專利名稱：抗人結(jié)腸癌相關(guān)抗原的單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
這一申請(qǐng)是美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)為No.08/159,836(1993年11月30日申請(qǐng))的部分繼續(xù)申請(qǐng)。而No.08/159,836是美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)為N08/117,430(1993年9月7日申請(qǐng))，的部分繼續(xù)申請(qǐng)，而No.08/117,430又是美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)為No.07/670,816(1991年3月18日申請(qǐng))的部分繼續(xù)申請(qǐng)，而No.07/670,816又是美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)為No.07/176,337(1988年3月31日申請(qǐng))的部分繼續(xù)申請(qǐng)，后三項(xiàng)專利目前都已經(jīng)放棄。
發(fā)明的背景發(fā)明的領(lǐng)域這項(xiàng)發(fā)明涉及免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)兩個(gè)領(lǐng)域。主要指一類新的雜交瘤細(xì)胞株，這類細(xì)胞株所分泌的單克隆抗體能特異性地結(jié)合臨床上所謂的結(jié)腸癌相關(guān)抗原。這種單克隆抗體對(duì)體內(nèi)免疫檢測(cè)和免疫治療是有用的。同時(shí)還可以用來檢測(cè)和純化結(jié)腸癌相關(guān)抗原。
背景技術(shù)：
在癌的發(fā)生過程中，在細(xì)胞上出現(xiàn)許多細(xì)胞表面分子或標(biāo)記。這種腫瘤相關(guān)標(biāo)記包括癌胚蛋白，新糖蛋白，鞘脂以及原來表面蛋白質(zhì)的修飾。而這些新產(chǎn)生的和結(jié)構(gòu)改變了的分子經(jīng)常從腫瘤細(xì)胞表面脫落下來，并出現(xiàn)在血清或其它體液中。對(duì)這些物質(zhì)或“腫瘤標(biāo)志”的檢測(cè)可為診斷或監(jiān)測(cè)癌性病變的發(fā)生發(fā)展提供依據(jù)。
早期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在這些腫瘤標(biāo)志中，有一類細(xì)胞膜蛋白或糖蛋白抗原具有免疫原性。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)癌癥病人的原發(fā)灶被手術(shù)切除后，這種抗原能夠有效地阻止新的癌組織的生長(zhǎng)。
Hollinshead和Stewart用肺癌患者的癌組織制成比較純的制劑試圖將比較相似的腫瘤相關(guān)抗原用于臨床治療(Stewart，T.H.M.et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.277436(1976)).以后這一研究工作又進(jìn)一步開展到黑色素瘤和結(jié)腸癌患者，而不同種類的同種異型較純制劑是和弗氏佐劑同時(shí)使用的。(Hollinshed，A.C.et al.Cancer 491387(1982)；Hollinshead，A.C.et al.，Cancer 56480(1985)).
同時(shí)使用弗氏佐劑的原因是由于科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，這種佐劑與正常組織抗原的共同使用，可以引起動(dòng)物受體強(qiáng)烈的自身免疫反應(yīng)。相反，若沒有同時(shí)使用這一佐劑，則沒有副作用的發(fā)生。因此，科學(xué)家認(rèn)為佐劑可以促進(jìn)宿主巨噬細(xì)胞的抗原加工，并延長(zhǎng)抗原在作用部位的反應(yīng)時(shí)間(請(qǐng)查閱Roitt，I.，Essential Immunology，6th Ed.，Blackwell Scinetific Publication，0xford(1988)).
正是由于以上的這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果，科學(xué)家開始嘗試著在臨床上用特異的人類腫瘤細(xì)胞膜的蛋白和糖蛋白作為腫瘤疫苗。接著，各種各樣已被分離的腫瘤相關(guān)抗原能夠延長(zhǎng)患者的存活期，甚至在一些實(shí)驗(yàn)中抑制了轉(zhuǎn)移灶腫瘤的生長(zhǎng)。
隨著單克隆抗體技術(shù)的產(chǎn)生與完善，科學(xué)家便能得到純化了的抗體，并以此來純化和定義不同的腫瘤標(biāo)志性分子和腫瘤相關(guān)抗原，最后用這些抗體進(jìn)行免疫診斷和免疫治療。許多單抗對(duì)腫瘤抗原表現(xiàn)出不同程度的選擇性，其中有些抗原可以同時(shí)出現(xiàn)在多種不同類型的腫瘤上，而另一些則表現(xiàn)出很強(qiáng)的腫瘤特異性，以下就介紹一些Herlyn及其同伴(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 761438(1979))通過用人類直腸結(jié)腸癌(CRC)細(xì)胞來免疫小鼠后得到兩種單抗，這兩種單抗都能選擇性地與人類CRC細(xì)胞相互作用?，F(xiàn)在已經(jīng)證明其中一個(gè)單抗，1083-17(17-1A的前體)，是與41KD的糖蛋白反應(yīng)的。
Herlyn等(J.Clin.Immunol.2135(1982))得到了一個(gè)抗SW116細(xì)胞株膜抗原的單抗，用這個(gè)單抗可以檢測(cè)體循環(huán)中的CRC相關(guān)抗原。單抗19-9和52a能識(shí)別單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂抗原(Magnani，J.L.等，science21255(1981)，在臨床上則能與12種細(xì)胞株中的8種、一種胃癌細(xì)胞、一種胰腺癌細(xì)胞反應(yīng)。單抗C414能與4/6的培養(yǎng)CRC細(xì)胞、胃癌細(xì)胞反應(yīng)。并且，單抗19-9和52a與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合會(huì)被CRC患者的血清所抑制。然而，胃癌患者的血清和胰腺癌患者的血清比CRC患者的血清更易于抑制單抗與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合。
1986年，Girardet及其同伴(J.Im munol.1361497-1503(1986))發(fā)現(xiàn)了抗人類結(jié)腸癌的單抗.L-D1單抗能與一種41KD的糖蛋白反應(yīng)，這種糖蛋白可能就是單抗1083-17-1A所識(shí)別的抗原(Herlyn etal，1979，參見前述)。單抗L-C5則能沉淀分子量分別為43，45，47和53KD的LoVo結(jié)腸癌細(xì)胞來源的蛋白。L-D1同時(shí)也能與子宮頸癌株反應(yīng)，L-C5乳腺癌細(xì)胞株反應(yīng)，但它們與胰腺癌瘤細(xì)胞反應(yīng)如何還不知道。
1987年，Greiner及其同伴(Science 235895-898(1987))發(fā)現(xiàn)了單抗06.2，它能與一種90 KD的糖蛋白反應(yīng)。而在75-80％的乳腺癌患者和90％以上的結(jié)腸癌患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了這種糖蛋白的存在。
Sakamoto及其同伴則發(fā)現(xiàn)了一系列通過其他途徑能夠診斷并治療人類結(jié)腸癌的單抗(美國(guó)專利4,579,827(4/1/86))。而所有這些單抗中沒有一種能與分子量分別為61或72 KD的人類結(jié)腸癌相關(guān)抗原蛋白反應(yīng)的性能，正是這一性質(zhì)使其有別于我們發(fā)明的抗體。而且，Sakamoto的單抗與我們發(fā)明的單抗在特異性上沒有任何相同之處。
1986年，Delaloye及其同事(J.Clin.Invest.77301(1986))用CEA特異性的單抗在體內(nèi)檢測(cè)結(jié)腸直腸癌，具體是借助與123I標(biāo)記片段和計(jì)算機(jī)模擬其釋放出的同位素的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。然而，這種單抗與我們所發(fā)明的單抗沒有任何關(guān)系。
1986年，Douillard及其同事(Hybridoma 5，Suppl.1S139(1986))發(fā)現(xiàn)了單抗17-1A，以及它在體外對(duì)胃-小腸腺癌細(xì)胞的毒性，而在某種程度上，單抗17-1A在免疫治療試驗(yàn)中是成功的。單抗17-1A能夠識(shí)別38-41 KD的蛋白并有廣泛的反應(yīng)性，但它對(duì)結(jié)腸癌腫瘤并無特異性，這就表明了它與我們所發(fā)明的抗體的明顯的差別。
Scannon等美國(guó)專利4,590,071(5/20/86)公開的單抗就結(jié)合了諸如ricinA鏈的毒蛋白，這些結(jié)合成份有治療黑色素瘤的功能，而這一單抗能特異性識(shí)別黑色素瘤抗原。然而，還沒有發(fā)現(xiàn)針對(duì)結(jié)腸癌抗原和抗體的單抗，以及這類單抗的使用。
Hollinshead等在1972年(Science 177887-889(1972))已經(jīng)報(bào)道了抗原的相對(duì)較純的制備物，這些抗原制備物含有免疫原性的結(jié)腸癌細(xì)胞膜抗原，也正是我們的抗體所識(shí)別并結(jié)合的部位。
在臨床上如何評(píng)價(jià)上述抗原制備物的價(jià)值，也已經(jīng)由Hollinshead等(參見前述1985)報(bào)道了，主要包括該抗原制備物的免疫原性，以及通過增強(qiáng)特異性主動(dòng)免疫以延長(zhǎng)患者的存活期。
在Intl.Symp.Biotech.in Clin.Med.，Rome，Italy，April 13-15，1987上，Tsang等在“抗人類結(jié)腸癌相關(guān)抗原的單抗″一文中簡(jiǎn)述了本發(fā)明的工作。這篇參考文獻(xiàn)的公開發(fā)表離本專利申請(qǐng)的基本原始申請(qǐng)專利(美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)為07/176,337)的時(shí)間還不足一年。
發(fā)明的概要本發(fā)明的發(fā)明者已經(jīng)制成了能針對(duì)結(jié)腸癌相關(guān)抗原的鼠源單抗和鼠-人嵌合抗體，而結(jié)腸癌相關(guān)抗原被認(rèn)為對(duì)人類具有免疫原性。這些在發(fā)明者實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分離得到的抗原是不同于前面所講的結(jié)腸癌抗原的，理由如下1.單抗所識(shí)別的表位并不是腫瘤相關(guān)糖蛋白的糖部分，而是蛋白部分；2.這一抗原在正常的組織中并不表達(dá)；3.這些抗原具有腫瘤特異性，存在于結(jié)腸癌，乳房癌和卵巢癌的腫瘤組織內(nèi)；4.這些抗原能同時(shí)通過細(xì)胞反應(yīng)和體液反應(yīng)來增強(qiáng)宿主的抗腫瘤的免疫能力，因此它們對(duì)于人類是有免疫活性的；5.抗原的免疫原性對(duì)于人類是具有特異性的，因?yàn)橹挥薪Y(jié)腸癌，乳腺癌和卵巢癌的患者才表現(xiàn)出對(duì)這些抗原的免疫學(xué)特異性，而對(duì)其它的腫瘤則沒有特異性，這已經(jīng)通過體內(nèi)體外的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了。
本發(fā)明的單抗和嵌合抗體能應(yīng)用于結(jié)腸癌，乳腺癌和卵巢癌的診斷與治療。例如描繪腫瘤的轉(zhuǎn)移；傳遞細(xì)胞毒性成份至腫瘤部位；激活諸如抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)或者補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)的宿主效應(yīng)機(jī)制來直接殺死腫瘤細(xì)胞。
本發(fā)明是一種針對(duì)結(jié)腸癌相關(guān)抗原蛋白的單克隆抗體，而這種結(jié)腸癌相關(guān)抗原對(duì)人類具有特異的免疫原性，在正常的人體組織或其它的腫瘤(除了結(jié)腸癌，乳腺癌和卵巢癌以外)內(nèi)并不能發(fā)現(xiàn)這些抗原。另外本發(fā)明還包括抗原結(jié)合片段或抗體的衍生物。
本發(fā)明的另一部分是特異性針對(duì)一種人類結(jié)腸癌相關(guān)蛋白抗原的嵌合抗體，而在正常的人體組織或其它的腫瘤(除了結(jié)腸癌以外)內(nèi)并不能發(fā)現(xiàn)這種抗原。
在一實(shí)施例中，該抗體對(duì)一分子量約為61KD的CCAA蛋白特異。在另一實(shí)施例中，該抗體對(duì)一分子量為72KD的CCAA蛋白特異。在一最佳實(shí)施例中該抗體是小鼠單克隆抗體33.8或31.1，或者是與33。28、31.1一樣能特異地結(jié)合在相同的結(jié)腸癌相關(guān)抗原的抗體。在另一最佳實(shí)施例中，抗體是一種小鼠/人嵌合抗體Chi#1，它如同31.1那樣能特異性地與相同的結(jié)腸癌相關(guān)表位結(jié)合。
本發(fā)明中的抗體是能在固定在固相物上。
本發(fā)明包括上述的經(jīng)標(biāo)記后能檢測(cè)的抗體，如同位素標(biāo)記的抗體。
在附加的實(shí)施例中，上述的抗體還能與具有細(xì)胞毒性的放射性核素、藥物、蛋白結(jié)合。
又在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明還包括能抗上述抗體的單抗，即第二次產(chǎn)生的單抗。
在一更深一層的實(shí)施例中，本發(fā)明還包括第三次產(chǎn)生的單抗，即對(duì)抗上述二抗的單克隆抗體。
本發(fā)明所針對(duì)的結(jié)腸癌相關(guān)抗原也是唯一的，理由如下1.單抗所識(shí)別的表位并不是腫瘤相關(guān)糖蛋白的糖部分，而是蛋白部分；2.這一抗原在正常的組織中并不表達(dá)；3.這些抗原具有腫瘤特異性，存在于結(jié)腸癌，乳房癌和卵巢癌的腫瘤組織內(nèi)；4.這些抗原能同時(shí)通過細(xì)胞反應(yīng)和體液反應(yīng)來增強(qiáng)宿主的抗腫瘤的免疫能力，因此它們對(duì)于人類是有免疫活性的；5.抗原的免疫原性對(duì)于人類是具有特異性的，因?yàn)橹挥薪Y(jié)腸癌，乳腺癌和卵巢癌的患者才表現(xiàn)出對(duì)這些抗原的免疫學(xué)特異性，而對(duì)其它的腫瘤則沒有特異性，這已經(jīng)通過體內(nèi)體外的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了。
到目前為止，所有其它純化的并已經(jīng)使用的抗原都不能引發(fā)細(xì)胞性或體液性免疫反應(yīng)。
本發(fā)明還為結(jié)腸癌、乳腺癌和卵巢癌提供了有效的藥物組份，該組份是包含有與具有細(xì)胞毒性的放射性核素，具有細(xì)胞毒性的藥物或具有細(xì)胞毒性的蛋白結(jié)合的在一合適的賦形劑中如上述的抗體、片段或衍生物。
本發(fā)明還包括一種免疫檢測(cè)方法，可以檢測(cè)樣品中能夠與鼠單抗33.28、31.1或Chi#1結(jié)合的結(jié)腸癌相關(guān)抗原的存在。這包括(a)用上述抗體接觸樣品；以及(b)通過檢測(cè)所結(jié)合的抗體來檢測(cè)抗原的多少。
在另一個(gè)最佳實(shí)施例中，本發(fā)明還提供了用成象的方法來檢測(cè)宿主中結(jié)腸癌相關(guān)抗原的存在，這包括(a)將標(biāo)記好的抗體接觸宿主；以及(b)檢測(cè)抗原。
本發(fā)明包括一個(gè)殺死攜帶有結(jié)腸癌相關(guān)抗原的細(xì)胞的方法，這包括(a)將上述抗體及一種具有細(xì)胞毒性的效應(yīng)劑傳遞給細(xì)胞；以及(b)殺死細(xì)胞。
執(zhí)行殺死細(xì)胞的任務(wù)的成份可以是補(bǔ)體，或是在ADCC中被激活的效應(yīng)細(xì)胞。也可以是有直接發(fā)揮殺死作用的已經(jīng)結(jié)合了細(xì)胞毒性成份(放射性核素、藥物、蛋白)的標(biāo)記的抗體。
本發(fā)明還提供一種治療方法來治療被懷疑已經(jīng)患上了結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌的人，這些人往往攜帶了能與33。28、31。1單克隆抗體、Chi#1結(jié)合的抗原，這一治療可以用如上所述的藥物組份的有效劑量。
另外還提供了一個(gè)用于臨床免疫治療結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌的生產(chǎn)具有免疫原性的組份的方法，這包括(a)制備一個(gè)含有能與33.28單抗或31.1單抗或Chi#1抗體結(jié)合的抗原的腫瘤或細(xì)胞系的細(xì)胞膜提取物；以及(b)運(yùn)用上述抗體用親和純化的方法分離抗原。這樣就能生產(chǎn)具有免疫原性的組份。
在另一實(shí)施例中，本發(fā)明還包括應(yīng)用上述的抗原來制成疫苗。
本發(fā)明也包括一個(gè)檢測(cè)和診斷結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌的方法，具體通過標(biāo)記結(jié)合在人類結(jié)腸癌相關(guān)抗原上生物單抗或嵌合抗體。
在另一實(shí)施例中，本發(fā)明也包括可以選擇性地鑒定結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌的試劑盒。
圖表的簡(jiǎn)要描述

圖1是一個(gè)Hollinshead“疫苗“的HPLC洗脫液特征圖象的記錄圖形，所謂的“疫苗“是指一個(gè)部分純化的結(jié)腸癌細(xì)胞膜的提取物。
圖2是一個(gè)結(jié)腸癌相關(guān)抗原的HPLC洗脫液的記錄圖形，這個(gè)抗原是通過對(duì)圖1中峰4內(nèi)的物質(zhì)進(jìn)行親和純化所得到的。
圖3的圖象描述單抗31.1在異體移植了人類腫瘤LS-174T后的裸鼠體內(nèi)的生物分布。
圖4則是單抗33.28在異體移植了人類腫瘤LS-174T后的裸鼠體內(nèi)的生物分布圖象。
最佳實(shí)施例的說明本發(fā)明提供了抗體，包括單抗和嵌合抗體，這些抗體特異性地能結(jié)合具有免疫原性的人類結(jié)腸癌相關(guān)抗原(CCAA)，這些抗原是天然的蛋白。這些抗體用于診斷和治療已經(jīng)患有或正在生成結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌的病人。
此項(xiàng)發(fā)明不僅僅提供了鼠單抗，而且還有由同一個(gè)單抗的V區(qū)所組成的嵌合抗體，它同樣能夠識(shí)別CCAA區(qū)段。
這里的“區(qū)段“是指能被抗體識(shí)別并結(jié)合的那部分分子。通常，區(qū)段由具有化學(xué)活性的界面分子簇所構(gòu)成，比如氨基酸、糖鏈，這些分子有著特殊的三維結(jié)構(gòu)和特殊的電荷特性。本發(fā)明所關(guān)注的區(qū)段由氨基酸構(gòu)成。
這里的“抗原“是指能夠被一個(gè)抗體結(jié)合的分子或部分分子，它們還能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生能結(jié)合到其自身區(qū)段上去的抗體。一個(gè)抗原可以含有一個(gè)或一個(gè)以上區(qū)段。上述的反應(yīng)是高度選擇性的，抗原只能與相關(guān)的抗體反應(yīng)。
這里的“抗體“是包括完整的免疫球蛋白分子、及它的片段和衍生物，例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv，它們都能與抗原結(jié)合。這些抗體片段缺少完整抗體的Fc片段，在血液中清除較快，而且比其他完整抗體少了非特異性組織結(jié)合(Wahl et al.，J.Nucl.Med.24316-325(1983))。這些片段都是應(yīng)用很成熟的方法從完整的抗體上剪切下來的，比如應(yīng)用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶就能分別得到Fab和F(ab′)2片段。
一個(gè)抗體的″衍生物″包含非蛋白結(jié)構(gòu)的化學(xué)組分。蛋白的共價(jià)修飾包含于這發(fā)明中。通過使抗體的靶氨基酸殘基與能和選擇的側(cè)鏈或末端殘基作用的有機(jī)衍生物發(fā)生反應(yīng)，此類修飾即可引入分子內(nèi)。例如，雙功能藥物的衍生對(duì)抗體或片段與非水溶性支持物或其它大分子載體的連接非常有用。
″疫苗″是指一類用于刺激生物的免疫系統(tǒng)來提供對(duì)抗未來感染藥物侵害的免疫防護(hù)的藥物，本發(fā)明預(yù)期的疫苗對(duì)病人的給藥可以采用任何已知或標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。這些包括口服，腸插管或支氣管-鼻噴霧。其他投藥方法，如使微生物達(dá)到人或動(dòng)物血流的靜脈注射，在微生物載體不能復(fù)制時(shí)是可接受的。
本發(fā)明的抗體是新穎的。它們是第一個(gè)已知的單克隆抗體(mAb)，并且是針對(duì)人體內(nèi)腫瘤抗原致免疫性的CCAA特異性的嵌合抗體?，F(xiàn)有發(fā)明的抗體識(shí)別的抗原可誘發(fā)結(jié)腸癌、乳腺癌和卵巢癌病人的免疫反應(yīng)，但對(duì)其它類型的癌癥病人無反應(yīng)。這些抗原的免疫原性主要表現(xiàn)為細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性，并可通過以下方法檢測(cè)體內(nèi)延遲皮膚過敏分析(″皮膚測(cè)試″)或?qū)w外各種特異性淋巴細(xì)胞反應(yīng)的分析，如淋巴細(xì)胞增殖或轉(zhuǎn)移抑制分析。關(guān)于免疫原性的普通原則和各種特異性免疫反應(yīng)的分析參見下列查考文獻(xiàn)Roitt，I.，Essential Immunology，6th Ed.，Blackwell ScientificPublications，Oxford(1988)；Roitt，I.et al.，Immunology，C.V.Mosby Co.，St.Louis，MO91985)；Klain，J.，Immunology，Blackwell ScientificPublications，Inc.，Cambridge，MA(1990)；Klain，J.，Immunology；The Scienceof Self-Nonself Discrimination，John Wiley & Sons，New York，NY(1982)；Paterson，P.Y.，Textbook of Immunopathology，Grune and Stratton，NewYork，(1986).
在一最佳實(shí)施例中，本發(fā)明抗體是鼠源單克隆抗體指定為33.28。在另一最佳實(shí)施例中，抗體是鼠源單克隆抗體指定為31.1。在再一個(gè)最佳實(shí)施例中，抗體是識(shí)別由33.28確認(rèn)的表位的嵌合抗體。在另再一實(shí)施例中，抗體是識(shí)別由31.1確認(rèn)的表位的嵌合抗體。
本發(fā)明的嵌合抗體包含不同免疫球蛋白(Ig)的重鏈(H)和輕鏈(L)。嵌合H鏈包含一個(gè)來自特異性對(duì)由33.28或31.1識(shí)別的表位的非人體抗體的H鏈的抗原結(jié)合區(qū)，它至少與人體H鏈C區(qū)一部分連接(CH)。
一個(gè)最佳的嵌合L鏈包含一個(gè)來自33.28或31.1的單克隆抗體的L鏈的抗原結(jié)合區(qū)，它至少與人體L鏈C區(qū)的一部分連接(CL)。
或者，一個(gè)最佳的嵌合H鏈包含一個(gè)來自33.28或31.1的單克隆抗體的L鏈的抗原結(jié)合區(qū)，它至少與人體L鏈C區(qū)的一部分連接(CL)。
文中的術(shù)語(yǔ)″抗原結(jié)合區(qū)″是指抗體分子中與抗原作用，并提供抗體特異性和抗原親和性的氨基酸殘基部分。抗體區(qū)域包括對(duì)維持抗原結(jié)合殘基的適當(dāng)構(gòu)型而必需的″框架″氨基酸殘基。
文中的術(shù)語(yǔ)″嵌合抗體″包括單價(jià)、二價(jià)或多價(jià)免疫球蛋白。一個(gè)單價(jià)嵌合抗體是由通過二硫鍵連接的嵌合H和L鏈組成的二聚體。一個(gè)二價(jià)嵌合抗體是由兩個(gè)至少通過一個(gè)二硫鍵連接的HL二聚體構(gòu)成的四聚體。同樣也可獲得多價(jià)嵌合抗體，例如，通過H鏈C區(qū)的聚合(如，IgMH或μ鏈)。
本發(fā)明也提供mAb或嵌合抗體的衍生物。它包括由為產(chǎn)生功能類似于Ig片段的分子類型而截短或修飾的基因所編碼的蛋白。這種修飾包括加入編碼細(xì)胞毒蛋白如植物和細(xì)菌毒素的基因序列，但不局限于此。這些片斷和衍生物可來源于原核和真核宿主，類似本文中描述的重組方式。它們可來源于化學(xué)過程，如完整Ig分子的蛋白切割，或文獻(xiàn)中講述的其它化學(xué)修飾或衍生方式。此類衍生組分可提高溶解性、吸收率、生物半衰期和其它有益特性，同樣也可選擇地消除或減弱抗體蛋白的任何有害副作用。能夠產(chǎn)生此類作用的組分已有報(bào)道。(見文獻(xiàn)Remington′s PharmaceuticalSciences，16 th ed.，Hack Publishing Co.，Easton，PA(1980))。
具有相同或不同V區(qū)結(jié)合特異性的嵌合H和L鏈的抗體、片段或衍生物可通過不同多肽鏈的連接來制備(見文獻(xiàn)Sear等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72353-357(1975))。通過這種方法，表達(dá)嵌合H鏈(或其衍生物)的宿主與表達(dá)嵌合L鏈(或其衍生物)的宿主進(jìn)行分別培養(yǎng)，在培養(yǎng)基質(zhì)中鏈自發(fā)連接，然后恢復(fù)裝配的Ig、片段或衍生物。
產(chǎn)生對(duì)CCAA特異的mAb的小鼠雜交瘤細(xì)胞，如本發(fā)明的33.28和31.1的mAb，是通過小鼠融合配偶體細(xì)胞，如SP2/0細(xì)胞，與CCAA免疫化小鼠的脾臟細(xì)胞融合而成。
小鼠可通過含有目的抗原的粗或半純制備物免疫化，如Hollinsheed″疫苗″是半純化的結(jié)腸癌細(xì)胞膜制備物。為使小鼠免疫化，可采用多種傳統(tǒng)方法。例如小鼠可接受抗原制備物的基本和激發(fā)(boosting)免疫法。
細(xì)胞融合可通過免疫領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)程序完成(見文獻(xiàn)Kohler andMilstain，Nature 256495-497(1975)and美國(guó)專利No.4,376,110；Hartlow，E.et al，supra；Campbell，A.，″Monoclonal Antibody Techology″InLaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology，Volume 13(Burdon，R.，et al，eds.)，Elsevier，Amsterdam(1984)；Kennett et al.，Monoclonal Antibodies(Kennett et al.，eds.pp.365-367，Plenum Press，NY，1980)；da St.Groth，S.F..et al.，J.Immunol.Meth.35；1-21(1980)；Galfre，G.，et al.，Methods Enzymol.733-46(1981)；Goding，J.W.1987，Monoclonal Antibodies；Principles andPractice，2nd ed.Academic Press，London，1987)。
融合配偶體細(xì)胞系和融合、選擇雜交瘤細(xì)胞以及篩選mAb的方法已很成熟。(見文獻(xiàn)Hartlow，E.et al.，Supra；Kawamoto，T.etal，Meth.Enzymol.121266-277(1986)；Keamey，J.F.et al.，J.Immunol.1231548-1550(1979)；Kilmartin，J.V.et al，J.Cell Biol.93576-582(1982)；Kohler，G.et al.，Eur.J.Immunol.6292-295(1976)；Lane，D.P.et al.，J.Immunol.Meth.47303-307(1981)；Mueller，U.W.et al.，J.Immunol.Meth.87193-196(1986)；Pontacorvo，G.，Somatic Cell Genet.1397-400(1975)；Sharo.J.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 761420-1424(1979)；SHulman，M.et al，Nature276269-270(1978)；Springer，T.A.(ed)，Hybridoma Techology in theBiosciences and Medicine，Plenum Press，New York，1985；and Taggart，R.T.et al.，Science 2191228-1230(1982)).
本發(fā)明的mAb可通過以下方法大量制備向小鼠腹腔注射分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞，適當(dāng)時(shí)間之后，收集含有高效價(jià)mAb的腹水，并分離mAb?；蛘?，可通過體外培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞并從細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)中分離mAb。
編碼本發(fā)明嵌合抗體的C區(qū)的人體基因來源于表達(dá)、產(chǎn)生人體Ig的細(xì)胞。人體H鏈C區(qū)可來源于任何已知種類或同型的人體H鏈，包括γ，μ，α，δ或θ。由于H鏈類型負(fù)責(zé)抗體的多種效應(yīng)功能，選擇H鏈C區(qū)應(yīng)受目的效應(yīng)功能的指導(dǎo)，如補(bǔ)體固定或抗體依賴性細(xì)胞毒性。理想的H鏈C區(qū)來源于γ1(IgG1)，γ3(IgG3)，γ4(IgG4)和μ(IgM)。
人體L鏈C區(qū)可來源于人體同型L鏈，卡巴或λ。
編碼人體IgC區(qū)的基因可通過標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)從人體細(xì)胞中獲得(Sambrook.J.et al，Molecular cloning；A Laboratory Manual，2 nd Edition，Cold Spring Harbor，Press，Cold Spring Haxbor，NY(1989))。人體C區(qū)基因存在于知表達(dá)兩類L鏈和五類H鏈的基因克隆中。嵌合抗體片段，如F(ab′)2和Fab，可通過設(shè)計(jì)經(jīng)適當(dāng)截短的嵌合H鏈基因而獲得，例如，編碼F(ab′)2片段H部分的嵌合基因包括編碼CH1區(qū)和H絞鏈區(qū)的DNA序列，尾隨一個(gè)翻譯終止密碼子以產(chǎn)生截短的分子。
通常，現(xiàn)有發(fā)明的嵌合抗體是通過克隆編碼CCAA特異性抗體的H和L鏈抗原結(jié)合區(qū)的DNA片段而制備，優(yōu)先是非人體基因，最佳的是33.28或31.1中的基因，然后把這些片段同編碼人體H鏈C區(qū)和L鏈C區(qū)的DNA片段相連，以制備編碼嵌合Ig的基因。
因此，在一最佳實(shí)施例中，創(chuàng)造的融合基因至少編碼一個(gè)非人體起源的Ag結(jié)合區(qū)，如帶有連接片段(J)的功能重排的V區(qū)，并且至少與一個(gè)編碼部分人體C區(qū)的第二DNA片段相連。這種融合可應(yīng)用PCR完成如由Temando等所報(bào)道的(見文獻(xiàn)Miami Symp.Short Reports 388，1993)。
編碼抗體結(jié)合區(qū)的DNA可以是基因組DNA或cDNA。選取染色體基因片段作為編碼小鼠V區(qū)抗原結(jié)合片段的DNA源的一種方便選擇就是應(yīng)用cDNA構(gòu)建嵌合Ig基因(見文獻(xiàn)Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 843439(1987)和J.Immunology 1393521(1987))。cDNA的應(yīng)用要求適合于宿主細(xì)胞的基因表達(dá)元素應(yīng)與基因結(jié)合，以獲得目的蛋白的合成。應(yīng)用cDNA序列比基因組序列(含內(nèi)含子)更有利，因?yàn)閏DNA序列可在缺少適當(dāng)RNA剪接系統(tǒng)的細(xì)菌或其它宿主中表達(dá)。
因此，在應(yīng)用編碼抗體V區(qū)的cDNA方式中，制備嵌合抗體的方法可概括為如下幾步1.從產(chǎn)生mAb的細(xì)胞系中分離mRNA，克隆和cDNA產(chǎn)物來源于此。
2.以純化mRNA制備全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，從中適當(dāng)?shù)腖和H鏈的V區(qū)基因片段可以(I)以適當(dāng)探針鑒定；(II)測(cè)序；(III)與C區(qū)基因片段匹配。
3.由cDNA制備物和克隆制備C區(qū)基因片段。
4.如上所述，通過連接克隆的特異V區(qū)基因和克隆的人體C區(qū)基因，可構(gòu)建編碼完整的H或L鏈的序列。
5.在選擇的宿主中，包括原核和真核細(xì)胞，表達(dá)和制備嵌合L和H鏈。
所有IgH和L基因及它們編碼的mRNA的一個(gè)共同特征就是J區(qū)。H和L鏈的J區(qū)有不同的序列，但序列同源性較高(＞80％)，尤其在C區(qū)附近。此同源性在這種方法中得到了應(yīng)用，并且H和L鏈的J區(qū)的相同序列可用來設(shè)計(jì)寡核苷酸引物，用于在J區(qū)中引入有用的限制位點(diǎn)，以便以后V區(qū)片段與人體C區(qū)片段的連接。
從人體細(xì)胞中制備的C區(qū)cDNA載體可經(jīng)定位誘變?cè)谌梭w序列的相似位置加入限制位點(diǎn)。例如，人們可克隆完整的人體卡巴鏈C區(qū)和完整的人體γ-1C區(qū)。在這種情況下，以基因組C區(qū)克隆作為C區(qū)載體源的其它方法，不能使這些基因在缺乏清除插入序列的必需酶的細(xì)菌系統(tǒng)中表達(dá)?？寺〉腣區(qū)片段被剪出并連接于L或H鏈的C區(qū)載體?；蛘?，人體γ-1C區(qū)可如此修飾引入終止密碼子，進(jìn)而產(chǎn)生編碼Fab分子的H鏈部分的基因序列。這樣，帶有V和C區(qū)的編碼序列可轉(zhuǎn)移入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，用來在適當(dāng)?shù)乃拗魅缭撕驼婧思?xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。
如果連接導(dǎo)致一個(gè)連續(xù)地可翻譯序列，而沒有改變或中斷三聯(lián)子閱讀框架，兩個(gè)DNA編碼序列可稱為是″可操作地連接″。如果此連接導(dǎo)致基因表達(dá)元素的正常功能，從而使DNA編碼序列表達(dá)，那么此DNA編碼序列就被可操作地連接于該基因表達(dá)元素了。
表達(dá)載體包括質(zhì)粒或其它載體。其中較佳的是攜帶含恰當(dāng)嵌入限制位點(diǎn)的功能完整的人體H或L鏈C區(qū)序列的載體，以便任何帶有適當(dāng)粘性末端的H或L鏈V區(qū)序列可輕易地插入。這樣，含人體H或L鏈C區(qū)序列的載體就作為在任何適當(dāng)宿主中表達(dá)任何目的完整H或L鏈的中間物。
典型地，小鼠-人體抗體可從構(gòu)建物中天然的小鼠H和L鏈V區(qū)的染色體基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因來合成；剪接通常出現(xiàn)于小鼠J區(qū)的剪接供點(diǎn)和人體C區(qū)前剪接受點(diǎn)之間；也可出現(xiàn)于人體H鏈C區(qū)內(nèi)剪接區(qū)域之間；聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止發(fā)生于人體天然染色體編碼區(qū)位點(diǎn)的下游。
對(duì)cDNA基因表達(dá)有用的基因表達(dá)元件包括(a)病毒轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和它們的增強(qiáng)子元件，如SV40早期啟動(dòng)子((見文獻(xiàn)OkayamaH.et al，Mol.CellBiol.3280(1983))，魯氏肉瘤病毒LTR(見文獻(xiàn)Gorman.C，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 796777(1982))和Moloney小鼠白血病病毒LTR(見文獻(xiàn)Grosschedd，R.et al，Cell 41885(1985))。(b)衍生于SV40晚期區(qū)域的剪接區(qū)域和聚腺苷酸化位點(diǎn)(見文獻(xiàn)Okayama等，參見前述)。(c)聚腺苷酸化位點(diǎn)，如SV40內(nèi)(見文獻(xiàn)Okayama等，參見前述)。
Ig cDNA基因可如此表達(dá)(見文獻(xiàn)Liu等，參見前述，及Weidle等，Gene 5121(1987)))以SV40早期啟動(dòng)子及其增強(qiáng)子，小鼠IgH鏈啟動(dòng)子的增強(qiáng)子，SV40晚期區(qū)域mRNA剪接，兔β-珠蛋白插入序列，Ig和兔β-珠蛋白聚腺苷酸化位點(diǎn)和SV40聚腺苷酸化位點(diǎn)作為表達(dá)元件。對(duì)于由部分cDNA，部分基因組DNA組成的Ig基因(見文獻(xiàn)Whittle等，Protein Engineering 1499(1987))，轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子可以是人體″CMV″，衍生于CMV和小鼠/人Ig啟動(dòng)子的增強(qiáng)子，或衍生于天然染色體Ig序列的mRNA剪接和聚腺苷酸化區(qū)。
在一實(shí)施例中，為了在嚙齒類細(xì)胞內(nèi)表達(dá)cDNA，轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子是病毒LTR序列，轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的增強(qiáng)子或是小鼠IgH鏈增強(qiáng)子，或是病毒LTR增強(qiáng)子，剪接區(qū)是包含大于31bp的內(nèi)含子，并且聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)來自對(duì)應(yīng)于合成Ig鏈的天然染色體序列。在其它方式中，編碼其它蛋白的cDNA序列結(jié)合于上述表達(dá)元件，以獲得哺乳細(xì)胞中蛋白的表達(dá)。
每個(gè)融合基因裝配或插入于一個(gè)表達(dá)載體，然后用一個(gè)編碼嵌合H或L鏈的基因進(jìn)行單獨(dú)轉(zhuǎn)染能夠表達(dá)嵌合Ig鏈基因產(chǎn)物的受體細(xì)胞；或者用一個(gè)編碼嵌合H和L鏈的基因共同轉(zhuǎn)染。在允許摻入基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞，并從培養(yǎng)物中恢復(fù)表達(dá)的Ig鏈、完整抗體或片段。在實(shí)施例中，編碼嵌和H和L鏈的融合基因或其部分，裝配于不同的表達(dá)載體，再用來共同轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞。
每個(gè)載體可包含兩個(gè)選擇基因，一個(gè)用于細(xì)菌系統(tǒng)的選擇，另一個(gè)用于真核系統(tǒng)的選擇，因此每個(gè)載體具有不同對(duì)基因。這個(gè)策略產(chǎn)生了細(xì)菌系統(tǒng)內(nèi)融合基因的指導(dǎo)生產(chǎn)、允許擴(kuò)增的載體。進(jìn)而，此類在細(xì)菌宿主中制備和擴(kuò)增的基因可用于共同轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，并允許攜帶目的轉(zhuǎn)染基因的共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的選擇。
在細(xì)菌系統(tǒng)中可以選擇使用的基因有抗氨芐青霉素基因和抗氯霉素基因。在真核轉(zhuǎn)染中選擇的基因以黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(gpt)和Tn5磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(neo)為好。選擇表達(dá)gpt的細(xì)胞的依據(jù)是這一基因所編碼的酶以黃嘌呤作為底物來合成嘌呤核苷酸，而同類的內(nèi)源性的酶則不然。在含有霉酚酸的培養(yǎng)基上，單磷酸次黃嘌呤無法轉(zhuǎn)化為單磷酸黃嘌呤和黃嘌呤，只有表達(dá)了gpt的細(xì)胞方可存活。neo的產(chǎn)物阻止了G418和新霉素類抗生素對(duì)蛋白質(zhì)合成的抑制作用。
這二種方法可同時(shí)選用亦可順序進(jìn)行以使免疫球蛋白鏈基因由二種不同的DNA載體介導(dǎo)進(jìn)入真核細(xì)胞表達(dá)。但真核細(xì)胞不需要不同的選擇標(biāo)記。一條H鏈載體和一條L鏈載體各有一個(gè)同樣的選擇標(biāo)記，可以同時(shí)轉(zhuǎn)染。篩選出未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞后，克隆的大部分將包含完整的含H和L鏈載體的拷貝。
或者，編碼嵌合性H和L鏈的融合基因可能裝配在同一表達(dá)載體上。
對(duì)于表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染和嵌合性抗體的產(chǎn)生，受轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系以骨髓瘤細(xì)胞優(yōu)先。骨髓瘤細(xì)胞可以合成、聚集和分泌有轉(zhuǎn)染的免疫球蛋白基因編碼的免疫球蛋白并具備使免疫球蛋白糖基化的機(jī)制。而特別優(yōu)先的受轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系是Ig-non-producing骨髓瘤細(xì)胞SP2/0(ATCC #CRL 8287)。SP 2/0只產(chǎn)生轉(zhuǎn)染的基因編碼的免疫球蛋白。骨髓瘤細(xì)胞可培養(yǎng)獲得，或接種于小鼠的腹腔中生長(zhǎng)，分泌的免疫球蛋白可以從腹水中獲得。其它合適的受轉(zhuǎn)染細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞比如人或非人類來源的B淋巴細(xì)胞，人類或非人類來源的雜交瘤細(xì)胞，或種間的異種雜交瘤細(xì)胞。
本發(fā)明的攜帶嵌合抗體的表達(dá)載體可用不同的方法導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞。這些方法包括生物化學(xué)方法，如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、連接，原生質(zhì)融合、鈣磷酸沉淀法，多價(jià)陽(yáng)離子試劑法，如二乙胺乙基葡聚糖(DEAE)，及其它的物理機(jī)械法，如電穿孔法、直接微量注射法和微投射物轟擊法(Johnston etal，Scence 2401538(1988)).將DNA導(dǎo)入淋巴細(xì)胞的較好的方法是電穿孔法(Dotter et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 817161(1984)；Yoshikawa，K etal，Jan.J.Cancer Res.771122-1133)。在這過程中，DNA在電脈沖下?lián)饺胧苻D(zhuǎn)染細(xì)胞。一般在轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞要在完全培養(yǎng)基中恢復(fù)24小時(shí)，然后接種于96孔培養(yǎng)板的選擇性培養(yǎng)基中。G418篩選的濃度為0.4-0.8mg/ml。霉酚酸篩選使用6ug/ml的濃度加0.25mg/ml黃嘌呤。電穿孔技術(shù)可使SP2/0細(xì)胞的轉(zhuǎn)染頻率達(dá)10-5至10-4.在原生質(zhì)融合方法中，溶菌酶被用來剝離含有嵌合抗體基因的重組質(zhì)粒的有粘膜炎的細(xì)胞壁。在聚乙二醇作用下，原生質(zhì)球體與骨髓瘤細(xì)胞融合。
本發(fā)明的嵌合性免疫球蛋白基因也可在哺乳動(dòng)物非淋巴細(xì)胞或其它真核細(xì)胞中表達(dá)，如酵母菌，或在原核細(xì)胞、在特定的細(xì)菌中表達(dá)。
酵母菌對(duì)免疫球蛋白H和L鏈的產(chǎn)生具有重要的優(yōu)越性。它可進(jìn)行翻譯后肽修飾反應(yīng)，包括糖基化。許多重組DNA的方法的出現(xiàn)即利用增強(qiáng)啟動(dòng)子序列和高拷貝數(shù)質(zhì)粒，這樣可用在酵母菌中獲得所需的蛋白質(zhì)。酵母菌可識(shí)別克隆的哺乳動(dòng)物基因產(chǎn)物的前導(dǎo)序列并分泌含有前導(dǎo)序列的肽(如前肽〕(Hitziman，et al，11th International Conference on Yeast，Geneticsand Molecular Biology，Montpeller，F(xiàn)rance，Setember 13-17，1982)通常酵母菌的基因表達(dá)系統(tǒng)的好壞可從產(chǎn)物的水平、分泌的情況、嵌合H和L鏈蛋白和嵌合抗體的穩(wěn)定水平來判斷。任何一種結(jié)合了啟動(dòng)基因和終止因子的酵母基因表達(dá)系統(tǒng)都可使用。這些啟動(dòng)基因和終止因子是從在富含葡萄糖的培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)的酵母菌產(chǎn)生的活躍表達(dá)的編碼糖酵解酶的基因中得來的。已知的糖酵解基因也可提供有效的轉(zhuǎn)譯控制信號(hào)，例如，可使用磷酸甘油激酶(CPK)的基因的啟動(dòng)基因和終止因子。許多手段可用來判斷選擇在酵母中克隆的免疫球蛋白cDNA的最佳表達(dá)質(zhì)粒。(參見Glover，D.M.ed.，DNA Cloning，Vol II pp.45-66，IRL Press，1985)細(xì)菌菌株可用來作為生產(chǎn)本發(fā)明所描述的抗體分子或抗體片段的宿主。E.Coli K12菌株如E.Coli W3110(ATCC 27325)和其它的腸桿菌株如Selmonella typhimurium或Serratia Marcascery和各種假單胞桿菌屬都可利用。
含有來自與宿主細(xì)胞種類相配的復(fù)制子和控制序列的質(zhì)粒載體用來與這些細(xì)菌宿主連接。載體帶有復(fù)制位點(diǎn)和能提供表型選擇能力的特定基因。細(xì)菌中由克隆的免疫球蛋白cDNA編碼的嵌合抗體或抗體鏈的產(chǎn)生的表達(dá)質(zhì)粒的評(píng)價(jià)可由多種方法完成。(參見Glover，D.M.ed.；DNACloning，Vol I，IRL Press，1985)。
其它優(yōu)先使用的宿主是可以在體內(nèi)、體外生長(zhǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞提供對(duì)免疫球蛋白分子的翻譯后的修飾，其中包括先導(dǎo)肽的除去、折疊以及H鏈和L鏈r-糖基化抗體分子的裝配，功能性抗體蛋白的分泌。
除了以上提及的淋巴來源的細(xì)胞外，能用來作為宿主生產(chǎn)抗體蛋白的哺乳類細(xì)胞包括一些成纖維細(xì)胞來源的細(xì)胞，如Vero.(ATCC CRL 81)CHO-Ki(ATCC CRL 61).
在哺乳類細(xì)胞內(nèi)表達(dá)已克隆的H鏈、L鏈的載體系統(tǒng)有許多。(參見Glover，D.M.ed.，DNA Cloning.Vol.II pp.143-238，IRL Press，1985)不同的途徑都能得到完整的H2L2抗體。正如前面所述，完全可以在同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)共同表達(dá)H鏈、L鏈，并使之在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合從而得到完整的四聚體的H2L2抗體。在同一宿主細(xì)胞內(nèi)，無論使用相同或不同的質(zhì)粒都能得到共同表達(dá)。編碼H鏈、L鏈的基因可以放在一個(gè)質(zhì)粒中，然后在轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，最后表達(dá)。另外一種方法是編碼一條鏈的質(zhì)粒，如L鏈，首先轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，然后帶有第二個(gè)特殊標(biāo)志并編碼H鏈的質(zhì)粒再轉(zhuǎn)染到這些細(xì)胞內(nèi)。無論用那一種途徑，都能得到H2L2分子。另外，在質(zhì)粒上再增加編碼一些因子的話，得到的H2L2分子還將具有諸如高產(chǎn)量、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。
除了單抗與嵌合抗體之外，本發(fā)明還能生產(chǎn)專門針對(duì)單抗與嵌合抗體的可變區(qū)(V)的抗Id抗體。一個(gè)抗Id抗體是專門識(shí)別與另一個(gè)抗體的抗原結(jié)合區(qū)有關(guān)的專一性決定簇的抗體，如代號(hào)為33.28的抗CCAA的抗體就稱為獨(dú)特型或Id抗體。通過用Id抗體或抗原結(jié)合物免疫與其具有相同種屬和基因型的動(dòng)物，就能得到抗Id抗體。也可進(jìn)一步用抗Id抗體作為免疫原去免疫另一個(gè)動(dòng)物，從而得到抗-抗Id抗體的動(dòng)物。其實(shí)這種抗-抗Id抗體相同于原來誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗Id抗體的抗體。這樣，通過使用針對(duì)單抗獨(dú)特位的抗體，就可能區(qū)分表達(dá)相同特異性的抗體的其它克隆。
因此，本發(fā)明的單抗和嵌合抗體可以用來在適合的動(dòng)物中誘導(dǎo)抗Id抗體，如BALB/C小鼠。這些免疫了的小鼠的脾細(xì)胞可以用來產(chǎn)生抗Id雜交瘤進(jìn)而分泌抗Id單抗。接著將抗Id單抗整合在一個(gè)載體(如KIH)上，并用來免疫另外的BALB/c小鼠；最后，這種小鼠的血清中就含有抗-抗Id抗體，這種抗體能特異性結(jié)合到最初的單抗的CCAA段。
本發(fā)明的抗體以及它們的抗原結(jié)合片段及衍生物可以具有多種診斷、監(jiān)測(cè)和治療癌癥的功能，包括結(jié)腸癌、乳癌和卵巢癌。這些用途都由Schlom，J.總結(jié)于Cancer Res.463225-3238(1986)。
當(dāng)它們被用來作為診斷時(shí)，本發(fā)明抗體可以在免疫診斷中檢查體液諸如血清、尿液、腦脊液、痰、滲出液中有無CCAA的存在。如果用適當(dāng)?shù)拿庖邩?biāo)記物標(biāo)記后，這些抗體也可以用來掃描或免疫成象以確定原發(fā)癌和轉(zhuǎn)移癌的位置，甚至于可以用來確定有癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)。
本發(fā)明的抗體也適用于免疫病理分析。比如腫瘤分化的診斷，以及依據(jù)CCAA表達(dá)的腫瘤的亞型的分析，這種判斷對(duì)于預(yù)測(cè)腫瘤的轉(zhuǎn)移可能性、治療結(jié)果及預(yù)后都是非常重要的。
特別值得一提的是，由于本發(fā)明的單抗和嵌合抗體的特異性便能夠確定出正在生長(zhǎng)的異源性腫瘤中細(xì)胞的不同類型。通過流式細(xì)胞儀的方法可以應(yīng)用這些抗體來確定組成腫瘤的腫瘤細(xì)胞的種類和交叉配對(duì)。這在手術(shù)和治療前進(jìn)行。運(yùn)用本發(fā)明的抗體以及其它的單抗來確定腫瘤細(xì)胞的亞型是指A哪一種抗原制劑最適合得到特異性活度高的免疫治療。B哪一種單抗或嵌合性抗體對(duì)ADCC是有效驗(yàn)的。C哪種抗體或單抗的組合最適用于預(yù)測(cè)治療后的病人是否會(huì)有復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)。
除了診斷應(yīng)用外，通過監(jiān)測(cè)體液中CCAA的存在，腫瘤的放射成象，或者通過檢測(cè)淋巴結(jié)和骨髓活檢、體液細(xì)胞、轉(zhuǎn)移的呼出細(xì)胞，本發(fā)明的抗體也適用于監(jiān)測(cè)病程的發(fā)展。
綜合本發(fā)明抗體的治療途徑，包括1.直接的細(xì)胞毒性途徑，這包括通過補(bǔ)體CDC或者效應(yīng)細(xì)胞ADCC的兩種途徑；2.與抗腫瘤藥物、毒素、放射性核素連接。在體外實(shí)驗(yàn)中，這些抗體能夠除去血液循環(huán)和骨髓中的腫瘤細(xì)胞。
所有這些方法將在以下的章節(jié)中詳細(xì)描述。學(xué)習(xí)并掌握這里所提供的方法介紹，具有一般實(shí)踐水平的人也將能夠知道，在診斷、監(jiān)測(cè)和實(shí)際的治療實(shí)踐中，如何使用本發(fā)明的抗體。
本發(fā)明最適用的動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，這里指的是哺乳綱的生物體。尤其適用于人類。
這里所謂的“治療”是指當(dāng)治療對(duì)象用了我們的抗體片段或衍生物，用于預(yù)防、緩解和治愈結(jié)腸癌、乳癌和卵巢癌。
本發(fā)明的抗體的所有藥物成份都是有助于達(dá)到一定的醫(yī)療目的的。具備常規(guī)的治療結(jié)腸癌、乳癌和卵巢癌以及有關(guān)疾病的臨床技能，就可以掌握這些抗體片段、衍生物的劑量和治療方案。例如，可以通過非腸道途徑、皮下、靜脈、肌肉、腹腔、經(jīng)皮和頰部給藥。除此以外，可以單獨(dú)或同時(shí)進(jìn)行口服，而給藥劑量則取決于患者的年齡、健康狀況、體重、有無合并用藥、治療頻率、期望的療效等因素。
本發(fā)明的范圍的組成是由所有這些抗體片段、衍生物所組合的方式所決定的，而這取決于所要達(dá)到的治療目的。當(dāng)個(gè)別病人調(diào)整藥物組成時(shí)，可以在技術(shù)允許范圍內(nèi)決定各有效成份量的最適范圍。有效劑量是特定的嵌合性或單克隆抗體所結(jié)合的其它治療成份的存在和性質(zhì)、病人的臨床狀況綜合的結(jié)果。這一有效劑量可以在10ng/kg-100mg/Kg體重范圍內(nèi)變動(dòng)。最好是在0.1-10mg/Kg體重范圍內(nèi)。
除了有藥理活性的成份外，新的藥物化學(xué)組成可以包括適當(dāng)?shù)乃幬锘瘜W(xué)載體，這其中包括賦形劑、佐劑。因?yàn)檫@些賦形劑和佐劑能加速活性成份制劑化過程。制劑中有效成份和賦形劑的含量在0.01％-99％范圍內(nèi)，最好是20％-75％。
本發(fā)明適用于腸道給藥的抗體、抗體片段、衍生物制劑，無論是一種可檢測(cè)的標(biāo)記形式、結(jié)合形式或非結(jié)合形式，均可包括無菌的水性溶液、非水性溶液、懸濁液和乳劑。水溶液有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，以及可注射的有機(jī)酯如油酸乙酯，水性載體包括水、乙醇/水溶液、乳劑或懸濁液，這些載體中都含有鹽、緩沖介質(zhì)，非腸道途徑載體則包括NaCl溶液、右旋糖林格氏液、右旋糖和氯化鈉、乳酸鹽林格氏液或固定油類，靜脈內(nèi)注射劑的載體主要有液體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑組成，它們往往是在右旋糖林格氏液的基礎(chǔ)上制成的，當(dāng)然防腐劑和其它的添加劑也是必不可少的，比如抗微生物成份、抗氧化劑、螯合成份、惰性氣體等，具體請(qǐng)看Remington′s Pharmaceutical Science，16th ed.，Mack Publishing Co.，Easton.PA.1980.
本發(fā)明的抗體、抗體片段及其衍生物也有助于治療已經(jīng)存在或正在發(fā)展中的結(jié)腸癌、乳癌和卵巢癌，這種治療是通過非腸道途徑給予單劑量或多劑量的抗體、抗體片段或衍生物或者是綴合物。
本發(fā)明的抗體之所以能發(fā)揮治療效用，是由于它們能夠?qū)鼓切┯蠧CAA在其表面的細(xì)胞，具體作用是通過介導(dǎo)ADCC和/或CDC來完成的。不管是內(nèi)源性的還是外源性的效應(yīng)細(xì)胞，(對(duì)ADCC)或補(bǔ)體成份(對(duì)CDC)都可以成為抗體發(fā)揮效應(yīng)的手段。
本發(fā)明的抗體、抗體片段、衍生物也可以作為免疫偶合物發(fā)揮治療效用。(參見Dillman，R.O.，Ann.Int Med.111592-603(1989))。它們可以與細(xì)胞毒性蛋白，包括(但不限于這些)Ricin-A，假單胞桿菌毒素，白喉毒素和腫瘤壞死因子偶合。將毒素偶合到抗體或其它配體上的技術(shù)是可行的(見Olsnes，S.et al.，Immunol.Today 10291-295(1989))。植物和細(xì)菌的毒素最能夠破壞蛋白的合成，從而達(dá)到殺死細(xì)胞的目的。
本發(fā)明的抗體還能綴合到其它類型的有治療作用的物質(zhì)中。這些物質(zhì)包括(但不限于這些)診斷用的放射性同位素、細(xì)胞毒性成份(如細(xì)胞毒性放射性核素、藥物和蛋白)。能夠偶聯(lián)于抗體上的并能運(yùn)輸?shù)襟w內(nèi)作用部位的放射性核素例如有212Bi、131I、186Re、90Y(這些還沒有詳盡的列出)。放射性核素能夠在局部通過放射性照射細(xì)胞以達(dá)到其細(xì)胞毒性作用。這也就是一般的放射性治療的機(jī)理。
上面所說的能夠結(jié)合到抗體上的具有治療作用的細(xì)胞毒性藥物包括道諾紅菌素，doxombicin，氨甲蝶呤和絲裂霉素C，但不限于這些。細(xì)胞毒性藥物會(huì)影響許多重要的活動(dòng)，如DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，詳細(xì)可見Goodman，A.C.，et al，Goodman and Gilman′s THE PHARMACOLOGYBASIS OF THERAPEUTICS，7th Ed.，Macmillan Publishing Co.，1985。
本發(fā)明抗體還有一個(gè)優(yōu)勢(shì)，它可以和其它的單克隆抗體、嵌合抗體、淋巴因子、促紅細(xì)胞生成生長(zhǎng)因子等聯(lián)合使用，這物質(zhì)都能增加效應(yīng)細(xì)胞的活力與數(shù)目。
本發(fā)明的抗體、片段及衍生物附著在一個(gè)固體支持物上，能夠從體液組織和細(xì)胞提取物中除去可溶性結(jié)腸癌相關(guān)抗原。在一最佳實(shí)施例中，它們被用于除去血液和血漿中的可溶性腫瘤抗原。在另一最佳實(shí)施例中，抗體被用于體外的免疫吸附裝置中(見Seminars in Hematology，Vol.26(2Suppl.1)(1989))。病人的血液與其它體液經(jīng)過吸附的抗體后，可部分或完全除去循環(huán)中的CCAA(游離的或是免疫復(fù)合物)、包含攜帶CCAA的細(xì)胞，接著將這些體液輸回體內(nèi)。這一免疫吸附的方法可以持續(xù)流動(dòng)的狀態(tài)中完成，可插入或不插入細(xì)胞離心這一步驟。參見實(shí)例Terman.D.S.etal.，J.Immunol.1171971-1975(1976)。
本發(fā)明也提供了上述抗體，片段或是衍生物，都作了檢測(cè)性的標(biāo)記，如下文所述。
本發(fā)明的抗體可用于免疫分析，對(duì)樣品中CCAA或細(xì)胞中CCAA進(jìn)行檢測(cè)或定量。這樣的免疫分析法一般如下，將生物樣品與本發(fā)明的抗體一起溫育，這抗體具有可檢測(cè)的標(biāo)記，能識(shí)別腫瘤抗原；檢出與樣品結(jié)合在一起的標(biāo)記了的抗體。
因此，從這方面考慮本發(fā)明，生物樣品可用硝化纖維素或其它能固定細(xì)胞、細(xì)胞碎片或可溶性蛋白、糖蛋白的固體支持物或載體進(jìn)行處理，再以適當(dāng)?shù)木彌_液沖洗，然后加入本發(fā)明中標(biāo)記過的抗體；再次用緩沖液洗固定相支持物，使未結(jié)合的抗體除去。與固定相支持物結(jié)合的抗體的量可用傳統(tǒng)的方法測(cè)出。
固定相支持物或載體是指任何能與抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)。常用的有玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、天然或人工纖維素、聚乙烯酰胺、瓊脂糖和磁鐵礦(magnetite)。載體的性質(zhì)可以在某種程度上可溶或不溶性的。只要連接的分子能與CCAA或CCAA特異性抗體結(jié)合，支持物的材料可以是任何可能的結(jié)構(gòu)形狀。因此，它可以是如圓珠子般球形的、如同試管的內(nèi)面般圓柱形的、如桿狀物的外表面、紙或試紙般平面的等等。比較適合的支持物有聚苯乙烯珠。熟練的技術(shù)人員還知道其它結(jié)合抗體或抗原的適合的載體，或能用常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定哪種載體是適用的。
同一批抗體的結(jié)合活性可用一些常用方法來確定。熟練的技術(shù)人員可通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)判斷每一項(xiàng)指標(biāo)的操作方法和最佳分析條件。
比較本發(fā)明的抗體的方法之一是將抗體與一種酶連結(jié)，用酶分析法(EIA)或酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)來檢測(cè)，當(dāng)這種酶與底物接觸時(shí)，會(huì)發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生一種可檢測(cè)的化學(xué)物質(zhì)，例如用分光光度計(jì)法、熒光測(cè)定法或可見光法測(cè)定。在一個(gè)補(bǔ)充的實(shí)施例中是將這種酶去標(biāo)記一種本發(fā)明的抗體的配體。這種配體可以是本發(fā)明的抗體的恒定區(qū)與可變區(qū)，諸如異源性抗小鼠免疫球蛋白抗體。另外，結(jié)合配體可以是一個(gè)能與本發(fā)明的抗體結(jié)合的非抗體蛋白，如葡萄球菌蛋白A或鏈球菌蛋白G。
可用以標(biāo)記本發(fā)明的抗體的CCAA特異性抗體，或這些抗體的結(jié)合配體的酶可包括以下列出的，但不僅限于這些蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-類固醇異構(gòu)酶、酵母菌酒精脫氫酶、α-磷酸甘油脫氫酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。
如果對(duì)本發(fā)明的抗體或結(jié)合配體進(jìn)行放射性標(biāo)記，就可以用放射免疫分析法檢測(cè)CCAA(參見Work，T.S.et al，Laboratory Techniques andBiochemistry in Molecular Biology，North Holland Publishing Company，N.Y.(1978)).放射性同位素可用γ-計(jì)數(shù)器或閃爍計(jì)數(shù)器或放射自顯影的方法來檢測(cè)。而應(yīng)用于本發(fā)明的抗體的同位素即是人們所經(jīng)常使用的那些。
熒光復(fù)合物也可用來標(biāo)記抗體或結(jié)合配體。當(dāng)用熒光標(biāo)記過的抗體暴露于一定波長(zhǎng)的光時(shí)，它的存在可因熒光而測(cè)出。最常用的熒光標(biāo)記復(fù)合物有異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、藻青蛋白、異藻青蛋白、鄰苯二醛和熒光胺。
抗體也可用發(fā)射熒光的金屬來標(biāo)記，如152Eu，或其它的鑭系。這些金屬可用金屬螯合劑如DTPA或EDTA連結(jié)到抗體上。
本發(fā)明的抗體也可用結(jié)合化學(xué)發(fā)光復(fù)合物標(biāo)記。標(biāo)記了的抗體在化學(xué)反應(yīng)過程中發(fā)出光，從而被檢測(cè)到。特別常用的一些化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物有魯米諾、魯米諾異構(gòu)體、咪唑、丫啶鹽和草酸酯。
同樣，生物發(fā)光物質(zhì)也可用來標(biāo)記本發(fā)明的抗體，無論是片段還是衍生物。生物發(fā)光物質(zhì)是從生物系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的一種化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，在這一系統(tǒng)中有一種催化蛋白能提高化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效率。生物發(fā)光蛋白的存在由它所發(fā)出的光來確定。用于標(biāo)記的重要的生物發(fā)光復(fù)合物有熒光素、熒光素酶和sequorin。
如果標(biāo)記物是放射性γ射線發(fā)射體，抗體的片段或衍生物的檢測(cè)可通過閃爍計(jì)數(shù)法完成；如果標(biāo)記物是一種熒光物質(zhì)，可通過熒光測(cè)定法；在酶標(biāo)法中，用比色法來完成檢測(cè)，這方法需要一種酶的底物，或者通過與預(yù)先準(zhǔn)備的標(biāo)準(zhǔn)品與底物的酶反應(yīng)程度的比較來檢測(cè)。
原位檢測(cè)需要從病人取得組織學(xué)標(biāo)本，并準(zhǔn)備好標(biāo)本的標(biāo)記了的抗體，或未標(biāo)記的抗體加上標(biāo)記了的結(jié)合配體。通過這樣一個(gè)過程，不僅能檢測(cè)抗原的存在，并且還可了解它在檢測(cè)組織中的分布情況。用本發(fā)明，具有一般技術(shù)的人很容易發(fā)現(xiàn)許多組織學(xué)方法(如染色法)經(jīng)過改良后可用作原位檢測(cè)。這些方法包括例如免疫組織化學(xué)染色法。在一最佳實(shí)施例中，親和素-生物素免疫過氧化物酶染色法能被使用，這種試劑盒在籌劃之中。
用本發(fā)明的單克隆抗體或嵌合抗體制成的試劑盒可用以評(píng)估結(jié)腸癌、乳癌和卵巢癌的免疫組織特性。組織學(xué)研究的結(jié)果是用來評(píng)價(jià)表達(dá)單抗31.1和33.28的抗原的腫瘤細(xì)胞亞群。
結(jié)腸癌檢測(cè)試劑盒包含免疫組織化學(xué)分析所需的試劑如下A、單克隆抗體31.1，33.28或鼠/人嵌合性抗體Chi#1，和癌胚抗原的單抗(CEA)，后者是結(jié)腸組織免疫組化的標(biāo)準(zhǔn)單克隆。
B、免疫過氧化物酶試劑，(封阻試劑)例如羊血清；二抗，如羊抗鼠抗體。
C、免疫過氧化物酶和。
D、棕色顯色試劑。
類似的試劑盒可用于乳癌和卵巢癌的免疫組化分析。免疫過氧化物酶技術(shù)是采用Sternberger的。一抗(單抗或嵌合抗體)作為抗原可與多個(gè)二抗相結(jié)合。二抗形成了一抗與辣根過氧化物酶-抗過氧化物酶復(fù)合物連接的“橋梁”。
這里所提的試劑盒可用來研究結(jié)腸、癌變、息肉的變化以確定惡變的程度，研究良性息肉轉(zhuǎn)化部位是否被忽略，研究腸炎以檢查任何未覺察的變化。類似的試劑盒可用于研究乳癌和卵巢癌。
計(jì)劃中的另一種類似上述試劑盒的試劑盒采用結(jié)腸癌的五種單克隆抗體，對(duì)所有腫瘤亞群進(jìn)行損傷分型和交叉配血。
本發(fā)明的抗體，片段或是衍生物，都能適用于免疫測(cè)定分析中，也稱為“雙層”分析法或“三明治”分析法。在一般的免疫測(cè)定分析中，一定數(shù)量的未標(biāo)記抗體(或抗體的片段)與固體支持物連結(jié)，這一支持物不溶于待測(cè)液體，加入標(biāo)記了的可溶性抗體，這樣通過對(duì)固相抗體、抗原和標(biāo)記抗體三種物質(zhì)形成的復(fù)合物的檢測(cè)，可測(cè)定或定量測(cè)定待測(cè)物。
典型和最好的免疫測(cè)定分析包括“正向”分析。與固相結(jié)合的抗體首先與待測(cè)樣品混合，樣品中的腫瘤抗原先與抗體形成固相抗體-CCAA復(fù)合物；經(jīng)過一段時(shí)間的穩(wěn)定后，清洗固相支持物除去剩余的樣品，還包括未結(jié)合的抗原；然后再加入包含未知數(shù)量的標(biāo)記抗體(作為報(bào)道分子)的溶液；再經(jīng)過穩(wěn)定，標(biāo)記抗體與CCAA結(jié)合的固相支持物通過未標(biāo)記抗體結(jié)合在一起，再次清洗固相支持物，去除未反應(yīng)的標(biāo)記抗體。這種方法可以只是簡(jiǎn)單的測(cè)定出CCAA是否存在，或者也可以對(duì)它進(jìn)行定量，這可與已知抗原數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)樣品比較標(biāo)記抗體的測(cè)量來進(jìn)行。這種“二層”分析法和“三明治”分析法可參見Wide的描述(Radioimmune AssayMethod，Kirkham，ed.，E.&S.Livingstone，Edinburgh，1970，pp.199-206)。
另一種可用于測(cè)定CCAA的“三明治”分析法被稱為“同步”和“反向”分析法。同步法中包含了一個(gè)溫育的過程，就是將抗體結(jié)合于固體支持物上而標(biāo)記了的抗體也同時(shí)加入待測(cè)樣品中。當(dāng)溫育完成后，清洗固體支持物以除去剩余的液體樣品和未結(jié)合的標(biāo)記抗體。與上述“正向”法中同樣，測(cè)定與固體支持物聯(lián)接的標(biāo)記抗體。
在反向法中，首先加入液體樣品的標(biāo)記抗體，然后加入未標(biāo)記的抗體，經(jīng)過一段時(shí)間后與固相支持物結(jié)合。經(jīng)過第二次溫育，沖洗固定相，清除剩余待測(cè)樣品和未結(jié)合的標(biāo)記抗體，用“同步”和“正向”分析法測(cè)定結(jié)合的標(biāo)記抗體，在一個(gè)實(shí)例中，聯(lián)合使用本發(fā)明的抗體的特殊的分離表位可構(gòu)建一個(gè)更靈敏的三位的免疫放射測(cè)定分析法。
用本發(fā)明的抗體體內(nèi)檢測(cè)結(jié)腸癌、乳癌和卵巢癌，一般的技術(shù)人員可用不同的標(biāo)記物和不同的標(biāo)記方法。本發(fā)明抗體可用的標(biāo)記物類型，例如有放射性同位素、順磁性同位素和可用PET(正電子發(fā)射斷層顯象)成象的復(fù)合物。一般的技術(shù)人員還知道其它的標(biāo)記方法或者通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定某一種方法。另外，技術(shù)人員可通過標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)來進(jìn)行結(jié)合標(biāo)記。
若是為體內(nèi)診斷的目的，選擇放射性核素取決于所具備的檢測(cè)儀器。所選擇的放射性核素的衰變必須是所具備的儀器能檢測(cè)到的。一般來說，任何使診斷圖象顯象的傳統(tǒng)方法都可用于本發(fā)明。
選擇體內(nèi)成象系統(tǒng)的診斷用放射性核素的另一重要因素是放射性核素的半衰期要足夠長(zhǎng)，這樣當(dāng)靶組織達(dá)最大攝取時(shí)仍可被測(cè)出；半衰期又要短，使對(duì)人體造成的放射性危害達(dá)到最小。在具體實(shí)驗(yàn)中，用于體內(nèi)成象的放射性核素不放出粒子，但產(chǎn)生大量的140-200Kev范圍的光子，光子易于用γ-照相機(jī)檢測(cè)。
為了體內(nèi)診斷的目的，放射性核素可用一個(gè)中介的功能團(tuán)作為媒介直接或間接的被連結(jié)到抗體上，常用于結(jié)合以金屬離子形式存在的放射性同位素的中介功能團(tuán)是螯合劑，二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙酸(EDTA)。可結(jié)合到本發(fā)明的抗體的金屬離子例如有99mTc，123I，111In，131I，97Ru，67Cu，67Ga，125I，68Ga，72As，89Zr和201Tl。
單抗33.28和31.1，以及嵌合抗體Chi#1可用來加速其它單抗的產(chǎn)生，這些單抗可與同一抗原或免疫交叉反應(yīng)性結(jié)腸癌相關(guān)性抗原相結(jié)合。首先，這些抗體可與層析柱連結(jié)，并用來免疫純化結(jié)腸癌相關(guān)抗原。這些純化的抗原反過來又刺激了某些動(dòng)物的免疫反應(yīng)。其次，反應(yīng)的動(dòng)物的脾細(xì)胞可與無限增殖化細(xì)胞融合，產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞可根據(jù)分泌的抗體來篩選，它們是與純化的抗原結(jié)合的抗體，和/或與結(jié)腸癌相關(guān)抗原結(jié)合的抗體，它們被33.28或31.1抗體或嵌合抗體Chi#1競(jìng)爭(zhēng)性抑制了。
以上是對(duì)我們的發(fā)明的一個(gè)大致描述，通過一些具體實(shí)例可進(jìn)一步了解我們的發(fā)明，這些例示只為了舉例說明的目的，并不限止本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例I結(jié)腸癌相關(guān)抗原的制備和特征按照Hollinshead的描述(Cancer，56；480(1985))，抗原制劑是從混合的結(jié)腸癌膜中獲得的。這種抗原性物質(zhì)要進(jìn)行純化，使膜中不再含有HL-A抗原，并除去了大部分的非免疫原性糖蛋白。這種抗原制劑的最終狀態(tài)應(yīng)顯示出僅誘發(fā)活躍的結(jié)腸癌、乳癌和卵巢癌的病人的遲發(fā)性過敏反應(yīng)。
將新鮮取出的標(biāo)本的腫瘤細(xì)胞制成鹽懸液。按傳統(tǒng)方法得到單細(xì)胞懸液，以400xg速度離心10分鐘，保留上清液，將細(xì)胞沉淀再次懸浮，離心。以電子顯微鏡確定僅有膜物質(zhì)而不是完整的細(xì)胞存在，內(nèi)含的蛋白以Lowry法測(cè)定。
然后用低頻率超聲處理膜物質(zhì)，使它成為膜蛋白懸濁液。用Sephadex-6200凝膠過濾分離溶液。2ml收集一管，記錄220到280um的吸收率。收集單個(gè)峰蛋白的部分混合在一起，用Diafle超濾法濃縮。用Sephadex-G200分離IB和IIA，這是由Hollinshead等定義的(參見前述)；再進(jìn)一步以梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)純化。于結(jié)腸癌病人作皮試，試驗(yàn)上面制備的蛋白片段是否能誘發(fā)陽(yáng)性的遲發(fā)性超敏反應(yīng)。這些具有免疫原性的片段含有結(jié)腸癌相關(guān)抗原(CCAA)，并被作為免疫原和制備單抗的篩選物。
經(jīng)過梯度PAGE，確定了與癌胚抗原(Gold，P.et al.，J.Exp.Med.122467-481(1965)；Hollinshead，A.et al.，Cancer 56480(1985))不同的雙帶抗原并得到了分離，組成這種抗原帶的示蹤染色顯示長(zhǎng)為6.3和6.6cm?？乖纳锘瘜W(xué)分析證明它是糖蛋白。根據(jù)分子量為76.5KDa的轉(zhuǎn)鐵蛋白的電泳遷移率(6.4-6.5cm)，可以估計(jì)抗原的分子量。
實(shí)施例II單克隆抗體的制備和篩選如上所述的用CCAA免疫BALB/C鼠，剖取脾細(xì)胞，與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0-Ag14融合雜交，從它們的克隆和產(chǎn)物中可獲得抗人結(jié)腸癌相關(guān)抗原(CCAA)的單克隆抗體。
建立五個(gè)雜交克隆，如下所述，稱為31.2，31.1，77，33.23和33.28。經(jīng)ELISA分析五種單抗均與CCAA和兩個(gè)結(jié)腸癌細(xì)胞系(SW480和SW620)強(qiáng)烈反應(yīng)，其中對(duì)31.1和33.28作了詳細(xì)研究。
A、免疫和細(xì)胞融合按照Hollonshead的臨床試驗(yàn)的描述(Hollinshead.et al，)，取BALB/C小鼠，腹腔注射50μgCCAA在完全佐劑中乳化，十天后對(duì)這些小鼠加強(qiáng)免疫，靜脈注射同劑量的CCAA鹽溶液。三天后處死，取脾細(xì)胞。將5×107小鼠脾細(xì)胞和107SP2/)Ag14骨髓瘤細(xì)胞置于40％聚乙二醇(MW-1500)中溫育，使細(xì)胞融合。
B、雜交克隆的篩選檢測(cè)產(chǎn)生CCAA特異性抗體的雜交瘤克隆，可用Tsang的酶聯(lián)免疫吸附分析法(Tsang et al，JNCI 771175(1986))。將CCAA固定于聚苯乙烯微孔板上(100ng/孔)。上清液中的抗體與固定的抗原結(jié)合，加上與過氧化物酶連接的小鼠免疫球蛋白特異性的第二抗體，以檢測(cè)連結(jié)了的鼠單抗。接著加入過氧化物酶的顯色底物D-苯二胺?？字酗@色反應(yīng)的吸收率≥0.500個(gè)單位的視為陽(yáng)性。吸收率在0.01到0.09范圍內(nèi)則為陰性。
經(jīng)ELISA確定為陽(yáng)性的雜交瘤再用間接免疫熒光法篩選。用下表1列出的已經(jīng)鑒定過的不同的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞。所有的腫瘤細(xì)胞系從ATCC獲得。將細(xì)胞與培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞上清液用磷酸緩沖液以1∶2的比例稀釋后于4℃共同溫育1小時(shí)。沖洗細(xì)胞，與熒光標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋白抗體一起溫育。用PBS沖洗細(xì)胞三次，用熒光顯微術(shù)觀察。結(jié)果列于表1。表1抗結(jié)腸癌相關(guān)抗原單克隆抗體和人培養(yǎng)細(xì)胞的間接免疫熒光反應(yīng)性細(xì)胞 單抗的反應(yīng)性31.2 7731.1 33.28 33.23腫瘤細(xì)胞系SW948(COL)- + -- -HCT116(COL) - - -+ -WIDR(COL) + + ++ +COLO320(COL) + + +- -HS619(COL)- - -- -HS853(COL)- - -- -CACO-2(COL) + + -- -SK-CO-1(COL) + + -+ +HT-29(COL)+ + -+ +SW1116(COL) +--++SW480(COL) +++++SW620(COL) +++++231(BR) -----CAMA-1(BR) -----PAN-1(PAN) --+--MIA(PAN) --+--HS766T(PAN) -----M-14(MEL)-----HT1080(FIB) -----LM(OS) -----TE-85(OS)-----正常皮膚纖維細(xì)胞 -----骨髓細(xì)胞 -----正常人外周血單核細(xì)胞 -----A.培養(yǎng)細(xì)胞懸液用PBS按1∶2稀釋B.根據(jù)對(duì)照所得的膜熒光強(qiáng)度確定陽(yáng)性(+)或陰性(-)。
C.COL結(jié)腸癌；BR乳癌；PAN胰腺癌；FIB纖維肉瘤實(shí)施例III單克隆抗體及其反應(yīng)性的分析上面所述的抗CCAA單抗的生產(chǎn)和檢測(cè)也要用新鮮人體組織檢測(cè)其反應(yīng)性。表2列出的組織類型置于低溫恒溫器中，均用3.5％的甲醛磷酸緩沖液固定，再用PBS沖洗三次。在間接的免疫熒光研究中，將組織與單抗一起溫育，然后用熒光標(biāo)記的二抗染色。
如表2所示，單抗31.1和33.28對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞具有高度的特異性。這表明所用的抗原(CCAA)對(duì)結(jié)腸癌高度特異性，而且，是結(jié)腸癌病人的免疫原(DH反應(yīng)陽(yáng)性)，對(duì)小鼠藻紅蛋白興奮性試驗(yàn)也是良好的免疫原。用正向?qū)?0°光散射檢測(cè)的細(xì)胞來建立引發(fā)區(qū)。如表4所示，31.1和33.28的單抗都能與結(jié)腸癌細(xì)胞連接。二者與PBMC細(xì)胞的連結(jié)則不明顯。表2用新鮮人體組織間接免疫熒光檢測(cè)抗CCAA單抗反應(yīng)性單抗的 反應(yīng)性組織 33.2831.1腫瘤結(jié)腸癌 3/3 3/3胰腺癌 0/2 0/2黑色素瘤 0/2 0/1乳癌 0/2 0/1正常組織胎盤 0/1 0/1肝臟 0/1 0/1結(jié)腸 0/3 0/3脾臟 0/1 0/1胸腺 0/1 0/1肌肉 0/1 0/1a.腹水用PBS按1∶50稀釋。低溫切片(4-6μM厚)用3.5％福爾馬林磷酸緩沖液固定10分鐘，然后用PBS洗三次。若不立即使用，將切片置于-70℃保存。
結(jié)果按試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性數(shù)量/陰性數(shù)量表示。
表3列出的是單抗的免疫吸附分析結(jié)果。三種結(jié)腸癌細(xì)胞系(HT-29，WIDR和SW620)和一種骨肉瘤細(xì)胞系(LM)用來吸附與異硫氰酸熒光素連接的單抗31.1和33.28。取接種了雜交瘤的小鼠腹水，以1∶50稀釋，加入吸附細(xì)胞中?；旌弦?℃溫育1小時(shí)，用2×107細(xì)胞(表3中A)或104細(xì)胞(表3中B)吸附抗體(表3)。骨肉瘤細(xì)胞系無吸附31.1或33.28的活性，而結(jié)腸癌細(xì)胞則有。
表3 單抗的免疫吸附分析吸 附 細(xì) 胞單抗 HT-29 WIDR SW620 LMABABABAB33.28-+-+-+++31.1 -+-+-+++抗體31.1、33.28和對(duì)照單抗與腫瘤細(xì)胞HT29、WIDR和SW480及外周血單核細(xì)胞(PBMCs)的結(jié)合情況可用細(xì)胞熒光測(cè)定分析法獲得。采用Ortho光譜III細(xì)胞熒光自顯影圖，帶有一個(gè)氬激光器可激活熒光素和藻紅蛋白。用正向?qū)?0°光散射檢測(cè)的細(xì)胞來建立引發(fā)區(qū)。如表4所示，31.1和33.28的抗體均能與結(jié)腸癌細(xì)胞相連，而單抗則不能與PBMC結(jié)合。
表4細(xì)胞熒光分析測(cè)定結(jié)果單抗細(xì)胞染色百分?jǐn)?shù)細(xì)胞33.2831.1對(duì)照HT29 51.053.99.2WIDR 21.0ND 8.1SW48037.0 32.03.8PBMC 2.1 2.1 ND單克隆抗體的重鏈和輕鏈的類型可用免疫擴(kuò)散法測(cè)定。31.1單抗是帶有Kappa輕鏈的IgG1，33.28單抗則是有Kappa輕鏈的IgG2a(表5)。這與過去的19.9單抗完全不同(Herlyn，M.et al，J.Biol.Chem.25714365-14369(1982))，它是屬于IgG1類的(Herlyn D.et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA794761-4765(1982))。重要的是，IgG2a型的抗體對(duì)免疫治療更為有效。(Cilcher，D.et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.783199-3203(1981)).19.9單抗對(duì)結(jié)腸腫瘤也有反應(yīng)性，但它是以胰腺癌作為抗原免疫而來的，對(duì)結(jié)腸具有交叉反應(yīng)性。這與B72.3單抗(citation)有些類似，它是以乳癌組織為免疫原獲得的抗體，也對(duì)結(jié)腸有反應(yīng)活性。
表5單克隆抗體的同種型培養(yǎng)懸液 IgG1 IgG2a IgG2b IgM 輕鏈卡巴 λ31.2-+ - - + -31.1+- - - + -77 -- + - + -33.23 -+ - - + -33.28 -+ - - + -實(shí)施例IV結(jié)腸癌相關(guān)抗原的特性用蛋白質(zhì)印跡(western blot)分析法測(cè)定取自SW480和SW620結(jié)腸癌細(xì)胞系的可溶性蛋白可確定上述單克隆抗體結(jié)合的抗原的分子量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)細(xì)胞系中分子量為61.1KDa和72KDa的抗原能與33.28和31.1單抗起反應(yīng)。在Western blot分析中，這些單抗不能與人外周血單核細(xì)胞或其它組織類型的腫瘤細(xì)胞系反應(yīng)。
為了更好的確定本發(fā)明的單克隆抗體對(duì)CCAA免疫反應(yīng)的特異性，并確立單抗是否會(huì)與已用于臨床治療的細(xì)胞膜制劑中的免疫原成份發(fā)生反應(yīng)(Hollinshead et al，supra)，上述的致免疫制劑將用高效液相色譜儀(HPLC)分析處理。
分析顯示4個(gè)較顯著的峰，于結(jié)腸癌病人作皮試，觀察每個(gè)峰的免疫反應(yīng)性(用DH誘發(fā))。在10個(gè)受試病人中，僅第4個(gè)峰的蛋白的皮試為陽(yáng)性。峰4的抗原與33.28單抗能起反應(yīng)，而31.1單抗與峰3的抗原反應(yīng)，峰3是第二個(gè)最顯著的峰。
上文引用的參考文獻(xiàn)與這里的結(jié)果是一致的。
實(shí)施例V結(jié)腸癌相關(guān)抗原的親和純化用33.28單抗將從HT-29細(xì)胞系中提取的抗原用親和層析法分離出來。經(jīng)純化的33.28IgG5mg連接到CNBr激活的瓊脂糖凝膠電泳4B上。柱子用PH 11.5的0.05M二乙胺預(yù)洗脫，然后用0.14M NaCl/0.01M Tris(PH8.0)平衡。將CCAA制劑注入柱子中，再用PH 11.5 0.05M的二乙胺洗脫。洗脫下的部分加入PH8.0的IM Tris-HCl中和。
連接在33.28親和基質(zhì)上并被洗脫下來的物質(zhì)再用HPLC處理。洗脫的CCAA制劑用啟動(dòng)緩沖液(0.01M磷酸鉀緩沖液，PH7.0)調(diào)節(jié)，加入Synchropak Wax Weak陰離子交換HPLC柱(250×4.6mm)中，并用以0.01M磷酸鉀緩沖液配制的0-1MNaCl溶液梯度洗脫，洗脫速度為1ml/分。陰離子交換層析采用惠普(Hewlett-Packard)HPLC(HP1090，HP，Arondals，PA)結(jié)果列于圖2，用33.28單抗從HT-29細(xì)胞分離的抗原性物質(zhì)產(chǎn)生的峰與第4個(gè)峰吻合，并且對(duì)人的免疫反應(yīng)性也相似，表明可利用33.28單抗來分離致人免疫的結(jié)腸癌制劑。
實(shí)施例VI單克隆抗體33.28和31.1的ADCC活性為了具有治療作用，一種免疫原性腫瘤抗原特異性單克隆抗體應(yīng)具備以下特征(A)對(duì)腫瘤組織的高度特異性；(B)對(duì)正常人體組織無交叉反應(yīng)性；(C)與破壞腫瘤相關(guān)的生物學(xué)活性，如依賴抗體的細(xì)胞毒性作用。
單抗33.28和31.1的ADCC活性可用結(jié)腸癌細(xì)胞系WIDR作為靶細(xì)胞來檢測(cè)。黑色素瘤細(xì)胞系M-14則作為特異性對(duì)照。分析ADCC采用傳統(tǒng)的51Cr 4小時(shí)釋放分析法，以人PBMC作為效應(yīng)細(xì)胞，結(jié)果用同位素釋放百分?jǐn)?shù)(分解％)(表6)來表示。分解的底數(shù)為8.3％，當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞的比例為100∶1時(shí)，33.28單抗導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞分解率達(dá)40.3％，而31.1單抗為51.8％。
表6單抗33.28和31.1的ADCC活性靶細(xì)胞釋放百分?jǐn)?shù)(E∶T比值)WIDRM-14抗體或?qū)φ? 25 50 100 25 5010033.28 23.140.345.36.9 8.4 9.031.114.326.751.87.5 6.4 8.7OSA110.09.2 12.211.414.8 10.9NMS 12.211.713.114.215.0 11.1PBS 8.2 5.1 7.6 11.014.2 10.5ADCC用51Cr 4小時(shí)釋放分析法分析。51Cr釋放的底數(shù)是8.3％。E∶T比值表示效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比值。單抗或血清以1∶100稀釋后檢測(cè)；OSA1--骨肉瘤相關(guān)抗原的單抗；NMS-正常小鼠血清；WIDR-結(jié)腸癌細(xì)胞系；M14--黑色素瘤細(xì)胞系。
實(shí)施例VII循環(huán)血液中帶有單抗33.28和31.1的CCAA的檢測(cè)檢測(cè)79例未知的血清樣品中的循環(huán)CCAA(表7)可以用來檢測(cè)本發(fā)明的單抗。這一分析是建立在ELISA分析法中血清抑制單抗與CCAA的結(jié)合的原理的基礎(chǔ)上的。50例正常血清無一出現(xiàn)假陽(yáng)性，10例活躍的結(jié)腸癌病人的血清9例為陽(yáng)性，結(jié)腸癌治愈一年后的病例未出現(xiàn)陽(yáng)性。
表7 循環(huán)結(jié)腸癌相關(guān)抗原的檢測(cè)(血清抑制單抗與CCAA的結(jié)合的數(shù)量)33.28 . 31.1 .
供體物樣品數(shù) ＜15％＞15％＜15％＞15％(陰性) (陽(yáng)性)(陰性)(陽(yáng)性)結(jié)腸癌 10 3 72 8結(jié)腸癌(切除) 4 4 04 0乳癌 9 9 09 0黑色素瘤5 5 05 0前列腺癌1 1 01 0正常血清50 500500結(jié)腸癌相關(guān)抗原用ELISA法檢測(cè)。每次分析取100μl血清。
實(shí)施例VIII其它對(duì)結(jié)腸癌有反應(yīng)性的單抗的特異性比較用ELISA方法進(jìn)一步研究腫瘤特異性(表8)。將單抗31.1與CC49比較，CC49是從B-72.3提純的結(jié)腸直腸癌特異性單克隆抗體，對(duì)照用小鼠骨髓瘤蛋白。31.1單抗與結(jié)腸直腸癌反應(yīng)的范圍比CC49小，但它具有更高的特異性，與胃腫瘤或正常結(jié)腸組織的交叉反應(yīng)性則較低或沒有。表8使用單抗31.1、CC49和MOPC-21的正常與腫瘤組織的ELISA結(jié)果組織31.1CC49MOPC-21結(jié)腸直腸癌1.COCA2A - +++ -2.COCA2 - +++ -3.COCA3 + ++ -4.COCA4 +++ +++ -5.G820± ++ -6.G853+++ ++ -7.G817+++ +++ -8.G781- - -其它癌1.乳腺癌1 - - -2.乳腺癌2 - - -3.肺癌1 - - -4.肺癌2 - - -5.卵巢癌D106 - - -6.卵巢癌5 - - -7.卵巢癌V5- - -8.卵巢癌V45 - - -9.卵巢癌V43 - - -10.胃癌14A++ +++ -11.胃癌12A- +++ -12.胃癌15A- - -其它正常組織1.子宮內(nèi)膜E21 - - -2.子宮內(nèi)膜EC19---3.子宮內(nèi)膜EC17-+-4.子宮內(nèi)膜EC18---(RBC)5.紅細(xì)胞1 ---6.紅細(xì)胞2 ---7.紅細(xì)胞3 ---8.紅細(xì)胞4 ---9.紅細(xì)胞5 ---10.紅細(xì)胞6---11.紅細(xì)胞7---12.紅細(xì)胞8---13.紅細(xì)胞9---14.紅細(xì)胞10 ---15.紅細(xì)胞11 ---16.粒細(xì)胞 ---17.385---18.386---19.正常脾3---20.392(正常脾)---21.395(正常肝臟) ---22.387(正常腎臟) ---23.398(正常脾)---24.390(正常肝臟) ---25.正常脾#1 ---26.正常脾#2 ---27.800(正常結(jié)腸) -++ -28.正常結(jié)腸(GW) -++ -29.正常結(jié)腸(Meloy)---30.正常結(jié)腸 ---
31.G1155B(正常結(jié)腸)---32.G1164B(正常結(jié)腸)---33.正常結(jié)腸 ± - -34.正常胃A ---35.正常胃B ---36.正常胃C ---37.正常肺 ---38.正常肝臟---CC49-NCI結(jié)腸直腸的單克隆抗體MOPC-21-骨髓瘤蛋白陰性對(duì)照所有單抗為40ng/孔，POGAM稀釋度為1∶3000實(shí)施例IX單抗33.28和31.1在體內(nèi)腫瘤部位的分布本發(fā)明的單抗在體內(nèi)的分布行為，是研究了125I標(biāo)記的單抗和異體移植了結(jié)腸癌LS-174T的無胸腺裸鼠內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)后得到的。而種植了黑色素A375的小鼠作為對(duì)照。放射部位指數(shù)(放射標(biāo)記物在腫瘤部位的濃度/放謝標(biāo)記物在周圍組織的濃度)即表示單抗在腫瘤內(nèi)相對(duì)于周圍組織(肝臟和脾臟)的相對(duì)單克隆抗體的濃度。表-9是125I標(biāo)記的單抗31.1和33.28的生物分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單抗顯著地集中在腫瘤部位，遠(yuǎn)高于正常組織(肝臟和脾臟)內(nèi)的分布，在96小時(shí)為正常組織的6倍，而在168小時(shí)時(shí)為12倍。圖3和圖4是單抗在腫瘤組織和血液、肝臟內(nèi)的放射分布指數(shù)。表9125I標(biāo)記的單抗在帶瘤的無胸腺裸鼠內(nèi)的生物分布組織96小時(shí)168小時(shí)LS174T A375 LS1745T A375A.mAb 31.1血液7.30NA4.674.42腫瘤21.92 NA25.43 2.91肝臟3.74NA2.161.24脾臟3.68NA2.411.32B.mAb 33.28血液7.80NA5.583.95腫瘤13.12 NA15.50 2.24肝臟2.55NA1.741.68脾臟2.31NA1.701.92結(jié)果用注射劑量/組織重量(克)表示LS174T-結(jié)腸癌；A375-黑色素瘤實(shí)施例X免疫組織化學(xué)的研究應(yīng)用特異性單抗的選擇性地定義腫瘤種群的能力，就可以通過免疫組織化學(xué)的方法在血清中發(fā)現(xiàn)腫瘤標(biāo)記物，從而描繪新生物的產(chǎn)生過程和新生物的細(xì)胞種群的特征。
運(yùn)用免疫過氧化物酶染色法，用50種以上的結(jié)腸癌對(duì)單抗31.1和33.28進(jìn)行試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這兩種單抗對(duì)于結(jié)腸新生物有很高的反應(yīng)性，而對(duì)于鄰近的正常組織則反應(yīng)性很低。當(dāng)檢查單抗對(duì)息肉有無反應(yīng)性時(shí)發(fā)現(xiàn)，良性部位，如絨毛-管狀腺瘤與單元毫無反應(yīng)。只有在已經(jīng)惡變的腺瘤部位出現(xiàn)與單抗的反應(yīng)。當(dāng)用普通的碳水化合物-抗原所誘導(dǎo)的單抗來檢查類似的組織，發(fā)現(xiàn)無論是正常組織還是新生組織，都能與這種單抗反應(yīng)。在單抗3.11和33.28的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)單抗分別與腫瘤組織中不同種群的細(xì)胞反應(yīng)。這提示不同的癌基因產(chǎn)生不同的細(xì)胞表面抗原。
實(shí)施例XI選擇性地結(jié)合石蠟包埋的良性和惡性的乳房組織的上皮細(xì)亞群應(yīng)用親和素-生物素染色法來研究單抗3.11和33.28在41個(gè)經(jīng)福爾馬林固定后，石蠟包埋的良性和惡性乳房標(biāo)本。在未經(jīng)酶處理之前，在細(xì)胞表面和胞漿內(nèi)這兩種抗體的染色都是陽(yáng)性。單抗31.1對(duì)33％的導(dǎo)管致癌劑為陽(yáng)性，對(duì)25％的良性乳房疾病的標(biāo)本為陽(yáng)性；單抗33.28對(duì)48％的導(dǎo)管癌的為陽(yáng)性，對(duì)35％的良性乳房疾病的標(biāo)本為陽(yáng)性。10-75％的細(xì)中群染色陽(yáng)性。這些結(jié)果說明，單抗3.11和33.28所定義的抗原選擇性地在一部分患有乳房疾病的婦女體內(nèi)有表達(dá)，這一結(jié)果將有助于這一疾病的診斷。
實(shí)施例XII選擇性地結(jié)合上新鮮冰凍的良性和惡性卵巢腫瘤的上皮細(xì)胞的亞群應(yīng)用親和素-生物素間接免疫過氧化物酶檢測(cè)的方法，研究單抗31.1和33.28在來自21個(gè)卵巢腫瘤新鮮冰凍的活檢組織。結(jié)果，4/7和乳頭狀粘液腺瘤，1/1的粘蛋白刺激性腺瘤，1/2的子宮內(nèi)膜樣腺瘤的組織出現(xiàn)局部染色陽(yáng)性。且沒有發(fā)現(xiàn)非上皮性卵巢腫瘤單抗染色陽(yáng)性。這些結(jié)果說明，單抗31.1和33.28所定義的抗原選擇性地在一部分患有卵巢癌的婦女體內(nèi)表達(dá)，這一結(jié)果同樣將有助于這一疾病的診斷。
實(shí)施例XIII人類結(jié)腸癌組織及細(xì)胞株對(duì)單抗31.1和33.28的免疫反應(yīng)性用單抗31.1和33.28來考察細(xì)胞株的免疫反應(yīng)性，這些細(xì)胞株包括結(jié)腸腺癌，淋巴瘤，白血病和成神經(jīng)細(xì)胞瘤。
應(yīng)用親和素-生物素免疫過氧化物酶染色法，發(fā)現(xiàn)單抗31.1和33.28能很強(qiáng)地結(jié)合上結(jié)腸腺癌細(xì)胞株，WIDR和HT-29，而在細(xì)胞株KGI-a、HL-60、Molt-3和JUKRAT上則沒有反應(yīng)。兩個(gè)抗體對(duì)淋巴瘤細(xì)胞株JY的反應(yīng)都弱。單抗33.28還與白血病細(xì)胞株K562和成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞株U87，MG有較弱的反應(yīng)。這些結(jié)果與前面所述的流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光反應(yīng)的結(jié)果一致。單抗只能與結(jié)腸腺癌的細(xì)胞株反應(yīng)，而與其他的腫瘤細(xì)胞株則沒有反應(yīng)，但與SKBR-3乳癌細(xì)胞則沒有反應(yīng)。
兩個(gè)單抗都表現(xiàn)了只能與結(jié)腸腺癌組織反應(yīng)的特性(單抗33.28與84％的細(xì)胞反應(yīng)，單抗31.1與64％的細(xì)胞反應(yīng))，而與正常組織或淋巴瘤，白血病和成神經(jīng)細(xì)胞瘤則沒有反應(yīng)。這些結(jié)果說明這些抗體能夠作為考察腫瘤標(biāo)記和細(xì)胞生物學(xué)研究的工具。
實(shí)施例XIV抗人類結(jié)腸直腸癌相關(guān)抗原的嵌合抗體的表達(dá)和特征嵌合小鼠/人重鏈基因是這樣得到的，用PCR的方法，將抗體31.1的重鏈的可變區(qū)的外顯子剪接到人類gammal鏈的恒定區(qū)上去。隨后，將31.1的嵌合抗體基因克隆到一個(gè)反轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體plgpCXII并轉(zhuǎn)染到細(xì)胞株P(guān)A317。轉(zhuǎn)染細(xì)胞PA317H與另一個(gè)細(xì)胞PA317一起培養(yǎng)，后者含有一個(gè)表達(dá)在反轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體plneoCXII中和SP2/00-Ag14細(xì)胞中的不相關(guān)的小鼠/嵌合輕鏈基因。經(jīng)傳導(dǎo)的SP2/-A14細(xì)胞能夠產(chǎn)生完整的嵌合抗體CH#1，它能與辣根過氧化物酶結(jié)合的羊抗人1gGFc片段在酶聯(lián)反應(yīng)中反應(yīng)，這說明了Ch#1的恒定區(qū)是人種屬的。細(xì)胞熒光測(cè)量分析表明，Ch#1能夠染色人類結(jié)腸直腸癌細(xì)胞株HT-29和LS174T，但是與人類肺癌細(xì)胞株則沒有反應(yīng)。抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(ADCC)顯示Ch#1能夠溶解Ls174T細(xì)胞。這些結(jié)果說明Ch#1具有對(duì)小鼠31.1單抗特異性抗原結(jié)合的能力，這也進(jìn)一步說明這種嵌合抗體能夠在結(jié)腸癌的預(yù)后請(qǐng)價(jià)中發(fā)揮作用。
以上我們?cè)敿?xì)的描述了本發(fā)明，在已經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)的相同的參數(shù)、濃度和條件允許的范圍內(nèi)可以使用這一技術(shù)。
當(dāng)本發(fā)明在描述中被限制在一些特殊的實(shí)施例時(shí)，也應(yīng)該理解它也是可以進(jìn)行修飾的。本發(fā)明申請(qǐng)中提到的重要特征、和下面所提的權(quán)利要求范圍，意圖覆蓋所欲改變本發(fā)明的變化、用途和適用范圍的行為。
權(quán)利要求
1.一種特異性對(duì)人結(jié)腸癌相關(guān)蛋白抗原的單克隆抗體，所述的抗原具有以下的特征(1).所述的單克隆抗體是識(shí)別所述抗原的蛋白成份的表位，而不是所述抗原的糖成份的表位；(2).所述抗原在正常的人類組織中不能發(fā)現(xiàn)；(3).所述抗原在除了結(jié)腸癌細(xì)胞以外其它的人癌細(xì)胞上不能發(fā)現(xiàn)；以及(4).所述抗原特異性地對(duì)人類具有免疫原性。
2.按權(quán)利要求1的抗體，該抗體是小鼠單克隆抗體33.28或是像33.28一樣能特異性地結(jié)合在同樣的結(jié)腸癌相關(guān)表位的抗體。
3.按權(quán)利要求2的抗體，所述結(jié)腸癌相關(guān)抗原是具有分子量約為61.1KD的蛋白。
4.按權(quán)利要求1的抗體，該抗體是小鼠單克隆抗體31.1或是像小鼠單克隆抗體31.1一樣能特異性地結(jié)合在同樣的結(jié)腸癌相關(guān)表位的抗體。
5.按權(quán)利要求4的抗體，所述結(jié)腸癌相關(guān)抗原是具有分子量約為72KD的蛋白，所述結(jié)腸癌相關(guān)抗原是糖蛋白，其蛋白成份分子量為61.1KD。
6.按權(quán)利要求1的抗體，固定在固相物上。
7.按權(quán)利要求1的抗體，它是經(jīng)標(biāo)記后能檢測(cè)的單抗。
8.按權(quán)利要求7的抗體，所述可檢測(cè)的標(biāo)記是同位素標(biāo)記。
9.按權(quán)利要求1的抗體，與具有細(xì)胞毒性放射性核素結(jié)合。
10.按權(quán)利要求1的抗體，與具有細(xì)胞毒性的藥物結(jié)合。
11.按權(quán)利要求1的抗體，與具有細(xì)胞毒性的蛋白結(jié)合。
12.一種免疫治療人類結(jié)腸癌，乳房癌和卵巢癌的藥物組份，包含按權(quán)利要求9的一種抗體，及與之結(jié)合的一種藥物可接受的載體。
13.一種免疫治療人類結(jié)腸癌，乳房癌和卵巢癌的藥物組份，包含一個(gè)具有治療效果的量的按權(quán)利要求10的一種抗體，及與之結(jié)合的一種藥物可接受的載體。
14.一種免疫治療人類結(jié)腸癌，乳房癌和卵巢癌的藥物組份，包含一個(gè)具有治療效果的量的按權(quán)利要求11的一種抗體，及與之結(jié)合的一種藥物可接受的載體。
15.一種具有以下特性的人結(jié)腸癌相關(guān)蛋白抗原(1).所述抗原的蛋白成份的表位能夠在哺乳宿主體內(nèi)產(chǎn)生抗體，而所述抗原的糖成份表位是不能產(chǎn)生所述抗體；(2).所述抗原在正常的人類組織中不能發(fā)現(xiàn)；(3).所述抗原在除了結(jié)腸癌細(xì)胞以外其它的人類癌細(xì)胞上不能發(fā)現(xiàn)；以及(4).所述抗原特異性地對(duì)人類具有免疫原性。
16.按權(quán)利要求15的抗原，所述抗原是分子量約為61KD的蛋白。
17.按權(quán)利要求15的抗原，所述抗原是分子量約為72KD的蛋白。
18.按權(quán)利要求16的抗原，所述抗原能特異性地結(jié)合小鼠單克隆抗體33.28，或是與像小鼠單克隆抗體33.28一樣能特異性地結(jié)合在同樣的結(jié)腸癌相關(guān)表位的抗體結(jié)合。
19.按權(quán)利要求17所述的抗原，所述抗原能特異性地結(jié)合小鼠單克隆抗體31.1，或是與像小鼠單克隆抗體31.1一樣能特異性地結(jié)合在同樣的結(jié)腸癌相關(guān)表位的抗體結(jié)合。
20.一種抗權(quán)利要求1的單克隆抗體的單克隆抗體。
21.一種抗權(quán)利要求2的單克隆抗體的單克隆抗體。
22.一種抗權(quán)利要求3的單克隆抗體的單克隆抗體。
23.一種抗權(quán)利要求4的單克隆抗體的單克隆抗體。
24.一種抗權(quán)利要求5的單克隆抗體的單克隆抗體。
25.一種檢測(cè)在樣品中能與小鼠單克隆抗體33.28結(jié)合的結(jié)腸癌相關(guān)抗原的免疫分析方法包括(1).將所述樣品與按權(quán)利要求1的抗體接觸；及(2).通過檢測(cè)所結(jié)合上的抗體來檢測(cè)所述抗原。
26.一種檢測(cè)在樣品中能與小鼠單克隆抗體31.1結(jié)合的結(jié)腸癌相關(guān)抗原的免疫分析方法包括(1).將所述樣品與按權(quán)利要求1的抗體接觸；及(2).通過檢測(cè)所結(jié)合上的抗體來檢測(cè)所述抗原。
27.一種用于檢測(cè)結(jié)腸癌相關(guān)抗原在宿主中的成象方法包括(1).將按權(quán)利要求7的標(biāo)記了的抗體與所述動(dòng)物接觸；及(2).檢測(cè)所述抗原。
28.一種殺死攜帶結(jié)腸癌相關(guān)抗原的細(xì)胞的方法，包括將有效量的權(quán)利要求1的抗體和一個(gè)具有細(xì)胞毒性的效應(yīng)劑傳遞給所述細(xì)胞。
29.按權(quán)利要求28的一種方法，所述效應(yīng)劑是選自于一組含有補(bǔ)體和具有依賴于抗體的細(xì)胞毒性功能的效應(yīng)細(xì)胞。
30.一種殺死攜帶結(jié)腸癌相關(guān)抗原的細(xì)胞的方法，包括將按權(quán)利要求9的抗體傳遞給所述細(xì)胞。
31.、一種殺死攜帶結(jié)腸癌相關(guān)抗原的細(xì)胞的方法，包括將按權(quán)利要求10的抗體傳遞給所述細(xì)胞。
32.一種殺死攜帶結(jié)腸癌相關(guān)抗原的細(xì)胞的方法，包括將按權(quán)利要求11的抗體傳遞給所述細(xì)胞。
33.一種治療懷疑患有結(jié)腸癌帶有能與小鼠單克隆抗體33.28或31.1結(jié)合的抗原的病人的方法，包括對(duì)所述病人用按權(quán)利要求12的組份的有效劑量。
34.一種治療懷疑患有結(jié)腸癌帶有能與小鼠單克隆抗體33.28或31.1結(jié)合的抗原的病人的方法，包括給所述病人用按權(quán)利要求13的組份的有效劑量。
35.一種治療懷疑患有結(jié)腸癌帶有能與小鼠單克隆抗體33.28或31.1結(jié)合的抗原的病人的方法，包括給所述病人用按權(quán)利要求14的組份的有效劑量。
36.一種生產(chǎn)用于人結(jié)腸癌的臨床免疫治療的具有免疫原性的組份的方法，包括(a)制備一個(gè)含有能與小鼠單克隆抗體33.28或31.1結(jié)合的抗原的腫瘤或細(xì)胞系的細(xì)胞膜提取物；以及(b)采用按權(quán)利要求6的抗體通過親和純化分離所述抗原，這樣可生產(chǎn)所述的組份。
37.一種抗人結(jié)腸癌的免疫疫苗，包括有效量的按權(quán)利要求15的抗原或與傳統(tǒng)的疫苗載體聯(lián)接的它的活性片段。
38.一種抗人結(jié)腸癌的免疫疫苗，包括有效量的人結(jié)腸癌相關(guān)抗原或與傳統(tǒng)疫苗載體聯(lián)接的又能與小鼠單克隆抗體33.28或31.1結(jié)合的它的活性片段。
39.一種人結(jié)腸癌的免疫治療方法，包括給病人按需要用含有效劑量按權(quán)利要求15的抗原的疫苗或與傳統(tǒng)的疫苗載體聯(lián)接的它的活性片段。
40.一種人結(jié)腸癌的免疫治療方法，包括給病人按需要用含有效劑量人結(jié)腸癌相關(guān)抗原的疫苗或與傳統(tǒng)疫苗載體聯(lián)接的并能與小鼠單克隆抗體33.28或31.1結(jié)合的它的活性片段。
41.按權(quán)利要求37的疫苗，劑量有效范圍是約0.001-100mg抗原/公斤體重。
42.按權(quán)利要求38的疫苗，劑量有效范圍是約0.001-100mg抗原/公斤體重。
43.一種診斷人結(jié)腸癌的方法包括(a)從懷疑患有結(jié)腸癌帶有按權(quán)利要求15的抗原的病人取組織學(xué)標(biāo)本；(b)將標(biāo)本與能識(shí)別所述抗原的單克隆抗體接觸；(c)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色；以及(d)根據(jù)染色檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的存在。
44.一種診斷人結(jié)腸癌的方法包括(a)從懷疑患有結(jié)腸癌的帶有能與小鼠單克隆抗體33.28或31.1結(jié)合的抗原病人取組織學(xué)標(biāo)本；(b)將標(biāo)本與能識(shí)別所述抗原的小鼠單克隆抗體接觸；(c)將標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色；以及(d)檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的存在。
45.按權(quán)利要求43的方法，所述染色是親和素-生物素免疫過氧化物酶染色。
46.按權(quán)利要求44的方法，所述染色是親和素-生物素免疫過氧化物酶染色。
47.一種用于結(jié)腸癌的免疫組化檢測(cè)的試劑盒包括(a)小鼠單克隆抗體33.28和31.1及癌胚抗原的單克隆抗體；(b)免疫過氧化物酶及二抗試劑；(c)免疫過氧化物酶；以及(d)染色劑。
48.一種用于結(jié)腸癌的免疫組化檢測(cè)的試劑盒包括(a)小鼠單克隆抗體31.1、31.2、33.23、33.28和77及癌胚抗原的單克隆抗體；(b)免疫過氧化物酶及二抗試劑；(c)免疫過氧化物酶；以及(d)染色劑。
49.一種用于按權(quán)利要求15的抗原的檢測(cè)的區(qū)室化試劑盒，所述試劑盒包括裝有所述抗原的抗體或活性成份的第一個(gè)容器及裝有所述抗原的二抗或活性成份的第二個(gè)容器，所述二抗標(biāo)記了報(bào)道分子，能給出可檢測(cè)信號(hào)。
50.按權(quán)利要求49的試劑盒，所述的報(bào)道分子是放射性同位素、酶、熒光分子、化學(xué)發(fā)光分子或生物發(fā)光分子。
51.按權(quán)利要求49的試劑盒，所述的報(bào)道分子是酶。
52.按權(quán)利要求49的試劑盒，所述試劑盒還包括一裝有盛酶的底物的第三個(gè)容器。
53.一種特異性對(duì)人結(jié)腸癌相關(guān)蛋白抗原的單克隆抗體，所述抗原具有如下的特征(i)所述的單克隆抗體是識(shí)別所述抗原的蛋白質(zhì)成份的表位，而不是所述抗原的糖成份的表位。(ii)所述抗原在正常的人類組織中不能發(fā)現(xiàn)；(iii)所述抗原在除了乳癌細(xì)胞以外其它的人癌細(xì)胞上不能發(fā)現(xiàn)，以及(iv)所述抗原特異性地對(duì)人類具有免疫性。
54.按權(quán)利要求53的抗體，該抗體是小鼠單克隆抗體33.28或是像33.28一樣能特異地結(jié)合在同樣的結(jié)腸癌相關(guān)表位的抗體。
55.按權(quán)利要求54的抗體，所述結(jié)腸癌相關(guān)抗原是具有分子量約為61.1KD的蛋白。
56.按權(quán)利要求53的抗體，所述抗體是小鼠單克隆抗體31.1或是象31.1一樣能特異地結(jié)合在同樣的結(jié)腸癌相關(guān)表位的抗體。
57.按權(quán)利要求53的抗體，所述結(jié)腸癌相關(guān)抗原是具有分子量約為72KD的蛋白，所述結(jié)腸癌相關(guān)抗原是糖蛋白，其蛋白成份的分子量為61.1KD。
58.一種免疫治療人乳癌的藥物組份，包括一個(gè)具有治療有效量的按權(quán)利要求53的一種抗體及與之結(jié)合的一種藥物可接受的載體。
59.一種具有下列特征的人結(jié)腸癌相關(guān)蛋白抗原(i)所述抗原的蛋白成份的表位能夠在哺乳宿主體內(nèi)產(chǎn)生抗體，而所述抗原的糖成份的表位是不能產(chǎn)生所述抗體；(ii)所述抗原在正常的人體組織中不能發(fā)現(xiàn)；(iii)所述抗原在除了乳癌細(xì)胞以外其它的人類癌組細(xì)胞上不能發(fā)現(xiàn)；以及(iv)所述抗原特異性地對(duì)人類具有免疫原性。
60.按權(quán)利要求59的抗原，所述抗原是具有分子量約為61KD的蛋白。
61.按權(quán)利要求59的抗原，所述抗原是具有分子量約為72KD的蛋白。
62.按權(quán)利要求60的抗原，所述抗原是特異性地與小鼠單克隆抗體33.28結(jié)合或是與像小鼠單克隆抗體33.28一樣能特異性地結(jié)合在同樣的結(jié)腸癌相關(guān)表位的抗體結(jié)合。
63.按權(quán)利要求61的抗原，所述抗原是特異性地與小鼠單克隆抗體31.1結(jié)合或是與像小鼠單克隆抗體31.1一樣能特異性地結(jié)合在同樣的結(jié)腸癌相關(guān)表位的抗體結(jié)合。
64.一種抗按權(quán)利要求53的單克隆抗體的單克隆抗體。
65.一種檢測(cè)能與樣品中的小鼠單克隆抗體33.28結(jié)合的結(jié)腸癌相關(guān)抗原的免疫分析方法包括(a)將所述樣品與按權(quán)利要求53的抗體接觸；以及(b)通過檢測(cè)抗體的結(jié)合來檢測(cè)所述抗原。
66.一種檢測(cè)能與樣品中的小鼠單克隆抗體31.1結(jié)合的結(jié)腸癌相關(guān)抗原的免疫分析方法包括(a)將所述樣品與按權(quán)利要求53的抗體接觸；以及(b)通過檢測(cè)抗體的結(jié)合來檢測(cè)所述抗原。
67.一種殺死攜帶結(jié)腸癌相關(guān)抗原的細(xì)胞的方法，包括將有效量按權(quán)利要求53的抗體和一個(gè)具有細(xì)胞毒性的效應(yīng)劑傳遞給所述細(xì)胞。
68.一種治療懷疑患有乳癌帶有能與小鼠克隆抗體33.28或31.1結(jié)合的抗原的病人的方法，包括給所述病人用按權(quán)利要求58的組份的有效劑量。
69.一種抗人乳癌免疫疫苗，包括有效量的按權(quán)利要求59的抗原或與傳統(tǒng)的疫苗載體聯(lián)接的它的活性片段。
70.一種抗人乳癌免疫疫苗，包括有效量的人結(jié)腸癌相關(guān)抗原或與傳統(tǒng)疫苗載體聯(lián)接的并能與小鼠單克隆抗體33.28或31.1結(jié)合的它的活性片段。
71.一種人乳癌的免疫治療方法，包括給病人按需要用含有有效量按權(quán)利要求59的抗原的疫苗或與傳統(tǒng)的疫苗載體聯(lián)接的它的活性片段。
72.一種人乳癌的免疫治療方法，包括給病人按需要用含有有效量人結(jié)腸癌相關(guān)抗原的疫苗或與傳統(tǒng)疫苗載體聯(lián)接的并能與小鼠單克隆抗體33.28或31.1結(jié)合的它的活性片段。
73.一種診斷人乳癌的方法，包括(a)從懷疑患有乳癌帶有按權(quán)利要求59的抗原的病人取組織學(xué)標(biāo)本；(b)將標(biāo)本與能識(shí)別所述抗原的單克隆抗體接觸；(c)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色；以及(d)根據(jù)染色檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的存在。
74.一種診斷人乳癌的方法，包括(a)從懷疑患有乳癌帶有能與小鼠單克隆抗體33.28或31.1的抗原的病人取組織學(xué)標(biāo)本；(b)將標(biāo)本與能識(shí)別所述抗原的小鼠單克隆抗體接觸；(c)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色；以及(d)檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的存在。
75.一種用于乳癌的免疫組化檢測(cè)的試劑盒，包括(a)小鼠單克隆抗體31.1和33.28及癌胚抗原的單克隆抗體；(b)免疫過氧化物酶及二抗試劑；(c)免疫過氧化物酶；以及(d)染色劑。
76.一種特異性對(duì)人結(jié)腸癌相關(guān)蛋白抗原的單克隆抗體，所述的抗原具有以下的特性(i)所述的單克隆抗體是認(rèn)識(shí)所述抗原的蛋白成份的表位，而不是所述抗原的糖成份表位；(ii)所述抗原在正常的人類組織中不能發(fā)現(xiàn)；(iii)所述抗原在除了卵巢癌細(xì)胞以外其它的人類癌細(xì)胞上不能發(fā)現(xiàn)；以及(iv)所述抗原特異性地對(duì)人類具有免疫原性。
77.按權(quán)利要求76的抗體，該抗體是小鼠單克隆抗體33.28或是像33.28一樣能特異性地結(jié)合在同樣的結(jié)腸癌相關(guān)表位的抗體。
78.按權(quán)利要求77的抗體，所述結(jié)腸癌相關(guān)抗原是具有分子量約為61.1KD的蛋白。
79.按權(quán)利要求76條抗體，該抗體是小鼠單克隆抗體31.1或是像小鼠單克隆抗體31.1一樣能特異性地結(jié)合在同樣的結(jié)腸癌相關(guān)表位的抗體。
80.按權(quán)利要求79的抗體，所述結(jié)腸癌相關(guān)抗原是具有分子量約為72KD的蛋白，所述結(jié)腸癌相關(guān)抗原是糖蛋白，其蛋白成份的分子量為61.1KD。
81.一種免疫治療人卵巢癌的藥物組份，包括一個(gè)具有治療有效量的按權(quán)利要求76的一種抗體及與之結(jié)合的一種藥物可接受的載體。
82.一種具有下列特征的人結(jié)腸癌相關(guān)蛋白抗原(i)所述抗原的蛋白成份的表位能夠在哺乳宿主體內(nèi)產(chǎn)生抗體，而所述抗原的糖成份的表位是不能產(chǎn)生所述抗體；(ii)所述抗原在正常人類組織中不能發(fā)現(xiàn)；(iii)所述抗原在除了卵巢癌細(xì)胞以外其它的人類癌細(xì)胞上不能發(fā)現(xiàn)；以及(iv)所述抗原特異性地對(duì)人類具有免疫原性。
83.按權(quán)利要求82的抗原，所述抗原是具有分子量約為61KD的蛋白。
84.按權(quán)利要求82的抗原，所述抗原是具有分子量約為72KD的蛋白。
85.按權(quán)利要求83的抗原，所述抗原是特異性地與小鼠單克隆抗體33.28結(jié)合或是與像小鼠單克隆抗體33.28一樣能特異性地結(jié)合在同樣的結(jié)腸癌相關(guān)表位的抗體結(jié)合。
86.按權(quán)利要求84的抗原，所述抗原是特異性地與小鼠單克隆抗體31.1結(jié)合或是與像小鼠單克隆抗體31.1一樣能特異性地結(jié)合在同樣的結(jié)腸癌相關(guān)表位的抗體結(jié)合。
87.一種抗權(quán)利要求76的單克隆抗體的單克隆抗體。
88.一種檢測(cè)能與樣品中的小鼠單克隆抗體33.28結(jié)合的結(jié)腸癌相關(guān)抗原的免疫分析方法，包括(a)將所述樣品與按權(quán)利要求76的抗體接觸；以及(b)通過檢測(cè)抗體的結(jié)合來檢測(cè)所述抗原。
89.一種檢測(cè)能與樣品中的小鼠單克隆抗體31.1結(jié)合的結(jié)腸癌相關(guān)抗原的免疫分析方法，包括(a)將所述樣品與按權(quán)利要求76的抗體接觸；以及(b)通過檢測(cè)抗體的結(jié)合來檢測(cè)述抗原。
90.一種殺死攜帶結(jié)腸癌相關(guān)抗原的細(xì)胞的方法，包括將有效量的按權(quán)利要求76的抗體和一個(gè)具有細(xì)胞毒性的效應(yīng)劑傳遞給所述細(xì)胞。
91.一種治療懷疑患有卵巢癌帶有能與小鼠單克隆抗體33.28或31.1結(jié)合的抗原的病人的方法，包括對(duì)前述病人用按權(quán)利要求81的組份的有效劑量。
92.一種抗人卵巢癌的免疫疫苗，包括有效量的按權(quán)利要求82的抗原或與傳統(tǒng)的疫苗載體聯(lián)接的它的活性片段。
93.一種抗人卵巢癌的免疫疫苗，包括有效量的人結(jié)腸癌相關(guān)抗原或與傳統(tǒng)疫苗載體聯(lián)接的又能與小鼠單克隆抗體33.28或31.1結(jié)合的它的活性片段。
94.一種人卵巢癌的免疫治療方法，包括給病人按需要用含有有效劑量按權(quán)利要求82的抗原的疫苗或與傳統(tǒng)的疫苗載體聯(lián)接的它的活性片段。
95.一種人卵巢癌的免疫治療方法，包括給病人按需要用含有有效劑量人結(jié)腸癌相關(guān)抗原的疫苗或與傳統(tǒng)疫苗載體聯(lián)接的并能與小鼠單克隆抗體33.28或31.1結(jié)合的它的活性片段。
96.一種診斷人卵巢癌的方法，包括(a)從懷疑患有卵巢癌帶有按權(quán)利要求82的抗原的病人取組織學(xué)標(biāo)本；(b)將標(biāo)本與能識(shí)別所述抗原的單克隆抗體接觸；(c)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色；以及(d)根據(jù)染色檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的存在。
97.一種診斷人卵巢癌的方法，包括(a)從懷疑患有卵巢癌帶有能與小鼠單克隆抗體33.28或31.1結(jié)合的抗原的病人取組織學(xué)標(biāo)本；(b)將標(biāo)本與能識(shí)別所述抗原的小鼠單克隆抗體接觸；(c)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色；以及(d)檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的存在。
98.一種用于卵巢癌的免疫組化檢測(cè)的試劑盒，包括(a)小鼠單克隆抗體31.1和33.28及癌胚抗原的單克隆抗體；(b)免疫過氧化物酶及二抗試劑；(c)免疫過氧化物酶；以及(d)染色劑。
99.一種特異性對(duì)人結(jié)腸癌相關(guān)蛋白抗原的嵌合抗體，所述抗原具有如下的特征(i)所述單克隆抗體是識(shí)別所述抗原的蛋白成份的表位，而不是所述抗原的糖成份的表位；(ii)所述抗原在正常的人類組織中不能發(fā)現(xiàn)；(iii)所述抗原在除了結(jié)腸癌細(xì)胞以外其它的人癌細(xì)胞上不能發(fā)現(xiàn)；以及(iv)所述抗原特異性地對(duì)人類具有免疫原性。
100.一種按權(quán)利要求99的嵌合抗體，該嵌合抗體是小鼠/人嵌合抗體Chi#1。
101.按權(quán)利要求100的嵌合抗體，所述結(jié)腸癌相關(guān)抗原是具有分子量約為72KD的蛋白。
102.一種免疫治療人結(jié)腸癌的藥物組份，包括一個(gè)具有治療有效量的按權(quán)利要求99的一種抗體，及與之結(jié)合的一種藥物可接受的載體。
103.按權(quán)利要求101的抗原，所述抗原是特異性地與嵌合抗體Chi#1結(jié)合或是與像嵌合抗體Chi#1一樣能特異性地結(jié)合在同樣的結(jié)腸癌相關(guān)表位的嵌合抗體結(jié)合。
104.一種抗按權(quán)利要求99的嵌合抗體的單克隆抗體。
105.一種檢測(cè)能與樣品中的小鼠/人嵌合抗體Chi#1結(jié)合的結(jié)腸癌相關(guān)抗原的免疫分析方法，包括(a)將所述樣品與按權(quán)利要求99的抗體接觸；以及(b)通過檢測(cè)抗體的結(jié)合來檢測(cè)所述抗原。
106.一種殺死攜帶結(jié)腸癌相關(guān)抗原的細(xì)胞的方法，包括將有效量的按權(quán)利要求99的抗體和一個(gè)具有細(xì)胞毒性的效應(yīng)劑傳遞給所述細(xì)胞。
107.一種治療懷疑患有結(jié)腸癌帶有能與小鼠/人嵌合抗體Chi#1結(jié)合的抗原的病人的方法，包括給所述病人用按權(quán)利要求102的組份的有效劑量。
108.一種抗人結(jié)腸癌免疫疫苗，包括有效量的人結(jié)腸癌相關(guān)抗原或與傳統(tǒng)疫苗載體聯(lián)接的并能與小鼠/人嵌合抗體Chi#1結(jié)合的它的活性片段。
109.一種人結(jié)腸癌的免疫治療方法，包括給病人按需要用含有有效量人結(jié)腸癌相關(guān)抗原的疫苗或與傳統(tǒng)疫苗載體聯(lián)接的并能與小鼠/人嵌合性抗體Chi#1結(jié)合的它的活性片段。
110.一種診斷人結(jié)腸癌的方法，包括(a)從懷疑患有結(jié)腸癌帶有按權(quán)利要求15的抗原的病人取組織學(xué)標(biāo)本；(b)將標(biāo)本與能識(shí)別所述抗原的嵌合抗體接觸；(c)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色；以及(d)根據(jù)染色檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的存在。
111.一種診斷人結(jié)腸癌的方法，包括(a)從懷疑患有結(jié)腸癌帶有能與小鼠/人嵌合抗體Chi#1結(jié)合的抗原的病人取組織學(xué)標(biāo)本；(b)將標(biāo)本與能識(shí)別所述抗原的小鼠/人嵌合抗體接觸；(c)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色；以及(d)檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物的存在。
112.一種用于結(jié)腸癌的免疫組化檢測(cè)的試劑盒，包括(a)小鼠/人嵌合抗體Chi#1和癌胚抗原的嵌合抗體；(b)免疫過氧化物酶及二抗試劑；(c)免疫過氧化物酶；以及(d)染色劑。
全文摘要
本文公開了單克隆抗體，特別是33.28和31.1及嵌合抗體，特別是特異性對(duì)人類具有免疫原性的結(jié)腸癌相關(guān)抗原的糖蛋白抗原的鼠/人嵌合抗體Chi#1。這些抗體及它們的片段和衍生物可用于人結(jié)腸癌、乳癌和卵巢癌的免疫診斷和免疫治療，并可用于作為免疫治療劑的抗原的純化。本文還公開了檢測(cè)樣品中結(jié)腸癌相關(guān)抗原的方法及結(jié)腸癌、乳癌和卵巢癌病人的治療方法。
文檔編號(hào)A61K41/00GK1164238SQ95196182
公開日1997年11月5日 申請(qǐng)日期1995年9月12日 優(yōu)先權(quán)日1995年9月12日
發(fā)明者章江益, 阿倫·邁倫 申請(qǐng)人:國(guó)際生物免疫有限公司