓磷脂堿性蛋白基因控制區(qū)(Readhead等，Cell,48:703-712,1987)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白輕鏈-2基因控制區(qū)(Saai,Nature,314:283-286,1985)；和在下丘腦中有活性的促性腺釋放激素基因控制區(qū)(Mason等，Science,234:1372-1378,1986)。增強(qiáng)子元件可以將增強(qiáng)子序列插入該載體，以增加高等真核細(xì)胞編碼本發(fā)明GDNFR蛋白的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子是DNA的順式作用元件，其長(zhǎng)度通常為10-300bp，并作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子相對(duì)地與定向和位置無(wú)關(guān)。已發(fā)現(xiàn)它們?cè)谵D(zhuǎn)錄單位的5’和3’。已知可得自哺乳動(dòng)物基因的幾個(gè)增強(qiáng)子序列(例如珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰島素)。然而，通常使用來(lái)自病毒的增強(qiáng)子。SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、多形瘤增強(qiáng)子和腺病毒增強(qiáng)子是典型的激活真核啟動(dòng)子的增強(qiáng)元件。雖然增強(qiáng)子可以剪接入載體的GDNFR DNA的5’或3’位置，但它通常位于該啟動(dòng)子的5’位點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄終止用于真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動(dòng)物、人、或來(lái)自其它多細(xì)胞生物體的具核細(xì)胞)的表達(dá)載體亦含有終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA的必需序列。這種序列通常得自真核DNA或cDNA的5’和有時(shí)3’非轉(zhuǎn)譯區(qū)。這些區(qū)含有做為該編碼GDNFR的mRNA的非轉(zhuǎn)譯部分中的多聚腺苷酸片段轉(zhuǎn)錄的核苷酸區(qū)段。
通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)完成含有一個(gè)或多個(gè)上述組分及目的GDNFR編碼序列的合適載體的構(gòu)建。將分離的質(zhì)?；駾NA片段酶切、加工并以所需順序再連接產(chǎn)生所需的質(zhì)粒。為確認(rèn)已構(gòu)建正確序列，可以用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并用已知技術(shù)(例如上述氨芐青霉素或四環(huán)素抗性)選擇成功的轉(zhuǎn)化體。然后可以制備來(lái)自所述轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶消化分析和/或測(cè)序以確認(rèn)目的構(gòu)建物的存在。
亦可以使用提供在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中編碼GDNFR的DNA的瞬時(shí)表達(dá)的載體。一般而言，瞬時(shí)表達(dá)涉及使用能在宿主細(xì)胞中有效復(fù)制的表達(dá)載體，使得該宿主細(xì)胞累積許多拷貝的該表達(dá)載體，由此合成高水平的由該表達(dá)載體編碼的目的蛋白。包含適當(dāng)表達(dá)載體和宿主細(xì)胞的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)允許方便地陽(yáng)性鑒別由克隆DNA編碼的蛋白以及快速篩選這種蛋白的所需生物學(xué)或生理學(xué)性質(zhì)。因此，瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)在鑒別該蛋白的變異體中特別有用。宿主細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化本發(fā)明亦提供用用于表達(dá)重組GDNFR蛋白的核酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(例如細(xì)菌、哺乳動(dòng)物、昆蟲、酵母或植物細(xì)胞)。將該轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞在允許該核酸序列表達(dá)的適當(dāng)條件下培養(yǎng)。適當(dāng)宿主細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、擴(kuò)增、篩選和產(chǎn)物生產(chǎn)和純化的方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。參見例如Gething和Sambrook,Nature,293:620-625(1981),或者參見Kaufman等，Mol.Cell.Biol.,5(7):1750-1759(1985)或Howley等，美國(guó)專利4,419,446號(hào)。本文討論了其它典型材料和方法。將轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞培養(yǎng)于適當(dāng)培養(yǎng)基中，然后用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當(dāng)手段將表達(dá)的GDNFR蛋白從該培養(yǎng)基中(或如果是胞內(nèi)表達(dá)，則從細(xì)胞)可選地回收、分離和純化。
不同的宿主細(xì)胞對(duì)于蛋白的轉(zhuǎn)譯和轉(zhuǎn)譯后加工和修飾(例如糖基化、酶切)具有特征性的和特定的機(jī)制?？梢赃x擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系或宿主系統(tǒng)以確保表達(dá)的外源蛋白的所需修飾和加工。例如，可以使用在細(xì)菌系統(tǒng)中表達(dá)以產(chǎn)生非糖基化核心蛋白產(chǎn)物。可以使用在酵母中表達(dá)以產(chǎn)生糖基化產(chǎn)物?？梢允褂迷诓溉閯?dòng)物細(xì)胞中表達(dá)以確保該異源GDNFR蛋白的“天然”糖基化。另外，不同的載體/宿主表達(dá)系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)諸如不同程度的蛋白水解切割的加工反應(yīng)。
本文公開的適用于克隆載體或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞是原核生物細(xì)胞、酵母或高等真核生物的細(xì)胞。真核微生物例如絲狀真菌或酵母可能是GDNFR蛋白表達(dá)的合適宿主。釀酒酵母或普通面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的，但許多其它屬、種和菌株是眾所周知并可以得到的。
亦從多細(xì)胞生物體得到用于表達(dá)糖基化GDNFR蛋白的宿主細(xì)胞。這種宿主細(xì)胞具有復(fù)雜加工和糖基化活性的能力。原則上可以使用任何高等真核細(xì)胞培養(yǎng)物，不管這種培養(yǎng)物涉及脊椎動(dòng)物還是無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞，包括植物和昆蟲細(xì)胞。在培養(yǎng)中增殖脊椎動(dòng)物細(xì)胞(組織培養(yǎng))是眾所周知的方法。有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的例子包括(但不限于)用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系(COS7)、人胚性腎系(293細(xì)胞或?yàn)樵趹腋∨囵B(yǎng)中生長(zhǎng)而亞克隆的293細(xì)胞)、幼齡倉(cāng)鼠腎細(xì)胞和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞。其它合適的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系包括(但不限于)HeLa、小鼠L-929細(xì)胞、得自Swiss、Balb-c或NIH小鼠的3T3系、BHK或HaK倉(cāng)鼠細(xì)胞系。
合適的宿主細(xì)胞亦包括原核細(xì)胞。原核宿主細(xì)胞包括(但不限于)諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽(yáng)性生物的細(xì)菌細(xì)胞(例如大腸桿菌)、諸如枯草桿菌的桿菌、諸如綠膿假單胞菌的假單胞菌屬種、鼠傷寒沙門菌或粘質(zhì)沙雷菌。例如，大腸桿菌的各種菌株(例如HB101、DH5a、DH10和MC1061)在生物技術(shù)領(lǐng)域中做為宿主細(xì)胞是眾所周知的。亦可以采用鏈霉菌屬菌種的各種菌株等等。目前優(yōu)選的產(chǎn)生GDNFR蛋白的宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞(例如大腸桿菌)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、COS細(xì)胞等)。
所述宿主細(xì)胞用上述表達(dá)載體或克隆載體轉(zhuǎn)染和最好是轉(zhuǎn)化，并培養(yǎng)于常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中。可以適當(dāng)修飾該培養(yǎng)基以誘導(dǎo)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增編碼所需序列的基因。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的并選擇適于涉及的宿主細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化。例如，對(duì)于無(wú)細(xì)胞壁的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，可以使用磷酸鈣沉淀法。亦可以使用電穿孔、微注射和其它已知技術(shù)。培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞將用于生產(chǎn)本發(fā)明的GDNFR蛋白的轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)于適合培養(yǎng)基中。該培養(yǎng)基可以根據(jù)需要添加激素和/或其它生長(zhǎng)因子(例如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白或表皮生長(zhǎng)因子)、鹽(例如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖液(例如HEPES)、核苷(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如慶大霉素)、微量元素(定義為通常以最終濃度為微摩爾范圍存在的無(wú)機(jī)化合物)和葡萄糖或其它能源。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，亦可包括適當(dāng)濃度的其它添加物。本領(lǐng)域技術(shù)人員亦熟知用于選擇宿主細(xì)胞的合適培養(yǎng)條件，例如溫度、pH等等。
一旦產(chǎn)生該GDNFR蛋白，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法包括層析(例如離子交換層析、親和層析和篩分柱層析)、離心、差示溶解度或用于蛋白純化的任何其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將其分離和純化。特別是，可以通過(guò)將GDNFR蛋白結(jié)合至包含結(jié)合至固定支持物的GDNF或抗GDNFR抗體的親和層析而分離。同源重組另外預(yù)期可以通過(guò)同源重組或使用采用了導(dǎo)入已含有GDNFR編碼DNA的細(xì)胞的控制元件的重組生產(chǎn)方法生產(chǎn)GDNFR蛋白。例如，可以使用同源重組方法修飾正常轉(zhuǎn)錄沉默的GDNFR基因或表達(dá)不足基因的細(xì)胞，并由此產(chǎn)生表達(dá)GDNFR的細(xì)胞。同源重組是一最初開發(fā)用于導(dǎo)向基因以在轉(zhuǎn)錄活性基因中誘導(dǎo)或糾正突變的技術(shù)(Kucherlapati,Prog.in Nucl.Acid Res.and Mol.Biol.36:301,1989)。其基本技術(shù)是做為將特定突變導(dǎo)入哺乳動(dòng)物基因組的特定區(qū)域(Thomas等，Cell,44:419-428,1986；Thomas和Capecchi,Cell,51:503-512,1987；Doetschman等，Proc.Natl.Acad.Sci.,85:8583-8587,1988)，或在缺陷基因中糾正特定突變(Doetschman等，Nature,330:576-578,1987)的方法開發(fā)的。典型的同源重組技術(shù)描述于美國(guó)專利5,272,071(EP91903051,EP公告505500號(hào)；PCT/US90/07642，國(guó)際申請(qǐng)WO91/09955)，其說(shuō)明書通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
通過(guò)同源重組，可以將欲插入基因組的DNA序列通過(guò)與導(dǎo)向DNA連接而導(dǎo)向目的基因的特定區(qū)域。該導(dǎo)向DNA是與該基因組DNA的區(qū)域互補(bǔ)(同源)的DNA。將與該基因組的特定區(qū)域互補(bǔ)的導(dǎo)向DNA的小片段在DNA復(fù)制過(guò)程中與親代鏈接觸。雜交并因此通過(guò)共有同源區(qū)域與內(nèi)源DNA的其它片段重新結(jié)合是已插入細(xì)胞的DNA的普遍性質(zhì)。如果該互補(bǔ)鏈連接有含有突變或DNA的不同序列的寡核苷酸，則它亦由于重組而被加入該新合成的鏈。作為校讀功能的結(jié)果，該DNA新序列可能做為模板起作用。因此，該轉(zhuǎn)移DNA被整合入該基因組。
如果已知特定基因的序列(例如核酸序列)，則可以合成或者例如通過(guò)于鄰接目的區(qū)域的特定識(shí)別位點(diǎn)對(duì)天然DNA進(jìn)行適當(dāng)限制，得到與該基因選定區(qū)域互補(bǔ)的一段DNA，即本文提出的GDNFR前-原序列或表達(dá)控制序列。該片段在插入細(xì)胞時(shí)做為導(dǎo)向序列，并將與基因組內(nèi)其同源序列雜交。如果該雜交發(fā)生于DNA復(fù)制期間，該DNA片段以及與其連接的任何其它序列將做為岡崎片段起作用，并將被倒縫入新合成DNA子鏈中。
連接至這些導(dǎo)向DNA片段的是可以與GDNFR蛋白表達(dá)相互作用的DNA區(qū)。例如，將啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件、抑制基因或外源轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件以足以影向編碼所需GDNFR蛋白的DNA轉(zhuǎn)錄的鄰近程度和定向插入預(yù)期宿主細(xì)胞的基因組。該控制元件不編碼GDNFR蛋白，而是控制宿主細(xì)胞基因組中存在的DNA部分。因此，GDNFR蛋白的表達(dá)可以不通過(guò)編碼GDNFR基因的DNA自身的轉(zhuǎn)染完成，而是利用偶聯(lián)DNA調(diào)節(jié)區(qū)段的導(dǎo)向DNA(含有與目的內(nèi)源基因同源區(qū))完成，該調(diào)節(jié)區(qū)段為內(nèi)源基因序列提供GDNFR蛋白轉(zhuǎn)錄可識(shí)別的信號(hào)。A.GDNFR變異體如上所述，本文使用的術(shù)語(yǔ)“GDNFR類似物”包括下述多肽，其中的氨基酸已從包括圖2和4(SEQ ID NO:2和4)中描述的那些多肽在內(nèi)的天然發(fā)生GDNFR多肽的氨基酸序列內(nèi)的殘基缺失(“缺失變異體”)、插入(“添加變異體”)或置換(“置換變異體”)。通過(guò)將適當(dāng)核苷酸變化導(dǎo)入編碼該多肽的DNA或通過(guò)體外化學(xué)合成所需多肽，制備這種變異體。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，可以對(duì)諸如成熟人GDNFR的氨基酸序列進(jìn)行缺失、插入和置換的許多組合，只要最終的分子具有GDNFR活性。
基于本文描述的GDNFR氨基酸序列，可以容易地設(shè)計(jì)和制造各種適用于重組(例如微生物)表達(dá)在一個(gè)或多個(gè)殘基的相同性或位置方面具有不同于附圖中描述的一級(jí)構(gòu)象的多肽的核酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員已熟知由圖2和4中描述的核酸序列編碼的一個(gè)或多個(gè)選定氨基酸殘基的置換、插入或缺失的誘變技術(shù)(例如美國(guó)專利4,518,584號(hào)，其說(shuō)明書通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。在構(gòu)建置換變異體時(shí)有兩個(gè)主要的變量突變位點(diǎn)的位置和突變的性質(zhì)。在設(shè)計(jì)GDNFR置換變異體時(shí)，突變位點(diǎn)和突變性質(zhì)的選擇取決于欲修飾的GDNFR的特征。突變位點(diǎn)可以單獨(dú)修飾或系列修飾，例如，通過(guò)(1)先用保守氨基酸修飾置換，然后根據(jù)達(dá)到的結(jié)果用多個(gè)基團(tuán)選擇置換，(2)缺失目標(biāo)氨基酸殘基、或(3)在該確定位點(diǎn)的相鄰位置插入氨基酸殘基。最好在1-30個(gè)鄰接氨基酸中的保守變化。亦可以通過(guò)蛋白水解酶制備N末端和C末端缺失的GDNFR變異體。
有關(guān)GDNFR缺失變異體，缺失范圍一般為約1-30個(gè)鄰接殘基，更常見為約1-10個(gè)殘基，通常為約1-5個(gè)鄰接殘基。考慮了N末端、C末端和內(nèi)部序列內(nèi)缺失。可以將缺失導(dǎo)入該分子與非人類GDNFR的同源性低的區(qū)域以修飾GDNFR活性。在與非人類GDNFR序列具有基本同源性的區(qū)域內(nèi)缺失將更有可能顯著修飾GDNFR的生物學(xué)活性。將通常選擇保守缺失的數(shù)目以保持GDNFR蛋白產(chǎn)物在受影響域的三級(jí)結(jié)構(gòu)，例如半胱氨酸交聯(lián)。非限制性的缺失變異體的例子包括缺失N末端或C末端氨基酸殘基的截短的GDNFR蛋白產(chǎn)物。例如，通過(guò)消除參與GDNFR受體與細(xì)胞質(zhì)膜的糖基-磷脂酰肌醇(GPI)錨定的肽區(qū)可以制備可溶性受體。
有關(guān)GDNFR添加變異體，氨基酸序列添加通常包括N末端和/或C末端融合或長(zhǎng)度范圍為一個(gè)殘基至含有一百個(gè)或更多殘基的多肽的末端添加，以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的內(nèi)部或中間添加。本發(fā)明的多肽亦可以包括起始甲硫氨酸殘基(位于相對(duì)于所需多肽的第一個(gè)氨基酸殘基的位置1)。內(nèi)部添加的范圍一般可以為約1-10個(gè)鄰接殘基，更通常為1-5個(gè)殘基，常見為1-3個(gè)氨基酸殘基。N末端添加變異體的例子包括在GDNFR的N末端包含異源N末端信號(hào)序列的GDNFR，以利于從重組宿主細(xì)胞中分泌成熟GDNFR并因此便于收獲或生物利用度。這種信號(hào)序列一般可以從預(yù)期宿主細(xì)胞物種得到，并因此與預(yù)期宿主細(xì)胞物種同源。添加亦可以包括得自其它神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子序列的氨基酸序列。例如，考慮可以產(chǎn)生具有或不具有連接序列的GDNF和GDNFR的融合蛋白，由此形成單分子治療實(shí)體。
GDNFR置換變異體有一個(gè)或多個(gè)GDNFR氨基酸序列的氨基酸殘基被除去并在其位置插入不同的殘基。這種置換變異體包括等位基因變異體，其特征在于可能導(dǎo)致或不導(dǎo)致氨基酸變化的種群中天然發(fā)生的核苷酸序列變化。與其它變異體形式一樣，置換變異體可以涉及在一個(gè)或多個(gè)不同位點(diǎn)上的單個(gè)或鄰接氨基酸殘基的置換。
GDNFR氨基酸序列的特定突變可以涉及修飾糖基化位點(diǎn)(例如絲氨酸、蘇氨酸或天冬酰胺)。缺少糖基化或僅僅部分糖基化是于任何天冬酰胺連接的糖基化識(shí)別位點(diǎn)或于通過(guò)添加O連接的碳水化合物修飾的分子的任何位點(diǎn)的氨基酸置換或缺失造成的。天冬酰胺連接的糖基化識(shí)別位點(diǎn)包含一個(gè)三肽序列，該序列被適當(dāng)?shù)募?xì)胞糖基化酶特異性識(shí)別。這些三肽序列或者是Asn-Xaa-Thr或者是Asn-Xaa-Ser，這里Xaa是除Pro之外的任何氨基酸。在糖基化識(shí)別位點(diǎn)的第一或第三氨基酸位置的一個(gè)或二者的各種氨基酸置換或缺失(和/或于第二位置的氨基酸缺失)導(dǎo)致在該修飾的三肽序列中無(wú)糖基化。因此，適當(dāng)改變的核苷酸序列的表達(dá)產(chǎn)生在該位點(diǎn)未糖基化的變異體?；蛘?，可以修飾該GDNFR氨基酸序列以增加糖基化位點(diǎn)。
鑒別用于誘變的GDNFR氨基酸殘基或區(qū)域的一種方法稱為“丙氨酸掃描誘變”，如Cunningham和Wells所述(Science,244:1081-1085,1989)。在該方法中，鑒別一個(gè)氨基酸殘基或一組靶殘基(例如諸如Arg、Asp、His、Lys和Glu的帶電荷殘基)并被一中性或帶負(fù)電荷氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或多丙氨酸)置換，以影響所述氨基酸與細(xì)胞內(nèi)外的周圍水性環(huán)境的相互作用?？梢越又ㄟ^(guò)在置換位點(diǎn)導(dǎo)入其它或者候補(bǔ)殘基，推敲那些對(duì)所述置換表現(xiàn)出功能敏感性的結(jié)構(gòu)域。由此，確定導(dǎo)入氨基酸序列變異的靶位點(diǎn)，在該DNA序列的對(duì)應(yīng)靶密碼子或區(qū)域上進(jìn)行丙氨酸掃描或隨機(jī)誘變，并就所需活性和活性程度的最佳組合篩選表達(dá)的GDNFR變異體。
最有興趣進(jìn)行置換誘變的位點(diǎn)包括在來(lái)自各種物種的GDNFR蛋白中發(fā)現(xiàn)的氨基酸在側(cè)鏈體積、電荷和/或疏水性方面基本不同的位點(diǎn)。其它有興趣的位點(diǎn)是那些其中得自各種物種的GDNFR樣蛋白的特定殘基相同的位點(diǎn)。這類位置一般對(duì)于蛋白的生物學(xué)活性是重要的。開始，以相對(duì)保守方式置換這些位點(diǎn)。這種保守置換示于表2的推薦置換項(xiàng)下。如果這種置換導(dǎo)致生物學(xué)活性的變化，然后可以導(dǎo)入更加實(shí)質(zhì)性的變化(例證置換)，和/或可以產(chǎn)生其它添加或缺失，并篩選得到的產(chǎn)物的活性。
表2氨基酸置換原始?xì)埢?推薦置換例證置換Ala(A)ValVal；Leu；IleArg(R)LysLys；Gln；AsnAsn(N)GlnGln；His；Lys；ArgAsp(D)GluGluCys(C)SerSerGln(Q)AsnAsnGlu(E)AspAspGly(G)ProProHis(H)ArgAsn；Gln；Lys；ArgIle(I)LeuLeu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸Leu(L)Ile正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；PheLys(K)ArgArg；Gln；AsnMet(M)LeuLeu；Phe；IlePhe(F)LeuLeu；Val；Ile；AlaPro(P)GlyGlySer(S)ThrThrThr(T)SerSerTrp(W)TyrTyrTyr(Y)PheTrp；Phe；Thr；SerVal(V)LeuIle；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸對(duì)該氨基酸序列的保守修飾(以及對(duì)所述編碼核酸序列的對(duì)應(yīng)修飾)預(yù)期產(chǎn)生具有與天然發(fā)生GDNFR的功能和化學(xué)特征類似的GDNFR蛋白產(chǎn)物。與之相反，通過(guò)選擇在保持(a)置換區(qū)域中的多肽主鏈結(jié)構(gòu)(例如片層或螺旋構(gòu)象)、(b)該分子在靶位點(diǎn)的電荷或疏水性、(c)側(cè)鏈體積方面的影響顯著不同的置換，完成GDNFR蛋白產(chǎn)物功能和/或化學(xué)特征方面的基本修飾。根據(jù)常見側(cè)鏈性質(zhì)可以將天然發(fā)生的殘基分組1)疏水性正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；2)中性親水性Cys、Ser、Thr；3)酸性Asp、Glu；4)堿性Asn、Gln、His、Lys、Arg；5)影響側(cè)鏈取向的殘基Gly、Pro；和6)芳族Trp、Tyr、Phe非保守置換可以涉及這些類中一類的一員與另一組的一員的交換。這種置換的殘基可以導(dǎo)入與非人類GDNFR蛋白同源的人GDNFR蛋白區(qū)、或?qū)朐摲肿拥姆峭磪^(qū)。
因此，GDNFR蛋白、類似物或其衍生物包括(但不限于)那些含有做為一級(jí)氨基酸序列在圖2和4(SEQ ID NO:2和4)中描述的所有或部分氨基酸序列的生物學(xué)活性分子。所述蛋白包括改變的序列，其中用生物學(xué)等效氨基酸殘基置換該序列內(nèi)的殘基導(dǎo)致沉默改變。例如，該序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可以用另一功能相當(dāng)?shù)念愃茦O性的氨基酸置換導(dǎo)致沉默改變。該序列內(nèi)一個(gè)氨基酸的置換可以選自該氨基酸所屬組的其它成員。例如，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷(堿性)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負(fù)電荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。亦考慮例如通過(guò)磷酸化、糖基化、交聯(lián)、酰化作用、蛋白水解切割、連接至抗體分子、膜分子或其它配基，可以在轉(zhuǎn)錄中或轉(zhuǎn)錄后差示修飾該GDNFR蛋白、其類似物、其片段或其衍生物。B.GDNFR衍生物根據(jù)本說(shuō)明書，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以制備GDNFR或GDNFR類似物的化學(xué)修飾衍生物。最適合衍生的化學(xué)部分包括水溶性聚合物。水溶性聚合物合乎要求，因?yàn)樗B接的該蛋白在水性環(huán)境(例如生理環(huán)境)中不沉淀。最好是，該聚合物對(duì)于制備治療產(chǎn)物或組合物是藥學(xué)上可接受的。根據(jù)諸如該聚合物/蛋白綴合物是否將用于治療，如果是則根據(jù)所需劑量、循環(huán)時(shí)間、對(duì)蛋白水解的抗性的考慮和其它考慮，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇所需的聚合物。該衍生的效力可以通過(guò)給與所需形式(例如通過(guò)滲透泵，或更優(yōu)選地通過(guò)注射或輸注，或進(jìn)一步配制用于口服、肺部或其它傳遞路徑)的該衍生物并測(cè)定其效力而確定。
合適的水溶性聚合物包括(但不限于)聚乙二醇、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯酮、聚1,3-二氧戊環(huán)、聚1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來(lái)酸酐共聚物、多聚氨基酸(或者同源聚合物或者隨機(jī)共聚物)、和葡聚糖或聚(正乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇(propropylene glycol)均聚物、聚環(huán)氧丙烷(prolypropyleneoxide)/環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇和它們的混合物。聚乙二醇丙醛由于它在水中的穩(wěn)定性可能在生產(chǎn)中有優(yōu)越性。
該聚合物的分子量是任意的可以分枝或不分枝。對(duì)于聚乙二醇，推薦分子量為約2kDa至約100kDa以便處理和制造(術(shù)語(yǔ)“約”表明在制備聚乙二醇時(shí)，一些分子的分子量將大于或小于陳述的分子量)。可以使用其它大小，這取決于所需的治療特征(例如所需的持續(xù)釋放時(shí)間；對(duì)生物學(xué)活性的任何影響(如果有的話)；處理的容易程度；抗原性的程度或缺失抗原性和聚乙二醇對(duì)治療蛋白或變異體的其它已知效果)。
如此連接的聚合物分子的數(shù)目可以變化，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定對(duì)功能的影響。使用相同或不同的化學(xué)部分(例如聚合物，諸如不同分子量的聚乙二醇)，可以單衍生、或提供雙、三、四或一些衍生組合。聚合物分子與蛋白(或肽)分子的比例可以變化，它們?cè)诜磻?yīng)混合物中的濃度同樣可以變化。一般而言，最佳比例(以反應(yīng)效率而言在反應(yīng)中沒有多余的未反應(yīng)蛋白或聚合物)可以通過(guò)諸如所需衍生程度(例如單、雙、三，等)、選定聚合物的分子量、該聚合物是分枝還是不分枝和反應(yīng)條件的因素確定。
應(yīng)在考慮對(duì)該蛋白的功能域或抗原域的影響下，將聚乙二醇分子(或其它化學(xué)部分)連接至該蛋白。有多種本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用的連接方法。參見例如EP0401384，其說(shuō)明書通過(guò)引用結(jié)合到本文中(將PEG偶聯(lián)至G-CSF)，亦可參見Malik等，Exp.Hematol.,20:1028-1035,1992(報(bào)道用tresyl chloride對(duì)GM-CSF進(jìn)行聚乙二醇化)。例如，聚乙二醇可以通過(guò)反應(yīng)基(例如游離氨基或羧基)共價(jià)連接至氨基酸殘基。反應(yīng)基是那些活化聚乙二醇分子可以連接的基團(tuán)。具有游離氨基的氨基酸殘基包括賴氨酸殘基和N末端氨基酸殘基。那些具有游離羧基的氨基酸殘基可以包括天冬氨酸殘基、谷氨酸殘基和C末端氨基酸殘基。巰基亦可以用做連接所述聚乙二醇分子的反應(yīng)基。對(duì)于治療用途，最好是連接至氨基，例如連接至N末端或賴氨酸基團(tuán)。如果需要受體結(jié)合，則應(yīng)避免連接至對(duì)受體結(jié)合重要的殘基。
可能具體需要N末端化學(xué)修飾的蛋白。使用聚乙二醇做為本組合物的說(shuō)明，可以根據(jù)以下因素進(jìn)行選擇各種聚乙二醇分子(根據(jù)分子量、分枝等)、反應(yīng)混合物中聚乙二醇分子與蛋白(或肽)分子的比例、欲進(jìn)行的聚乙二醇化反應(yīng)的類型和得到選定N末端聚乙二醇化的蛋白的方法。得到N末端聚乙二醇化制備物的方法(即如果需要從其它單聚乙二醇化的部分分離該部分)可以是從聚乙二醇化蛋白分子群體中純化該N末端聚乙二醇化材料?？梢酝ㄟ^(guò)利用了特定蛋白中可用于衍生的不同類型伯氨基的不同反應(yīng)性(賴氨酸對(duì)N末端)的還原性烷基化，完成選擇性的N末端化學(xué)修飾。在適當(dāng)反應(yīng)條件下，達(dá)到該蛋白在N末端帶有含有聚合物的羰基的基本選擇性衍生。例如，通過(guò)在允許利用該蛋白賴氨酸殘基的e-氨基和N末端殘基的a-氨基之間的pKa差異的pH下進(jìn)行反應(yīng)，可以選擇性地N末端聚乙二醇化該蛋白。通過(guò)這種選擇性衍生，控制了水溶性聚合物與蛋白的連接與該聚合物的綴合主要在該蛋白的N末端發(fā)生，并且沒有發(fā)生其它反應(yīng)基(例如賴氨酸側(cè)鏈氨基)的顯著修飾。使用還原性烷基化，該水溶性聚合物可以是上述類型并應(yīng)具有單個(gè)反應(yīng)性醛以偶聯(lián)至該蛋白?？梢允褂煤袉蝹€(gè)反應(yīng)性醛的聚乙二醇丙醛。
本發(fā)明考慮使用與至少一個(gè)聚乙二醇分子連接的、為原核生物表達(dá)的GDNFR或其變異體的衍生物，以及使用通過(guò)?；蛲榛c一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇分子連接的GDNFR或其變異體。
可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何聚乙二醇化反應(yīng)進(jìn)行聚乙二醇化。參見例如Focus on Growth Factors,3(2):4-10,1992；EP0154316，其說(shuō)明書通過(guò)引用結(jié)合到本文中；EP0401384；和本文引用的其它有關(guān)聚乙二醇化的出版物。通過(guò)酰化反應(yīng)或烷基化反應(yīng)，用反應(yīng)性聚乙二醇分子(或類似的反應(yīng)性水溶性聚合物)進(jìn)行聚乙二醇化。
通過(guò)酰化作用的聚乙二醇化一般涉及將聚乙二醇(PEG)的活性酯衍生物與該GDNFR蛋白或變異體反應(yīng)。任何已知或后續(xù)發(fā)現(xiàn)的反應(yīng)性PEG分子都可以用于進(jìn)行GDNFR蛋白或變異體的聚乙二醇化。推薦的活化PEG酯是酯化至N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的PEG。如本文所用的“?；饔谩笨紤]包括(無(wú)限制性)該治療蛋白與諸如PEG的水溶性聚合物的下列連接類型酰胺、氨基甲酸酯、尿烷等等。參見Bioconjugate Chem.,5:133-140,1994。反應(yīng)條件可以從在聚乙二醇化領(lǐng)域已知的條件或后續(xù)發(fā)展的條件選擇，但應(yīng)避免會(huì)可能失活欲修飾的該GDNFR或變異體的諸如溫度、溶劑和pH的條件。
通過(guò)?；饔玫木垡叶蓟话惝a(chǎn)生多聚聚乙二醇化GDNFR蛋白或變異體。該連接鍵最好為酰胺鍵。產(chǎn)生的產(chǎn)物亦最好為基本上僅(例如＞95％)單、雙或三聚乙二醇化。然而，一些具有更高程度聚乙二醇化的種類可以形成，其量取決于使用的的特定反應(yīng)條件。如果需要，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)，包括透析、鹽析、超濾、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析和電泳，可以從該混合物特別是未反應(yīng)種類中分離更加純化的聚乙二醇化種類。
通過(guò)烷基化的聚乙二醇化一般涉及將PEG的末端醛衍生物與該GDNFR蛋白或變異體在還原劑的存在下反應(yīng)。通過(guò)烷基化的聚乙二醇化亦可產(chǎn)生聚乙二醇化GDNFR蛋白或變異體。另外，可以操縱反應(yīng)條件以利于基本上僅在該GDNFR蛋白或變異體N末端的a-氨基聚乙二醇化(即單聚乙二醇化蛋白)。在單聚乙二醇化或多聚乙二醇化二種情況下，該P(yáng)EG基團(tuán)最好通過(guò)-CH2-NH-基團(tuán)連接至該蛋白。特別關(guān)于該-CH2-基團(tuán)，這類型鍵在本文中稱為“烷基鍵”。
通過(guò)還原性烷基化產(chǎn)生單聚乙二醇化產(chǎn)物的衍生利用了可用于衍生的不同類型伯氨基的不同反應(yīng)性(賴氨酸對(duì)N末端)。在允許利用該蛋白所述賴氨酸殘基的e-氨基和N末端殘基的a-氨基的pKa差異的pH下進(jìn)行反應(yīng)。通過(guò)這種選擇性衍生，控制含有諸如醛的反應(yīng)基的水溶性聚合物與蛋白的連接與該聚合物的連接主要在該蛋白的N末端發(fā)生，并且沒有發(fā)生其它反應(yīng)基(例如賴氨酸側(cè)鏈氨基)的顯著修飾。在一個(gè)重要方面，本發(fā)明考慮使用單聚合物/GDNFR蛋白(或變異體)綴合分子的基本均一的制備物(指聚合物分子連接的GDNF蛋白或變異體基本上僅(即＞95％)在單一位置)。更具體地說(shuō)，如果使用聚乙二醇，本發(fā)明亦包括使用缺乏可能的抗原連接基團(tuán)并具有直接偶聯(lián)至該GDNFR蛋白或變異體的聚乙二醇分子的聚乙二醇化蛋白或變異體。
因此，按照本發(fā)明的GDNFR蛋白產(chǎn)物包括聚乙二醇化GDNFR蛋白或變異體，其中所述PEG基團(tuán)通過(guò)?；蛲榛B接。如上所述，這種產(chǎn)物可以是單聚乙二醇化或多聚乙二醇化(例如含有2-6、最好為2-5個(gè)PEG基團(tuán))。所述PEG基團(tuán)一般于氨基酸的a或e氨基連接至該蛋白，但亦考慮所述PEG基團(tuán)連接至該蛋白上的任何氨基，該氨基在合適反應(yīng)條件下有足夠的反應(yīng)性以連接至PEG基團(tuán)。
在?；饔煤屯榛椒ㄖ惺褂玫木酆衔锓肿涌梢詮纳鲜鏊苄跃酆衔镏羞x擇。應(yīng)修飾選擇的聚合物，以具有單個(gè)反應(yīng)基，例如最好是用于酰化作用的活性酯或用于烷基化的醛，使得聚合度可以按照本方法控制。典型的反應(yīng)性PEG醛是水溶性的聚乙二醇丙醛或其C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(參見美國(guó)專利5,252,714)。該聚合物可以分枝或不分枝。對(duì)于?；磻?yīng)，選擇的聚合物應(yīng)具有單個(gè)反應(yīng)性酯基。對(duì)于本還原性烷基化，選擇的聚合物應(yīng)具有單個(gè)反應(yīng)性醛基。一般而言，不從天然發(fā)生的糖基殘基選擇水溶性聚合物，因?yàn)檫@些可以由哺乳動(dòng)物重組表達(dá)系統(tǒng)更方便地制備。該聚合物可以具有任意分子，它可以分枝或不分枝。
本文使用的典型的水溶性聚合物是聚乙二醇。如本文所用，聚乙二醇是指包括已用于衍生其它蛋白的PEG的任何形式，例如單(C1-C10)烷氧基或芳氧基聚乙二醇。
一般而言，可以在任何用于將生物學(xué)活性物質(zhì)與活化聚合物分子反應(yīng)的適合條件下進(jìn)行化學(xué)衍生。制備聚乙二醇化GDNFR蛋白產(chǎn)物的方法一般包括步驟(a)將GDNFR蛋白產(chǎn)物與聚乙二醇(例如PEG的反應(yīng)性酯或醛衍生物)在該蛋白變?yōu)檫B接至一個(gè)或多個(gè)PEG基團(tuán)的條件下反應(yīng)，和(b)獲得該反應(yīng)產(chǎn)物。一般而言，?；磻?yīng)的最佳反應(yīng)條件將根據(jù)已知參數(shù)和需要的結(jié)果具體確定。例如，PEG蛋白的比例越高，則多聚乙二醇化產(chǎn)物的百分比越高。
制備單聚合物/GDNFR蛋白產(chǎn)物的基本均一群體的還原性烷基化一般包含步驟(a)將GDNFR蛋白或變異體與反應(yīng)性PEG分子在還原性烷基化條件下，在允許選擇性修飾所述GDNFR蛋白或變異體的氨基末端的a-氨基的合適pH下進(jìn)行反應(yīng)；和(b)得到所述反應(yīng)產(chǎn)物。
對(duì)于單聚合物/GDNFR蛋白產(chǎn)物的基本均一群體，所述還原性烷基化反應(yīng)條件是那些允許將該水溶性聚合物部分選擇性連接至GDNFR蛋白或變異體的N末端的條件。這種反應(yīng)條件一般提供賴氨酸的氨基與N末端a-氨基之間的pKa差異(pKa是50％的氨基質(zhì)子化而50％的氨基未質(zhì)子化時(shí)的pH)。pH亦影響欲使用的聚合物與蛋白的比例。一般而言，如果pH較低，在需要聚合物超出蛋白很多(即N末端a-氨基的反應(yīng)性越低，則需要越多的聚合物以達(dá)到最佳條件)。如果pH較高，則聚合物∶蛋白的比例不需要那么高(即可用的反應(yīng)基越多，需要的聚合物分子越少)。為了本發(fā)明的目的，pH范圍一般為3-9，最好為3-6。
另一重要的考慮是聚合物的分子量。一般而言，聚合物的分子量越高，能連接至該蛋白的聚合物越少。類似地，當(dāng)優(yōu)化這些參數(shù)時(shí)，應(yīng)考慮這些聚合物的分枝。一般而言，分子量越高(或分枝越多)，則聚合物∶蛋白比例越高。一般而言，對(duì)于本文考慮的聚乙二醇化反應(yīng)，推薦的平均分子量是約2kDa至約100kDa。優(yōu)選的平均分子量是約5kDa至約50kDa，特別優(yōu)選的是約12kDa至約25kDa。水溶性聚合物對(duì)GDNF蛋白或變異體的比例的一般范圍是1∶1至100∶1，優(yōu)選為(對(duì)于多聚乙二醇化)1∶1至20∶1和(對(duì)于單聚乙二醇化)1∶1至5∶1。
采用上述表明的條件，還原性烷基化提供將聚合物選擇性地連接至在氨基末端具有a-氨基的任何GDNFR蛋白或變異體，并提供單聚合物/GDNFR蛋白(或變異體)綴合物的基本均一的制備物。此處使用的術(shù)語(yǔ)“單聚合物/GDNFR蛋白(或變異體)綴合物”指由連接至一分子GDNFR蛋白或GDNFR變異體蛋白的單個(gè)聚合物分子組成的組合物。該單聚合物/GDNFR蛋白(或變異體)綴合物通常具有一位于N末端而不是賴氨酸氨基側(cè)基的聚合物分子。該制備物一般是高于90％的單聚合物/GDNFR蛋白(或變異體)綴合物，更經(jīng)常是高于95％的單聚合物/GDNFR蛋白(或變異體)綴合物，而余下的觀察到的分子均未反應(yīng)(即缺少該聚合物部分的蛋白)。亦預(yù)期該GDNFR蛋白產(chǎn)物可以涉及制備涉及融合蛋白或連接的GDNFR和GDNF分子的聚乙二醇化分子。
對(duì)于本還原性烷基化，該還原劑必須在水溶液中穩(wěn)定，最好能夠僅還原在還原性烷基化的起始過(guò)程中形成的席夫堿。合適的還原劑選自硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉、二甲胺硼烷、三甲胺硼烷和吡啶硼烷。特別合適的還原劑是氰基硼氫化鈉。諸如溶劑、反應(yīng)時(shí)間、溫度等的其它反應(yīng)參數(shù)和產(chǎn)物純化方法可以根據(jù)已發(fā)表的有關(guān)用水溶性聚合物衍生蛋白的資料(參見本文引用的出版物)具體確定。C.GDNFR蛋白產(chǎn)物藥用組合物GDNFR蛋白產(chǎn)物藥用組合物通常包括與一種或多種藥學(xué)上和生理上可接受的選擇適合于給藥方式的配制材料混合的治療或預(yù)防有效量的GDNFR蛋白產(chǎn)物。合適的配制材料包括(但不限于)抗氧化劑、防腐劑、著色劑、調(diào)味劑和稀釋劑、乳化劑、懸浮劑、溶劑、填充劑、膨脹劑、緩沖液、傳遞載體、稀釋劑、賦形劑和/或藥用輔助劑。例如，合適的載體可以是注射用水、生理鹽水溶液或人造腦脊髓液，可能添加了通常用于非腸道給藥組合物的其它材料。中性緩沖鹽水或與血清白蛋白混合的鹽水是其它典型的載體。本文使用的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”或“生理上可接受的載體”指適于完成或增強(qiáng)做為藥用組合物的該GDNFR蛋白產(chǎn)物傳遞的配制材料。
載體中的主要溶劑的特性可以或者是水性或者是非水性。另外，該載體可以含有其它修飾或保持該制劑的pH、滲透性、粘度、澄清度、顏色、無(wú)菌性、穩(wěn)定性、溶解速率或氣味的配制材料。類似地，該載體可以含有修飾或保持GDNFR蛋白產(chǎn)物釋放速率、或促進(jìn)GDNFR蛋白產(chǎn)物越過(guò)血腦屏障吸收或透過(guò)的其它配制材料。
一旦配制好該治療藥用組合物，可以將其做為溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體、或脫水或凍干粉末儲(chǔ)存于無(wú)菌西林瓶中。這種制劑可以即用形式或在給藥前需復(fù)制的形式(例如凍干)儲(chǔ)存。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)預(yù)期給藥途徑和需要的劑量確定最佳藥用制劑。參見例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版(1990,Mack Publishing Co.,Easton,PA 18042)第1435-1712頁(yè)，其說(shuō)明書通過(guò)引用結(jié)合到本文中。這種組合物可以影響所述蛋白和衍生物的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速率和體內(nèi)清除速率。
預(yù)期了有效給藥形式，例如(1)緩釋制劑，(2)吸入霧劑，或(3)口服活性制劑。該GDNFR蛋白產(chǎn)物藥用組合物亦可配制用于非腸道給藥。這種非腸道給藥治療組合物通常是無(wú)熱原、非腸道可接受的水溶液形式，它包含在藥學(xué)上可接受載體中的該GDNFR蛋白產(chǎn)物。一種推薦的載體是生理鹽水。所述GDNFR蛋白產(chǎn)物藥用組合物亦可以包括諸如聚乳酸、聚乙醇酸等的聚合化合物的顆粒制劑或包入脂質(zhì)體中。亦可以使用透明質(zhì)酸，這可以具有促進(jìn)在循環(huán)中延長(zhǎng)時(shí)間的效果。
特別合適于非腸道注射的載體是無(wú)菌蒸餾水，其中該GDNFR蛋白配制成無(wú)菌的等滲溶液并適當(dāng)?shù)胤栏Ｔ僖恢苿┛梢陨婕皩⒃揋DNFR蛋白產(chǎn)物與例如可注射微球體或脂質(zhì)體的試劑一同配制，所述試劑提供該蛋白的緩釋或持久釋放，該蛋白然后將做為儲(chǔ)存注射液而傳遞。其它合適導(dǎo)入GDNFR蛋白產(chǎn)物的方法包括含有該GDNFR蛋白產(chǎn)物的可植入藥物傳遞裝置。
正如本領(lǐng)域熟知的，本發(fā)明的制劑可以包括其它組分，例如非腸道可接受的防腐劑、張力劑、共溶劑、濕潤(rùn)劑、絡(luò)合劑、緩沖劑、抗微生物劑、抗氧化劑和表面活性劑。例如，合適的張力增強(qiáng)劑包括堿金屬鹵化物(最好為氯化鈉或氯化鉀)、甘露醇、山梨醇等等。合適的防腐劑(但不限于)氯芐烷胺、硫柳汞、苯乙醇、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥苯甲酸丙酯、氯醛己醇、山梨酸等等。亦可以用過(guò)氧化氫做為防腐劑。合適的共溶劑是例如甘油、丙二醇和聚乙二醇。合適的絡(luò)合劑是例如咖啡因、聚乙烯吡咯酮、β-環(huán)糊精或羥丙基-β-環(huán)糊精。合適的表面活性劑或濕潤(rùn)劑包括山梨聚糖酯、諸如聚山梨醇酯80的聚山梨醇酯、氨丁三醇(tromethamine)、卵磷脂、膽固醇、四丁酚醛(tyloxapal)等等。緩沖液可以是常規(guī)緩沖液，例如硼酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽、碳酸氫鹽或Tris-HCl。
該配方組分存在的濃度是給藥位點(diǎn)可接受的。例如，使用緩沖液保持該組合物于生理pH或略低的pH，通常的pH范圍為約pH5至約pH8。
可以配制用于吸入的藥用組合物。例如，可以將該GDNFR蛋白產(chǎn)物配制成吸入用的干粉。亦可以在氣溶膠傳遞用的液化發(fā)射劑中配制GDNFR蛋白產(chǎn)物吸入溶液。在再一配方中，可以噴霧溶液。
亦考慮將口服含有GDNFR蛋白產(chǎn)物的某些制劑。以這種方式給藥的GDNFR蛋白產(chǎn)物可以連同或不連同那些常用于混合諸如片劑和膠囊的固體劑量形式的載體配制。例如，可以設(shè)計(jì)膠囊使其在胃腸道中當(dāng)生物利用度最大而前系統(tǒng)降解最低的點(diǎn)釋放該制劑的活性部分?？梢园ㄆ渌渲撇牧弦员阌贕DNFR蛋白產(chǎn)物的吸收。亦可以使用稀釋劑、調(diào)味劑、低熔點(diǎn)蠟、植物油、潤(rùn)滑劑、懸浮劑、片劑崩解劑和粘合劑。
另一制劑可以包括與無(wú)毒的適于制造片劑的賦形劑混合的有效量的GDNFR蛋白產(chǎn)物。通過(guò)將該片劑溶于無(wú)菌水中或其它適當(dāng)?shù)妮d體中，可以制備單位劑量形式的溶液。合適的賦形劑包括(但不限于)惰性稀釋劑，例如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉、乳糖或磷酸鈣；或粘合劑，例如淀粉、明膠或阿拉伯膠；或潤(rùn)滑劑例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石粉。
其它GDNFR蛋白產(chǎn)物配方對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的，包括涉及GDNFR蛋白產(chǎn)物與GDNF蛋白產(chǎn)物組合的配方。本領(lǐng)域技術(shù)人員亦熟知配制各種其它延遲或控制傳遞手段(例如脂質(zhì)體載體、生物可腐蝕微顆粒或多孔珠和儲(chǔ)存注射液)的技術(shù)。參見，例如，Supersaxo等有關(guān)傳遞藥用組合物的控釋多孔聚合物微顆粒的描述(國(guó)際公告WO93/15722號(hào)；國(guó)際申請(qǐng)PCT/US93/00829)，其說(shuō)明書通過(guò)引用結(jié)合到本文中。D.GDNFR蛋白產(chǎn)物的給藥可以通過(guò)各種途徑將GDNFR蛋白產(chǎn)物給藥，所述途徑包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)肺、經(jīng)皮、鞘內(nèi)和大腦內(nèi)傳遞。另外，不容易越過(guò)血腦屏障的蛋白因子可以直接大腦內(nèi)給藥或者與將它們運(yùn)過(guò)該屏障的其它成分相結(jié)合。例如，該GDNFR蛋白產(chǎn)物可以腦室內(nèi)給藥或給藥進(jìn)入大腦或脊髓蛛網(wǎng)膜下的空間。GDNFR蛋白產(chǎn)物亦可以大腦內(nèi)給藥直接進(jìn)入大腦實(shí)質(zhì)。GDNFR蛋白產(chǎn)物可以以已化學(xué)修飾或包裝使其通過(guò)血腦屏障的形式、或與一種或多種能夠促進(jìn)GDNFR蛋白產(chǎn)物透過(guò)血腦屏障的藥劑一起大腦外給藥。例如，NGF和單克隆抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體的綴合物已顯示通過(guò)結(jié)合至轉(zhuǎn)鐵蛋白受體運(yùn)輸至大腦。
為達(dá)到GDNFR蛋白產(chǎn)物的需要水平，可以每天重復(fù)或頻率略低地注射給藥，或者GDNFR蛋白產(chǎn)物可以從恒定或可編程流動(dòng)植入泵連續(xù)或周期性地輸注。含有包埋于生物可降解聚合物基質(zhì)中的該神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的緩釋植入物亦可以傳遞GDNFR蛋白產(chǎn)物。給藥頻率將取決于如此配制的該GDNFR蛋白產(chǎn)物的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)以及給藥途徑和位點(diǎn)。
不管給藥方式如何，都可以根據(jù)體重、體表面積或器官大小計(jì)算具體的劑量。確定涉及上述每個(gè)配方的治療的適當(dāng)劑量的必需計(jì)算的進(jìn)一步精細(xì)化可以由本領(lǐng)域一般技術(shù)人員常規(guī)進(jìn)行，并屬于他們?nèi)粘＿M(jìn)行的工作的范圍。通過(guò)使用適當(dāng)?shù)膭┝糠磻?yīng)數(shù)據(jù)可以確定適當(dāng)?shù)膭┝俊?br> 涉及治療特定損傷或疾病的方法的最終劑量制度將由主治醫(yī)師確定。一般而言，通過(guò)考慮修飾藥物作用的各種因素，例如病人的年齡、病情、體重、性別和飲食、任何感染的嚴(yán)重性、給藥時(shí)間和其它臨床因素確定本GDNFR多肽的有效量。參見Remington’sPharmaceutical Sciences，見上述，第697-773頁(yè)，通過(guò)引用結(jié)合到本文中。亦考慮如果GDNFR用于增強(qiáng)GDNF的作用，則選擇該GDNFR劑量使其與GDNF治療所需的類似；如果GDNFR用于拮抗GDNF的作用，則該GDNFR劑量將是GDNF劑量的幾倍。給藥可以一天一次或多次或更少，并可以與本文所述的其它組合物聯(lián)用。應(yīng)注意本發(fā)明不限于本文列舉的劑量。
預(yù)期連續(xù)給藥或延遲傳遞GDNFR蛋白產(chǎn)物對(duì)給定治療可能是有利的。雖然可以通過(guò)諸如輸注泵的機(jī)械手段完成連續(xù)給藥，但亦考慮可以使用其它方式的連續(xù)或接近連續(xù)給藥。例如，化學(xué)衍生或包膠囊可以產(chǎn)生該蛋白的緩釋形式，它具有基于確定劑量模式的以預(yù)期量在血液中連續(xù)存在的效果。因此，GDNFR蛋白產(chǎn)物包括衍生的或者配制的以實(shí)現(xiàn)這種連續(xù)給藥的蛋白。將配制GDNFR蛋白產(chǎn)物的緩釋形式以提供所需的每天或每周的有效劑量。
另外考慮該GDNFR蛋白產(chǎn)物可以以與GDNF聯(lián)合的形式給藥?；蛘?，所述GDNFR和GDNF蛋白產(chǎn)物可以或者順序或者同時(shí)獨(dú)立地給藥。
在治療神經(jīng)疾病中，本發(fā)明的GDNFR蛋白產(chǎn)物亦可以單獨(dú)使用或與其它生長(zhǎng)因子聯(lián)合使用。另外，其包括化學(xué)組合物的它因子或其它分子可以與GDNFR蛋白產(chǎn)物一同使用。在治療帕金森病中，考慮可以使用GDNFR蛋白產(chǎn)物自身或與左旋多巴聯(lián)用，其中該GDNFR會(huì)增強(qiáng)內(nèi)源GDNF的活性，并因此增強(qiáng)神經(jīng)元攝入較高濃度的多巴胺。
如上所述，亦考慮其它神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子會(huì)對(duì)治療一些神經(jīng)元細(xì)胞群或一些類型的損傷或疾病有用或必需。其它可以與GDNFR或GDNFR和GDNF的組合物聯(lián)用的因子包括(但不限于)粗促細(xì)胞分裂劑，例如胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、血管活性生長(zhǎng)因子、垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽、干擾素和生長(zhǎng)激素釋放抑制因子；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，例如神經(jīng)生長(zhǎng)因子、大腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素(neurotrophin)-3、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-4/5、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-6、胰島素樣生長(zhǎng)因子、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、酸性和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-5、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、可卡因-苯異丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄物(CART)；和其它生長(zhǎng)因子例如表皮生長(zhǎng)因子、白血病抑制因子、白介素、干擾素和集落刺激因子；以及與這些因子的功能相同的分子和物質(zhì)。GDNFR蛋白產(chǎn)物的細(xì)胞治療和基因治療亦考慮了GDNFR蛋白產(chǎn)物的細(xì)胞治療，例如大腦內(nèi)植入產(chǎn)生GDNFR蛋白產(chǎn)物的細(xì)胞。該實(shí)施方案涉及向病人植入能夠合成和分泌生物學(xué)活性形式的GDNFR蛋白產(chǎn)物的細(xì)胞。這種產(chǎn)生GDNFR蛋白產(chǎn)物的細(xì)胞可以是GDNFR蛋白產(chǎn)物的天然產(chǎn)生者或是重組細(xì)胞，該重組細(xì)胞產(chǎn)生GDNFR蛋白產(chǎn)物的能力通過(guò)用編碼所需GDNFR蛋白產(chǎn)物的基因轉(zhuǎn)化所增強(qiáng)。通過(guò)適于傳遞該基因并促進(jìn)其表達(dá)和分泌的載體可以完成這種修飾。為最大限度地降低給與異源物種GDNFR蛋白產(chǎn)物的病人中潛在的免疫反應(yīng)，最好是產(chǎn)生GDNFR蛋白產(chǎn)物的天然細(xì)胞來(lái)源于人并產(chǎn)生人GDNFR蛋白產(chǎn)物。類似地，最好是產(chǎn)生GDNFR蛋白產(chǎn)物的重組細(xì)胞用含有編碼人GDNFR蛋白產(chǎn)物基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
可以將植入的細(xì)胞包囊，以避免周圍組織浸潤(rùn)?？梢詫⑷嘶蚍侨祟悇?dòng)物細(xì)胞在生物相容的、半透性聚合物包被或膜中植入病人，該包被或膜允許釋放GDNFR蛋白產(chǎn)物，但防止細(xì)胞被病人免疫系統(tǒng)或被周圍組織的其它有害因子破壞所述細(xì)胞?；蛘?，可以將在活體外轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生GDNFR蛋白產(chǎn)物的病人自身的細(xì)胞直接植入病人中，不而需這種包囊。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉活細(xì)胞的包囊技術(shù)，不需過(guò)度試驗(yàn)就可以完成該包囊細(xì)胞的制備并植入病人。例如，Baetge等(國(guó)際公告WO95/05452號(hào)；國(guó)際申請(qǐng)PCT/US94/09299，其說(shuō)明書通過(guò)引用結(jié)合到本文中)描述了用于生物學(xué)活性分子有效傳遞的含有遺傳工程化的細(xì)胞的生物相容性膠囊。另外，參見美國(guó)專利4,892,538、5,011,472和5,106,627號(hào)，每個(gè)都具體地通過(guò)引用結(jié)合到本文中。在Aebischer等的PCT申請(qǐng)WO91/10425(具體地通過(guò)引用結(jié)合到本文中)中描述了包囊活細(xì)胞的系統(tǒng)。亦參見Aebischer等的PCT申請(qǐng)WO91/10470、Winn等，Exper.Neurol.,113:322-329,1991、Aebischer等，Exper.Neurol.,111:269-275,1991；Tresco等，ASAIO,38:17-23,1992，每個(gè)都具體地通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
亦預(yù)期了體內(nèi)和體外基因治療傳遞GDNFR蛋白產(chǎn)物。通過(guò)局部注射核酸構(gòu)建物或其它適當(dāng)載體將編碼GDNFR蛋白產(chǎn)物的基因?qū)氚屑?xì)胞，可以完成體外基因治療。(Hefti,J.Neurobiol.,25:1418-1435,1994)。例如，編碼GDNFR蛋白產(chǎn)物的核酸序列可以包含于腺相關(guān)病毒載體中以傳遞入靶細(xì)胞(例如Johnson，國(guó)際公告WO95/34670號(hào)；國(guó)際申請(qǐng)PCT/US95/07178，其說(shuō)明書通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。替代的病毒載體包括(但不限于)逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、單純皰疹病毒和乳頭瘤病毒載體。亦可以通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、直接注射(裸DNA)、受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移(配基-DNA復(fù)合物)、電穿孔、磷酸鈣沉淀或微粒轟擊(基因槍)達(dá)到或者體內(nèi)或者活體外適當(dāng)?shù)奈锢韨鬟f。
亦考慮GDNFR蛋白產(chǎn)物的基因治療或細(xì)胞治療可以另外包括傳遞GDNFR蛋白產(chǎn)物。例如，可以修飾宿主細(xì)胞以同時(shí)表達(dá)和釋放GDNFR蛋白產(chǎn)物和GDNF蛋白產(chǎn)物?；蛘?，可以從獨(dú)立的細(xì)胞中表達(dá)和釋放所述GDNFR和GDNF蛋白產(chǎn)物。這種細(xì)胞可以獨(dú)立地導(dǎo)入病人或者所述細(xì)胞可以包含于單個(gè)可植入裝置，例如上述包囊膜。
應(yīng)注意本文描述的GDNFR蛋白產(chǎn)物制劑可以用于獸醫(yī)和人類應(yīng)用，該術(shù)語(yǔ)“病人”應(yīng)不受限制。在獸醫(yī)應(yīng)用的情況下，可以按照上述確定劑量范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1表達(dá)高親和性GDNF結(jié)合位點(diǎn)細(xì)胞的鑒定表達(dá)克隆涉及選擇有可能含有顯著水平目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物的mRNA源。鑒別出視網(wǎng)膜感光細(xì)胞對(duì)極低濃度GDNF應(yīng)答，提示存在功能性的、高親和性的受體。為確認(rèn)大鼠感光細(xì)胞的確表達(dá)高親和性GDNF受體，進(jìn)行了[125I]GDNF結(jié)合和照相乳膠分析。大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞培養(yǎng)將5天的的C57B1/6鼠幼鼠或3天的的Sprague-Dawley大鼠幼鼠(Jackson Laboratories,Bar Harbor,MA)的神經(jīng)視網(wǎng)膜小心地取出并將色素上皮切除干凈，然后切成1mm2的塊并置于冰凍磷酸緩沖鹽水(PBS)中。然后將視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移至含有120單位木瓜蛋白酶和2000單位DNA酶的10ml Hank平衡鹽溶液(HBSS)中，并于37℃在旋轉(zhuǎn)平臺(tái)搖床上于約200rpm培育20分鐘。然后通過(guò)經(jīng)火拋光Pasteur移液管的研磨以分散細(xì)胞、通過(guò)20μm Nitex尼龍網(wǎng)篩分并于200xg離心5分鐘。將得到的細(xì)胞沉淀再懸浮于含有1％卵清蛋白和500單位DNA酶的HBSS中并鋪于4％卵清蛋白溶液(在HBSS中)之上，于500xg離心10分鐘。將最終的沉淀再懸浮于完全培養(yǎng)基中(見下述)，調(diào)整至約15,000細(xì)胞/ml，以90μl的等份接種于如前述(Louis等，Journal OfPharmacology And Experimental Therapeutics,262,1274-1283,1992)包被了聚鳥氨酸和層粘連蛋白的組織培養(yǎng)平板。
該培養(yǎng)基由1:1Dulbecco修改的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)和F12培養(yǎng)基混合物組成，并添加了2.5％熱滅活馬血清(Hyclone,Logan,UT)、B27培養(yǎng)基補(bǔ)充物(GIBCO,Grand Island,NY)、D-葡萄糖(最終濃度5mg/ml)、L-谷氨酰胺(最終濃度2mM)、20mM HEPES、牛胰島素和人轉(zhuǎn)鐵蛋白(最終濃度分別為2.5和0.1mg/ml)。感光細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)識(shí)別通過(guò)免疫染色制動(dòng)蛋(arrestin)(視桿細(xì)胞特異性抗原)識(shí)別感光細(xì)胞。將感光細(xì)胞的培養(yǎng)物于室溫用PBS中的4％多聚甲醛，pH7.4固定30分鐘，接著在PBS中清洗三次。然后將固定的培養(yǎng)物在Superblock封閉緩沖液(Pierce,Rockford,IL)培育，該緩沖液含有1％Nonidet P-40以增強(qiáng)抗體滲透。然后在同一緩沖液中以1∶2000以內(nèi)的稀釋度加入抗制動(dòng)蛋白抗體(多克隆抗制動(dòng)蛋白的合成肽序列兔抗體，其序列為Val-Phe-Glu-Glu-Phe-Ala-Arg-Gln-Asn-Leu-Lys-Cys)，該培養(yǎng)物于37℃在旋轉(zhuǎn)搖床上培育1小時(shí)。用PBS洗三次后，將該培養(yǎng)物與1∶500稀釋的山羊抗兔IgG(Vectastain藥盒，得自Vector Laboratories,Burlingame,CA)一同于37℃培育1小時(shí)。用PBS洗三次后，然后將第二抗體用1∶500稀釋的抗生物素蛋白-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物標(biāo)記(37℃ 45分鐘)。用PBS洗三次以上后，將該標(biāo)記細(xì)胞培養(yǎng)物在含有0.04％3’,3’-二氨基苯胺-(HCl)4、0.06％NiCl2和0.02％過(guò)氧化氫的0.1M Tris-HCl,pH7.4的溶液中反應(yīng)5-20分鐘。根據(jù)制動(dòng)蛋白-免疫反應(yīng)性，培養(yǎng)物中約90％的細(xì)胞是桿狀感光細(xì)胞。
通過(guò)用200倍放大亮光光學(xué)鏡片檢查制動(dòng)蛋白染色的培養(yǎng)物以測(cè)定感光細(xì)胞的存活。在一個(gè)代表6mm孔約總表面積的20％、沿直徑方向的1×6mm條中計(jì)數(shù)制動(dòng)蛋白陽(yáng)性感光細(xì)胞的數(shù)量。活感光細(xì)胞的特征是具有規(guī)則形狀的細(xì)胞體，具有一通常為短的類似軸突突起。從計(jì)數(shù)中除去顯示變性跡象(例如具有不規(guī)則、空泡化的核周體或片段化的軸突)的感光細(xì)胞(而絕大多數(shù)變性感光細(xì)胞都從培養(yǎng)基質(zhì)上脫落)。用細(xì)胞/6-mm孔，表達(dá)細(xì)胞數(shù)量。
用人重組GDNF(從10ng/ml-1g/ml十倍連續(xù)稀釋)處理增加感光細(xì)胞(10,000/6-mm孔)的培養(yǎng)大鼠的視網(wǎng)膜細(xì)胞。6天后固定培養(yǎng)物并對(duì)制動(dòng)蛋白(桿狀感光細(xì)胞特異性抗原)免疫染色。在未用GDNF處理的培養(yǎng)物中，感光細(xì)胞數(shù)目持續(xù)穩(wěn)定地下降并在培養(yǎng)6天后到達(dá)原始數(shù)目的約25％。用GDNF處理培養(yǎng)物導(dǎo)致在培養(yǎng)6天后有約二倍高數(shù)量的活制動(dòng)蛋白陽(yáng)性感光細(xì)胞。GDNF的效果在約200pg/ml時(shí)最大，ED50為約30pg/ml。除了促進(jìn)感光細(xì)胞存活外，加入GDNF亦刺激其類軸突突起的伸長(zhǎng)，由此證明對(duì)該感光細(xì)胞形態(tài)發(fā)育的影響(與對(duì)照培養(yǎng)物中的27±18μm對(duì)比，在GDNF中感光細(xì)胞的平均軸突長(zhǎng)度68μm)。
為確認(rèn)大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞表達(dá)高親和性GDNF受體，進(jìn)行了[125I]GDNF結(jié)合和照相乳膠分析。將出生后的大鼠感光細(xì)胞在試驗(yàn)前3-4天以2800細(xì)胞/mm2的密度接種于塑料玻片小瓶(Nunc)中。用冰凍清洗緩沖液(含有25mM N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES),pH7.5的Dulbecco的修改的Eagle培養(yǎng)基(DMEM))清洗細(xì)胞一次。關(guān)于競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，將細(xì)胞與結(jié)合緩沖液(含有25mM HEPES,pH7.5和2mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的DMEM)中的各種濃度的[125I]GDNF在500nM未標(biāo)記GDNF存在或不存在的條件下于4℃培育4小時(shí)。用冰凍清洗緩沖液清洗細(xì)胞四次，在1M NaOH中裂解并用伽嗎計(jì)數(shù)器測(cè)定與細(xì)胞結(jié)合的放射性。甚至在低配體濃度(低至30pM)下有顯著數(shù)量的[125I]GDNF與感光細(xì)胞結(jié)合，并且這種結(jié)合被過(guò)量存在的未標(biāo)記GDNF徹底抑制。
關(guān)于照相乳膠檢測(cè)，將細(xì)胞與結(jié)合緩沖液中的50pM的[125I]GDNF在500nM未標(biāo)記GDNF存在或不存在的條件下于4℃培育4小時(shí)。將細(xì)胞用冰凍清洗緩沖液清洗6次，用2.5％戊二醛固定并相繼用50％和70％乙醇脫水，并浸入NTB-2照相乳膠又取出(EastmanKodak,Rochester NY)。曝光5天后，將玻片顯影并檢查。照相乳膠分析證明[125I]GDNF與一些感光細(xì)胞結(jié)合，由此表明存在GDNF受體。然而，這種結(jié)合被加入未標(biāo)記GDNF有效阻斷。
實(shí)施例2來(lái)自感光細(xì)胞的GDNFR的表達(dá)克隆選擇大鼠感光細(xì)胞作為GDNF高親和性受體的可能來(lái)源，是基于如實(shí)施例1所述它們的細(xì)胞表面結(jié)合放射性標(biāo)記GDNF和它們對(duì)很低濃度配體應(yīng)答的能力。為鑒別該受體，通過(guò)下述方法，用哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(pSR的衍生物，Takebe等，1988見上述)和從培養(yǎng)出生后大鼠感光細(xì)胞分離的mRNA，構(gòu)建約50,000獨(dú)立克隆的選擇大小cDNA文庫(kù)。將該文庫(kù)分成約1,500至2,000個(gè)獨(dú)立克隆的庫(kù)并用已建立的表達(dá)克隆方法(Gearing等，EMBO Jounal,8,3667-3676,1989)篩選。制備代表該文庫(kù)的每個(gè)庫(kù)的質(zhì)粒DNA并轉(zhuǎn)染入在塑料顯微鏡玻片小瓶(Nunc,Naperville,IL)上生長(zhǎng)的COS7細(xì)胞中。
該轉(zhuǎn)染細(xì)胞用[125I]GDNF處理，用戊二醛固定，脫水并蘸照相乳膠做放射自顯影。曝光5天后，將玻片顯影并檢查由銀粒覆蓋細(xì)胞的存在，該銀粒表明作為細(xì)胞表達(dá)GDNF受體的結(jié)果，[125I]GDNF與細(xì)胞表面結(jié)合。以[125I]EGF處理的EGF受體轉(zhuǎn)染細(xì)胞用作陽(yáng)性對(duì)照。
以這種方式篩選的27個(gè)庫(kù)(F8-11)中的一個(gè)庫(kù)在轉(zhuǎn)染后表現(xiàn)出19個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞。因此，鑒別出一個(gè)單cDNA文庫(kù)庫(kù)，其含有表達(dá)GDNFR的cDNA克隆。將該庫(kù)分成60個(gè)較小的100個(gè)克隆/庫(kù)的亞庫(kù)，并用上述同樣方法再篩選。這些庫(kù)中的5個(gè)被鑒定為陽(yáng)性，這5個(gè)中的2個(gè)庫(kù)又進(jìn)一步再劃分以產(chǎn)生對(duì)該GDNF結(jié)合活性負(fù)責(zé)的單個(gè)克隆。將來(lái)自該單個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染入COS7細(xì)胞導(dǎo)致[125I]GDNF與約15％的細(xì)胞結(jié)合。這種結(jié)合被過(guò)量的未標(biāo)記GDNF特異性地競(jìng)爭(zhēng)抑制。表達(dá)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建從出生后3-7天的大鼠收獲大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞并以約5700細(xì)胞/mm2的密度種入用層粘連蛋白和聚鳥氨酸包被的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)3-4天后，估計(jì)群體含有約80％的感光細(xì)胞。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法從該培養(yǎng)物制備總RNA，并用polyA束(polyA-tract)藥盒(Promega,Madison,WI)純化Po1yA+RNA。用Gibco Superscript選擇系統(tǒng)(Gibco/BRL,Gaithersburg,MD)由該大鼠感光細(xì)胞多聚A+RNA構(gòu)建cDNA文庫(kù)。將2μg的多聚A+RNA與50ng隨機(jī)六聚物混合，加熱至70℃10分鐘并接著在冰上快速冷卻。用400U SuperscriptⅡRT于37℃進(jìn)行1小時(shí)的第一鏈合成。在加入dNTPs、10U大腸桿菌DNA連接酶、40U大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ和2U大腸桿菌RNA酶H后，在同一試管中進(jìn)行第二鏈合成。在16℃ 2小時(shí)后，通過(guò)用10UT4聚合酶于16℃處理另外5分鐘將該cDNA末端變成平端。用異丙醇沉淀后，通過(guò)與10μg的未磷酸化EcoRⅠ接頭寡核苷酸連接過(guò)夜，將EcoRⅠ克隆位點(diǎn)加到該cDNA上。
然后將該連接了EcoRⅠ的cDNA磷酸化并上sephacryl S-500 HR大小分級(jí)柱。上樣后，用100μl等份的TEN緩沖液(10mM Tris-HCl pH7.5,0.1mM EDTA,25mM NaCl)清洗該柱，并收集30μl分部收集液。合并含有約34ng高分子量cDNA的6-8分部收集液并沉淀。將回收的連接了EcoRⅠ的cDNA與50ng EcoRⅠ切割載體pBJ5連接過(guò)夜。將每個(gè)含有約15ng cDNA的該連接混合物等份通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞(大腸桿菌菌株DH10B；GIBCO/BRL,Gaithersburg,MD)。測(cè)定該轉(zhuǎn)化混合物的效價(jià)并接著以1500菌落/平板的密度鋪板于27個(gè)Amp/LB平板。從每個(gè)平板刮下菌落并收集入10mL Luria肉湯(LB)中，以產(chǎn)生每個(gè)有1500個(gè)獨(dú)立克隆的27個(gè)庫(kù)。將每個(gè)庫(kù)的部分細(xì)胞冷凍于甘油中，剩余的細(xì)胞則用于采用Qiagen tip-500藥盒(Qiagen Inc.,Chatsworth,CA)分離質(zhì)粒DNA。COS細(xì)胞轉(zhuǎn)染和照相乳膠分析在轉(zhuǎn)染前一天將COS7細(xì)胞接種于(220,000細(xì)胞/玻片)包被了ProNectin(10μg/ml在磷酸緩沖鹽水PBS中)的塑料玻片小瓶(Nunc)上。對(duì)于轉(zhuǎn)染，將含有2μg cDNA的700μl Opti MEMI(GIBCO/BRL,Gaithersburg,MD)與35μl DEAE葡聚糖溶液(10mg/ml,Sigma,St.Louis,MO)在Eppendorf管中溫和混合。細(xì)胞用PBS清洗二次，并與該轉(zhuǎn)染混合物于37℃在5％CO2空氣中培育30分鐘。培育后，向每個(gè)小瓶中加入含有10％胎牛血清(FCS)和80nM氯喹(Sigma,St.Louis,MO)的3mL DMEM培養(yǎng)基。將細(xì)胞再培養(yǎng)3.5小時(shí)，用溶于DMEM的10％二甲基亞砜于室溫振蕩2分鐘，用PBS清洗一次并使之在含有10％FCS的DMEM中生長(zhǎng)。48小時(shí)后，將該轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞用冰凍清洗緩沖液(含有25mM HEPES,pH7.5的DMEM)清洗一次，并在添加了50pM[125I]GDNF的冰凍結(jié)合緩沖液(含有25mM HEPES,pH7.5和2mg/mlBSA的DMEM)中于4℃培育4小時(shí)。將細(xì)胞在冰凍清洗緩沖液中清洗6次，用2.5％戊二醛于室溫固定5分鐘，相繼用50％和70％乙醇脫水，然后浸入NTB-2照相乳膠(Eastman Kodak)。于4℃黑暗中曝光4-5天后，將玻片顯影并通過(guò)亮視場(chǎng)和暗視場(chǎng)顯微鏡術(shù)篩選。陽(yáng)性庫(kù)的亞分割鑒定了一個(gè)單一的庫(kù)，它含有假定的GDNF受體克隆。將該庫(kù)的克隆以100個(gè)菌落/平板的密度接種于60個(gè)平板上。從每個(gè)平板刮下細(xì)胞并收集于LB中，并使之于37℃生長(zhǎng)4-5小時(shí)。如前，從每個(gè)庫(kù)制備冷凍儲(chǔ)存菌株和DNA制備物，以產(chǎn)生各含有100個(gè)獨(dú)立克隆的60個(gè)亞庫(kù)。通過(guò)上述方法鑒定這些60個(gè)亞庫(kù)中的2個(gè)為陽(yáng)性，將那些庫(kù)的克隆以允許分離單菌落的低密度于平板接種。從這兩個(gè)亞庫(kù)中每個(gè)庫(kù)挑選單菌落(384)并在96孔平板中的200μl LB中生長(zhǎng)6小時(shí)。為選擇表達(dá)GDNFR的單個(gè)克隆，將這四個(gè)96孔平板排成由16行和24列組成的單個(gè)大矩陣。將每行和每列孔中的細(xì)胞混合以總共產(chǎn)生40個(gè)混合物。將這些混合物在10mL LB/Amp(100μg/mL)中生長(zhǎng)過(guò)夜，并用Qiagen tip-20藥盒制備DNA。當(dāng)分析假定GDNF受體克隆時(shí)，三個(gè)行混合物和三個(gè)列混合物給出陽(yáng)性信號(hào)，提示九個(gè)潛在陽(yáng)性單個(gè)克隆。制備每個(gè)潛在陽(yáng)性單個(gè)克隆的DNA并用EcoRⅠ和PstⅠ消化。這九個(gè)單個(gè)克隆中的三個(gè)的DNA表現(xiàn)出相同的限制內(nèi)切酶類型，而其它六個(gè)則不相關(guān)，提示該三個(gè)代表了含有GDNFR的真正克隆。
實(shí)施例3DNA測(cè)序和序列分析從陽(yáng)性單個(gè)克隆制備DNA并按照制造商說(shuō)明書，用自動(dòng)ABI373ADNA測(cè)序儀(Perkin/Elmer Applied Biosystems,Santa Clara,CA)和雙脫氧染色終止子測(cè)序。使用在威斯康辛大學(xué)遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組軟件包(威斯康辛軟件包程序手冊(cè)，第8版，1994年9月，Genetics Computer Group,Madison,Wisconsin)中描述的FASTA(Pearson和Lipman,Proceedings OfThe National Academy of Sciences U.S.A.,85,2444-2448,1988)程序算法，將GDNF受體序列與所有可得公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較。大鼠GDNFR的序列特征從上述實(shí)施例2中描述的克隆制備質(zhì)粒DNA并提交DNA序列分析。該克隆的2138bp大鼠cDNA的核苷酸序列分析展現(xiàn)一編碼468個(gè)氨基酸殘基的轉(zhuǎn)譯蛋白的單個(gè)大開放閱讀框架(圖3)。
該編碼序列的側(cè)面是5’端301bp的非轉(zhuǎn)譯區(qū)和不含有潛在多聚腺苷酸化位點(diǎn)的3’端430bp的非轉(zhuǎn)譯區(qū)。在位于堿基對(duì)302的第一個(gè)ATG的上游存在一個(gè)框內(nèi)終止密碼子和其周圍核苷酸前后的關(guān)系的表明該甲硫氨酸密碼子是最有可能的轉(zhuǎn)譯起始子位點(diǎn)(Kozak,NucleicAcids Research.15,8125-8148,1987)。
在該大鼠cDNA克隆的3’端非轉(zhuǎn)譯序列的430個(gè)核苷酸中未發(fā)現(xiàn)多聚腺苷酸化信號(hào)。這不奇怪，因?yàn)镹orthern印跡分析數(shù)據(jù)顯示最短的mRNA轉(zhuǎn)錄物約為3.6kb。
該GDNFR多肽序列具有一約19個(gè)殘基(甲硫氨酸-1至丙氨酸-19，圖3)的N末端疏水區(qū)，具有分泌信號(hào)肽的特征(von Heijne,ProteinSequences And Data Analysis,1,41-42,1987；von Hijne,Nucleic AcidsResearch.14,4683-4690,1986)。未發(fā)現(xiàn)可以做為跨膜域的內(nèi)部疏水性域。但是，存在一個(gè)21個(gè)殘基的羧基末端疏水性區(qū)(圖3中亮氨酸-448至絲氨酸-468)并可能參與該受體糖基-磷脂酰肌醇(GPI)錨定至細(xì)胞質(zhì)膜上。除三個(gè)潛在N連接糖基化位點(diǎn)之外，未發(fā)現(xiàn)保守序列或基序。該蛋白極富有半胱氨酸(該468個(gè)氨基酸殘基中有31個(gè))，但是它們的間隔與在已知受體的胞外部分中發(fā)現(xiàn)的富含半胱氨酸域的間隔是不一樣的。
使用FASTA將該GDNFR序列與可得到的公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行了比較。該檢索未發(fā)現(xiàn)與其它已公開序列的顯著同源性。一旦得到該大鼠cDNA克隆后，如以下實(shí)施例5中所述，將其進(jìn)行放射性標(biāo)記并用于檢測(cè)從人腦黑質(zhì)制備的cDNA文庫(kù)。
實(shí)施例4GDNF與表達(dá)GDNFR細(xì)胞的結(jié)合按照先前由Jing等描述的檢測(cè)方法(Journal Of Cell Biology,110,283-294,1990)進(jìn)行結(jié)合檢測(cè)。該檢測(cè)涉及[125I]GDNF結(jié)合至大鼠感光細(xì)胞、已被轉(zhuǎn)染表達(dá)GDNFR的COS7細(xì)胞或293T細(xì)胞。在293T細(xì)胞表面表達(dá)的重組GDNFR可以特異性地結(jié)合GDNF，并且結(jié)合的親和性可以與在大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞上觀測(cè)到的與GDNF結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的親和性相比擬。
按照以上實(shí)施例1所述制備大鼠感光細(xì)胞，并在檢測(cè)前2-3天以5.7×105細(xì)胞/cm2的密度接種于用聚鳥氨酸和層粘合蛋白預(yù)包被的24孔Costar組織培養(yǎng)平板上。將COS7細(xì)胞于檢測(cè)前1天以2.5×104細(xì)胞/cm2的密度種入并采用DEAE-葡聚糖-氯喹法(Aruffo和Seed,Proceedings Of The National Academy Of Sciences U.S.A.,84,8573-8577,1987)用10-20μg質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染。移出每個(gè)平板中的細(xì)胞并于轉(zhuǎn)染后24小時(shí)再接種于24孔Costar組織培養(yǎng)平板的30個(gè)孔中，并使之再生長(zhǎng)48小時(shí)。然后將細(xì)胞置于冰上5-10分鐘，用冰凍清洗緩沖液清洗一次并與含有各種濃度的[125I]GDNF及含或不含未標(biāo)記GDNF的0.2mL結(jié)合緩沖液于4℃培育4小時(shí)。用0.5mL冰凍清洗緩沖液清洗細(xì)胞四次并用0.5mL 1M NaOH裂解。將裂解液在1470Wizard自動(dòng)伽馬計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)。
對(duì)一些結(jié)合試驗(yàn)，使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞(參見以下有關(guān)293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染)。轉(zhuǎn)染后二天，用2×versine從皿中移出細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀、用冰凍結(jié)合緩沖液清洗一次并以3×105細(xì)胞/mL的密度再懸浮于冰凍結(jié)合緩沖液中。將該細(xì)胞懸液分成含有1.5×105細(xì)胞/樣品的等份。然后將細(xì)胞沉淀并與含有各種濃度的[125I]GDNF在有或沒有500nM未標(biāo)記GDNF于4℃溫和攪拌培育4小時(shí)。用冰凍清洗緩沖液清洗細(xì)胞四次并再懸浮于0.5mL清洗緩沖液中。將兩個(gè)0.2mL等份的該懸浮液在伽馬計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)以確定與細(xì)胞連接[125I]GDNF的量。
在全部的檢測(cè)中，通過(guò)使用雙份樣品(其中之一含有500nM未標(biāo)記GDNF)測(cè)定非特異性結(jié)合。非特異性結(jié)合的水平為在沒有未標(biāo)記GDNF的情況下測(cè)定的特異性結(jié)合的10％-20％，并從特異性結(jié)合中減去。該檢測(cè)證明細(xì)胞不結(jié)合GDNF，除非該細(xì)胞已用GDNFR cDNA克隆轉(zhuǎn)染。
實(shí)施例5GDNFR mRNA的組織分布通過(guò)Northern印跡分析檢查胚胎小鼠、成年小鼠、大鼠和人組織中GDNFR mRNA表達(dá)的形式。按照制造商程序，用隨機(jī)引物DNA標(biāo)記藥盒(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)標(biāo)記克隆的大鼠GDNFR cDNA。將大鼠、小鼠和人組織RNA印跡(購(gòu)自Clontech,PaloAlto,CA)與該探針雜交并按照制造商說(shuō)明書使用ExpressHyb藥盒(Clontech)試劑清洗。
從成年大鼠、小鼠和人組織制備的組織Northern印跡表明GDNFR mRNA主要在肝臟、大腦和腎臟中高度表達(dá)。在肺中亦檢測(cè)到mRNA高表達(dá)，在脾臟、腸、睪丸和骨骼肌中量較低或未能檢測(cè)到。在從小鼠胚胎分離的mRNA制備的印跡中，于胚胎7天時(shí)不能檢測(cè)到表達(dá)，在胚胎11天時(shí)表達(dá)變得明顯，到胚胎17天時(shí)表達(dá)非常高。在從成人大腦的幾個(gè)亞區(qū)分離的組織中GDNFR mRNA以相對(duì)平穩(wěn)的水平表達(dá)。GDNFR mRNA在成人大腦中的表達(dá)對(duì)任何特定區(qū)域幾乎都未顯示特異性。
在大多數(shù)組織中，存在兩個(gè)不同大小的轉(zhuǎn)錄物。在小鼠和人組織中，發(fā)現(xiàn)8.5和4.4kb的轉(zhuǎn)錄物，而在大鼠中該轉(zhuǎn)錄物是8.5和3.6kb。較大和較小轉(zhuǎn)錄物的相對(duì)量隨組織類型變化，該較小的轉(zhuǎn)錄物主要在肝臟和腎臟中，該較大轉(zhuǎn)錄物在大腦中更豐富。通過(guò)Scatchard分析檢測(cè)GDNF與用在pBKRSV載體中克隆的GDNFR cDNA轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的結(jié)合。檢測(cè)到二類結(jié)合位點(diǎn)，一類的結(jié)合親和性在低pM范圍，而另一類的親和性為約500pM。
實(shí)施例6重組的人GDNFR用實(shí)施例1的大鼠GDNFR cDNA克隆做為探針篩選克隆于噬菌體gt10中的成人黑質(zhì)cDNA文庫(kù)(5’端加附加物伸長(zhǎng)的cDNA文庫(kù)，Clontech,Palo Alto,CA)。按照制造商說(shuō)明書使用隨機(jī)引物DNA標(biāo)記藥盒(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)，將該探針用[32P]-dNTP標(biāo)記。將來(lái)自該人黑質(zhì)cDNA文庫(kù)的約1.2×106gt10噬菌體接種于15cm瓊脂糖平板上并在雙層硝酸纖維素濾膜上復(fù)制。然后用該放射性標(biāo)記探針通過(guò)雜交篩選該濾膜。將該濾膜在200mL的6×SSC、1×Denhardts、0.5％SDS、50μg/mL鮭魚精DNA中于55℃預(yù)雜交3.5小時(shí)。加入2×108cpm放射性標(biāo)記的該探針后，繼續(xù)雜交18小時(shí)。然后將濾膜在0.5×SSC、0.1％SDS中于55℃中清洗二次，每次30分鐘，并用增強(qiáng)屏對(duì)X光膠片曝光過(guò)夜。
分離出5個(gè)陽(yáng)性噬菌斑，其cDNA插入物代表該人GDNFR cDNA的一部分。與圖3(bp 0-2140)中描述的大鼠GDNFR核酸序列相比較，發(fā)現(xiàn)這5個(gè)人GDNFR克隆含有以下序列表3克隆2 1247至2330(SEQ ID NO:21)克隆9 1270至2330(SEQ ID NO:23)克隆21-A-235至1692(SEQ ID NO:9)克隆21-B-237至1692(SEQ ID NO:11)克隆29805至2971(SEQ ID NO:15)如圖5描述將這些序列對(duì)齊并比較，提供了人GDNFR的共有序列。根據(jù)該人cDNA序列預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物由465個(gè)氨基酸組成并與大鼠GDNFR有93％相同。
為產(chǎn)生編碼全長(zhǎng)GDNFR的人cDNA，將克隆21B和2的部分于一個(gè)內(nèi)部BglⅡ位點(diǎn)剪接在一起并亞克隆入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pBKRSV(Stratagene,La Jolla,CA)。
可以制備重組的人GDNFR表達(dá)載體以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。如上表明，亦可以在諸如細(xì)菌細(xì)胞的非哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)?？梢詫⒈疚墓_的核酸序列置于市售哺乳動(dòng)物載體(例如CEP4,Invitrogen)以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，包括市售的人胚胎腎細(xì)胞系“293”。為在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)，可以通常除去編碼前導(dǎo)序列的部分(例如圖1的核酸1-590)?？梢栽贜末端添加一額外的甲硫氨酰用于細(xì)菌表達(dá)。另外，可以用不同的前導(dǎo)序列或其它為便于表達(dá)而切割的序列置換天然的前導(dǎo)序列。
實(shí)施例7可溶性GDNFR構(gòu)建物制備了可溶性人GDNFR蛋白產(chǎn)物。以下例子提供四種不同形式，僅在羧基末端不同，由圖2中提供的殘基號(hào)碼表明。兩種是于緊靠疏水性尾上游和最后一個(gè)半胱氨酸殘基下游的不同位點(diǎn)截短的可溶性形式。另兩種是同樣截短蛋白的但添加了“FLAG”序列，它是有市售抗體的一個(gè)八肽(Eastman Kodak)。該FLAG序列是H2N-DYKDDDDK-COOH。方法用EcoRⅠ消化含有幾乎整個(gè)人GDNFR編碼區(qū)的λ噬菌體克隆#21以切下該cDNA插入物。將該片段純化并連接進(jìn)入EcoRⅠ切割的pBKRSV載體(Stratagene,La Jolla,CA)以制備克隆21-B-3/pBKRSV。以該人GDNFR克隆21-B-3/pBKRSV做為模板，在PCR反應(yīng)中使用如下所示的引物1和2。PCR條件是94℃5分鐘，接著是25個(gè)周期的94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃2分鐘和于72℃最后延伸5分鐘。這樣產(chǎn)生了一個(gè)由該人GDNFR克隆的核苷酸1265-1868加上由引物2提供的終止密碼子和HindⅢ限制位點(diǎn)所組成的片段。該片段用限制性酶HindⅢ(含于引物2中)和BglⅡ(在人GDNFR中的位置為1304)消化，產(chǎn)生的572核苷酸的片段用凝膠電泳分離。該片段含有從異亮氨酸-255至甘氨酸-443的該hGDNFR編碼區(qū)。使用類似的策略，用引物1和3制備具有BglⅡ和HindⅢ末端、編碼異亮氨酸-255至脯氨酸-446的片段。設(shè)計(jì)引物4和5以產(chǎn)生編碼hGDNFR相同區(qū)域和引物1和3、但添加了該Flag肽編碼序列(IBI/Kodak,New Haven,CN)的片段。該Flag肽序列由8個(gè)氨基酸(H2N-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-COOH)組成，有其市售抗體。引物1和4或1和5被用于使用如前的同樣模板PCR反應(yīng)中，并如前用HindⅢ和BglⅡ消化。該方法產(chǎn)生了編碼異亮氨酸-255至甘氨酸-443和異亮氨酸-255至脯氨酸-446但在其羧基末端添加了該Flag肽的片段。引物1)5′-CTGTTTGAATTTGCAGGACTC-3′(SEQ ID NO:30)2)5′-CTCCTCTCTAAGCTTCTAACCACAGCTTGGAGGAGC-3′(SEQID NO:31)3)5′-CTCCTCTCTAAGCTTCTATGGGCTCAGACCACAGCTT-3′(SEQ ID NO:32)4)5′-CTCCTCTCTAAGCTTCTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCACCACAGCTTGGAGGAGC-3′(SEQ ID NO:3 3)5)5′-CTCCTCTCTAAGCTTCTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCTGGCTCAGACCACAGCTT-3′(SEQ ID NO:3 4)將如上述制備的所有四個(gè)片段轉(zhuǎn)移回21B3/pBKRSV。該21B3/pBKRSV克隆用BglⅡ和HindⅢ消化并用小牛腸堿性磷酸酶(CIAP)處理。將含有該載體和人GDNFR編碼區(qū)直至該BglⅡ位點(diǎn)的大片段進(jìn)行凝膠純化并從凝膠提取。將如上述制備的四個(gè)BglⅡ/HindⅢ片段的每一個(gè)都連接到該載體上，以產(chǎn)生在該pBRSV載體中的下列構(gòu)建物表41)GDNFR/gly-443/pBKRSV hGDNFR終止于甘氨酸443，后接終止密碼子2)GDNFR/pro-446/pBKRSV hGDNFR終止于脯氨酸446，后接終止密碼子3) GDNFR/gly-443/Flag/pBKRSV hGDNFR終止于甘氨酸443并帶C末端Flag標(biāo)記，后接終止密碼子4)GDNFR/pro-446/Flag/pBKRSV hGDNFR終止于脯氨酸446并帶C末端Flag標(biāo)記，后接終止密碼子通過(guò)DNA測(cè)序確認(rèn)所有克隆的正確構(gòu)建。使用在下述pBKRSV多接頭序列中的酶位點(diǎn)，將來(lái)自該pBKRSV克隆的插入物轉(zhuǎn)移至其它表達(dá)載體。亦已將可溶性GDNFR(例如sGDNFR/gly和sGDNFR/pro)轉(zhuǎn)移進(jìn)入瞬時(shí)表達(dá)載體并進(jìn)入pDSR-2中以在CHO細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。pDSRα2+PL克隆將適當(dāng)?shù)膒BKRSV克隆用XbaⅠ和SalⅠ消化。將插入片段連接至用同樣的酶切割并用CIAP處理的pDSRα2+PL。該構(gòu)建物可以用于在CHO細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)GDNFR。pCEP4克隆將適當(dāng)?shù)膒BKRSV克隆用SpeⅠ和XhoⅠ消化。將插入片段連接至用NheⅠ(SpeⅠ末端)和XhoⅠ消化并用CIAP處理的pCEP4(Invitrogen,SanDiego,CA)。該構(gòu)建物可以用于瞬時(shí)表達(dá)GDNFR。
基本上按照于1990年3月29日提交的共同擁有和共同未決美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)501,904(亦可參見于1990年5月18日提交的歐洲專利申請(qǐng)90305433，公告EP398 753號(hào)和WO 90/14363(1990))(其說(shuō)明書通過(guò)引用結(jié)合到本文中)中描述的方法制備質(zhì)粒構(gòu)建物pDSR-2。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解可以用各種編碼GDNFR類似物的核酸序列。
另一構(gòu)建物是pDSRα2，它是質(zhì)粒pCD(Okayama&Berg,Mol.CellBiol.3:280-289,1983)的衍生物，具有三個(gè)主要修飾(ⅰ)SV40多聚腺苷酸化信號(hào)已被來(lái)自牛濾泡刺激激素的α亞基α-bFSH(Goodwin等，Nucleic Acids Res.11:6873-6882,1983)的信號(hào)取代；(ⅱ)已在該表達(dá)盒的下游插入小鼠二氫葉酸還原酶小基因(Gasser等，Proc.Natl.Acad.Sci.79:6522-6526,1982)以選擇和擴(kuò)增該轉(zhuǎn)化體；和(ⅲ)已克隆了267 bp含有人I型T-細(xì)胞白血病病毒(HTLV-I)長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)的“R元件”和部分“U5”序列的片段，并按照前述(Takebe等，Mol.Cell Biol.8:466-472,1988)插入到該SV40啟動(dòng)子和該剪接信號(hào)之間。
碘處理的GDNF與細(xì)胞表面的結(jié)合確認(rèn)了GDNFR在CHO細(xì)胞中的表達(dá)。如上討論，可以用該重組表達(dá)的可溶性GDNFR蛋白產(chǎn)物增強(qiáng)GDNF的活性或細(xì)胞特異性。亦可以將連接了可檢測(cè)標(biāo)記的可溶性GDNFR如上述用于診斷應(yīng)用。
實(shí)施例8GDNF與GDNFR的化學(xué)交聯(lián)為研究其結(jié)合特性和分子特征，通過(guò)轉(zhuǎn)染該大鼠cDNA克隆將GDNFR瞬時(shí)表達(dá)于293T細(xì)胞表面。按照制造商說(shuō)明書使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(GIBCO/BRL,Gaithersburg,MD)進(jìn)行293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染2天后，通過(guò)2xversine處理移出細(xì)胞，用清洗緩沖液清洗一次，然后以2×106細(xì)胞/mL的密度再懸浮于清洗緩沖液中。將完全一樣的一組細(xì)胞與0.5u/mL PI-PLC在[125I]GDNF結(jié)合前于37℃培養(yǎng)30分鐘。將這些細(xì)胞用冰凍結(jié)合緩沖液清洗三次，然后用1-3nM[125I]GDNF與其它細(xì)胞一起于4℃培養(yǎng)4小時(shí)。將細(xì)胞用冰凍清洗緩沖液清洗四次，再懸浮于添加了用于交聯(lián)的1mM雙辛二酸(BS3Pierce,Rockford,IL)的清洗緩沖液并于室溫培育30分鐘。用TBS清洗三次后，將完全一樣的一組樣品用0.5u/mL PI-PLC于37℃處理30分鐘。將這些細(xì)胞沉淀并收集上清液。然后用清洗緩沖液清洗細(xì)胞并與其它細(xì)胞一起用2×SDS-PAGE樣品緩沖液裂解。將細(xì)胞裂解液和收集的上清液在7.5％SDS-PAGE上分辨。
將細(xì)胞懸液分成含有1.5×105細(xì)胞/樣品的等份。然后沉淀細(xì)胞，并與含有各種濃度的[125I]GDNF在有或沒有500nM未標(biāo)記GDNF條件下于4℃溫和攪拌培育4小時(shí)。用冰凍清洗緩沖液清洗細(xì)胞四次并再懸浮于0.5mL清洗緩沖液中。將兩個(gè)0.2mL等份的該懸浮液在伽馬計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)以確定與細(xì)胞連接[125I]GDNF的量。
盡管模擬轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞未展示任何GDNF結(jié)合能力，但GDNFR轉(zhuǎn)染的細(xì)胞甚至在pM濃度時(shí)強(qiáng)烈結(jié)合[125I]GDNF。這種結(jié)合幾乎完全被500nM未標(biāo)記GDNF抑制，表明天然GDNF對(duì)該表達(dá)受體的特異性結(jié)合。
由293T細(xì)胞表達(dá)的GDNFR可以通過(guò)用磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC,Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)處理從細(xì)胞釋放。在配體結(jié)合前用PI-PLC處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞，幾乎完全消除了該細(xì)胞的GDNF結(jié)合能力。另外，在交聯(lián)后處理該轉(zhuǎn)染細(xì)胞把大多數(shù)交聯(lián)產(chǎn)物釋放到培養(yǎng)基中。這些結(jié)果強(qiáng)有力地提示GDNFR通過(guò)GPI鍵合固定于細(xì)胞膜上。
交聯(lián)數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明GDNFR的分子量為約50-65kD，提示有低水平的糖基化。盡管主要交聯(lián)種類具有的分子量與該受體的單體一致，但已發(fā)現(xiàn)一小類具有約為預(yù)期為二聚體的質(zhì)量。
實(shí)施例9GDNF信號(hào)發(fā)生由GDNFR和Ret受體蛋白酪氨酸激酶的復(fù)合物介導(dǎo)前言在GDNF基因中攜帶定向無(wú)效突變的小鼠在得自神經(jīng)脊細(xì)胞的組織、自主神經(jīng)系統(tǒng)、三叉及脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中展示出各種缺陷。最嚴(yán)重的缺陷是缺少腎臟和在消化道中完全沒有腸神經(jīng)元。GDNF剔除小鼠的表現(xiàn)型與c-ret剔除動(dòng)物的表現(xiàn)型(Schuchardt等1 994)驚人地相似，提示在GDNF和c-ret信號(hào)傳導(dǎo)通道之間可能的聯(lián)系。
用得自基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中分離的癌基因的探針鑒別了原癌基因c-ret(Takahashi等，Cell.42,581-588,1985；Takahashi和Cooper,Mol.Cell.Biol.,7,1378-1385,1987)。該c-ret cDNA的序列分析揭示編碼新受體蛋白酪氨酸激酶(PTK)的大開放閱讀框。已將受體PTKS家族按照胞外域結(jié)構(gòu)和與胞內(nèi)激酶域內(nèi)的序列同源性分組為亞家族(van der Geer等，1994)。Ret的獨(dú)特胞外域結(jié)構(gòu)使其置于任何其它已知受體PTK亞家族之外，它包括一個(gè)信號(hào)肽、一個(gè)類鈣粘連素基序和一個(gè)富含半胱氨酸區(qū)(van Heyningen,Nature,367,319-320,1994；Iwamoto等，1993)。原位雜交和免疫組織化學(xué)分析顯示在小鼠胚胎的發(fā)育中的中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)和排泄系統(tǒng)中有ret mRNA和蛋白的高水平表達(dá)(Pachnis等，1993；Tsuzuki等，Oncogene,10,191-198,1995)，提示該Ret受體或者在這些組織的發(fā)育或者在這些組織的功能中起作用。由于尚未識(shí)別出該Ret受體的功能配體，因此限制了對(duì)Ret信號(hào)發(fā)生的分子機(jī)制的深入理解。在該c-ret基因中的突變與在家族性髓狀甲狀腺癌(FMTC)和2A型(MEN2A)和2B型(MEN2B)多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤形成中的遺傳性的易患癌癥相關(guān)。這些疾病可能是由組成型地激活該Ret激酶的“功能增加”突變引起。(Donis-Keller等，Hum.Molec.Genet.2,851-856,1993；Hofstra等，Nature.367,375-376,1994；Mulligan等，Nature.363,458-460,1993；Santoro等，Science.267,381-383,1995)。它們特異地賦予衍生自神經(jīng)脊突的組織易發(fā)惡性腫瘤，在該組織中ret在早期發(fā)育中正常表達(dá)。另一與ret相關(guān)的遺傳性疾病先天性巨結(jié)腸(HSCR)的特征在于在下消化道中先天性缺乏副交感神經(jīng)支配(Edery等，Nature.367,378-380,1994；Romeo等，1994)。HSCR最可能的原因是導(dǎo)致產(chǎn)生缺失激酶域的截短Ret蛋白的無(wú)義突變或滅活該Ret激酶的錯(cuò)義突變。如上述，小鼠中該c-ret原癌基因的定向破壞導(dǎo)致腎發(fā)育不全或嚴(yán)重發(fā)育不全和在消化道中缺乏腸神經(jīng)元(Schuchardt等，1994)。這種表現(xiàn)型與GDNF剔除小鼠的表現(xiàn)型密切地相似。綜合起來(lái)，這些數(shù)據(jù)提示Ret和GDNF均參與對(duì)腎臟和腸道神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)鍵的信號(hào)傳導(dǎo)通道。然而不知道Ret和GDNF是怎樣參與的。
如上述通過(guò)表達(dá)克隆，對(duì)GDNFR cDNA的分離和表征導(dǎo)致在轉(zhuǎn)化的人胚胎腎細(xì)胞系293T中表達(dá)GDNFR。轉(zhuǎn)化導(dǎo)致出現(xiàn)高(Kd約為2PM)和低(Kd約為200pM)親和性的結(jié)合位點(diǎn)。所述高親和性位點(diǎn)可以由GDNFR自身的同源二聚體或同源寡聚體組成、或由GDNFR與其它分子的異源二聚體或畀源寡聚體組成。如上所述，因?yàn)镚DNFR缺失細(xì)胞質(zhì)域，它必須通過(guò)一個(gè)或多個(gè)輔助分子發(fā)揮功能，以便在GDNF信號(hào)傳導(dǎo)中起作用。在本研究中我們確認(rèn)在GDNFR的存在下，GDNF與Ret蛋白酪氨酸激酶受體相結(jié)合，并快速誘導(dǎo)Ret自磷酸化。
結(jié)果表達(dá)與GDNF以高親和性結(jié)合的GDNFR的Neuro-2a細(xì)胞Neuro-2a是內(nèi)源表達(dá)高水平Ret蛋白的小鼠成神經(jīng)纖維瘤細(xì)胞系(Ikeda等，Oncogene.5,1291-1296,1990；Iwamoto等，Oncogene.8,1087-1091,1993；Takahashi和Cooper,1987)，但不表達(dá)Northem印跡評(píng)價(jià)的可檢測(cè)水平的GDNFR mRNA。為確定Ret是否能在GDNFR存在下與GDNF結(jié)合，進(jìn)行一項(xiàng)研究以測(cè)定[125I]GDNF與工程化改造的表達(dá)GDNFR的Neuro-2a細(xì)胞的結(jié)合。用含有該大鼠GDNFR cDNA的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(例如上述表達(dá)質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染Neuro-2a細(xì)胞。檢測(cè)了三個(gè)克隆系NGR-16、NGR-33和NGR-38結(jié)合[125I]GDNF的能力。在培育末期除去未結(jié)合的[125I]GDNF，并按照實(shí)驗(yàn)程序測(cè)定與細(xì)胞結(jié)合的放射性活性的量。所有三個(gè)系都能特異性地結(jié)合[125I]GDN，而親代Neuro-2a細(xì)胞幾乎沒有或沒有表現(xiàn)出與[125I]GDNF結(jié)合(圖6)。通過(guò)加入500nM未標(biāo)記GDNF可以有效地競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。這些結(jié)果證明Neuro-2a細(xì)胞上表達(dá)的Ret受體不能在缺乏GDNFR的情況下結(jié)合GDNF，并且與以前的GDNFR在Neuro-2a細(xì)胞中沒有可以觀察到的水平的表達(dá)的觀察一致。
在很寬的配基濃度范圍(存在或缺乏500nM未標(biāo)記GDNF的情況下0.5pM至1nM[125I]GDNF)測(cè)定[125I]GDNF與NGR-38細(xì)胞的平衡結(jié)合(圖7A)。培育后，除去未結(jié)合[125I]GDNF并按照實(shí)驗(yàn)程序所述測(cè)定與細(xì)胞結(jié)合的放射性活性。結(jié)果描述于圖7中(A)[125I]GDNF與NGR-38細(xì)胞(圓圈)和Neuro-2a細(xì)胞在未標(biāo)記GDNF存在下(空心圓和空心方塊)或不存在下(實(shí)心圓和實(shí)心方塊)的平衡結(jié)合；(B)[125I]GDNF與NGR-38細(xì)胞結(jié)合的Scatchard分析。Neuro-2a細(xì)胞甚至在[125I]GDNF為1nM濃度下沒表現(xiàn)出多少的結(jié)合，并且這種結(jié)合不為加入過(guò)量未標(biāo)記的GDNF所影響。如圖7B所示通過(guò)Sccatchard作圖，分析NGR-38細(xì)胞的結(jié)合。檢測(cè)到二類結(jié)合位點(diǎn)，一類的Kd=1.5±0.5pM，而另一類的Kd=332±53pM。這些解離常數(shù)與如上述瞬時(shí)表達(dá)GDNFR的293T細(xì)胞中的高和低親和性結(jié)合位點(diǎn)得到的值非常相似。GDNF與表達(dá)GDNFR的Neuro-2a細(xì)胞中的Ret結(jié)合為確定該Ret受體PTK是否可以在表達(dá)GDNFR的細(xì)胞中與GDNF結(jié)合，使用NGR-38和親代Neuro-2a細(xì)胞進(jìn)行交聯(lián)試驗(yàn)。將NGR-38細(xì)胞與[125I]GDNF培育，用交聯(lián)試劑處理，然后或者直接在SDS-PAGE樣品緩沖液中裂解或者在Triton X-100裂解緩沖液中裂解，并按照實(shí)驗(yàn)程序描述進(jìn)一步用抗Ret抗體免疫沉淀。在不存在(NR)或存在(R)巰基乙醇的情況下通過(guò)SDS-PAGE分析該免疫沉淀物。裂解物用Ret特異性抗體處理、免疫沉淀并在還原條件下通過(guò)SDS-PAGE分析(參見圖8，如下標(biāo)記條帶～75kD，實(shí)心三角；～150kD，空心三角；～185kD，實(shí)心箭頭；～250kD，星號(hào)；～400kD，空心箭頭)。最顯著交聯(lián)的種類位于～75kD和～185kD，而低強(qiáng)度的條帶為～150kD和～250kD。亦可見到非常弱的～400kD條帶(圖8，泳道2)。當(dāng)用非還原性SDS-PAGE分析免疫沉淀物時(shí)，該～75kD、～150和～185kD條帶以與在還原膠中約同樣的強(qiáng)度存在，但是該～400kD條帶的量顯著增加(圖8，泳道4)。位于～250kD的條帶亦變得顯著。
在還原和非還原條件下，當(dāng)使用親代Neuro-2a細(xì)胞而不是NGR-38(圖8，泳道1和3)時(shí)，觀察到類似分子量但強(qiáng)度急劇減弱的條帶?！?5kD和～150kD種類可能代表GDNF和GDNFR的交聯(lián)復(fù)合物，因?yàn)榫哂邢嗟确肿恿康姆N類是在不表達(dá)Ret的293T細(xì)胞中由交聯(lián)產(chǎn)生的。此外，因?yàn)镽et的分子量是170kD，任何包括Ret的復(fù)合物至少必須是這個(gè)大小。
這些復(fù)合物被抗Ret抗體免疫沉淀的事實(shí)表明它們是Ret和在該凝膠分析條件下被破壞的該GDNF/GDNFR復(fù)合物之間的結(jié)合的產(chǎn)物。預(yù)期位于～185kD的寬條帶可能由一個(gè)Ret分子(170kD)與一個(gè)分子單體重組GDNF(15kD)交聯(lián)組成，盡管可以包括一些二聚體GDNF。通過(guò)一個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Ret在該種類中的存在，其中當(dāng)未標(biāo)記GDNF與NGR-38細(xì)胞交聯(lián)并用Western印跡結(jié)合抗Ret抗體檢測(cè)該產(chǎn)物時(shí)，觀察到同樣分子量的條帶(未給出數(shù)據(jù))。
未可靠地鑒別該～400kD條帶，部分是因?yàn)殡y以估計(jì)其分子量。它只在非還原條件下顯著的事實(shí)表明它是在還原條件下觀察到的一種或多種種類的二硫鍵連接的二聚體。最有可能的解釋是它是代表該185kD種類的二聚體，盡管它可能是由兩個(gè)Ret、一個(gè)或兩個(gè)GDNFR和一個(gè)或兩個(gè)GDNF分子組成的高分子量復(fù)合物的混合物。尚未確定該～250kD條帶的準(zhǔn)確身份。一種可能是它代表該～75kD(GDNF+GINFR)和～185kD(GDNF+Ret)復(fù)合物的交聯(lián)異源二聚體。GDNF刺激在表達(dá)GDNFR的Neuro-2a細(xì)胞中的Ret自磷酸化在GDNFR存在的情況下該Ret蛋白酪氨酸激酶受體與GDNF結(jié)合的能力導(dǎo)致研究GDNF刺激的Ret的自磷酸化。NGR-38細(xì)胞用GDNF處理、裂解并將該裂解物用抗Ret抗體免疫沉淀。按照實(shí)驗(yàn)程序所述用抗磷酸酪氨酸抗體通過(guò)Western印跡分析該免疫沉淀物。當(dāng)用產(chǎn)生于或者哺乳動(dòng)物(CHO細(xì)胞，圖9A，泳道4)或者大腸桿菌細(xì)胞(圖9A，泳道1、3)的純化的重組GDNF處理NGR-38細(xì)胞(圖9A，泳道2-4)時(shí)，在170kD觀察到一條強(qiáng)烈的條帶，表明在Ret的成熟形式上的酪氨酸殘基的自磷酸化。在GDNF處理的Neuro-2a細(xì)胞中觀察到一個(gè)弱得多的對(duì)應(yīng)條帶(圖9A，泳道1)。在另一糖基化的Ret150kD前體形式上未觀察到磷酸化作用(圖9A)。由GDNF誘導(dǎo)的Ret自磷酸化是劑量依賴的。在NGR-38細(xì)胞中的GDNF誘導(dǎo)的Ret酪氨酸磷酸化作用的劑量反應(yīng)和動(dòng)力學(xué)示于板B和C中。在所有的板中，用實(shí)心箭頭標(biāo)明該酪氨酸磷酸化的170 kD Ret條帶。由用抗Ret抗體(SantaCruz,C-19,Cat.#sc-167)重新探測(cè)該免疫印跡測(cè)定的每個(gè)泳道中Ret蛋白的上樣量示于板A的右側(cè)。位于～150kD的條帶代表未進(jìn)行自磷酸化的另一糖基化未成熟形式的Ret。如圖9B中所示，在NGR-38細(xì)胞中的Ret自磷酸化的刺激可以用50pg/mL的GDNF檢測(cè)，并且該反應(yīng)于20-50ng/mL的GDNF時(shí)飽和。處理后0-20分鐘在NGR-38細(xì)胞中由純化的重組GDNF對(duì)Ret自磷酸化的刺激示于圖9C中。在GDNF處理一分鐘內(nèi)可以觀察到Ret自磷酸化水平提高，并于處理10分鐘時(shí)最高(圖9C)。GDNF和可溶性GDNFR在Neuro-2A細(xì)胞中誘導(dǎo)Ret自磷酸化如上討論的，GDNFR通過(guò)GPI鍵合固定于細(xì)胞質(zhì)膜上，并可以通過(guò)用磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)處理而釋放。當(dāng)將NGR-38細(xì)胞與PI-PLC培育時(shí)，在這些細(xì)胞中GDNF誘導(dǎo)的Ret受體自磷酸化被消除(圖10A；PI-PLC處理(泳道1)或未處理(泳道2和3)NGR-38細(xì)胞與GDNF(泳道1和3)或不與GDNF(泳道2)培育，并按照實(shí)驗(yàn)程序描述的通過(guò)免疫印跡分析Ret自磷酸化)。
圖10B描述了按照實(shí)驗(yàn)程序所述，通過(guò)免疫印跡分析Ret自磷酸化在從Neuro-2a或NGR-38細(xì)胞得到的PI-PLC/CM存在下(泳道5-8)或不存在下(泳道1-4)用GDNF處理(泳道2、4、6、8)或不用GDNF處理(泳道1、3、5、7)的親代Neuro-2a細(xì)胞。在板A和B中，用實(shí)心箭頭標(biāo)記自磷酸化的170kD Ret條帶。當(dāng)將含有通過(guò)PI-PLC(PI-PLC/CM)處理NGR-38細(xì)胞釋放的可溶性GDNFR的條件培養(yǎng)基與GDNF一起加入親代Neuro-2a細(xì)胞時(shí)，觀察到與GDNF處理NGR-38細(xì)胞所得到的相比擬的Ret受體的自磷酸化(圖10B，泳道2和8)。當(dāng)未加入GDNF時(shí)，或當(dāng)測(cè)試得自PI-PLC處理的Neuro-2a細(xì)胞的條件培養(yǎng)基時(shí)，僅觀察到本底水平的Ret自磷酸化(圖10B，泳道3-7)。Ret-Fc融合蛋白阻斷由GDNF和可溶性GDNFR誘導(dǎo)的Ret磷酸化為確認(rèn)在GDNFR存在的情況下由GDNF誘導(dǎo)的Ret磷酸化是受體自磷酸化的結(jié)果，進(jìn)行了一項(xiàng)研究以確定Ret胞外域/免疫球蛋白Fc融合蛋白(Ret-Fc)是否可以阻斷Ret活化。由于阻斷在NGR-38細(xì)胞上表達(dá)的大量GDNFα受體存在技術(shù)困難，因而使用Neuro-2a做為靶細(xì)胞，并從用PI-PLC處理的NGR-38細(xì)胞液中移出的培養(yǎng)基做為GDNFR源進(jìn)行Ret磷酸化檢測(cè)。用包括GDNF(50ng/mL)、含有可溶性GDNFR的培養(yǎng)基(例如得自NGR-38細(xì)胞的PI-PLC/CM)和或者單獨(dú)或者如圖11中表明的各種組合的不同濃度的Ret-Fc融合蛋白的各種組合的混合物處理細(xì)胞。用GDNF、含有可溶性GDNFR的培養(yǎng)基、Ret-Fc或預(yù)培育的混合物處理Neuro-2a細(xì)胞。然后裂解該細(xì)胞，并按照實(shí)驗(yàn)程序描述，用抗Ret抗體通過(guò)免疫沉淀分析裂解物的c-Ret自磷酸化。用抗磷酸酪氨酸抗體通過(guò)Western印跡分析該免疫沉淀物。
GDNF和含有可溶性GDNFR培養(yǎng)基的預(yù)培育混合物誘導(dǎo)在Neuro-2a中表達(dá)的Ret受體的酪氨酸磷酸化，其水平可以與GDNF處理的NGR-38對(duì)照細(xì)胞的水平相當(dāng)(圖11，泳道7和2)。自磷酸化170kD Ret條帶的位置用實(shí)心箭頭標(biāo)記。當(dāng)將Ret-Fc融合蛋白包括于該預(yù)培育GDNF/GDNFR混合物中時(shí)，Ret磷酸化以劑量依賴方式被抑制(圖11，泳道8-10)。這表明Ret磷酸化是由GDNFR介導(dǎo)的GDNF/Ret相互作用的結(jié)果。在未處理的Neuro-2a細(xì)胞或在不存在GDNFR的情況下用GDNF或Ret-Fc融合蛋白的任何組合處理的細(xì)胞中，僅觀察到本底水平的Ret磷酸化(圖11，泳道3-6)。GDNF誘導(dǎo)在胚胎運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中表達(dá)的c-RET的自磷酸化脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元是GDNF體內(nèi)作用的主要靶之一(Henderson等，Science.266,1062-1064,1994；Li等，Proceedings Of The NationalAcademy Of Sciences,U.S.A.92,9771-9775,1995；Oppenheim等，Nature.373,344-346,1995；Yan等，Nature.373,341-344,1995；Zurn等，Neuroreport.6,113-118,1995)。為測(cè)試GDNF誘導(dǎo)這些細(xì)胞中Ret自磷酸化的能力，用(泳道2和4)和不用(泳道1和3)20ng/mL GDNF處理胚胎大鼠脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元并接著裂解細(xì)胞，用抗Ret抗體免疫沉淀，并按照實(shí)驗(yàn)程序描述的，用抗磷酸酪氨酸抗體通過(guò)Western印跡進(jìn)行分析。在用GDNF處理細(xì)胞的裂解物中，觀察到分子質(zhì)量為～170kD的酪氨酸磷酸化蛋白條帶(圖12，泳道2)。在僅用結(jié)合緩沖液處理的細(xì)胞中未觀察到這種信號(hào)(圖12，泳道1)。當(dāng)將同一Western印跡濾膜剝離并用抗Ret抗體重新探測(cè)(即在每條泳道中上樣的c-Ret蛋白量用抗Ret抗體重新探測(cè)該免疫印跡而測(cè)定)時(shí)，具有同樣分子量和類似強(qiáng)度的條帶在兩個(gè)樣品中都出現(xiàn)(圖12，泳道3和4)。在GDNF處理細(xì)胞中的磷酸酪氨酸條帶與該Ret蛋白條帶共遷移，表明GDNF刺激Ret的自磷酸化。該自磷酸化Ret條帶(泳道1和2)和對(duì)應(yīng)的蛋白條帶(泳道3和4)用實(shí)心箭頭標(biāo)記。
討論多肽生長(zhǎng)因子通過(guò)和與其相關(guān)的細(xì)胞表面受體結(jié)合而引起生物學(xué)效應(yīng)。受體可以根據(jù)其結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制分成幾個(gè)組。這些分類包括蛋白酪氨酸激酶(PTK)、絲氨酸/蘇氨酸激酶和細(xì)胞因子受體。受體PTK信號(hào)發(fā)生由與配基的直接相互作用啟動(dòng)，它誘導(dǎo)受體二聚體化或寡聚化，由此依次導(dǎo)致受體自磷酸化。該激活的受體接著吸收并磷酸化胞內(nèi)底物，啟動(dòng)達(dá)到生物學(xué)反應(yīng)頂點(diǎn)的級(jí)聯(lián)事件(Schlessinger和Ullrich,Neuron 9,383-391,1992)。對(duì)比之下，通過(guò)絲氨酸/蘇氨酸激酶或細(xì)胞因子受體的信號(hào)傳導(dǎo)通常涉及形成多組分受體復(fù)合物，其中配基結(jié)合和信號(hào)傳導(dǎo)組分是獨(dú)特的。實(shí)例是TGF受體復(fù)合物、由獨(dú)立的結(jié)合組分(Ⅱ型)和信號(hào)(Ⅰ型)組分組成對(duì)絲氨酸/蘇氨酸激酶受體和CNTF家族。CNTF、白介素-6(IL-6)和白細(xì)胞抑制因子(LIF)分別在其各自的受體復(fù)合物中共享共同的信號(hào)發(fā)生組分gp130和/或LIFR。雖然這些復(fù)合物的配基特異性是由各個(gè)單獨(dú)配基的特異性結(jié)合亞基決定的，但信號(hào)傳導(dǎo)需要配基和配基結(jié)合亞基的初始復(fù)合物與不能直接結(jié)合配基的其它受體亞基的結(jié)合(Ip等，Cell.69,1121-1132,1992)。在CNTF受體復(fù)合物中，該配基結(jié)合組分是CNTF受體(CNTFR)，它象GDNFR一樣，是GPI固定的膜蛋白。本發(fā)明涉及受體PTK的第一個(gè)例子的描述，該受體PTK的自磷酸化依賴于與獨(dú)立的配基特異性結(jié)合組分的結(jié)合。
本研究確認(rèn)需要GDNFR這種GPI連接的與GDNF以高親和性結(jié)合的膜蛋白，以使GDNF與該Ret受體PTK有效地結(jié)合。缺乏GDNFR時(shí)，GDNF不能與Ret結(jié)合或刺激Ret受體自磷酸化。存在GDNFR時(shí)，GDNF與Ret結(jié)合并以劑量依賴方式快速誘導(dǎo)Ret自磷酸化。GDNFR能夠如上述以膜固定形式或可溶性形式而起作用(圖11)。濃度為50pg/mL(1.7pM)的GDNF能夠在表達(dá)GDNFR的細(xì)胞中激活Ret酪氨酸激酶。這與在NGR-38細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的高親和性GDNF結(jié)合位點(diǎn)的解離常數(shù)(1.5pM)相一致。GDNF對(duì)Ret磷酸化的快速誘導(dǎo)(處理1分鐘后即可檢測(cè)到)和Ret-Fc阻斷自磷酸化的能力提示Ret是直接被激活，而不是做為某些其它受體磷酸化的下游結(jié)果。
交聯(lián)研究支持Ret與GDNF的有效結(jié)合取決于GDNFR的假設(shè)。雖然GDNF與表達(dá)高水平GDNFR的NGR-38細(xì)胞中的Ret的交聯(lián)是堅(jiān)固的，但是在親代Neuro-2a細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到交聯(lián)產(chǎn)物。盡管難以最終識(shí)別所有交聯(lián)復(fù)合物，但該數(shù)據(jù)清楚地證明Ret與GDNF的結(jié)合取決于GDNFR的存在，并證明GDNFR被包埋于一些交聯(lián)產(chǎn)物中。不清楚Neuro-2a細(xì)胞中較少的交聯(lián)種類存在的原因。盡管通過(guò)Northern印跡不能檢測(cè)到Neuro-2a細(xì)胞中GDNFR mRNA的表達(dá)，但GDNFR以非常低的水平在這些細(xì)胞中表達(dá)是可能的。
在培養(yǎng)的大鼠胚胎脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中Ret可以被GDNF激活的事實(shí)進(jìn)一步證明該Ret/GDNF相互作用的生物學(xué)聯(lián)系。這些細(xì)胞是GDNF在體內(nèi)的基本靶，并已顯示在體外對(duì)低劑量GDNF的應(yīng)答(Henderson等，1994)。當(dāng)用PI-PLC預(yù)處理該運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞時(shí)，Ret磷酸化刺激被取消(數(shù)據(jù)未顯示)，提示Ret被GDNF的激活需要GDNFR。
盡管配基與受體胞外域的結(jié)合是激活其它已知受體PTK的第一步，本數(shù)據(jù)已顯示GDNF和Ret并非這種情況。圖13描述GDNF與GDNFR和Ret結(jié)合的模型，以及接著對(duì)GDNF應(yīng)答激活Ret PTK。在該過(guò)程中的初始事件是二硫鍵連接的二聚體GDNF與或者單體或者二聚體形式的GDNFR結(jié)合。盡管目前沒有二聚體GDNFR存在的直接證據(jù)，但用GDNFR cDNA轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞時(shí)，出現(xiàn)二類結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)此觀察的最簡(jiǎn)單解釋是存在單體和二聚體GDNFR，各有其自己的配基結(jié)合親和性。這與GDNF結(jié)合親和性明顯地不受Ret存在的影響的發(fā)現(xiàn)一致。因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)不論及是否在不存在GDNF的情況下二聚體GDNFR與其單體平衡的問(wèn)題或二聚體化是否由GDNF結(jié)合誘導(dǎo)的問(wèn)題，所以提出這些可能性做為另一種路徑。由二聚體GDNFR和二聚體GDNF組成的復(fù)合物可以結(jié)合兩個(gè)Ret分子，形成活性信號(hào)發(fā)生復(fù)合物。至于其它PTK，兩個(gè)Ret分子細(xì)胞內(nèi)催化域之間的緊密接觸有可能導(dǎo)致受體自磷酸化。引起Ret穩(wěn)態(tài)二聚體化的MEN2A突變，導(dǎo)致該Ret激酶的組成型激活的事實(shí)(Santoro等，1995)支持Ret通過(guò)這種機(jī)制起作用的這種概念。
已報(bào)道運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元以低至5fM的ED50對(duì)GDNF應(yīng)答(Henderson等，1994)。盡管難以用生物學(xué)反應(yīng)的ED50比較結(jié)合親和性，但有在這些細(xì)胞上可能存在很高親和性的GDNF結(jié)合位點(diǎn)。已報(bào)道諸如胚胎小雞交感神經(jīng)元的其它細(xì)胞以1-5nM的Kd與GDNF結(jié)合(Trupp等，Journal Of Cell Biology.130,137-148,1995)。GDNFR不太可能涉及如此低親和性位點(diǎn)的受體復(fù)合物，但可能存在GDNF和Ret之間的弱直接相互作用。
在發(fā)育中的中樞神經(jīng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)的許多細(xì)胞譜系(包括腸神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞)中的胚胎發(fā)生中觀察到c-ret的表達(dá)(Pachnis等，Development,119,1005-1017,1993；Tsuzuki等，1995)。在神經(jīng)系統(tǒng)之外，已在腎臟的中腎管、輸尿管芽上皮和集合管中檢測(cè)到c-ret表達(dá)(Pachnis等，見上述；Tsuzuki等，1995)。亦在得自神經(jīng)脊突(Ikeda等，1990)和得自外科切除成神經(jīng)細(xì)胞瘤(Nagao等，1990；Takahashi和Cooper,1987)的所有成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系中檢測(cè)到Ret表達(dá)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中、以及在胚胎發(fā)育的非神經(jīng)元組織中都已觀察到GDNF表達(dá)。在許多非神經(jīng)元組織中發(fā)現(xiàn)的GDNF表達(dá)水平比在神經(jīng)系統(tǒng)中的高(Choi-Lundberg和Bohn,Brain Res.Dev.Brain Res.85,80-88,1995)。盡管未廣泛研究GDNFR的表達(dá)，初步的Norther印跡分析在成年大鼠和小鼠的肝臟、大腦和腎臟中檢測(cè)到高水平的GDNFR mRNA的存在。ret、GDNF和GDNFR在發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)和腎中的表達(dá)類型的相似性與它們?cè)诎l(fā)育中的聯(lián)合作用相一致。
已假設(shè)哺乳動(dòng)物腎臟的發(fā)育發(fā)生于后腎和發(fā)育中的輸尿管(從中腎管的尾部發(fā)育的分枝)之間的交互式相互作用(Saxen,Organogenesisof the kidney.Development and Cell Biology series,Cambridge UniversityPress,Cambridge,England,1987)。盡管在發(fā)育胚胎的輸尿管芽而不是在周圍間質(zhì)中發(fā)現(xiàn)Ret表達(dá)，在腎臟的未分化而不是成熟的后腎帽中檢測(cè)到GDNF表達(dá)。這些觀察提示GDNF與Ret之間的相互作用對(duì)啟動(dòng)輸尿管結(jié)構(gòu)的發(fā)育負(fù)責(zé)。GDNF和ret基因的定向破壞對(duì)此假設(shè)提供了進(jìn)一步的支持，這種破壞導(dǎo)致腎臟的很相似的表現(xiàn)型缺陷(Schuchardt等，Nature.367,380-383,1994；Sanchez，正在出版中)。在GDNF剔除(-/-)和ret剔除(-/-)的動(dòng)物中觀察到的另一主要表現(xiàn)型缺陷是在消化道中完全喪失腸神經(jīng)元。已把先天性巨結(jié)腸(特征在于在下消化道中先天性缺乏副交感神經(jīng)支配的遺傳性疾病)也與ret中“功能喪失”突變相聯(lián)系(Romeo等，Nature.367,377-378,1994.Edery等，1994)。一個(gè)較近的報(bào)道(Angrist等，Hum.Mol.Genet.4,821-830,1995)表明與較早的觀察相反，一些先天性巨結(jié)腸病人并不攜帶ret中的突變。現(xiàn)在預(yù)期這種病人可能攜帶GDFN、GDNR或該信號(hào)發(fā)生路徑的一些其它關(guān)鍵組分中的突變。
實(shí)驗(yàn)程序[125I]GDNF與表達(dá)GDNFR的Neuro-2a細(xì)胞的結(jié)合如上述按照制造商說(shuō)明書使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(GIBCO/BRL)，用表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Neuro-2a細(xì)胞(ATCC#CCL131)。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞通過(guò)在400μg/mL G418抗生素(Sigma)中生長(zhǎng)以選擇質(zhì)粒表達(dá)。擴(kuò)增G418抗性克隆并通過(guò)與[125I]GDNF(Amersham,Inc.,dy定制的碘化，目錄#IMQ1057)結(jié)合檢測(cè)GDNFR表達(dá)。以3×104細(xì)胞/cm2的密度將各個(gè)克隆的細(xì)胞接種于用聚鳥氨酸預(yù)包被的24孔組織培養(yǎng)平板(BectonDickinson)的雙份孔中。用冰凍清洗緩沖液(含有25mM HEPES的DMEM,pH7.5)清洗細(xì)胞一次，然后與結(jié)合緩沖液(清洗緩沖液加0.2％BSA)中的50pM的[125I]GDNF在500mM未標(biāo)記GDNF存在或不存在的情況下于4℃培育4小時(shí)。用冰凍清洗緩沖液清洗細(xì)胞四次并在1M NaOH中裂解，在1470 Wizard自動(dòng)伽馬計(jì)數(shù)器(Wallac Inc.)中測(cè)定細(xì)胞結(jié)合的放射性標(biāo)記的量。通過(guò)在缺乏和存在未標(biāo)記GDNF的情況下[125I]GDNF與細(xì)胞結(jié)合的比例，估計(jì)由單個(gè)克隆表達(dá)的GDNFR量。選擇三個(gè)克隆做為高、中、低水平GDNFR表達(dá)者的代表以用于結(jié)合實(shí)驗(yàn)。在缺乏和存在未標(biāo)記GDNF的情況下這些克隆與[125I]GDNF結(jié)合的比例是NGR-38)16:1、NGR-16)12.8:1和NGR-33)8:1。如上述進(jìn)行[125I]GDNF與NGR-38細(xì)胞的平衡結(jié)合，只是標(biāo)記GDNF的濃度范圍為0.5pM至1nM。在所有的檢測(cè)中，從缺乏未標(biāo)記GDNF的結(jié)合中減去非特異性結(jié)合(通過(guò)在有500pM未標(biāo)記GDNF的情況下與細(xì)胞結(jié)合的放射性標(biāo)記數(shù)量估計(jì))。通過(guò)Scatchard作圖分析結(jié)合數(shù)據(jù)?；瘜W(xué)交聯(lián)將Neuro-2a或NGR-38細(xì)胞用磷酸緩沖鹽水(PBS,pH7.1)清洗一次，然后用結(jié)合緩沖液中的1或3nM[125I]GDNF在有或沒有500nM未標(biāo)記GDNF的情況下于4℃處理4小時(shí)。結(jié)合后，將細(xì)胞用冰凍清洗緩沖液清洗四次，用在清洗緩沖液中的1mM雙辛二酸(BS3Pieree)于室溫培育45分鐘。通過(guò)用Tris緩沖鹽水(TBS,pH7.5)清洗細(xì)胞三次，抑制該交聯(lián)反應(yīng)。然后將這些細(xì)胞或者在SDS-PAGE樣品緩沖液(80 mM Tris HCl[pH 6.8],10％甘油，1％SDS,0.025％溴酚藍(lán))或在Triton X-100裂解緩沖液(50mM Hepes,pH7.5,1％Triton X-100,50mM NaCl,50mM NaF,10mM焦磷酸鈉，1％抑肽酶(Sigma，目錄#A-6279),1mM PMSF(Sigma，目錄#P-7626),0.5mM Na3VO4(Fisher目錄#S454-50))中直接裂解。通過(guò)離心澄清裂解液，與5μg/mL抗Ret抗體(Santa Cruz Antibody,C-19,Cat.#SC-167)一起培育，通過(guò)與蛋白A-Sepharose CL-4B(Pharmacia)一起沉淀收集產(chǎn)生的免疫復(fù)合物。用該裂解緩沖液清洗該免疫沉淀物三次，用含有50mM NaCl和20mMTris-Cl,pH7.5的0.5％NP-40清洗一次，然后再懸浮于SDS-PAGE樣品緩沖液中。將全部細(xì)胞裂解液和該免疫沉淀物都用比例為1∶200的雙丙烯酰胺通過(guò)7.5％SDS-PAGE分級(jí)分離。Western印跡分析通過(guò)Western印跡分析檢測(cè)Ret受體的自磷酸化。簡(jiǎn)言之，將細(xì)胞于檢測(cè)前24小時(shí)以1.5×106細(xì)胞/孔的密度接種于6孔組織培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞用結(jié)合緩沖液清洗一次，并用結(jié)合緩沖液中的或者單獨(dú)或者組合的各種濃度的不同試劑(包括GDNF、PI-PLC、PI-PLC/CM和Ret-Fc融合蛋白)處理各種時(shí)間。將處理的細(xì)胞和未處理的對(duì)照在Triton X-100裂解緩沖液中裂解并用該抗Ret抗體(Santa Cruz,C-19,Cat.#SC-167)和蛋白A-Sepahrose如上所述免疫沉淀。將免疫沉淀物通過(guò)SDS-PAGE分級(jí)分離，并按照Harlow和Lane所述(Antibodies:ALaboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,New York,1988)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。該膜預(yù)先用5％BSA(Sigma)封閉，通過(guò)用抗磷酸酪氨酸單克隆抗體4G10(UBI,Cat.#05-321)于室溫2小時(shí)在該膜形成印跡，以測(cè)定該受體酪氨酸磷酸化的水平。通過(guò)剝離同一膜并用該抗Ret抗體重新檢測(cè)該膜，以測(cè)定每個(gè)泳道包括的蛋白量。最終，按照制造商說(shuō)明書用化學(xué)發(fā)光試劑(ECL,Amersham)處理該膜，并對(duì)X光膠片(Hyperfilm-ELC,Amersham)曝光。用PI-PLC處理細(xì)胞和制備PI-PLC處理的條件培養(yǎng)基為從細(xì)胞表面釋放GPI連接的GDNFR，將細(xì)胞用清洗緩沖液清洗一次，然后與結(jié)合緩沖液中的1U/mL磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC,Boehringer Mannheim,Cat.#1143069)于37℃培育45分鐘。然后將細(xì)胞用清洗緩沖液清洗三次，并進(jìn)一步為Ret自磷酸化檢測(cè)或交聯(lián)進(jìn)行加工。為制備PI-PLC處理的條件培養(yǎng)基(PI-PLC/CM)，通過(guò)用含有2mM EDTA的PBS于37℃處理細(xì)胞5-10分鐘，從組織培養(yǎng)皿中移出8×106細(xì)胞。將細(xì)胞用清洗緩沖液清洗一次，再懸浮于含有1U/mL PI-PLC的1mL結(jié)合緩沖液中，并于37℃培育45分鐘。將細(xì)胞離心沉淀，并收集該P(yáng)I-PLC/CM。制備Ret-Fc融合蛋白用對(duì)應(yīng)于小鼠c-Ret的前20個(gè)氨基酸的寡核苷酸探針從17天大的鼠胎盤cDNA文庫(kù)中分離了包含整個(gè)c-Ret編碼區(qū)的cDNA(Iwamoto等，1993；van Heyningen,1994)。將編碼該Ret受體胞外域的編碼區(qū)(以最后一個(gè)氨基酸結(jié)束，R636)與編碼人IgG(IgG1)的Fc區(qū)的編碼DNA在框內(nèi)融合，并如前述亞克隆到表達(dá)載體pDSR2中(Bartley等，Nature.368,558-560,1994)。將該ret-Fc/pDSRa2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中，并使用Ni++柱(Qiagen)通過(guò)親和層析純化該重組Ret-Fc融合蛋白。制備胚胎大鼠脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元培養(yǎng)物在實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)從完整的E15 Sprague-Dawley大鼠胎兒脊髓制備富集胚胎大鼠脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元培養(yǎng)物。解剖脊髓，除去腦脊膜和脊神經(jīng)節(jié)(DRGs)。將脊髓切成小塊并用L15培養(yǎng)基中的木瓜蛋白酶(木瓜蛋白酶藥盒，Worthington)消化。使用6.8％甲泛葡胺梯度(Camu和Henderson,J Neuroscience.44,59-70,1992)富集在該分離的細(xì)胞懸浮液中大于其它細(xì)胞類型的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。收集位于甲泛葡胺墊和細(xì)胞懸浮液之間的界面處富集的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元并清洗，以～9×104細(xì)胞/cm2的密度接種于預(yù)先包被了聚-L-鳥氨酸和層粘合蛋白的組織培養(yǎng)皿中并于37℃培育。
本文引用了各種參考文獻(xiàn)，其說(shuō)明書通過(guò)引用全部結(jié)合到本文中。
雖然已經(jīng)以推薦實(shí)施方案和示范性的核酸和氨基酸序列描述本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員理解可以發(fā)生變例證核酸和氨基酸序列描述本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解可以發(fā)生變化和修飾。因此，預(yù)期所附的權(quán)利要求書覆蓋所有這種屬于如要求保護(hù)的本發(fā)明范圍的相等變化。
參考文獻(xiàn)Angrist,M.,Bolk,S.,Thiel,B.,Puffenberger,E.G.,Hofstra,R.M.,Buys,C.H.,Cass,D.T.和Chakravarti,A.(1995).Hirschsprung病中RET受體酪氨酸激酶的突變分析.Hum.Mol.Genet.4,82l-830.Arenas,E.,Trupp,M.,Akerud,P.和Ibanez,C.F.(1995).GDNF在體內(nèi)防止腦去甲腎上腺素能神經(jīng)元變性并促進(jìn)其表型.Neuron 15,1465-1473.Aruffo,A和Seed,B.(1987).用高效COS細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)分子克隆CD28cDNA.Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The UnitedStates Of America.84,8573-8577.Bartley,T.D.,Hunt,R.W.,Welcher,A.A.,Boyle,W.J.,Parker,V.P.,Lindberg,R.A.,Lu,H.S.,Colombero,A.M.,Elliott,R.L.,Guthrie,B.A.,Holst,P.L.,Skrine,J.D.,Toso,R.J.,Zhang,M.,Fernandez,E.,Trail,G.,Varnum,B.,Yarden,Y.,Hunter,T.,and Fox,G.M.(1994).B61是ECK受體蛋白-酪氨酸激酶的配基.Nature.368,558-560.Beck,KD.,Valverde,J.,Alexi,T.,Poulsen,K.,Moffat,B.,Vandlen,R.A.,Rosenthal,A.和Hefti,F.(1995).在成人大腦中來(lái)自軸突切開術(shù)誘導(dǎo)的變性的DGNF保護(hù)的中腦多巴胺能神經(jīng)元.Nature.373,339-341.Camu,W.和Henderson,C.(1992).通過(guò)淘選抗低親和性NFG受體的單克隆抗體純化大鼠胚胎運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元.J Neuroscience.44,59-70.Choi-Lundberg,D.L.和Bohn,M.C.(1995).大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)mRNA的個(gè)體發(fā)育和分布.Brain Res.Dev.Brain Res.85,80-88Davis,S.,Aldrich,T.H.,Valenzuela,D.M.,Wong,V.V.,Furth,M.E.,Squinto,S.P.和Yancopoulos,G.D.(1991).睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的受體.Science.253.59-63.
84Donis-Keller,H.,Dou,S.,Chi,D.,Carlson,K.,Toshima,K.,Lairmore,T.,Howe,J.,Moley,J.,Goodfellow,P.和Wells,S,(1993).ret原癌基因中的突變與MEN 2A和FMTC有關(guān).Hum.Molec.Genet.2,851-856.Ebendal,T.,Tomac,A,Hoffer,B.J.和Olson,L.,(1995).神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在培養(yǎng)的來(lái)自外周軸突切開的神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元中刺激纖維形成和存活.Journal Of Neuroscience Research.40,276-284.Economides,A.N.,Ravetch,J.V.,Yancopoulos,G.D.和Stahl,N.(1995).設(shè)計(jì)者細(xì)胞因子(Designer cytokines)導(dǎo)向選擇細(xì)胞的作用.Science 270,1351-1353.Edery,P.,Lyonnet,S.,Mulligan,L.,Pelet,A.,DoW,E.,Abel,L.,Holder,S.,Nihoul-Fekete,C.,Ponder,B.和Munnich,A,(1994).Hirschsprug病中ret原癌基因的突變.Nature.367,378-380.Gearing,D.P.,King,J.A.,Gough,N.M.和Nicola,N.A.(1989).人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集刺激基因子受體的表達(dá)克隆.EMBO Journal 8,3667-3676.Henderson,C.E.,Phillips,H.S.,Pollock,R.A.,Davies,A.M.,Lemeulle,C.,Armanini,M.,Simpson,L.C.,Moffet,B.,Vandlen,R.A.,Koliatsos,V.E.等(1994).GDNF存在于外周神經(jīng)和肌肉的有效存活因子，Science.266,1062-1064Hoffer,B.J.,Hoffman,A.,Bowenkamp,K.,Huettl,P.,Hudson,J.,Manrtin,D.,Lin,L.F.和Gerhardt,G.A.(1994).神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子體內(nèi)逆轉(zhuǎn)毒素誘導(dǎo)的中腦多巴胺能神經(jīng)元損傷.Neuroscience Letters.182,107-111.Hofstra,R.,Landsvater,R.,Ceecherini,I.,Stulp,R.,Stelwagen,T.,Luo,Y.,Pasini,B.,Hoppener,J.,van Amstel,H.,Romeo,G.,Lips,C.和Buys,C.(1994).ret原癌基因中的突變與2B型多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤形成和散發(fā)性髓樣甲狀腺癌有關(guān).Nature.367,375-376.Ikeda,I.,Ishizaka,Y.,Tahira,T.,Suzuki,T.,Onda,M.,Sugimura,T.和Nagao,M.(1990).人成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系中ret原癌基因的特異性表達(dá).Oncogene.5,1291-1296.Ip,N.Y.,Nye,S.H.,Boulton,T.G.,Davis,S.,Yasukawa,K.,Kishimoto,T.,Anderson,D.J.等(1992).CNTF和LIF通過(guò)共享的涉及IL-6信號(hào)傳導(dǎo)受體組分gp130的信號(hào)發(fā)生途徑作用于神經(jīng)元細(xì)胞.Cell.69,1121-1132.Iwamoto,T.,Taniguchi,M.,Asia,N.,Ohkusu,K.,Nakashima,I.和Takahashi,M.(1993).小鼠ret原癌基因的cDNA克隆及其與鈣粘連素超家族的序列相似性.Oncogene.8,1087-1091.Jing,S.Q.,Spencer,T.,Miller,K.,Hopkins,C.和Trowbridge,I.S.(1990).人運(yùn)鐵蛋白受體胞質(zhì)域在胞吞中的作用特定內(nèi)在化信號(hào)序列的定位.Journal Of Cell Biology.110,283-294.Kearns,C.M.和Gash,D.M.(1995).GDNF體內(nèi)保護(hù)黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元抵抗6-羥基多巴胺.Brain Research.672,104-111.Kozak,M.(1987).來(lái)自699種脊椎動(dòng)物信使RNA的5’-非轉(zhuǎn)譯區(qū)的分析.Nucleic Acids Research.15,8125-8148.Li,L.,Wu,W.,Lin,L.F.,Lei,M.,Oppenheim,R.W.和Houenou,L.J.(1995).用神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子營(yíng)救成年小鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元脫離損傷誘導(dǎo)的死亡.Proceedings Of The National Academy Of SciencesOf The United States Of America,92,9771-9775.Lin,L-F.H.,Doherty,D.H.,Lile,JD.,Bektesh,S.和Collins,F.(1993).GDNF中腦多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子.Science.260,1130-1132.Louis,J.C.,Magal,E.和Varon,S.(1992).去甲腎上腺素對(duì)培養(yǎng)的大鼠腦干兒茶酚胺能神經(jīng)元的受體介導(dǎo)的毒性.Journal Of PharmacologyAnd Experimental Therapeutics.262,1274-1283.Mount,HT.,Dean,D.O.,Alberch,J.,Dreyfus,C.F.和Black,I.B.(1995).神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子促進(jìn)Purkinje細(xì)胞的存活和形態(tài)分化.Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United StatesOf America.92,9092-9096.Mulligan,L.,Kwok,J.,Healey,C.,Elsdon,M.,Eng,C.,Gardner,E.,Love,D.,Mole,S.,Moore,J.,Papi,L.,Ponder,M.,Telenius,H,Tunnacliffe,A和Ponder,A.(1993).2A型多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤形成中ret原癌基因的種系突變.Nature.363,458-460.Oppenheim,R.W.,Houenou,L.J.,Johnson,J.E.,Lin,L.F.,Li.L.,Lo,A.C.,Newsome,A.L,Prevette,D.M.和Wang,S.(1995).用GDNF從程序性細(xì)胞死亡和軸突切開術(shù)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中營(yíng)救的發(fā)育中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元.Nature.373,344-346.Pachnis,V.,Mankoo,B.和Costantini,F.(1993).c-ret原癌基因在小鼠胚胎發(fā)生期間的表達(dá).Development,119,1005-1017.Pearson,W.R.和Lipman,D.J.(1988).用于生物學(xué)序列比較的改進(jìn)工具.Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United StatesOf America.85,2444-2448.Poulsen,K.T.,Armanini,M.P.,Klein,R.D.,Hynes,M.A.,Phillips,H.S.和Rosenthal,A.(1994).TGFβ2和TGFβ3是中腦多巴胺能神經(jīng)元的有效存活因子.Neuron.13,1245-1252.Romeo,G.,Patrizia,R,Luo,Y.,Barone,V.,Seri,M.,Ceccherini,I.,Pasini,B.,Bocciardi,R.,Lerone,M.,Kaariainen,H.和Maartucciello,G.(1994).Hirschsprung病中ret原癌基因的酪氨酸激酶域的點(diǎn)突變Nature.367,377-378.Santoro,M.,Carlomagno,F.,Romeo,A.,Bottaro,D.,Dathan,N.,Grieco,M.,Fusco,A.,Vecchio,G.,Matoskova,B.,Kraus,M.和Di Fiore,P.(1995).MEN2A和MEN2B的種系突變激活作為顯性轉(zhuǎn)化基因的ret.Science.267,38l-383.Sauer,H.,Rosenblad,C.和Bjoerklund,A.(1995).神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子而不是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β3防止黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元在紋狀體6-羥基多巴胺損害后的遲發(fā)性變性.Proceedings Of The NationalAcademy Of Sciences Of The United States Of America.92,8935-8939.Saxen,L.(1987).腎臟的器官發(fā)生.Development and Cell Biology Series,Cambridge University Press,Cambridge,England.Schaar,D.G.,Sieber,B.A.,Dreyfus,C.F.和Black,I.B.(1993).GDNF在大鼠腦中的區(qū)域特異性和細(xì)胞特異性表達(dá).Experimental Neurology.124,368-371.Schaar,D.G.,Sieber,B.A.,Sherwood,A.C.,Dean,D.,Mendoza,G.,Ramakrishnan,L.,Dreyfus,C.F.和Black,I.B.(1994).多個(gè)星形細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物在大鼠和人中編碼黑質(zhì)營(yíng)養(yǎng)因子.Experimental Neurology 130,387-393.Schlessinger,J.和Ullrich,A.(1992).通過(guò)受體酪氨酸激酶的生長(zhǎng)因子信號(hào)發(fā)生.Neuron 9,383-391.Schuchardt,A.,D’Agati,V.,Larsson-Blomberg,L.,Costantini,F.和Pachnis,V.(1994).缺乏酪氨酸激酶受體ret小鼠的腎臟和腸神經(jīng)系統(tǒng)的缺陷.Nature.367,380-383.Segarini,PR.,Ziman,J.M.,Kane,C.J.和Dasch,JR.(1992).轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)結(jié)合細(xì)胞表面蛋白的兩種新形式取決于TGF-β1的結(jié)合,并表明陽(yáng)性協(xié)同性.Journal Of Biological Chemistry.267,1048-1053.Springer,J.E.,Mu,X.,Bergmann,L.W.和Trojanowski,J.Q.(1994).GDNF mRNA在大鼠和人神經(jīng)組織中的表達(dá).Experimental Neurology.127,167-170.Stroemberg,I.,Bjoerklund,L.,Johansson,M.,Tomac,A.,Collins,F.,Olson,L.,Hoffer,B.和Humpel,C.(1993).神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在發(fā)育中的而非成年紋狀體中表達(dá)并在體內(nèi)刺激發(fā)育中的多巴胺神經(jīng)元.Experimental Neurology.124,401-412.Takahashi,M.,Ritz,J.和Cooper,G.(1985).DNA重排刺激新的類轉(zhuǎn)化基因ret.Cell.42,581-588.Takahashi,M.和Cooper,G.(1987).Ret轉(zhuǎn)化基因編碼與酪氨酸激酶同源的融合蛋白.Mol.Cell.Biol.,7,1378-1385.Takebe,Y.,Seiki,M.,Fujisawa,J.,Hoy,P.,Yokota,K.,Arai,K.,Yoshida,M.和Arai,N.(1988).SRa啟動(dòng)子由猿猴病毒40早期啟動(dòng)子和人1型T細(xì)胞白血病病毒長(zhǎng)末端重復(fù)的R-U5區(qū)段組成的有效的通用哺乳動(dòng)物cDNA表達(dá)系統(tǒng).Mol.Cell.Biol.8,466-472.Tomac,A.,Lindqvist,E.,Lin,L.F.,Ogren,S.O.,Young,D.,Hoffer,B.J.和Olson,L.(1995a).用GDNF在體內(nèi)保護(hù)和修復(fù)黑質(zhì)紋狀體多巴胺能系統(tǒng).Nature.373,335-339.Tomac,A.,Widenfalk,J.,Lin,L.F.,Kohno,T.,Ebendal,T.,Hoffer,B.J.和Olson,L.(1995b).神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在成年黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)中的逆行和運(yùn)輸提示在該成體中的營(yíng)養(yǎng)作用.Proceedings Of TheNational Academy Of Sciences Of The United States Of America.92,8274-8278.Trupp,M.,Ryden,M.,Joemvall,H.,Funakoshi,H.,Timmusk,T.,Arenas,E.和Ibanez,C.F.(1995).GDNF的外周表達(dá)和生物學(xué)活性,一種鳥類和哺乳動(dòng)物外周神經(jīng)元的營(yíng)養(yǎng)因子.Journal Of Cell Biology.130,137-148.Tsuzuki,T.,Takahashi,M.,Asai,N.,Iwashita,T.,Matsuyama,M.和Asai,J.(1995).ret原癌基因產(chǎn)生在胚胎、嬰兒和成體大鼠組織中的空間和瞬時(shí)表達(dá).Oncogene,l0,191-198.Ullrich,A和Schlessinger,J.(1990).具有酪氨酸激酶活性的受體進(jìn)行的信號(hào)傳導(dǎo).Cell,61,203-211.van der Geer,P.,Hunter,T.和Lindberg,R.A.(1994).受體酪氨酸激酶及其信號(hào)傳導(dǎo)途徑.10,251-337.van Heyningen,V.(1994).一個(gè)基因-四種綜合癥.Nature,367,319-320.von Heijne,G.(1986).預(yù)測(cè)信號(hào)序列酶切位點(diǎn)的新方法.Nucleic AcidsResearch.14,4683-4690.Yan,Q.,Matheson,C.和Lopez,O.T.(1995).GDNF對(duì)新生兒和成體面部運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的體內(nèi)圣經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用.Nature.373,341-344.Zum,A.D.,Baetge,E.E.,Hammang,J.P.,Tan,S.A.,和Aebischer,P.(1994).神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)，一種運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的新神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子.Neuroreport.6,113-118.
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請(qǐng)人Fox,Gary MJing,ShuqianWen,Duanzhi(ⅱ)發(fā)明名稱神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體(ⅲ)序列數(shù)34(ⅳ)通信地址(A)收信人AMEGE INC(B)街道1840 DeHavilland Drive(C)城市Thousand Oaks(D)州CA(E)國(guó)家美國(guó)(F)郵政編碼91320-1789(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0,版本1.30(ⅵ)當(dāng)前申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朥S未知(B)提交日期1997年4月14日(C)分類(ⅶ)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 60/017,221(B)提交日期1996年5月9日
(ⅶ)在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朥S 60/015,907(B)提交日期1996年4月22日(ⅷ)代理律師/代理人資料(A)姓名Curry,Daniel R.
(B)注冊(cè)號(hào)32,727(C)參考/檔案號(hào)A-401A(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度2568個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置540…1934(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:1AATCTGGCCT CGGAACACGC CATTCTCCGC GCCGCTTCCA ATAACCACTA ACATCCCTAA 60CGAGCATCCG AGCCGAGGGC TCTGCTCGGA AATCGTCCTG GCCCAACTCG GCCCTTCGAG 120CTCTCGAAGA TTACCGCATC TATTTTTTTT TTCTTTTTTT TCTTTTCCTA GCGCAGATAA 180AGTGAGCCCG GAAAGGGAAG GAGGGGGCGG GGACACCATT GCCCTGAAAG AATAAATAAG 240TAAATAAACA AACTGGCTCC TCGCCGCAGC TGGACGCGGT CGGTTGAGTC CAGGTTGGGT 300CGGACCTGAA CCCCTAAAAG CGGAACCGCC TCCCGCCCTC GCCATCCCGG AGCTGAGTCG 360CCGGCGGCGG TGGCTGCTGC CAGACCCGGA GTTTCCTCTT TCACTGGATG GAGCTGAACT 420TTGGGCGGCC AGAGCAGCAC AGCTGTCCGG GGATCGCTGC ACGCTGAGCT CCCTCGGCAA 480GACCCAGCGG CGGCTCGGGA TTTTTTTGGG GGGGCGGGGA CCAGCCCCGC GCCGGCACC 539ATG TTC CTG GCG ACC CTG TAC TTC GCG CTG CCG CTC TTG GAC TTG CTC 587Met Phe Leu Ala Thr Leu Tyr Phe Ala Leu Pro Leu Leu Asp Leu Leu1 5 10 15CTG TCG GCC GAA GTG AGC GGC GGA GAC CGC CTG GAT TGC 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1984Ser465GTTATCTGTT TCCTGTTCTC TTGTATAGCT GAAATTCCAG TTTAGGAGCT CAGTTGAGAA 2044ACAGTTCCAT TCAACTGGAA CATTTTTTTT TTTNCCTTTT AAGAAAGCTT CTTGTGATCC 2104TTNGGGGCTT CTGTGAAAAA CCTGATGCAG TGCTCCATCC AAACTCAGAA GGCTTTGGGA 2164TATGCTGTAT TTTAAAGGGA CAGTTTGTAA CTTGGGCTGT AAAGCAAACT GGGGCTGTGT 2224TTTCGATGAT GATGATNATC ATGATNATGA TNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 2284NNNNNNNNNN GATTTTAACA GTTTTACTTC TGGCCTTTCC TAGCTAGAGA AGGAGTTAAT 2344ATTTCTAAGG TAACTCCCAT ATCTCCTTTA ATGACATTGA TTTCTAATGA TATAAATTTC 2404AGCCTACATT GATGCCAAGC TTTTTTGCCA CAAAGAAGAT TCTTACCAAG AGTGGGCTTT 2464GTGGAAACAG CTGGTACTGA TGTTCACCTT TATATATGTA CTAGCATTTT CCACGCTGAT 2524GTTTATGTAC TGTAAACAGT TCTGCACTCT TGTACAAAAG AAAA2568(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度465個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:2:Met Phe Leu Ala Thr Leu Tyr Phe Ala Leu Pro Leu Leu Asp Leu Leu1 5 10 15Leu Ser Ala Glu Val Ser Gly Gly Asp Arg Leu Asp Cys Val Lys Ala20 25 30Ser Asp Gln Cys Leu Lys Glu Gln Ser Cys Ser Thr Lys Tyr 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NO:3的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度2138個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置302…1705(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:3AGCTCGCTCT CCCGGGGCAG TGGTGTGGAT GCACCGGAGT TCGGGCGCTG GGCAAGTTGG 60GTCGGAACTG AACCCCTGAA AGCGGGTCCG CCTCCCGCCC TCGCGCCCGC CCGGATCTGA 120GTCGCTGGCG GCGGTGGGCG GCAGAGCGAC GGGGAGTCTG CTCTCACCCT GGATGGAGCT 180GAACTTTGAG TGGCCAGAGG AGCGCAGTCG CCCGGGGATC GCTGCACGCT GAGCTCTCTC 240CCCGAGACCG GGCGGCGGCT TTGGATTTTG GGGGGGCGGG GACCAGCTGC GCGGCGGCAC 300C ATG TTC CTA GCC ACT CTG TAC TTC GCG CTG CCA CTC CTG GAT TTG 346Met Phe Leu Ala Thr Leu Tyr Phe Ala Leu Pro Leu Leu Asp Leu1 5 10 15CTG ATG TCC GCC GAG GTG AGT GGT GGA GAC CGT CTG GAC TGT GTG AAA 394Leu Met Ser Ala Glu Val Ser Gly Gly Asp Arg Leu Asp Cys Val Lys20 25 30GCC AGC GAT CAG TGC CTG AAG GAA CAG AGC TGC AGC ACC AAG TAC CGC 442Ala Ser Asp Gln Cys Leu Lys Glu Gln Ser Cys Ser Thr Lys Tyr Arg35 40 45ACA CTA AGG CAG TGC GTG GCG GGC AAG GAA ACC AAC TTC AGC CTG ACA 490Thr Leu Arg Gln Cys Val Ala Gly Lys Glu 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TCCCATATCT CCTTTAATGA CATTGATTTC 1336TAATGATATA AATTTCAGCC TACATTGATG CCAAGCTTTT TTGCCACAAA GAAGATTCTT 1396ACCAAGAGTG GGCTTTGTGG AAACAGCTGG TACTGATGTT CACCTTTATA TATGTACTAG 1456CATTTTCCAC GCTGATGTTT ATGTACTGTA AACAGTTCTG CACTCTTGTA CAAAAGAAAA 1516AACACCTGTC ACATCCAAAT ATAGTATCTG TCTTTTCGTC AAAATAGAGA GTGGGGAATG 1576AGTGTGCCGA TTCAATACCT CAATCCCTGA ACGACACTCT CCTAATCCTA AGCCTTACCT 1636GAGTGAGAAG CCCTTTACCT AACAAAAGTC CAATATAGCT GAAATGTCGC TCTAATACTC 1696TTTACACATA TGAGGTTATA TGTAGAAAAA AATTTTACTA CTAAATGATT TCAACTATTG 1756GCTTTCTATA TTTTGAAAGT AATGATATTG TCTCATTTTT TTACTGATGG TTTAATACAA 1816AATACACAGA GCTTGTTTCC CCTCATAAGT AGTGTTCGCT CTGATATGAA CTTCACAAAT 1876ACAGCTCATC AAAAGCAGAC TCTGAGAAGC CTCGTGCTGT AGCAGAAAGT TCTGCATCAT 1936GTGACTGTGG ACAGGCAGGA GGAAACAGAA CAGACAAGCA TTGTCTTTTG TCATTGCTCG 1996AAGTGCAAGC GTGCATACCT GTGGAGGGAA CTGGTGGCTG CTTGTAAATG TTCTGCAGCA 2056TCTCTTGACA CACTTGTCAT GACACAATCC AGTACCTTGG TTTTCAGGTT ATCTGACAAA 2116GGCAGCTTTG ATTGGGACAT GGAGGCATGG GCAGGCCGGA A2157(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度295個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)
(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:16:Ser Ala Tyr Ile Thr Pro Cys Thr Thr Ser Val Ser Asn Asp Val Cys1 5 10 15Asn Arg Arg Lys Cys His Lys Ala Leu Arg Gln Phe Phe Asp Lys Val20 25 30Pro Ala Lys His Ser Tyr Gly Met Leu Phe Cys Ser Cys Arg Asp Ile35 40 45Ala Cys Thr Glu Arg Arg Arg Gln Thr Ile Val Pro Val Cys Ser Tyr50 55 60Glu Glu Arg Glu Lys Pro Asn Cys Leu Asn Leu Gln Asp Ser Cys Lys65 70 75 80Thr Asn Tyr Ile Cys Arg Ser Arg Leu Ala Asp Phe Phe Thr Asn Cys85 90 95Gln Pro Glu Ser Arg Ser Val Ser Ser Cys Leu Lys Glu Asn Tyr Ala100 105 110Asp Cys Leu Leu Ala Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Thr Val Met Thr Pro115 120 125Asn Tyr Ile Asp Ser Ser Ser Leu Ser Val Ala Pro Trp Cys Asp Cys130 135 140Ser Asn Ser Gly Asn Asp Leu Glu Glu Cys Leu Lys Phe Leu Asn Phe145 150 155 160Phe Lys Asp Asn Thr Cys Leu Lys Asn Ala Ile Gln Ala Phe Gly Asn165 170 175Gly Ser Asp Val Thr Val Trp Gln Pro Ala Phe Pro Val Gln Thr Thr180 185 190Thr Ala Ala Thr Thr Thr Ala Leu Arg Val Lys Asn Lys Pro Leu Gly195 200 205Pro Ala Gly Ser Glu Asn Glu Ile Pro Thr His Val Leu Pro Pro Cys210 215 220Ala Asn Leu Gln Ala Gln Lys Leu Lys Ser Asn Val Ser Gly Asn Thr225 230 235 240His Leu Cys Ile Ser Asn Gly Asn Tyr Glu Lys Glu Gly Leu Gly Ala245 250 255Ser Ser His Ile Thr Thr Lys Ser Met Ala Ala Pro Pro Ser Cys Gly260 265 270Leu Ser Pro Leu Leu Val Leu Val Val Thr Ala Leu Ser Thr Leu Leu275 280 285Ser Leu Thr Glu Thr Ser *290 295(2)SEQ ID NO17的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度659個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置2…658(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置1…659(C)其它信息/注釋=“1-659為圖5 Hsgr-21ar的1033-1691”(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:17:G AAT TTG CAG GAC TCC TGC AAG ACG AAT TAC ATC TGC AGA TCT CGC46Asn Leu Gln Asp Ser Cys Lys Thr Asn Tyr Ile Cys Arg Ser Arg1 5 10 15CTT GCG GAT TTT TTT ACC AAC TGC CAG CCA GAG TCA AGG TCT GTC AGC 94Leu Ala Asp Phe Phe Thr Asn Cys Gln Pro Glu Ser Arg Ser Val Ser20 25 30AGC TGT CTA AAG GAA AAC TAC GCT GAC TGC CTC CTC GCC TAC TCG GGG 142Ser Cys Leu Lys Glu Asn Tyr Ala Asp Cys Leu Leu Ala Tyr Ser Gly35 40 45CTT ATT GGC ACA GTC ATG ACC CCC AAC TAC ATA GAC TCC AGT AGC CTC 190Leu Ile Gly Thr Val Met Thr Pro Asn Tyr Ile Asp Ser Ser Ser Leu50 55 60AGT GTG GCC CCA TGG TGT GAC TGC AGC AAC AGT GGG AAC GAC CTA GAA 238Ser Val Ala Pro Trp Cys Asp Cys Ser Asn Ser Gly Asn Asp Leu Glu65 70 75GAG TGC TTG AAA TTT TTG AAT TTC TTC AAG GAC AAT ACA TGT CTT AAA 286Glu Cys Leu Lys Phe Leu Asn Phe Phe Lys Asp Asn Thr Cys Leu Lys80 85 90 95AAT GCA ATT CAA GCC TTT GGC AAT GGC TCC GAT GTG ACC GTG TGG CAG 334Asn Ala Ile Gln Ala Phe Gly Asn Gly Ser Asp Val Thr Val Trp Gln100 105 110CCA GCC TTC CCA GTA CAG ACC ACC ACT GCC ACT ACC ACC ACT GCC CTC 382Pro Ala Phe Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ala Leu115 120 125CGG GTT AAG AAC AAG CCC CTG GGG CCA GCA GGG TCT GAG AAT GAA ATT 430Arg Val Lys Asn Lys Pro Leu Gly Pro Ala Gly Ser Glu Asn Glu Ile130 135 140CCC ACT CAT GTT TTG CCA CCG TGT GCA AAT TTA CAG GCA CAG AAG CTG 478Pro Thr His Val Leu Pro Pro Cys Ala Asn Leu Gln Ala Gln Lys Leu145 150 155AAA TCC AAT GTG TCG GGC AAT ACA CAC CTC TGT ATT TCC AAT GGT AAT 526Lys Ser Asn Val Ser Gly Asn Thr His Leu Cys Ile Ser Asn Gly Asn160 165 170 175TAT GAA AAA GAA GGT CTC GGT GCT TCC AGC CAC ATA ACC ACA AAA TCA 574Tyr Glu Lys Glu Gly Leu Gly Ala Ser Ser His Ile Thr Thr Lys Ser180 185 190ATG GCT GCT CCT CCA AGC TGT GGT CTG AGC CCA CTG CTG GTC CTG GTG 622Met Ala Ala Pro Pro Ser Cys Gly Leu Ser Pro Leu Leu Val Leu Val195 200 205GTA ACC GCT CTG TCC ACC CTA TTA TCT TTA ACA GAA A 659Val Thr Ala Leu Ser Thr Leu Leu Ser Leu Thr Glu210215(2)SEQ ID NO:18的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度219個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)
(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:18:Asn Leu Gln Asp Ser Cys Lys Thr Asn Tyr Ile Cys Arg Ser Arg Leu1 5 10 15Ala Asp Phe Phe Thr Asn Cys Gln Pro Glu Ser Arg Ser Val Ser Ser20 25 30Cys Leu Lys Glu Asn Tyr Ala Asp Cys Leu Leu Ala Tyr Ser Gly Leu35 40 45Ile Gly Thr Val Met Thr Pro Asn Tyr Ile Asp Ser Ser Ser Leu Ser50 55 60Val Ala Pro Trp Cys Asp Cys Ser Asn Ser Gly Asn Asp Leu Glu Glu65 70 75 80Cys Leu Lys Phe Leu Asn Phe Phe Lys Asp Asn Thr Cys Leu Lys Asn85 90 95Ala Ile Gln Ala Phe Gly Asn Gly Ser Asp Val Thr Val Trp Gln Pro100 105 110Ala Phe Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ala Leu Arg115 120 125Val Lys Asn Lys Pro Leu Gly Pro Ala Gly Ser Glu Asn Glu Ile Pro130 135 140Thr His Val Leu Pro Pro Cys Ala Asn Leu Gln Ala Gln Lys Leu Lys145 150 155 160Ser Asn Val Ser Gly Asn Thr His Leu Cys Ile Ser Asn Gly Asn Tyr165 170 175Glu Lys Glu Gly Leu Gly Ala Ser Ser His Ile Thr Thr Lys Ser Met180 185 190Ala Ala Pro Pro Ser Cys Gly Leu Ser Pro Leu Leu Val Leu Val Val195 200 205Thr Ala Leu Ser Thr Leu Leu Ser Leu Thr Glu210 215(2)SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度630個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置3…629(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置1…630(C)其它信息/注釋=“1-630為圖5 Hsgr-21br的1062-1691”(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:19:AC ATC TGC AGA TCT CGC CTT GCG GAT TTT TTT ACC AAC TGC CAG CCA 47Ile Cys Arg Ser Arg Leu Ala Asp Phe Phe Thr Asn Cys Gln Pro1 5 10 15GAG TCA AGG TCT GTC AGC AGC TGT CTA AAG GAA AAC TAC GCT GAC TGC 95Glu Ser Arg Ser Val Ser Ser Cys Leu Lys Glu Asn Tyr Ala Asp Cys20 25 30CTC CTC GCC TAC TCG GGG CTT ATT GGC ACA GTC ATG ACC CCC AAC TAC 143Leu Leu Ala Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Thr Val Met Thr Pro Asn Tyr35 40 45ATA GAC TCC AGT AGC CTC AGT GTG GCC CCA TGG TGT GAC TGC AGC AAC 191Ile Asp Ser Ser Ser Leu Ser Val Ala Pro Trp Cys Asp Cys Ser Asn50 55 60AGT GGG AAC GAC CTA GAA GAG TGC TTG AAA TTT TTG AAT TTC TTC AAG 239Ser Gly Asn Asp Leu Glu Glu Cys Leu Lys Phe Leu Asn Phe Phe Lys65 70 75GAC AAT ACA TGT CTT AAA AAT GCA ATT CAA GCC TTT GGC AAT GGC TCC 287Asp Asn Thr Cys Leu Lys Asn Ala Ile Gln Ala Phe Gly Asn Gly Ser80 85 90 95GAT GTG ACC GTG TGG CAG CCA GCC TTC CCA GTA CAG ACC ACC ACT GCC 335Asp Val Thr Val Trp Gln Pro Ala Phe Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala100 105 110ACT ACC ACC ACT GCC CTC CGG GTT AAG AAC AAG CCC CTG GGG CCA GCA 383Thr Thr Thr Thr Ala Leu Arg Val Lys Asn Lys Pro Leu Gly Pro Ala115 120 125GGG TCT GAG AAT GAA ATT CCC ACT CAT GTT TTG CCA CCG TGT GCA AAT 431Gly Ser Glu Asn Glu Ile Pro Thr His Val Leu Pro Pro Cys Ala Asn130 135 140TTA CAG GCA CAG AAG CTG AAA TCC AAT GTG TCG GGC AAT ACA CAC CTC 479Leu Gln Ala Gln Lys Leu Lys Ser Asn Val Ser Gly Asn Thr His Leu145 150 155TGT ATT TCC AAT GGT AAT TAT GAA AAA GAA GGT CTC GGT GCT TCC AGC 527Cys Ile Ser Asn Gly Asn Tyr Glu Lys Glu Gly Leu Gly Ala Ser Ser160 165 170 175CAC ATA ACC ACA AAA TCA ATG GCT GCT CCT CCA AGC TGT GGT CTG AGC 575His Ile Thr Thr Lys Ser Met Ala Ala Pro Pro Ser Cys Gly Leu Ser180 185 190CCA CTG CTG GTC CTG GTG GTA ACC GCT CTG TCC ACC CTA TTA TCT TTA 623Pro Leu Leu Val Leu Val Val Thr Ala Leu Ser Thr Leu Leu Ser Leu195 200 205ACA GAA A 630Thr Glu(2)SEQ ID NO:20的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度209個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:20:Ile Cys Arg Ser Arg Leu Ala Asp Phe Phe Thr Asn Cys Gln Pro Glu1 5 10 15Ser Arg Ser Val Ser Ser Cys Leu Lys Glu Asn Tyr Ala Asp Cys Leu20 25 30Leu Ala Tyr Ser Gly Leu Ile Gly Thr Val Met Thr Pro Asn Tyr Ile35 40 45Asp Ser Ser Ser Leu Ser Val Ala Pro Trp Cys Asp Cys Ser Asn Ser50 55 60Gly Asn Asp Leu Glu Glu Cys Leu Lys Phe Leu Asn Phe Phe Lys Asp65 70 75 80Asn Thr Cys Leu Lys Asn Ala Ile Gln Ala Phe Gly Asn Gly Ser Asp85 90 95Val Thr Val Trp Gln Pro Ala Phe Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala Thr100 105 110Thr Thr Thr Ala Leu Arg Val Lys Asn Lys Pro Leu Gly Pro Ala Gly115 120 125Ser Glu Asn Glu Ile Pro Thr His Val Leu Pro Pro Cys Ala Asn Leu130 135 140Gln Ala Gln Lys Leu Lys Ser Asn Val Ser Gly Asn Thr His Leu Cys145 150 155 160Ile Ser Asn Gly Asn Tyr Glu Lys Glu Gly Leu Gly Ala Ser Ser His165 170 175Ile Thr Thr Lys Ser Met Ala Ala Pro Pro Ser Cys Gly Leu Ser Pro180 185 190Leu Leu Val Leu Val Val Thr Ala Leu Ser Thr Leu Leu Ser Leu Thr195 200 205Glu(2)SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度1075個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置2…445
(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置1…1075(C)其它信息/注釋=“1-1075為圖5 Hsgr-2的1255-2330”(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:21:T GGG AAC GAC CTA GAA GAG TGC TTG AAA TTT TTG AAT TTC TTC AAG 46Gly Asn Asp Leu Glu Glu Cys Leu Lys Phe Leu Asn Phe Phe Lys15 10 15GAC AAT ACA TGT CTT AAA AAT GCA ATT CAA GCC TTT GGC AAT GGC TCC94Asp Asn Thr Cys Leu Lys Asn Ala Ile Gln Ala Phe Gly Asn Gly Ser20 25 30GAT GTG ACC GTG TGG CAG CCA GCC TTC CCA GTA CAG ACC ACC ACT GCC142Asp Val Thr Val Trp Gln Pro Ala Phe Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala35 40 45ACT ACC ACC ACT GCC CTC CGG GTT AAG AAC AAG CCC CTG GGG CCA GCA190Thr Thr Thr Thr Ala Leu Arg Val Lys Asn Lys Pro Leu Gly Pro Ala50 55 60GGG TCT GAG AAT GAA ATT CCC ACT CAT GTT TTG CCA CCG TGT GCA AAT238Gly Ser Glu Asn Glu Ile Pro Thr His Val Leu Pro Pro Cys Ala Asn65 70 75TTA CAG GCA CAG AAG CTG AAA TCC AAT GTG TCG GGC AAT ACA CAC CTC286Leu Gln Ala Gln Lys Leu Lys Ser Asn Val Ser Gly Asn Thr His Leu80 85 90 95TGT ATT TCC AAT GGT AAT TAT GAA AAA GAA GGT CTC GGT GCT TCC AGC334Cys Ile Ser Asn Gly Asn Tyr Glu Lys Glu Gly Leu Gly Ala Ser Ser100 105 110CAC ATA ACC ACA AAA TCA ATG GCT GCT CCT CCA AGC TGT GGT CTG AGC382His Ile Thr Thr Lys Ser Met Ala Ala Pro Pro Ser Cys Gly Leu Ser115 120 125CCA CTG CTG GTC CTG GTG GTA ACC GCT CTG TCC ACC CTA TTA TCT TTA430Pro Leu Leu Val Leu Val Val Thr Ala Leu Ser Thr Leu Leu Ser Leu130 135 140ACA GAA ACA TCA TAG CTGCATTAAA AAAATACAAT ATGGACATGT AAAAAGACAA485Thr Glu Thr Ser *145AAACCAAGTT ATCTGTTTCC TGTTCTCTTG TATAGCTGAA ATTCCAGTTT AGGAGCTCAG 545TTGAGAAACA GTTCCATTCA ACTGGAACAT TTTTTTTTTT CCTTTTAAGA AAGCTTCTTG 605TGATCCTTCG GGGCTTCTGT GAAAAACCTG ATGCAGTGCT CCATCCAAAC TCAGAAGGCT 665TTGGGATATG CTGTATTTTA AAGGGACAGT TTGTAACTTG GGCTGTAAAG CAAACTGGGG 725CTGTGTTTTC GATGATGATG ATCATCATGA TCATGATNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN 785NNNNNNNNNN NNNNNNGATT TTAACAGTTT TACTTCTGGC CTTTCCTAGC TAGAGAAGGA 845GTTAATATTT CTAAGGTAAC TCCCATATCT CCTTTAATGA CATTGATTTC TAATGATATA 905AATTTCAGCC TACATTGATG CCAAGCTTTT TTGCCACAAA GAAGATTCTT ACCAAGAGTG 965GGCTTTGTGG AAACAGCTGG TACTGATGTT CACCTTTATA TATGTACTAG CATTTTCCAC 1025GCTGATGTTT ATGTACTGTA AACAGTTCTG CACTCTTGTA CAAAAGAAAA 1075(2)SEQ ID NO:22的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度148個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性
(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:22:Gly Asn Asp Leu Glu Glu Cys Leu Lys Phe Leu Asn Phe Phe Lys Asp1 5 10 15Asn Thr Cys Leu Lys Asn Ala Ile Gln Ala Phe Gly Asn Gly Ser Asp20 25 30Val Thr Val Trp Gln Pro Ala Phe Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala Thr35 40 45Thr Thr Thr Ala Leu Arg Val Lys Asn Lys Pro Leu Gly Pro Ala Gly50 55 60Ser Glu Asn Glu Ile Pro Thr His Val Leu Pro Pro Cys Ala Asn Leu65 70 75 80Gln Ala Gln Lys Leu Lys Ser Asn Val Ser Gly Asn Thr His Leu Cys85 90 95Ile Ser Asn Gly Asn Tyr Glu Lys Glu Gly Leu Gly Ala Ser Ser His100 105 110Ile Thr Thr Lys Ser Met Ala Ala Pro Pro Ser Cys Gly Leu Ser Pro115 120 125Leu Leu Val Leu Val Val Thr Ala Leu Ser Thr Leu Leu Ser Leu Thr130 135 140Glu Thr Ser *145(2)SEQ ID NO:23的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度1059個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置3…428
(?、?特征0(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_feature(B)位置1…1059(C)其它信息/注釋=“1-1059為圖5 Hsgr-9的1059-1272”(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:23:AG TGC TTG AAA TTT TTG AAT TTC TTC AAG GAC AAT ACA TGT CTT AAA 47Cys Leu Lys Phe Leu Asn Phe Phe Lys Asp Asn Thr Cys Leu Lys1 5 10 15AAT GCA ATT CAA GCC TTT GGC AAT GGC TCC GAT GTG ACC GTG TGG CAG95Asn Ala Ile Gln Ala Phe Gly Asn Gly Ser Asp Val Thr Val Trp Gln20 25 30CCA GCC TTC CCA GTA CAG ACC ACC ACT GCC ACT ACC ACC ACT GCC CTC 143Pro Ala Phe Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ala Leu35 40 45CGG GTT AAG AAC AAG CCC CTG GGG CCA GCA GGG TCT GAG AAT GAA ATT 191Arg Val Lys Asn Lys Pro Leu Gly Pro Ala Gly Ser Glu Asn Glu Ile50 55 60CCC ACT CAT GTT TTG CCA CCG TGT GCA AAT TTA CAG GCA CAG AAG CTG 239Pro Thr His Val Leu Pro Pro Cys Ala Asn Leu Gln Ala Gln Lys Leu65 70 75AAA TCC AAT GTG TCG GGC AAT ACA CAC CTC TGT ATT TCC AAT GGT AAT 287Lys Ser Asn Val Ser Gly Asn Thr His Leu Cys Ile Ser Asn Gly Asn80 85 90 95TAT GAA AAA GAA GGT CTC GGT GCT TCC AGC CAC ATA ACC ACA AAA TCA 335Tyr Glu Lys Glu Gly Leu Gly Ala Ser Ser His Ile Thr Thr Lys Ser100 105 110ATG GCT GCT CCT CCA AGC TGT GGT CTG AGC CCA CTG CTG GTC CTG GTG 383Met Ala Ala Pro Pro Ser Cys Gly Leu Ser Pro Leu Leu Val Leu Val115 120 125GTA ACC GCT CTG TCC ACC CTA TTA TCT TTA ACA GAA ACA TCA TAG 428Val Thr Ala Leu Ser Thr Leu Leu Ser Leu Thr Glu Thr Ser *130 135 140CTGCATTAAA AAAATACAAT ATGGACATGT AAAAAGACAA AAACCAAGTT ATCTGTTTCC 488TGTTCTCTTG TATAGCTGAA ATTCCAGTTT AGGAGCTCAG TTGAGAAACA GTTCCATTCA 548ACTGGAACAT TTTTTTTTTT TCCTTTTAAG AAAGCTTCTT GTGATCCTTT GGGGCTTCTG 608TGAAAAACCT GATGCAGTGC TCCATCCAAA CTCAGAAGGC TTTGGGATAT GCTGTATTTT 668AAAGGGACAG TTTGTAACTT GGGCTGTAAA GCAAACTGGG GCTGTGTTTT CGATGATGAT 728GATGATCATG ATGATGATCA TCATGATCAT GATGATGATC ATCATGATCA TGATGATGAT 788TTTAACAGTT TTACTTCTGG CCTTTCCTAG CTAGAGAAGG AGTTAATATT TCTAAGGTAA 848CTCCCATATC TCCTTTAATG ACATTGATTT CTAATGATAT AAATTTCAGC CTACATTGAT 908GCCAAGCTTT TTTGCCACAA AGAAGATTCT TACCAAGAGT GGGCTTTGTG GAAACAGCTG 968GTACTGATGT TCACCTTTAT ATATGTACTA GCATTTTCCA CGCTGATGTT TATGTACTGT 1028AAACAGTTCT GCACTCTTGT ACAAAAGAAA A 1059(2)SEQ ID NO:24的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度142個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:24:Cys Leu Lys Phe Leu Asn Phe Phe Lys Asp Asn Thr Cys Leu Lys Asn1 5 10 15Ala Ile Gln Ala Phe Gly Asn Gly Ser Asp Val Thr Val Trp Gln Pro20 25 30Ala Phe Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr Thr Ala Leu Arg35 40 45Val Lys Asn Lys Pro Leu Gly Pro Ala Gly Ser Glu Asn Glu Ile Pro50 55 60Thr His Val Leu Pro Pro Cys Ala Asn Leu Gln Ala Gln Lys Leu Lys65 70 75 80Ser Asn Val Ser Gly Asn Thr His Leu Cys Ile Ser Asn Gly Asn Tyr85 90 95Glu Lys Glu Gly Leu Gly Ala Ser Ser His Ile Thr Thr Lys Ser Met100 105 110Ala Ala Pro Pro Ser Cys Gly Leu Ser Pro Leu Leu Val Leu Val Val115 120 125Thr Ala Leu Ser Thr Leu Leu Ser Leu Thr Glu Thr Ser*130 135 140(2)SEQ ID NO:25的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:25:
Gln Ser Cys Ser Thr Lys Tyr Arg Thr Leu1 5 10(2)SEQ ID NO:26的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:26:
Cys Lys Arg Gly Met Lys Lys Glu Lys Asn1 5 10(2)SEQ ID NO:27的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:27Leu Leu Glu Asp Ser Pro Tyr Glu Pro Val1 5 10(2)SEQ ID NO:28的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度10個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:28:
Cys Ser Tyr Glu Glu Arg Glu Arg Pro Asn1 5 10(2)SEQ ID NO:29的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度14個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:29:Pro Ala Pro Pro Val Gln Thr Thr Thr Ala Thr Thr Thr Thr1 5 10(2)SEQ ID NO:30的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:30:CTGTTTGAAT TTGCAGGACT C 2(2)SEQ ID NO:31的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度36個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:31:CTCCTCTCTA AGCTTCTAAC CACAGCTTGG AGGAGC 36(2)SEQ ID NO:32的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度37個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性
(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:32:CTCCTCTCTA AGCTTCTATG GGCTCAGACC ACAGCTT 37(2)SEQ ID NO:33的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度60個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:33:CTCCTCTCTA AGCTTCTACT TGTCATCGTC GTCCTTGTAG TCACCACAGC TTGGAGGAGC 60(2)SEQ ID NO:34的信息(ⅰ)順序特征(A)長(zhǎng)度60個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)順序描述SEQ ID NO:34:CTCCTCTCTA AGCTTCTACT TGTCATCGTC GTCCTTGTAG TCTGGCTCAG ACCACAGCTT 60
權(quán)利要求
1．分離和純化的蛋白，它包含如圖2或4(SEQ ID NO:2或4)描述的氨基酸序列及其類似物，其中該蛋白能夠與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)復(fù)合并由此介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)GDNF的應(yīng)答。
2．權(quán)利要求1的蛋白，它包含描述于圖2(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。
3．權(quán)利要求1的蛋白，它包含描述于圖4(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。
4．權(quán)利要求1的蛋白，它包含描述于圖2(SEQ ID NO:2)的Ser18至Pro446的氨基酸序列。
5．權(quán)利要求1的蛋白，它包含描述于圖2(SEQ ID NO:2)的Asp25至Leu447的氨基酸序列。
6．權(quán)利要求1的蛋白，它包含描述于圖2(SEQ ID NO:2)的Cys29至Cys442的氨基酸序列。
7．權(quán)利要求1的蛋白，它包含描述于圖4(SEQ ID NO:4)的Ala19至Val450的氨基酸序列。
8．權(quán)利要求1的蛋白，它包含描述于圖4(SEQ ID NO:4)的Cys29至Cys443的氨基酸序列。
9．糖基化的權(quán)利要求1的蛋白。
10．非糖基化的權(quán)利要求1的蛋白。
11．權(quán)利要求1-10的蛋白，它通過(guò)重組技術(shù)或化學(xué)合成產(chǎn)生。
12．包含權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的蛋白與藥學(xué)上可接受載體聯(lián)合的藥用組合物。
13．分離的核酸序列，它編碼包含權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的氨基酸序列的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體。
14．分離的核酸序列，它編碼包含如圖2或4(SEQ ID NO:2或4)描述的氨基酸序列的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白及其類似物，其中該蛋白能夠與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)復(fù)合，并由此介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)GDNF的應(yīng)答。
15．權(quán)利要求14的核酸序列，它編碼包含如圖2(SEQ ID NO:2)描述的氨基酸序列的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白。
16．權(quán)利要求14的核酸序列，它編碼包含如圖4(SEQ ID NO:4)描述的氨基酸序列的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白。
17．包含以下的分離核酸序列(a)陳述于圖1(SEQ ID NO:1)包含編碼Met1至Ser465的核苷酸或陳述于圖3(SEQ ID NO:3)包含編碼Met1至Ser468的核苷酸的序列，其中所述序列編碼能與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)復(fù)合并因此介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)GDNF應(yīng)答的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白(GDNFR)；(b)核酸序列，它(1)與(a)的互補(bǔ)序列雜交和(2)編碼具有GDNFR活性的氨基酸序列；和(c)核酸序列，它如果不是因?yàn)檫z傳密碼的簡(jiǎn)并性將會(huì)與(a)的互補(bǔ)序列雜交和(2)編碼具有GDNFR活性的氨基酸序列。
18．包含按照權(quán)利要求14-17的任何一項(xiàng)的核酸序列的載體，該核酸序列可操作地連接至一個(gè)或多個(gè)能夠?qū)崿F(xiàn)所述核酸序列擴(kuò)增或表達(dá)的操作元件。
19．包含編碼包含圖2或4(SEQ ID NO:2或4)中描述的氨基酸序列的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白的核酸序列的載體，該核酸序列可操作地連接至一個(gè)或多個(gè)能夠?qū)崿F(xiàn)所述核酸序列擴(kuò)增或表達(dá)的操作元件。
20．用權(quán)利要求18的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
21．用權(quán)利要求19的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
22．權(quán)利要求20的宿主細(xì)胞，選自哺乳動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞。
23．權(quán)利要求22的宿主細(xì)胞，它是COS-7細(xì)胞或大腸桿菌。
24．權(quán)利要求20的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞適于人類植入，而且其中所述細(xì)胞表達(dá)和分泌所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體。
25．權(quán)利要求21的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞適于人類植入并且其中所述細(xì)胞表達(dá)和分泌所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體。
26．權(quán)利要求20的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞在活體外轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染。
27．權(quán)利要求20的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞封閉于適于人類植入的半透膜中。
28．包含如下步驟的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白的生產(chǎn)方法(a)在適于由所述宿主細(xì)胞表達(dá)所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞含有編碼包含描述于圖2或4(SEQ IDNO:2或4)的氨基酸序列的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白及其類似物的核酸序列，其中該蛋白能夠與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)復(fù)合并因此介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)GDNF的應(yīng)答；和(b)可選地，分離由所述宿主細(xì)胞表達(dá)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白。
29．權(quán)利要求28的方法，其中所述核酸序列編碼包含描述于圖2(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白。
30．權(quán)利要求28的方法，其中所述核酸序列編碼包含描述于圖4(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白。
31．包含以下步驟的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白的生產(chǎn)方法(a)培養(yǎng)用按照權(quán)利要求17的核酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，其培養(yǎng)條件適于由所述宿主細(xì)胞表達(dá)所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白；和(b)可選地，分離由所述宿主細(xì)胞表達(dá)的所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白。
32．權(quán)利要求28或31的方法，另外包含重折疊的該分離的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體。
33．權(quán)利要求28或31的方法，其中所述宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。
34．權(quán)利要求28或31的方法，其中所述宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。
35．按照權(quán)利要求28-31的任一項(xiàng)的方法制備的基本純化的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白。
36．權(quán)利要求1的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白用于制造藥用組合物的用途。
37．通過(guò)給與權(quán)利要求1的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白治療功能不正常的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的方法。
38．通過(guò)給與權(quán)利要求1的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白治療帕金森病的方法。
39．通過(guò)給與權(quán)利要求1的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白治療早老性癡呆的方法。
40．通過(guò)給與權(quán)利要求1的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白治療肌萎縮性側(cè)索硬化的方法。
41．與包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白結(jié)合的抗體。
42．權(quán)利要求41的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
43．權(quán)利要求41的抗體，其中所述抗體是多克隆抗體。
44．通過(guò)用包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白免疫動(dòng)物產(chǎn)生的抗體。
45．雜交瘤，它產(chǎn)生與包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白結(jié)合得單克隆抗體。
46．治療神經(jīng)損害的裝置，它包含(a)適于植入的半透膜；和(b)包囊于所述膜中的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞分泌按照權(quán)利要求1的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白；所述膜可透過(guò)該神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白、并不可透過(guò)對(duì)所述細(xì)胞有害的材料。
47．權(quán)利要求46的裝置，其中所述細(xì)胞是分泌所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白的天然發(fā)生的細(xì)胞。
48．權(quán)利要求46的裝置，其中所述細(xì)胞已通過(guò)核酸修飾以分泌所述神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白，該核酸序列包含(a)陳述于圖1(SEQ ID NO:1)包含編碼Met1至Ser465的核苷酸或陳述于圖3(SEQ ID NO:3)包含編碼Met1至Ser468的核苷酸的序列，該序列編碼能與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)復(fù)合并介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)GDNF應(yīng)答的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體蛋白(GDNFR)；(b)核酸序列，它(1)與(a)的互補(bǔ)序列雜交和(2)編碼具有GDNFR活性的氨基酸序列；和(c)核酸序列，它如果不是因?yàn)檫z傳密碼的簡(jiǎn)并性將會(huì)與(a)的互補(bǔ)序列雜交和(2)編碼具有GDNFR活性的氨基酸序列。
49．檢測(cè)裝置，用于分析測(cè)試樣品中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的存在，包含含有或由GDNFR蛋白包被的固相，其中所述GDNFR蛋白與該測(cè)試樣品種的GDNF反應(yīng)，并產(chǎn)生可檢測(cè)的表明GDNF存在的反應(yīng)產(chǎn)物。
50．分析測(cè)試樣品中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的方法，包括將該樣品與包含GDNFR蛋白的檢測(cè)試劑接觸，其中所述GDNFR蛋白與該測(cè)試樣品中的GDNF反應(yīng)，并產(chǎn)生可檢測(cè)的表明GDNF存在的反應(yīng)產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF),一種表現(xiàn)出對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)的各種類型的細(xì)胞具有廣譜生物學(xué)活性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素。本發(fā)明涉及克隆和表征GDNF的高親和性受體。該分子被命名為GDNF受體(GDNFR),因?yàn)樗鞘荏w系統(tǒng)的第一個(gè)已知組分。描述了GDNFR蛋白產(chǎn)物的核酸和氨基酸序列。在氨基末端發(fā)現(xiàn)具有信號(hào)肽特征的疏水性域,而羧基末端的第二個(gè)疏水性域譫語(yǔ)該受體與細(xì)胞膜的連接。缺少跨膜域和胞質(zhì)區(qū)表明GDNFR需要一個(gè)或多個(gè)輔助分子以介導(dǎo)跨膜信號(hào)發(fā)生。GDNFRmRNA廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)和非神經(jīng)組織中,與發(fā)現(xiàn)的GDNF的類似分布一致。
文檔編號(hào)A61K31/00GK1219967SQ97194013
公開日1999年6月16日 申請(qǐng)日期1997年4月15日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月22日
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