專(zhuān)利名稱(chēng)：具有高艾杜糖醛酸含量的多糖類(lèi)的制作方法
現(xiàn)有技術(shù)葡糖胺聚糖屬于含有艾杜糖醛酸的多糖類(lèi)物質(zhì)，它們從不同來(lái)源的動(dòng)物組織提取得到，這些組織如腸粘膜，肺等。肝素，硫酸乙酰肝素，condroitin sulfates和透明質(zhì)酸屬于葡糖胺聚糖族系。
不同的葡糖胺聚糖具有不相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，它們由糖醛酸和己糖胺重復(fù)構(gòu)成的多糖鏈形成。具體講，在肝素和硫酸乙酰肝素中，糖醛酸(uronicacid)由糖醛酸(glycuronic acid)或艾杜糖醛酸構(gòu)成，而己糖胺則由葡糖胺構(gòu)成。
葡糖胺可優(yōu)先被N-乙?；?硫酸乙酰肝素)或優(yōu)先N-硫酸鹽化(肝素)和6-O硫酸鹽化。此外，還發(fā)現(xiàn)在葡糖胺的3位上也帶有硫酸根。糖醛酸可被2-O硫酸鹽化。
在臨床實(shí)踐中，肝素作為抗凝血?jiǎng)┖涂寡ㄐ纬蓜┚哂惺种匾淖饔谩?br> 對(duì)肝素和硫酸乙酰肝素來(lái)講，除上述這種治療應(yīng)用外，還希望它們?cè)谌舾善渌±韺W(xué)方面具有有用的應(yīng)用，例如具有抗血脂，抗增生，抗病毒，抗腫瘤和抗生成血管功能等作用。
肝素和硫酸乙酰肝素在這些新治療應(yīng)用方面的使用包括必需用不同于提取的方法，特別是用適應(yīng)性更強(qiáng)的可以制備不同結(jié)構(gòu)產(chǎn)物的方法，制得這些產(chǎn)物或類(lèi)似產(chǎn)物。
并且，提取動(dòng)物組織的方法不能保證得到無(wú)病毒產(chǎn)物。
WO92/17507專(zhuān)利申請(qǐng)中描述了通過(guò)生物合成制備抗凝血?jiǎng)┢咸前肪厶堑姆椒āＴ诖朔椒ㄖ?，使用從大腸桿菌中得到的多糖K5為原料，采用下述反應(yīng)順序進(jìn)行-N-脫乙?；饔?；-N-硫酸鹽化作用；-差向異構(gòu)作用，以便將D-糖醛酸的至少某些殘基轉(zhuǎn)移到L-艾杜糖醛酸的殘基上；和-至少某些游離羥基的硫酸鹽化作用。
此方法中，其關(guān)鍵步驟在于差向異構(gòu)作用，這種差向異構(gòu)作用最多限于20％。差向異構(gòu)是在由HEPES、氯化鉀、EDTA和TRITON X-100組成的pH為7.4的經(jīng)典反應(yīng)介質(zhì)中，于D-糖醛酸基-L-艾杜糖醛酸基-C5-差向異構(gòu)酶(D-glycuronyl-L-iduronyl-C5-epimerase)存在下室溫進(jìn)行兩天。以前已闡述了限于三分之一糖醛酸差向異構(gòu)作用(M.Hook等人，生物化學(xué)(The J.of Biol.Chem.)249，123908-3915，1974年6月25日)。并且這種差向異構(gòu)程度似乎至今仍是無(wú)法逾越的。此外，必須注意的是，在此文獻(xiàn)中，細(xì)胞環(huán)境中的差向異構(gòu)作用是在生物合成方法的各種因素存在的條件下于鼠肥大細(xì)胞瘤中進(jìn)行。
但是，象從現(xiàn)有技術(shù)中得到的差向異構(gòu)程度不允許得到具有各種治療應(yīng)用所需特征的產(chǎn)物。
事實(shí)上，艾杜糖醛酸賦予糖醛酸產(chǎn)物優(yōu)越的柔性(Casu B.，Petitou M.，Provasoli M.，和Sinay P.(1988)構(gòu)象柔性一種解釋包含艾杜糖醛酸的葡糖胺聚糖結(jié)合和生物特性的新概念。Trends Biochem.Sci.13，221-225)。因此，正如由肝素相對(duì)于硫酸乙酰肝素具有更強(qiáng)的抗凝和抗血栓形成活性和其它活性如對(duì)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的活性所指出的那樣，含有高百分比量艾杜糖醛酸的產(chǎn)物較之那些含有糖醛酸的產(chǎn)物具有更高活性，其中艾杜糖醛酸被認(rèn)為是活性部位的必需部分(Maccarana M.，Casu B，.和Lindahl U.(1993).結(jié)合堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子所需要的肝素/硫酸乙酰肝素中的最低序列(Minimal sequence in Heparin/Heparan SulfateRequired for Binding of Basic Fibroblast Growth Factor).生物化學(xué)(J.Biol.Chem.)，268，23898-23905)。因此，從工業(yè)角度來(lái)看，存在著這樣難題，即尋求能得到具有可接受的產(chǎn)率和時(shí)間的高度差向異構(gòu)作用的產(chǎn)物的方法。概述我們已發(fā)現(xiàn)，具有高艾杜糖醛酸含量的多糖類(lèi)可通過(guò)下述方法以由大腸桿菌得到的多糖K5或以肝素或硫酸乙酰肝素為原料制得，該方法包括a)N-脫乙?；龆嗵荎5或硫酸乙酰肝素，或者O-脫硫酸鹽化肝素或硫酸乙酰肝素；b) N-硫酸鹽化a)步所得產(chǎn)物；c)在D-糖醛酸基-L-艾杜糖醛酸基-C5差向異構(gòu)酶存在下進(jìn)行一次或多次差向異構(gòu)處理；d)將至少某些游離羥基進(jìn)行硫酸鹽化，其特征在于差向異構(gòu)步驟是在由由HEPES、氯化鉀和EDTA形成的pH為7.4的經(jīng)典緩沖溶液構(gòu)成的、加有TRITON X-100和一種或多種選自乙二醇，甘油，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇和磷脂酰膽堿的添加劑的反應(yīng)介質(zhì)中進(jìn)行。
按照本發(fā)明方法，可以制得相對(duì)于糖醛酸總含量，艾杜糖醛酸含量大于50％的多糖。發(fā)明詳述下文詳盡的說(shuō)明過(guò)程中基本上完全指出了本發(fā)明方法和所得多糖的特征及優(yōu)點(diǎn)。
按Manzoni M.，Bergomi S.，Cavazzoni V.(生物活性和相容聚合物(Journal of Bioactive and Compatible Polymers).Vol VIII，1993年7月，251-257)所述由大腸桿菌得到的多糖K5特別適合用作本發(fā)明方法的起始原料。
肝素和硫酸乙酰肝素也可用作第一步中操作條件有某些改變的本發(fā)明方法的起始原料。
起始原料可以具有2,000至大于50,000D的分子量。
當(dāng)使用多糖K5時(shí)，其結(jié)構(gòu)首先通過(guò)N-脫乙?；男?，這種改性可通過(guò)用肼和硫酸肼混合物處理來(lái)進(jìn)行，或者在堿性環(huán)境中通過(guò)用氫氧化鈉或氫氧化鉀處理進(jìn)行。
然后通過(guò)用三乙胺-三氧化硫或用三甲胺-三氧化硫處理，進(jìn)行N-硫酸鹽化。利用這些操作，可以得到各種，例如25％至100％的N-硫酸鹽化產(chǎn)物。
N-脫乙?；蚇-硫酸鹽化的反應(yīng)按照已知技術(shù)進(jìn)行，例如按照WO92/17507中所述方法進(jìn)行。
當(dāng)使用肝素作為起始原料時(shí)，先進(jìn)行O-脫硫酸鹽化，然后進(jìn)行N-硫酸鹽化，以便再硫酸鹽化O-脫硫酸鹽化作用期間脫去硫酸根的氨基位置。
當(dāng)硫酸乙酰肝素被用作起始原料時(shí)，不僅進(jìn)行N-脫乙?；蚈-脫硫酸鹽化，而且還進(jìn)行形成N-再硫酸鹽化。
按上所述由多糖K5或硫酸乙酰肝素得到的N-硫酸鹽化產(chǎn)物進(jìn)行差向異構(gòu)處理，以轉(zhuǎn)化糖醛酸成艾杜糖醛酸，另一方面，為了由艾杜糖醛酸得到糖醛酸，則可用酶處理由肝素得到的產(chǎn)物。
差向異構(gòu)作用是在D-糖醛酸基-L-艾杜糖醛酸基-C5-差向異構(gòu)酶(以下用C5差向異構(gòu)酶簡(jiǎn)單表示)進(jìn)行，這種酶是從貓肝臟中提取出并按A.Malmstron在J.B.C 255，3878-3883(1980)中所述方法純化得到。
本申請(qǐng)人驚奇地發(fā)現(xiàn)，用適當(dāng)添加劑改性經(jīng)典反應(yīng)介質(zhì)，能獲得非常高程度的差向異構(gòu)作用。
本發(fā)明的反應(yīng)介質(zhì)為由HEPES，氯化鉀，EDTA和TRITON X-100構(gòu)成的pH為7.4的緩沖溶液，并加有一種或多種選自乙二醇，甘油，聚乙烯吡咯烷酮，特別是具有15,000至90,000分子量的聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇和磷脂酰膽堿的添加劑，其加入量為適于增加緩沖溶液粘度至1.1至3厘沲的量。
具體講，所述反應(yīng)介質(zhì)由下述pH為7.4的緩沖溶液制備HEPES0.04M，KCl 0.4M和EDTA 0.06M，并向25ml此緩沖溶液中加入100至1000μlTRITON X-100，0.5ml至60ml添加劑，并加蒸餾水至100ml。
將進(jìn)行差向異構(gòu)作用的多糖加到所述反應(yīng)介質(zhì)中，其加入量為每100ml反應(yīng)介質(zhì)5至1000mg，得到溶液A。
將C5差向異構(gòu)酶獨(dú)立加到與上所述相同的反應(yīng)介質(zhì)中，其量為每100ml反應(yīng)介質(zhì)21至2000μg，得到溶液B。
以能得到每100ml進(jìn)行差向異構(gòu)作用的混合物含1.5至15.000μgC5差向異構(gòu)酶量的比例，將溶液B加到溶液A內(nèi)。攪拌均化混合物，并在恒溫室中于30至40℃溫度下加熱90分鐘至15小時(shí)。
在100℃加熱混合物5分鐘，停止反應(yīng)。
產(chǎn)物通過(guò)DEAE-Sephacel柱純化，采用0.05M(NH4)HCO3作為緩沖液，并用2M(NH4)HCO3緩沖液洗脫產(chǎn)物。
收集各餾份并通過(guò)Sephadex G-15柱脫鹽。凍干含產(chǎn)物部分的餾份，并通過(guò)1H-NMR分析產(chǎn)物。
依據(jù)1H-NMR譜，計(jì)算D-糖醛酸和L-艾杜糖醛酸的含量。所得產(chǎn)物可再溶于溶液A中并用溶液B再次處理，進(jìn)一步差向異構(gòu)化處理后，L-艾杜糖醛酸的含量增加。
為評(píng)估抗凝和抗血栓形成活性，使用吡啶-三氧化硫作為硫酸鹽化劑，按照如Ogamo等人在第XIV屆國(guó)際碳水化合物討論會(huì)文摘(1988年8月14-19日，Stockholm)中所述方法，將差向異構(gòu)化產(chǎn)物O-硫酸鹽化。如下文所報(bào)道的用本發(fā)明方法得到的，進(jìn)行了O-硫酸鹽化的實(shí)施例1，3，4，5，6，7和9的產(chǎn)物，顯示出優(yōu)越的抗凝和抗血栓形成活性，而按照已知技術(shù)制得的實(shí)施例2和8的產(chǎn)物則顯示出非常低的活性。
所得結(jié)果表明，本發(fā)明產(chǎn)物具有適于臨床使用特性的抗凝和抗血栓形成作用，因此，它們可用于制備混合有輔劑和賦形劑物質(zhì)的有關(guān)藥物組合物。
為說(shuō)明本發(fā)明方法，報(bào)道了下述實(shí)施例。實(shí)施例1制備含0.04M HEPES，0.06M EDTA，0.4M KCl的緩沖溶液(pH7.4)，取4.5ml此溶液，向其中加入27μlTRITON X-100，9ml10％聚乙烯吡咯烷酮K15水溶液，1.62ml乙二醇，并加水至總體積18ml。
所得溶液的粘度為1.41厘沲。在此溶液中溶入1mg100％N-脫乙酰、N-硫酸鹽化K5，得到溶液A。
向0.8mlpH為7.4且含有8.9μgC5差向異構(gòu)酶的相同起始緩沖溶液中加入1.6ml10％聚乙烯吡咯烷酮K15水溶液、288μl乙二醇并加水至總體積3.2ml，得到溶液B。
將溶液A與1.6ml溶液B混合，混合物在37℃的溫室中保持4小時(shí)。4小時(shí)后，加入1.6ml溶液B，并將反應(yīng)在37℃保持過(guò)夜。通過(guò)在100℃加熱5分鐘使反應(yīng)停止。產(chǎn)物通過(guò)DEAE-Sephacel柱(2×1.5cm)純化，采用0.05M(NH4)HCO3作為緩沖液，并用2M(NH4)HCO3緩沖液洗脫產(chǎn)物。
將含產(chǎn)物餾分通過(guò)Sephadex G-15柱(0.3×5cm)脫鹽并凍干。產(chǎn)物通過(guò)1H-NMR分析，其光譜見(jiàn)

圖1。
L-艾杜糖醛酸占糖醛酸總量的百分比為55。實(shí)施例2(對(duì)比)重復(fù)實(shí)施例1，區(qū)別在于不加聚乙烯吡咯烷酮和乙二醇。
所用緩沖液的粘度約等于水的粘度，即大約為0。
所得產(chǎn)物的1H-NMR譜見(jiàn)圖2中報(bào)道。結(jié)果，相對(duì)于艾杜糖醛酸與糖醛酸的總和，L-艾杜糖醛酸的含量等于18％。實(shí)施例3重復(fù)實(shí)施例1，區(qū)別在于使用N-脫乙酰和50％N-硫酸鹽化多糖K5作為起始原料。
通過(guò)1H-NMR分析所得產(chǎn)物，其相關(guān)光譜見(jiàn)圖3中報(bào)道。結(jié)果，相對(duì)于局限于N-硫酸鹽化葡糖胺的糖醛酸總和，L-艾杜糖醛酸含量等于51％。實(shí)施例4將0.06M EDTA，0.4M KCl(pH7.4)，30μlTRITON X-100，10.6ml10％聚乙烯吡咯烷酮K15水溶液，0.85ml乙二醇和4.42ml水加到5.3ml含0.04M HEPES的緩沖溶液中。
所得溶液的粘度為1.2厘沲。在9ml此溶液中溶入2mg100％N-脫乙酰、N-硫酸鹽化K5，得到溶液A。
在8ml相同溶液中溶入1.7μgC5差向異構(gòu)酶，得到溶液B。
混合溶液A和B，混合物在37℃的溫室中保持4小時(shí)。通過(guò)在100℃加熱5分鐘使反應(yīng)停止。
產(chǎn)物如實(shí)施例1所述純化。
冷凍干燥后，將純化產(chǎn)物溶于1ml溶液A中并與含8.9μgC5差向異構(gòu)酶的3.2ml溶液B混合。
混合物于37℃保持過(guò)夜，在100℃加熱5分鐘使酶失活。按實(shí)施例1所述純化產(chǎn)物并通過(guò)1H-NMR分析，光譜如圖4所示。
L-艾杜糖醛酸占糖醛酸總量的百分比為53。實(shí)施例5制備含0.04M HEPES，0.06M EDTA，0.4M KCl，pH為7.4的緩沖溶液，取2ml此溶液，向其中加入22.8μlTRITON X-100，1mg100％N-脫乙酰，N-硫酸鹽化K5，4ml20％含40％乙二醇的聚乙烯吡咯烷酮K15溶液，并加水至總體積8ml。向6ml此溶液內(nèi)加入6ml含下述組成的溶液0.01M HEPES，0.015M EDTA，0.01MKCl，0.015％TRITON X-100和134.4μgC5差向異構(gòu)酶。
所得溶液的粘度為1.36厘沲。
混合物在37℃保持1小時(shí)。通過(guò)在100℃沸騰5分鐘使反應(yīng)停止。
產(chǎn)物按實(shí)施例1所示純化。
冷凍干燥后，產(chǎn)物溶于含有下述組分的緩沖溶液內(nèi)6.25ml pH7.4的0.04M HEPES，0.06M EDTA，0.4M KCl溶液，2.5g聚乙烯吡咯烷酮K15，2.5ml乙二醇，71.21μlTRITON X-100，加水至總體積25ml。
將1.9μgC5差向異構(gòu)酶溶于12ml含0.015％TRITON X-100的0.01M HEPES，0.015M EDTA，0.1M KCl溶液(pH7.4)內(nèi)，并將它們加到12ml上面所得混合物中。
混合物的粘度為1.4厘沲。
反應(yīng)在37℃保持過(guò)夜。在反應(yīng)最后，于100℃加熱溶液5分鐘使酶失活。產(chǎn)物如實(shí)施例1所述純化，并測(cè)定1H-NMR譜(圖5)。
L-艾杜糖醛酸占糖醛酸總量的百分比為52。實(shí)施例6重復(fù)實(shí)施例5，只是在第一步中，將反應(yīng)于37℃保持4小時(shí)。
在與實(shí)施例1相同的條件下純化和冷凍干燥后，將產(chǎn)物溶于1ml水中，并加到含有下述組成的緩沖溶液內(nèi)50ml(pH7.4)的0.04M HEPES，0.06MEDTA，0.4M KCl溶液，283.5μlTRITON X-100，100ml10％聚乙烯吡咯烷酮K15，20ml乙二醇，2ml90％甘油，1.9μgC5差向異構(gòu)酶，并加水至總體積200ml?；旌衔锏恼扯葹?.41厘沲。
反應(yīng)在37℃保持4小時(shí)，于100℃加熱5分鐘失活酶。
如實(shí)施例1所述純化產(chǎn)物并測(cè)定1H-NMR譜(圖6)。
L-艾杜糖醛酸占糖醛酸總量的百分比為55。實(shí)施例7將1.5mg100％N-脫乙酰，N-硫酸鹽化K5溶于含有下述組分的緩沖溶液內(nèi)7mlpH7.4的0.04M HEPES，0.06M EDTA，0.4MKCl溶液，210μlTRITON X-100，1.4g聚乙烯吡咯烷酮K15，2.8ml乙二醇，1.5mgC5差向異構(gòu)酶和至總體積28ml量的水。
溶液的粘度為1.36厘沲。
反應(yīng)在37℃保持4小時(shí)，于100℃加熱5分鐘失活酶。
如實(shí)施例1所述純化產(chǎn)物并冷凍干燥。
然后將產(chǎn)物溶于24ml含1.3mgC5差向異構(gòu)酶的相同溶液內(nèi)，將反應(yīng)在37℃保持4小時(shí)，并在100℃加熱5分鐘使酶失活。
如實(shí)施例1所述純化產(chǎn)物并冷凍干燥。
然后將產(chǎn)物溶于8.4ml含1mgC5差向異構(gòu)酶的相同溶液內(nèi)，將反應(yīng)在37℃保持4小時(shí)。
如實(shí)施例1所述純化產(chǎn)物并測(cè)定1H-NMR譜(圖7)。
L-艾杜糖醛酸占糖醛酸總量的百分比為80。實(shí)施例8(對(duì)比)將1mg100％N-脫乙酰，N-硫酸鹽化K5溶于含有下述組分的緩沖溶液內(nèi)3mlpH7.4的0.04M HEPES，0.06M EDTA，0.4MKCl液，18μlTRITON X-100，1.2ml丙酮，1.9μgC5差向異構(gòu)酶和至總體積12ml量的水。
溶液的粘度為0.09厘沲。
反應(yīng)在37℃保持4小時(shí)。
如實(shí)施例1所述純化產(chǎn)物并測(cè)定1H-NMR譜(圖8)。
L-艾杜糖醛酸占糖醛酸總量的百分比為0。實(shí)施例9將1mg100％N-脫乙酰，N-硫酸鹽化K5溶于含有下述組分的緩沖溶液內(nèi)2mlpH7.4的0.04M HEPES，0.06M EDTA，0.4MKCl液，12μlTRITON X-100，1.336m12.4％聚乙烯吡咯烷酮K90，304μgC5差向異構(gòu)酶和至總體積8ml量的水。
溶液的粘度為1.29厘沲。
反應(yīng)在37℃保持4小時(shí)，于100℃加熱5分鐘失活酶，溶液通過(guò)0.22μm裝置過(guò)濾。
取8ml含304μgC5差向異構(gòu)酶的相同混合物，加到過(guò)濾后溶液內(nèi)，并將反應(yīng)在37℃保持4小時(shí)，于100℃加熱5分鐘使酶失活并用0.22μm裝置過(guò)濾溶液。
取8ml含304μgC5差向異構(gòu)酶的相同混合物，加到此溶液內(nèi)，并將反應(yīng)在37℃保持4小時(shí)，于100℃加熱5分鐘使酶失活，溶液通過(guò)0.22μm裝置過(guò)濾。
如實(shí)施例1所述純化產(chǎn)物并測(cè)定1H-NMR譜(圖9)。
L-艾杜糖醛酸占糖醛酸總量的百分比為59。
權(quán)利要求
1.以大腸桿菌得到的多糖K5或由肝素或硫酸乙酰肝素為原料，制備相對(duì)于糖醛酸總含量，L-艾杜糖醛酸含量大于50％的多糖的方法。該方法包括a) N-脫乙?；龆嗵荎5或硫酸乙酰肝素，或者O-脫硫酸鹽化肝素或硫酸乙酰肝素；b)N-硫酸鹽化a)步所得產(chǎn)物；c)在C5差向異構(gòu)酶存在下進(jìn)行一次或多次差向異構(gòu)處理；d)將至少某些游離羥基進(jìn)行硫酸鹽化，其特征是差向異構(gòu)步驟是在由由HEPES、氯化鉀和EDTA構(gòu)成的pH為7.4的經(jīng)典緩沖溶液組成的、加有適于增加所述緩沖溶液的粘度值至1.1至3厘沲量的TRITON X-100和一種或多種添加劑的反應(yīng)介質(zhì)中進(jìn)行。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述添加劑選自乙二醇，甘油，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇和磷脂酰膽堿。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述添加劑為分子量為15,000至90,000的聚乙烯吡咯烷酮。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，相對(duì)于每100ml所述緩沖溶液，所述的一種或多種添加劑以2至240ml的量加入到所述緩沖溶液內(nèi)。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，相對(duì)于每100ml反應(yīng)介質(zhì)，所述原料化合物以5至1000mg的量溶于所述反應(yīng)介質(zhì)中。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，相對(duì)于每100ml反應(yīng)介質(zhì)，C5差向異構(gòu)酶以21至2000μg的量溶于所述反應(yīng)介質(zhì)中。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，每100ml進(jìn)行差向異構(gòu)作用的混合物含有1.5至15,000μgC5差向異構(gòu)酶。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述差向異構(gòu)反應(yīng)是在恒溫室中于30至40℃的溫度下進(jìn)行。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述起始產(chǎn)物為25％至100％N-磁酸鹽化的。
10.按權(quán)利要求1的方法得到的多糖，其特征在于，相對(duì)于糖醛酸的總含量，它們含有大于50％含量的L-艾杜糖醛酸。
11.權(quán)利要求10所述的多糖在制備具有抗凝和抗血栓形成活性的藥物組合物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了制備具有高含量艾杜糖醛酸的多糖的方法，包括a)N-脫乙?；瘡拇竽c桿菌得到的多糖K5或硫酰乙酰肝素，或者O-脫硫酸鹽化肝素或硫酸乙酰肝素；b)N-硫酸鹽化a)部所得產(chǎn)物；c)在C5差向異構(gòu)酶存在下進(jìn)行差向異構(gòu)化；d)將至少某些游離羥基進(jìn)行硫酸鹽化，其特征是步驟c)是在由HEPES、氯化鉀和EDTA形成的經(jīng)典緩沖溶液，和TRITON X-100構(gòu)成的并加有適當(dāng)添加劑的反應(yīng)介質(zhì)中進(jìn)行。
文檔編號(hào)A61K31/715GK1162339SQ95196040
公開(kāi)日1997年10月15日 申請(qǐng)日期1995年10月30日 優(yōu)先權(quán)日1994年11月4日
發(fā)明者G·佐派逖, P·奧里斯特, G·希波萊逖 申請(qǐng)人:伊納爾科公司