專利名稱：聚乙二醇－干擾素結(jié)合物的制作方法
本申請是申請?zhí)枮?3116479.6、申請日為1993年8月25日、發(fā)明名稱為“聚乙二醇-干擾素結(jié)合物”的發(fā)明專利申請的分案申請。
許多天然的和重組的蛋白質(zhì)都具有醫(yī)療和醫(yī)藥效用。一旦被純化并制成制劑，它們能夠?qū)Ω鞣N臨床適應(yīng)征進行非腸道使用。然而，非腸道使用的蛋白質(zhì)可能具有免疫原性，可能相對來說不易溶于水，也可能藥理半壽期短。結(jié)果，病人體內(nèi)的蛋白質(zhì)很難達到有效治療的血液水平。
這些問題可通過將蛋白質(zhì)同聚合物(如聚乙二醇)結(jié)合來克服。Davis等人在美國專利4,179,337中公開了將聚乙二醇(PEG)結(jié)合到蛋白質(zhì)(如酶和胰島素)上，從而得到其中蛋白質(zhì)免疫原性較低，但能保持大部分生理活性的結(jié)合物。Nakagawa等人公開了將PEG結(jié)合到小島活化蛋白質(zhì)上以減少其副作用和免疫原性。Veronese等人在Applied Biochem.and Biotech,11:141-152(1985)上公開了用氯甲酸苯酯類來活化聚乙二醇以修飾核糖核酸酶和超氧化物歧化酶。Katre等人在美國專利4,766,106和4,917,888上也公開了通過聚合物結(jié)合使蛋白質(zhì)增溶。將PEG和其它聚合物同重組蛋白質(zhì)結(jié)合以減弱蛋白質(zhì)的免疫原性和提高它們的半壽期。參見Nitecki等人的美國專利4,902,502；Enzon公司的國際申請PCT/US90/03133；Nishimura等人的歐洲專利申請154,316；Tomasi的國際申請PCT/US85/02572。
以往形成PEG/蛋白質(zhì)結(jié)合物的方法以及由所述方法得到的結(jié)合物存在幾個問題。其一是形成這些蛋白質(zhì)-PEG結(jié)合物的某些方法可能使蛋白質(zhì)失活，從而使得到的結(jié)合物的生物活性可能較差。另外，在形成這些PEG-蛋白質(zhì)結(jié)合物時所用的某些連接劑可能易在體內(nèi)水解斷開。當給藥以后發(fā)生這樣的斷裂時，這些結(jié)合物便失去了由PEG帶來的有利性能。
本發(fā)明的一個實施方案是由獨特的連接劑將干擾素(IFN)的氨基連接到PEG上的新型干擾素-PEG結(jié)合物。本發(fā)明特別涉及通式Ⅰ的具有生物活性的干擾素結(jié)合物
其中R為低級烷基；R1、R2、R3和R4為H或低級烷基；m選自≥1的整數(shù)到干擾素中可及的氨基的數(shù)目；W為O或NH；x為1-1000之間的整數(shù)，y和z為0-1000之間的整數(shù)，x、y和z三者之和為3-1000；附帶條件，R1、R2、R3和R4中至少有一個是低級烷基。
式Ⅰ中的-NH-基團由干擾素分子中可及的氨基衍生而來的，這一點是不言而喻的。
更具體地說，兩種不同的干擾素結(jié)合物具有下列化學(xué)式
其中R為低級烷基；R1、R2、R3、R4為H或低級烷基；m為最大可到干擾素中可及氨基數(shù)的數(shù)字；x、y和z選自使結(jié)合物具有形成結(jié)合物的蛋白質(zhì)的至少一部分生物活性的任意數(shù)字組合；附帶條件是，R1、R2、R3和R4中至少有一個是低級烷基。


圖1用實施例7的化合物進行PEG修飾的時間進程。干擾素(5mg/ml)與相對于蛋白質(zhì)過量10倍、20倍或40倍的試劑一起在25mMTricine(pH 10.0)、0.5M KSCN、100mM NaCl中保溫所示時間。在不同時刻取等分試樣，用甘氨酸停止反應(yīng)，在15％的SDS-PAGE凝膠上分析。標記“Ⅰ”為干擾素。
圖2用實施例5的化合物進行PEG修飾的時間進程。象圖1中那樣，干擾素與過量3倍或10倍的試劑一起保溫所示的時間。在所示時刻取等分試樣，用甘氨酸停止反應(yīng)，在15％SDS-PAGE凝膠上分析。“S”為蛋白質(zhì)分子量標準物的標記，“Ⅰ”為干擾素的標記。
圖3用實施例1(左側(cè))和實施例3(右側(cè))的化合物進行PEG修飾的比較。干擾素與3倍過量的試劑一起保溫0.25、1.5或24小時。取出等分試樣，用甘氨酸停止反應(yīng)并在15％SDS-PAGE凝膠上分析?！癝”為蛋白質(zhì)分子量標準物的標記，“Ⅰ”為干擾素的標記。
按照本發(fā)明，式ⅠA和式ⅠB的IFN結(jié)合物可如下制得使末端羥基或氨基已被活化的連接基團取代的活化PEG縮合，然后，這些試劑可與IFN中的一個或更多個氨基反應(yīng)。只同一個氨基縮合形成單PEG化的結(jié)合物是本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。所以，本發(fā)明也涉及那些可用來制備本發(fā)明的干擾素結(jié)合物的新型活化化合物(試劑)。這些化合物具有下列通式
其中R為低級烷基；R1、R2、R3、R4和R5為H或低級烷基；W為NH或O；x為1-1000的整數(shù)，y和z為0-1000的整數(shù)，x、y和z三者之和為3-1000；附帶條件是，假如W為NH或W為O,R5為H，則R1、R2、R3和R4中至少有一個為低級烷基；
其中，R為低級烷基；R1、R2、R3和R4為H或甲基；x為1-1000的整數(shù)，y和z為0-1000的整數(shù)，x、y和z三者之和為3-1000。
更具體地說，式Ⅱ包括下列兩種類型的化合物
在ⅡA、ⅡB和Ⅲ中，R、R1、R2、R3、R4和R5均如上所述；x、y和z選自能使聚合物在同蛋白質(zhì)結(jié)合后允許蛋白質(zhì)保持至少一部分結(jié)合前生物活性水平的任何數(shù)字組合；加上式Ⅱ中所提到的附帶條件。
按照本發(fā)明，通過使用式ⅡA、ⅡB或Ⅲ的活化的PEG試劑制備結(jié)合物，在蛋白質(zhì)(如干擾素(IFN))的游離氨基和PEG之間形成了一個連鍵，使所得的結(jié)合物保持了蛋白質(zhì)的至少一部分生物活性，但免疫原性降低。另外，通過使用式ⅡA、ⅡB或Ⅲ中的任何一種活化的聚乙二醇而在本發(fā)明結(jié)合物中形成的連接基團，使所得的蛋白質(zhì)結(jié)合物不易在體內(nèi)水解斷開，也不易出現(xiàn)先有技術(shù)PEG蛋白質(zhì)結(jié)合物中所存在的缺點。
按照本發(fā)明，R、R1、R2、R3、R4和R5可以是低級烷基，優(yōu)選甲基。低級烷基指含1-6個碳原子的低級烷基，如甲基、乙基、正丙基、異丙基等。通常，優(yōu)選的烷基是含1-4個碳原子的低級烷基，其中甲基是最優(yōu)選的。R1、R2、R3、R4和R5也可以是氫，但R1、R2、R3和R4不能同時為氫。
按照本發(fā)明，x、y和z可以選自能使所得結(jié)合物保持形成結(jié)合物的IFN的至少一部分生物活性的任何數(shù)字組合。顯然，x、y和z的總和以及m與結(jié)合物所保持的IFN生物活性量成反比。x、y和z的數(shù)值代表形成結(jié)合物的聚乙二醇中的二醇單元數(shù)。m代表IFN中包含的能與活化的PEG混合物反應(yīng)的游離氨基或可及氨基數(shù)。m以及x、y和z的值越大，結(jié)合物的分子量越大。按照本發(fā)明，x、y和z是使除了蛋白質(zhì)部分以外的結(jié)合物分子量在約300-30,000道爾頓的任何數(shù)字。對于IFN，m優(yōu)選1-3。一個特別優(yōu)選的實施方案是m為1的單PEG化的結(jié)合物，它的制備條件能夠以高收率得到IFN中僅有一個游離氨基同式ⅡA或ⅡB或Ⅲ的PEG試劑反應(yīng)的IFN結(jié)合物。按照m為1的優(yōu)選實施方案，x、y和z是使形成結(jié)合物的二醇的平均分子量為大約300-30,000道爾頓，優(yōu)選大約1,000-10,000道爾頓，尤其是大約1,000-5,000道爾頓的任何數(shù)字。特別優(yōu)選的實施方案是分子量大約為2,000道爾頓。
至于單元數(shù)x、y和z,x為1-1000的整數(shù)，y和z為0-1000的整數(shù)，x、y和z三者之和為3-1000。
在式ⅠA和ⅠB結(jié)合物的一個優(yōu)選實施方案中，x和y為5-500,z為0-4。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，所用的二醇是一個二醇混合物，其中x為10-100,y為1-10,z為0。最優(yōu)選的是式ⅠA的干擾素結(jié)合物，其中m為1,R、R2和R4為CH3；R1為H；x大約為19，y大約為2，z為0。這對應(yīng)于PEG單元的平均分子量約為1000道爾頓。
為了避免有關(guān)PEG分子中單元數(shù)的任何疑問，聚乙二醇聚合物用分子量表征優(yōu)于指出PEG聚合物中用x、y和z來表示的自重復(fù)單元(SRU)數(shù)。這些數(shù)值由于起始PEG化合物的潛在不均一性而可能難于估計，因為這些起始PEG化合物通常由平均分子量定義而不是由它們所含的自重復(fù)單元數(shù)定義。不同分子量的起始PEG化合物可由本領(lǐng)域已知的方法制得或由供應(yīng)商處購得。
假如由分子量測定得到的或由供應(yīng)商標示的x、y和z值不是整數(shù)(一般是這種情況)，它們的值則必須按常用方法取舍而化為整數(shù)，從而使可能構(gòu)成聚合物混合物的主要部分的聚合物分子中的上述數(shù)值為整數(shù)。
式ⅡA、ⅡB或Ⅲ中的任何一個試劑同含一個以上游離氨基的IFN反應(yīng)時，可能得到IFN同PEG試劑混合物的不同反應(yīng)產(chǎn)物的混合物。這些反應(yīng)產(chǎn)物是由于PEG試劑同一個或更多個游離氨基反應(yīng)而形成的。這可由式IA和IB中的m表示。例如，當IFN含有三個游離氨基時，活化的PEG試劑可同其中的一個、二個或所有三個游離氨基反應(yīng)。這種情形下，混合物包含所有三種情況下所形成的結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物。由于這個混合物中的不同結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物依m(xù)值的不同(即1、2或3)而具有大不相同的分子量，這些反應(yīng)產(chǎn)物可用傳統(tǒng)方法(如色譜法)分離。為確定m以及x、y和z是否選取適當，分離的結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物可用與篩選IFN母體同樣的方法篩選有生物活性的結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物，從而確定結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物是否仍保持了用未形成結(jié)合物的IFN的一部分生物活性。
按照優(yōu)選的實施方案，m為1。即使有兩個或更多個游離氨基也能得到m為1的結(jié)合物?；罨腜EG試劑首先同IFN中包含的游離氨基之一發(fā)生反應(yīng)。通過控制試劑(如IFN)的濃度和反應(yīng)條件，按照胺縮合的標準方法，可控制蛋白質(zhì)中包含的游離氨基的聚乙二醇化程度。在包含一個或更多個游離氨基的蛋白質(zhì)中，若有一個游離氨基較其它氨基活潑，可選擇反應(yīng)條件使蛋白質(zhì)同活化的PEG化合物反應(yīng)以形成m為1的式ⅠA或ⅠB化合物。形成蛋白質(zhì)的氨基酸中所含的其它游離氨基可通過延長縮合反應(yīng)時間或利用其它更劇烈的反應(yīng)條件進一步同PEG反應(yīng)。
本說明書和權(quán)利要求書中所用的術(shù)語干擾素和IFN包括所有類型的干擾素(即具有干擾素活性的分子)，例如，α、β、γ和ω干擾素以及這些類型的所有亞類，如α1、α2、α2A、α2B或α2C以及不同類型和/或亞類干擾素的雜種分子或嵌合體。干擾素可以是任何來源的，可以從天然來源、組織培養(yǎng)或由重組DNA技術(shù)得到。制備或分離天然或重組干擾素的方法在本領(lǐng)域中是公知的，并在如下公開號的專利申請中有所描述EP43980、EP211148、EP140127、DE3028919、USP4503035和USP4414150。
使用R1、R2、R3和R4中至少有一個為低級烷基尤其是甲基的式ⅡA、ⅡB和Ⅲ的試劑(烷基取代試劑)，其優(yōu)點在于當用烷基取代試劑時，同相應(yīng)的非取代試劑相比可以出人意料地提高結(jié)合物即PEG化蛋白質(zhì)的產(chǎn)率。在相同反應(yīng)時間內(nèi)，烷基取代試劑同相應(yīng)的非取代試劑相比，制備結(jié)合物時，前者可得到至少兩倍量的結(jié)合物。
當給予病人由上述的取代試劑制備的式ⅠA和ⅠB結(jié)合物用于治療時，這些結(jié)合物同由相應(yīng)的非取代試劑制備的結(jié)合物相比，在病人血流中的體內(nèi)半壽期意外地提高。雖然體內(nèi)半壽期同結(jié)合物的分子量成正比，由取人試劑制得的結(jié)合物出人意料地同由非取代試劑制得的較高分子量的結(jié)合物具有同樣長的半壽期。治療劑在病人血流中的半壽期較長能提高對病人給藥的效率。例如，由烷基取代試劑制得的結(jié)合物可以比由相應(yīng)的非取代試劑制得的結(jié)合物給藥次數(shù)少，或者用量較少。為了提高同聚乙二醇結(jié)合的生物性蛋白質(zhì)的給藥效率，形成這些蛋白質(zhì)結(jié)合物時使用了較高分子量的聚乙二醇。然而，結(jié)合的活性IFN的生物效能隨分子量增大而減小。但是，通過使用本發(fā)明的由取代試劑制得的結(jié)合物，相對于使用相應(yīng)的非取代結(jié)合物提高了給藥效率，但分子量增加較少。
在另外一個實施方案中，本發(fā)明也涉及制備新型結(jié)合物的方法。
式ⅠA的結(jié)合物可如下制備
其中，R、R1、R2、R3、R4和R5，m和x、y和z同上；附帶條件是R1、R2、R3、R4中任何一個或更多個都可以是低級烷基。
在這一反應(yīng)中，PEG-胺在烴或氯代烴熔劑中同式Ⅳ化合物混合以制備式ⅡA化合物。式ⅡA化合物可在水性介質(zhì)中同蛋白質(zhì)的一個或更多個游離氨基縮合以制備式ⅠA的結(jié)合物。這個反應(yīng)可在水性介質(zhì)中胺縮合的常規(guī)條件下進行。該反應(yīng)通常在pH7-10的標準緩沖水溶液中進行，以制備式ⅠA的結(jié)合物。依蛋白質(zhì)中的游離氨基數(shù)和反應(yīng)時間而定，該反應(yīng)可制備不同分子量的PEG蛋白質(zhì)結(jié)合物的混合物。PEG蛋白質(zhì)結(jié)合物接下來可用常規(guī)方法如高效液相色譜(HPLC)或凝膠電泳法分出各個組分。用HPLC或凝膠電泳法依分子量來分離化合物的任何常規(guī)方法均可使用。這個混合物的分離可按照本文所述的所得產(chǎn)物的分子量來進行。
式ⅠB的IFN結(jié)合物可按下列反應(yīng)路線來制備
其中，R、R1、R2、R3、R4、R5、m、x、y、z和附帶條件如上所述。
式Ⅳ化合物由光氣和2-羥基吡啶(當R5為低級烷基時為取代的2-羥基吡啶)用酰鹵和醇縮合的任何常規(guī)方法制備。
PEG醇同式Ⅳ化合物的縮合利用醇和碳酸酯縮合的常規(guī)條件進行以制備式ⅡB化合物。式ⅡB化合物通過蛋白質(zhì)上的一個或更多個游離氨基同蛋白質(zhì)縮合，以制備式ⅠB化合物。該反應(yīng)可按照上述的式ⅡA化合物縮合制備式ⅠA結(jié)合物的方法進行。依蛋白質(zhì)中與式ⅡB化合物發(fā)生反應(yīng)的游離氨基數(shù)的不同，式ⅠB的結(jié)合物可由不同分子量結(jié)合物的混合物組成。該結(jié)合物混合物可用前面描述過的方法來分離。
式ⅠB化合物也可用如下反應(yīng)路線來制備
其中，R、R1、R2、R3、R4、R5、m、x和y均如上所述。
在該反應(yīng)路線中，PEG-醇同式Ⅳ化合物縮合以制備式Ⅲ化合物。在該反應(yīng)中，式ⅡB化合物作為中間產(chǎn)物形成之后與另一摩爾的PEG-醇反應(yīng)生成式Ⅲ化合物。在該反應(yīng)進行時，PEG-醇的用量至少為每摩爾式Ⅳ化合物用2摩爾PEG-醇。在這一步驟中，醇同碳酸酯縮合的任何常規(guī)方法均可使用。式Ⅲ化合物同干擾素反應(yīng)形成式ⅠB結(jié)合物是按照上述的式ⅡA化合物轉(zhuǎn)化為式ⅠA化合物的方法進行的。依蛋白質(zhì)所含的游離氨基數(shù)，式Ⅲ化合物同蛋白質(zhì)縮合得到各種結(jié)合物的混合物，該混合物可用前面描述的分離ⅠA結(jié)合物的方法分離成各個組分。
按照本發(fā)明，已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的干擾素結(jié)合物同用于形成結(jié)合物的蛋白質(zhì)具有同樣的效用。這樣，這些結(jié)合物同形成它們的蛋白質(zhì)具有相同形式的治療活性，可以按與蛋白質(zhì)本身相同的方式使用，而不會產(chǎn)生在給予病人蛋白質(zhì)本身時可能引起的不良免疫反應(yīng)。因此，本發(fā)明也包括以式Ⅰ化合物或其鹽為主要成分的藥物組合物以及制備這些組合物的方法。
本發(fā)明用來控制或預(yù)防疾病的藥物組合物包括通式Ⅰ的干擾素結(jié)合物和治療惰性的、治療上可接受的無毒的載體物質(zhì)。欲使用的藥物組合物可制成制劑，并按與合適的醫(yī)療慣例一致的方式給藥，并應(yīng)考慮所要治療的疾病、病人的個體狀況、蛋白質(zhì)結(jié)合物的釋放部位、給藥方法以及操作者已知的其它因素。
下述實施例代表本發(fā)明的說明性實施方案，但本發(fā)明不受這些實施例的限制。
在這些實施例中所用的Jeffamine M-2070是由環(huán)氧丙烷和環(huán)氧乙烷衍生而來的、平均分子量為2070的單甲氧基聚氧化烯丙胺聚合物，其骨架由聚乙二醇組成，并平均包含30％無規(guī)結(jié)合的環(huán)氧丙烷基團。
Jeffamine M-1000是平均分子量為1000的單甲氧基聚氧化烯丙胺聚合物，它由環(huán)氧丙烷和環(huán)氧乙烷衍生而來，其骨架由聚乙二醇組成，并包含14％專一性結(jié)合的環(huán)氧丙烷基團，其中x平均為18.6,y平均為1.6,z為0(這里所用的x、y和z的意義如上所述)。
這些實施例中所用的所有試劑均在4℃下于棕色瓶中干燥貯存?zhèn)溆?。每次修飾反?yīng)都使用新鮮的等分試劑。
實施例實施例1α,α′-氧亞甲基雙[ω-甲氧基聚(氧-1,2-亞乙基)]SRU 111的制備從含1.5克MPEG(甲氧基聚乙二醇，分子量為5000)的80ml干燥甲苯的懸浮液中蒸去50ml溶劑。溶液冷卻后加入30.5mg碳酸二-2-吡啶酯。然后將得到的混合物回流24小時。將溶液冷卻，得到的沉淀過濾后，先用少量甲苯洗滌，再用乙醚洗滌，得到的固體在高真空下干燥得到0.6克α,α′-氧亞甲基雙[ω-甲氧基聚(氧-1,2-亞乙基)]SRU 111白色粉末。經(jīng)PEG修飾的干擾素由下述的方法1制備。
經(jīng)PEG修飾的干擾素-α的制備方法1濃度為每ml5g蛋白質(zhì)的重組干擾素-α在含5mM乙酸鈉(pH5.0)、120mM NaCl的緩沖液中滲析。加入硫氰酸鉀達最后濃度為0.5M，加入1/10體積pH11.9的1M Tricine-氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值，得到最終pH為10.0的溶液。PEG試劑以固體或DMSO溶液(DMSO的體積小于總體積的10％)形式按3∶1摩爾比加入到蛋白質(zhì)中。在室溫下進行修飾反應(yīng)30分鐘到4小時，然后加入1ML-甘氨酸(pH6.3)到最后濃度為20mM以終止進一步的修飾。加入3.5M硫酸銨、50mM磷酸鈉，pH7.0，使硫酸銨的最后濃度達到1.1M(對于PEG-1000為1.0M硫酸銨)，使經(jīng)PEG修飾的蛋白質(zhì)沉淀，沉淀經(jīng)離心收集，洗滌后再溶于pH5.0的25mM乙酸銨中。經(jīng)PEG修飾的蛋白質(zhì)在疏水交換柱(如75×7.5mm)如BioRad TSK Phenyl-5-PW或ToyopearlPhenyl-650M上用色譜法純化，使用pH7.0的50mM磷酸鈉溶液中硫酸銨濃度遞減的梯度。另一種方法是，PEG-IFN在用25mM乙酸鈉(pH5.0)、200mM NaCl平衡的Sephacryl S-200柱(如90cm×3.2cm柱)(Pharmacia)上進行凝膠過濾純化。經(jīng)PEG修飾的蛋白質(zhì)用SDS-PAGE鑒定。從柱中洗脫出相應(yīng)于結(jié)合有一個PEG(PEG1-IFN)或兩個PEG(PEG2-IFN)的IFN的蛋白質(zhì)，合并這些蛋白質(zhì)并濃縮后，通過測定280nm處的光吸收或用比色分析法(Pierce)測定蛋白質(zhì)濃度。PEG-IFN在4℃下于含50mM磷酸鈉(pH7.0)、0.3M硫酸銨的緩沖液中貯存。
方法2大約6mg/ml蛋白質(zhì)濃度的干擾素α-2a用5mM乙酸鈉(pH5.0)、0.12M氯化鈉滲析。以1.0mg-1ml為消光系數(shù)測定280nm處的光吸收，以此來測定蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)溶液以蛋白質(zhì)試劑為1∶3的摩爾比與修飾試劑混合。用1/10體積的pH 10.7的0.1MNa2B4O7-NaOH調(diào)節(jié)pH到10.0，從而引發(fā)修飾反應(yīng)。在室溫下保溫1小時后，通過加入1/20體積pH7.5的1M甘氨酸終止反應(yīng)。3-5分鐘后，加入1/20體積的pH4.0的1M乙酸鈉使pH降至5.0-6.0。
含PEG-干擾素、已停止反應(yīng)的試劑和未修飾干擾素的溶液用pH4.5的40mM乙酸銨稀釋4倍后，移至一個羧甲基纖維素柱(Whatman CM-52，每mg蛋白質(zhì)約0.5ml樹脂)上，用5倍體積pH4.5的40mM乙酸銨洗柱后，PEG-干擾素和未修飾干擾素用氯化鈉在pH4.5的40mM乙酸銨中的線性梯度(0-0.5M)洗脫，含蛋白質(zhì)的級分用280nm處的光吸收來鑒定，含PEG-干擾素的級分由SDS-PAGE來鑒定。
PEG-干擾素在裝有Sephacryl S-200樹脂(Pharmacia LKB)的柱上用排阻-凝膠過濾色譜法進一步純化。從柱中洗脫出的級分用SDS-PAGE來分析，合并含PEG-干擾素的峰物質(zhì)。
實施例2α,α-氧亞甲基雙[ω-甲氧基聚(氧-1,2-亞乙基)]SRU 28.3的制備按實施例1中描述的方法，將MPEG(分子量1300)轉(zhuǎn)化為α,α-氧亞甲基雙[ω-甲氧基聚(氧-1,2-亞乙基)SRU28.3，經(jīng)PEG修飾的干擾素用這個試劑按實施例1中所述方法1來制備。
實施例3α-甲基-ω-[2-[[2-吡啶基氧)羰基]氧]乙氧基]-聚(氧-1,2-亞乙基)SRU111.7的制備從含1克分子量為5000的MPEG的30ml干燥CH2Cl2溶液中蒸出10ml溶劑。溶液冷卻到室溫后加入132mg(0.6mM)碳酸二-2-吡啶酯和4mg DMAP。得到的溶液攪拌14小時后真空下除去溶劑。殘余物用乙醚研制并將得到的沉淀過濾。然后將產(chǎn)物溶于7ml干燥的甘醇二甲醚中，加熱使其溶解，使得到的溶液冷卻，并在室溫下放置數(shù)小時。然后將得到的沉淀過濾并用2×5ml干燥的甘醇二甲醚洗滌，固體在氮氣流下于真空爐中干燥，得到0.7克α-[(2-吡啶基氧)羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1,2-亞乙基)SRU111.7。
元素分析C9H11NO4(CH2CH2O)111.7的計算值C,54.57；H,9.02；N,0.28。實測值C,54.51；H,9.19；N,0.28。
經(jīng)PEG修飾的干擾素用這個試劑按實施例1中所述方法1來制備。
實施例4α-[(2-吡啶基氧)羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1,2-亞乙基)SRU225的制備分子量為10,000的MPEG按實施例3中所述方法轉(zhuǎn)化為α-[(2-吡啶基氧)羰基]-ω-甲氧基聚(氧-1,2-亞乙基)SRU225。
元素分析C9H11NO4(CH2CH2O)225的計算值C,54.54；H,9.08；N,0.14。實測值C,54.54；H,9.12；N,0.11。
經(jīng)PEG修飾的干擾素用這個試劑按實施例1中所述方法1來制備。
實施例5α-甲基-ω-[2-[2-[[(2-吡啶基氧)羰基]氧]丙氧基]丙氧基]聚(氧-1,2-亞乙基)SRU64.7的制備從含0.5克α-2-[2-(羥基丙氧基)丙基]-ω-甲氧基聚(氧-1,2-亞乙基)SRU64.7的40ml干燥CH2Cl2溶液中蒸去15ml溶劑。然后向溶液中加入108mg碳酸二-2-吡啶酯、4mgDMAP和幾粒4A分子篩。混合物攪拌過夜，過濾后減壓除去溶劑。殘余物通過排阻色譜法純化。
這個試劑對應(yīng)于式ⅡB-1化合物
其中n約為64，這相當于聚合物的分子量約為3000道爾頓。
經(jīng)PEG修飾的干擾素用這個試劑按實施例1中所述方法1來制備。
實施例6α-甲基-ω-[2[2-[[(2-吡啶基氧)羰基]氧]丙氧基]丙氧基]聚(氧-1,2-亞乙基)SRU110的制備α-2-[2-(羥基丙氧基)丙基]-ω-甲氧基聚(氧-1,2-亞乙基)SRU110按實施例5中所述方法轉(zhuǎn)化為α-甲基-ω-[2-[2-[[(2-吡啶基氧)羰基]氧]丙氧基]丙氧基]聚(氧-1,2-亞乙基)SRU110。
這個試劑(ⅡB-2)除了n大約為110，對應(yīng)于5000道爾頓外，同實施例5所述的化合物(ⅡB-1)相當。
經(jīng)PEG修飾的干擾素用這個試劑按實施例1中所述方法1來制備。
實施例7甲基環(huán)氧乙烷同環(huán)氧乙烷的聚合物2-[[(2-吡啶基氧)羰基]氨基]丙基甲基醚(MO/O=10/32)的制備從含1克Jeffamine M-2070(Texaco Chemical Co.)的40ml干燥CH2Cl2溶液中蒸出15ml溶劑。溶液冷卻到0℃并加入215mg碳酸二-2-吡啶酯。得到的溶液在0℃下再攪拌4小時，之后減壓除去溶劑。殘余物用串連的兩個Phenomenex排阻色譜柱(500和1000)純化。該產(chǎn)物在紫外光譜上顯示232nm和310nm兩個吸收帶。
這個試劑對應(yīng)于下式化合物
其中，R5為H，R2為H或甲基，并且，作為平均分布，當R2為H時n為32，當R2為甲基時n為10。
經(jīng)PEG修飾的干擾素用這個試劑按實施例1中所述方法2來制備。
實施例8甲基環(huán)氧乙烷同環(huán)氧乙烷的聚合物2-[[(3-甲基-2-吡啶基氧)羰基]氨基]丙基甲基醚(MO/O=10/32)的制備按實施例7中所述方法，1克Jeffamine M-2070同碳酸雙(3-甲基-2-吡啶基)酯反應(yīng)得到甲基環(huán)氧乙烷同環(huán)氧乙烷的聚合物2-[[(3-甲基-2-吡啶基氧)羰基]氨基]丙基甲基醚(MO/O=10/32)。
除了R5為CH3外，這個試劑(ⅡA-2)同實施例7中所述化合物(ⅡA-1)相當。
經(jīng)PEG修飾的干擾素用這個試劑按實施例1中所述方法1來制備。
實施例9甲基環(huán)氧乙烷同環(huán)氧乙烷的聚合物2-[[(2-吡啶基氧)羰基]氨基]丙基甲基醚嵌段(MO/O=1.6/18.6)的制備按實施例7中所述方法，0.6克Jeffamine M-1000(TexacoChemical Co.)同155.6mg碳酸二-2-吡啶酯反應(yīng)得到甲基環(huán)氧乙烷同環(huán)氧乙烷的聚合物-[[(2-吡啶基氧)羰基]氨基]丙基甲基醚嵌段(MO/O=1.6/18.6)。
得到下式化合物
其中聚合物中各單元的平均分布如所示。
經(jīng)PEG修飾的干擾素用該試劑按實施例1中所述方法1來制備。
干擾素的抗病毒活性對干擾素及經(jīng)PEG修飾的干擾素的抗病毒活性進行了測定(Rubenstein等人，(1981)J.Virol.37:755-758；Familletti等人，(1981)Methocls Enzymol.78:387-394)。所有的測定都相對于對照物進行了標準化。測定中所用的干擾素標準物的比活性為每mg蛋白質(zhì)2×108單位。
修飾干擾素所用條件是以所述的最優(yōu)化程序為基礎(chǔ)的。PEG修飾過程中，由SDS-PAGE分析不同培養(yǎng)時間內(nèi)干擾素轉(zhuǎn)化為單PEG-干擾素的轉(zhuǎn)化率(化學(xué)反應(yīng)性)以及不同種類PEG-干擾素結(jié)合物的分布(位點選擇性)。在SDS-PAGE中，觀察到經(jīng)PEG修飾的物質(zhì)是凝膠上的遷移較慢的條帶。單PEG-干擾素和雙PEG-干擾素的產(chǎn)率都足以使它們能夠用疏水性相互作用色譜法從反應(yīng)混合物中純化出來。測定純化的PEG-干擾素的抗病毒活性并與未修飾的干擾素-α2a標準物比較。所用聚合物的分子量以及一些PEG化的衍生物的抗病毒活性如表1所示。
表1PEG試劑的物理性質(zhì)及其蛋白質(zhì)結(jié)合物的生物活性抗病毒活性實施例化合物(％對照物)聚合物分子量 單PEG 雙PEG4 10000 25 23 5000 40 41 5000 40 ND6 5000 40 ND5 3000 60 ND7 2070 45 ND2 1300 70 ND9 1000 100 40ND未測
權(quán)利要求
1．一種具有下式的化合物
其中R為低級烷基；R1、R2、R3、R4和R5為H或低級烷基；W為NH或O；x為1-1000的整數(shù)，y和z為0-1000的整數(shù)，x、y和z三者之和為3-1000；附帶條件是，假如W為NH或W為O，R5為H，則R1、R2、R3和R4中至少有一個為低級烷基。
2．權(quán)利要求1的化合物，其中選擇x、y和z，使得所述化合物的分子量在大約300-30000道爾頓的范圍內(nèi)。
3．權(quán)利要求1的化合物，其中R為甲基。
4．權(quán)利要求3的化合物，其中x為10.0-100.0,y為1.0-10.0,z為0.0-4.0。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有生理活性的水溶性聚乙二醇同干擾素的結(jié)合物,以及可用來制備這些結(jié)合物的新型聚乙二醇化合物。
文檔編號A61K39/00GK1211578SQ9710543
公開日1999年3月24日 申請日期1993年8月25日 優(yōu)先權(quán)日1992年8月26日
發(fā)明者R·卡拉西韋茨, C·納林, P·羅森 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司