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將分子導入細胞溶質(zhì)的制作方法

文檔序號:1054623閱讀:352來源:國知局
專利名稱:將分子導入細胞溶質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種將分子導入細胞的方法,即通過光動力學處理,在不大量殺傷細胞的情況下,破壞核內(nèi)體和溶酶體膜,將分子導入細胞。
多數(shù)分子并不容易通過細胞膜。將分子導入活細胞溶質(zhì)的方法是調(diào)控和研究生物學過程的有用工具?,F(xiàn)今,最常用的方法包括顯微注射,紅細胞血影介導的融合及脂質(zhì)體融合,胞飲小體的滲透性溶解,刮擦負荷試驗,電穿孔,磷酸鈣和病毒介導的轉(zhuǎn)染方法。這些技術(shù)對于研究培養(yǎng)中的細胞是有用的,盡管在許多情況下并不實際,可能導致時間消耗,無法有效導入或誘導顯著的細胞死亡。因此,這些技術(shù)對于那些細胞需要保持功能的生物學。醫(yī)學研究或治療并不是最好的方法。
眾所周知,卟啉及許多其它光敏化合物可誘導對細胞和組織的細胞毒作用。這些作用是根據(jù)當光敏化合物在光照情況下會釋放單線態(tài)氧(′O2),單線態(tài)氧分解細胞膜和細胞結(jié)構(gòu),如果損傷廣泛,最終會殺死細胞。這種作用已被用于幾種腫瘤疾病的治療。此治療命名為光動力學療法(PDT),先注射一種光敏感的并具有腫瘤定位能力的染料,接著用光照射腫瘤區(qū)域。這種細胞毒作用主要是通過單線態(tài)氧的形成來介導的。這個活性中間產(chǎn)物在細胞中有一個非常短的壽命(<0.04μs)。這樣,PDT主要的細胞毒作用在光照下被執(zhí)行,并且非常靠近于′O2的形成位點?!銸2和蛋白質(zhì)(組氨酸,色氨酸,蛋氨酸,半胱氨酸,酪氨酸),DNA(鳥嘌呤),不飽和脂肪酸,膽固酸反應并氧化它們。PDT的優(yōu)點之一是未暴露于光下的組織不受影響。有大量的文獻關(guān)于使用PDT破壞不需要的細胞群如腫瘤細胞。有幾個專利涉及到單獨使用光動力化合物或者與定向到腫瘤細胞受體決定鎂的免疫球蛋白偶聯(lián)使得復合物更具有細胞特異性。某些光化學化合物,如血卟啉衍生物,而且具有天生濃聚于惡性細胞的能力。這些用于破壞不需要的細胞的方法和化合物在挪威專利號173319,挪威專利申請?zhí)?0 0731,90 2634,90 1018,941548,85 1897,93 4837,92 4151和89 1491中得到說明。
在PCT/US 93/00683中描述了一種藥物運輸系統(tǒng),它包括一種抗腫瘤藥和附著于共聚物載體的光激活藥物。該復合物在服用后通過胞飲和胞吞作用進入細胞內(nèi)部,并定位于核內(nèi)體和溶酶體內(nèi)部。在溶酶體內(nèi),抗腫瘤化合物和聚合物之間的鍵被水解,前者經(jīng)溶酶體膜被動擴散到細胞溶質(zhì)。因此,此方法僅限于能夠穿透溶酶體膜的小分子化合物。經(jīng)過一段時間延遲擴散之后,施用合適的波長和能量的光源激活可光激活的化合物??拱┧幬锛翱晒饧さ乃幬锏慕M合效應破壞了細胞,因此,所有已知的可光激活的化合物的使用都是導致廣泛地破壞細胞結(jié)構(gòu)以導致細胞死亡。通過定位破壞核內(nèi)體和溶酶體膜,使不能穿透這些膜的小分子釋放進入細胞溶質(zhì)的方法還尚屬未知。
因此本發(fā)明的目的在于提供一種將分子轉(zhuǎn)運到培養(yǎng)或組織活細胞中的方法,它是通過將細胞暴露于可光激活的化合物,能被轉(zhuǎn)送到細胞溶質(zhì)中的分子(多種分子),二者的攝取可以被各種載體易化。將細胞暴露于有合適波長和能量的光下以破壞核內(nèi)體和溶酶體膜,在不破壞大多數(shù)細胞的功能的情況下,將分子釋放入細胞溶質(zhì)中,光敏物質(zhì)和要被轉(zhuǎn)運入細胞溶質(zhì)的分子可以結(jié)合或分別與合適的載體一起施用,任選對目標分子攝取的易化。
本發(fā)明達到了以所附權(quán)利要求為特征的本發(fā)明的目標。
本發(fā)明涉及到一種將任何分子轉(zhuǎn)運到活細胞溶質(zhì)的方法。此后,細胞溶質(zhì)中可以找到此分子而細胞仍保持功能活性。此方法過程如下將細胞暴露于可光激活的化合物中,此化合物可被細胞吸收并定位于核內(nèi)體。溶酶體或其它細胞分隔腔(compartment)內(nèi),此可光激活的化合物或者分別與載體分子一起和靶向免疫球蛋白偶聯(lián),分子被轉(zhuǎn)運到細胞溶質(zhì),并且當細胞暴露于適當波長的光照下時,激活光敏化合物,這樣核內(nèi)體,溶酶體或其它細胞分隔腔膜被破壞,分子釋放進入細胞溶質(zhì),而未使細胞由于光活化的化合物和核內(nèi)體/溶酶體內(nèi)容物的可能作用而失去其功能。
本發(fā)明的詳細描述及圖示如下文

圖1描述了通過本發(fā)明的方法分子如何被導入細胞溶質(zhì)。光敏物質(zhì)(S)和所選的分子經(jīng)細胞內(nèi)吞(I.示啟幼內(nèi)吞過程中質(zhì)膜的凹入)和兩種物質(zhì)終于同一小泡內(nèi)(II)。當這些小泡暴露于光下時,小泡膜破裂,內(nèi)容物釋放(III);圖2在NHIK 3025細胞中,經(jīng)gelonin處理,含或不含TPPS2a,光照50秒后蛋白質(zhì)合成情況。符號○,TPPS2a+光;●,-TPPS2a-光;,+TPPS2a-光;,-TPPS2a+光。細胞經(jīng)3.2μg/ml
TPPS2a和所顯示的gelonin濃度過夜處理,每一例給予相同劑量的光照。蛋白質(zhì)的合成是通過光照后24小時,3[H]亮氨酸摻入蛋白質(zhì)的量來測定。圖3顯示僅經(jīng)過TPPS2a和光照處理后的劑量反應曲線(○)或者與0.2μg/ml()或2.0μg/ml gelonin(●)如圖2所描述的聯(lián)合作用的劑量反應曲線。圖4顯示在NHIK 3025細胞中經(jīng)3.2μg/ml TPPS2a,光照,有或無0.2μg/ml gelonin處理的條件下蛋白質(zhì)合成情況。符號●,TPPS2a-gelonin;○,TPPS2a+gelonin。這些細胞在有或無gelonin條件下經(jīng)TPPS2a過夜處理,并且暴露于所顯示劑量的光照下。蛋白質(zhì)的合成通過3[H]亮氨酸摻入蛋白質(zhì)的量來測定。圖5說明在V79細胞中,在缺乏和存在1μg/ml gelonin條件下經(jīng)25μg/ml AlPcS2和光照處理蛋白質(zhì)的合成情況。符號●光敏物質(zhì)+毒素○光敏物質(zhì)。圖6說明在H146細胞中,在缺乏和存在1μg/ml gelonin條件下用0.3μg/ml TPPS2a和光照處理,蛋白質(zhì)的合成情況。符號;如圖5示,圖7說明在V79細胞中,在缺乏和存在lμg/ml gelonin條件下,用1μg/ml TPPS2a和光照處理,蛋白質(zhì)的合成情況。符號如圖5示,圖8說明在NHIK 3025細胞中,在缺乏或存在1μg/ml gelonin條件下,用3.2μg/ml TPPS2a和光照處理,蛋白質(zhì)的合成情況。符號如圖5示,圖9說明在NHIK 3025細胞中,在缺乏或存在1μg/ml agrostin條件下,用3.2μg/ml TPPS2a和光照處理,蛋白質(zhì)的合成情況,符號如圖5所示。圖10說明在NHIK 3025細胞中,在缺乏或存在1μg/ml皂草素條件下,用0.25μg/ml 3-THPP和光照處理,蛋白質(zhì)的合成情況。符號如圖5所示,圖11說明在COS-7細胞中,在缺乏或存在1μg/ml gelonin條件下,用3μg/ml TPPS2a和光照處理,蛋白質(zhì)的合成情況。符號如圖5所示,圖12說明在NHIK 3025細胞中,在缺乏或存在TPPS4條件下,用gelonin處理后光照50秒,蛋白質(zhì)的合成情況。符號;■TPPS4+光;
-TPPS4-光;◇+TPPS4-光。這些細胞經(jīng)75μg/ml TPPS4和所示濃度gelonin過夜處理,在所有情況下給予相同劑量照。蛋白質(zhì)的合成通過光照后24小時3[H]亮氨酸摻入量來測定;圖13.說明在OHS細胞中,在光照之前,在缺乏或存在3μg/ml gelonin條件下,先用3μg/ml TPPS2a處理18小時接著4小時無TPPS2a,此時蛋白質(zhì)合成情況。細胞于50μM氯喹或10μM氯化胺中處理4小時以抑制溶酶體蛋白降解。
已報道許多藥物包括二和四磺基鋁酞菁,磺化四苯基卟吩(TPPSn),尼羅藍,二氫卟吩ε6衍生物,尿卟啉I,葉赤素和可能的血卟啉和亞甲基藍在培養(yǎng)中定位于核內(nèi)體和溶酶體中。在大多數(shù)情況下是由于內(nèi)吞活性。發(fā)明者顯示溶酶體中含有光敏物質(zhì)的細胞在光照下會導致溶酶體的通透性,釋放光敏物質(zhì)。在一些情況下,如TPPS2a和TPPS1,以PDT以后,在細胞溶質(zhì)中發(fā)現(xiàn)大量的溶酶體酶活性。表明在不失去其活性的情況下,溶酶體內(nèi)容物可以釋放到細胞溶質(zhì)中??偟膩碚f根據(jù)目前的調(diào)查,光敏染料的作用可用于從核內(nèi)體和溶酶體中釋放內(nèi)吞的分子。
將分子導入細胞質(zhì)的過程是通過以下過程實現(xiàn)的首先,把細胞或組織暴露于光敏染料中,需要轉(zhuǎn)移到細胞溶質(zhì)內(nèi)的分子與或不與載體分子和免疫球蛋白一起,所有這些優(yōu)先定位于核內(nèi)體和/或溶酶體中。其次,組織或細胞暴露于合適波長和能量的光下以誘導光動力學反應。這些光動力學反應將導致溶酶體和/或核內(nèi)體膜的裂解,這些小泡的內(nèi)容物將釋放到細胞溶質(zhì)中。
本發(fā)明的原理在圖1中得到說明。光敏物質(zhì)和要導入細胞的分子位于同一細胞分隔腔中是必要的。另一需要強調(diào)的是外加的分子也許會聚集在除了溶酶體,核內(nèi)體之外的其它的細胞內(nèi)分隔腔中如高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在這種情況下,假如光的劑量與光敏化合物的聯(lián)合作用并不破壞細胞的功能,位于同一分隔腔內(nèi)的光敏化合物也許與光聯(lián)合作用用于同一目的。
本發(fā)明是根據(jù)我們體外的顯示光敏物質(zhì),如TPPS2a,在鄰近苯基上帶有2個磺基的四苯基卟吩與光聯(lián)合作用在不殺死大部分細胞的情況下能夠誘導釋放功能完整的溶酶體內(nèi)容物。單獨使用其它光敏化合物或者與用作載體的其它分子或顆粒聯(lián)合也可以得到相同作用,這些載體可以將光敏物質(zhì)定位到核內(nèi)體/溶酶體或其它細胞內(nèi)分隔腔中。這樣的載體可以是組織或細胞特異性抗體或其它配基,它們能連結(jié)到細胞表面,通過受體介導的細胞內(nèi)吞提高光敏物質(zhì)的吸收。另一載體可以使用重建的LDL-顆粒。這些顆粒也能被受體介導的細胞內(nèi)吞所吸收。對比于天然LDL的預連結(jié),每個LDL顆粒上的光敏物質(zhì)分子數(shù)和LDL-顆粒上的連結(jié)數(shù)通過此法得到提高。
本發(fā)明不僅限于體外使用,也可以用于體內(nèi),或者通過原位處理,或者通過注射處理的細胞先體外后體內(nèi)處理。如象上述描述的體外處理的方式,吸收進入核內(nèi)體和溶酶體的能力可以加強。只要光敏物質(zhì)能被靶細胞吸收,光照被合適轉(zhuǎn)遞,所有組織都能被處理。
本發(fā)明根據(jù)光敏物質(zhì)和光照。光照必須被光敏物質(zhì)吸收或間接誘導光敏物質(zhì)的興奮狀態(tài)。因此,使用的波長區(qū)域依賴于光敏物質(zhì)。光照并不需要單色光或平行光。能夠發(fā)射合適波長的任一光源都能使用。
令人驚奇的是根據(jù)目前研究,光動力學反應似乎中和了釋放溶酶體內(nèi)容物的潛在的細胞毒作用。因此作者提出在培養(yǎng)的NHIK 3025細胞中,溶酶體的組織蛋白酶被TPPS2a的光動力學(fotodynamic)反應顯著抑制。這是本發(fā)明的一個令人驚奇的效應,通過裂解核內(nèi)體/溶酶體的膜將分子轉(zhuǎn)移進細胞溶質(zhì),它有助于維持細胞的存活和功能。實驗與臨床應用的實施例1)腫瘤治療幾種光敏物質(zhì)優(yōu)先聚集在腫瘤組織中,對于腫瘤組織的選擇通常超過周圍組織的2-3倍,但此系數(shù)在某些情況下比如腦組織也許會更高,即達到30。那些對于治療腫瘤有臨床意義的分子,但限于低的或根本無法攝入細胞溶質(zhì),可以經(jīng)過本發(fā)明的方法導入細胞溶質(zhì),如下列例子中的Gelonin,即是這樣的一種分子。幾種其它的分子,或者單獨使用,或者連結(jié)到別的分子上(如抗體,轉(zhuǎn)鐵蛋白,光敏物質(zhì),重建LDL-顆粒上的apoB)使用。這種聯(lián)合治療的優(yōu)點是1)因為低劑量或亞毒性劑量的光照足夠裂解溶酶體和核內(nèi)體,加強了腫瘤組織深層的細胞毒效應;2)因為PDT僅用于腫瘤區(qū)域,加強了毒素的特異性。2)基因治療基因治療,即治療性轉(zhuǎn)移基因到病人細胞中,對于治療許多遺傳性疾病如腫瘤,膀胱纖維化,心血管疾病和許多其它疾病是一種有前途的方法。目前主要問題是轉(zhuǎn)染必須在體內(nèi)執(zhí)行或在某些情況下先體外后體內(nèi)。目前最常用的載體,即幫助轉(zhuǎn)移DNA分子進入細胞的結(jié)構(gòu),是不同類型的病毒,尤其是逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒。這些方法的缺點是載體的穩(wěn)定性不高,有限制的特異性,低產(chǎn)率及把病毒DNA導入人體細胞。
借助于光化學誘導的核內(nèi)體或/和溶酶體的破裂,DNA或反義DNA,整個基因都能進入細胞。此處理可以在體內(nèi)執(zhí)行。3)實驗應用本發(fā)明可用于導入大范圍的分子進入培養(yǎng)的細胞,如基因,抗體,處理的蛋白和化合物,這些通常不透過質(zhì)膜的分子。
本發(fā)明通過下列非限定性的實施例做進一步說明。實施例1.此實例說明光動力學處理釋放了一種抑制蛋白質(zhì)合成的化合物進入細胞溶質(zhì)許多植物毒素通過進入細胞溶質(zhì),酶促滅活核糖體的功能而殺死細胞的。大部分細胞毒植物蛋白含有兩條多肽鏈,A鏈和B鏈,經(jīng)二硫鍵連在一起。B鏈的功能是連結(jié)蛋白至細胞表面,而A鏈則含有酶促活性。Gelonin是一種植物毒素,它能在無細胞系統(tǒng)中有效抑制蛋白質(zhì)合成,但對于完整細胞則極少或完全沒有作用。對于完整細胞低的細胞毒作用可能由于gelonin中缺乏B鏈。
NHIK 3025細胞在暴露于光之前,先用TPPS2a(通式I)和gelonin分別或一起孵育18小時,接著在含有TPPS2a而無gelonin的培養(yǎng)基中孵育1小時。曝光后24小時測定蛋白質(zhì)的合成。光動力學處理,單獨使用將殺死10-20%的細胞,降低蛋白質(zhì)合成30-40%(圖2)。如在圖2中所見到的在缺乏或存在光照的情況下單獨使用gelonin在某種程度上抑制蛋白質(zhì)合成。然而聯(lián)合使用PDT和IC50=0.2μg/ml gelonin可完全抑制蛋白質(zhì)的合成。因此在無光動力學處理的情況下,gelonin基本上不進入細胞溶質(zhì)。此例說明TPPS2a和光照可以用于將功能完整的大分子導入細胞溶質(zhì)。
實施例2.
此例說明光的劑量(用染料所吸收的波長)如何來決定細胞存活級分的大小。
根據(jù)實施例1的設計,NHIK 3025細胞用TPPS2a和gelonin孵育。
曝光后24小時測定細胞克隆的存活。正如圖3所顯示,事實上當曝光量增加時,TPPS2a和光殺死了所有的細胞。這與以前關(guān)于用PDT殺死不需要的細胞的技術(shù)是一致的。當gelonin加入時,由于gelonin對蛋白合成的抑制作用,存活率下降。表明gelonin釋放到細胞質(zhì)中。增加gelonin的濃度導致更多的gelonin存在于細胞溶質(zhì)中,在圖中顯示為增加了細胞對光激活的敏感性。
因此,本發(fā)明提供了在每一種情況下設置存活水平,選擇光敏化合物和曝光量的組合來保持所需的活細胞組分的可能性。實施例3.
本例說明如何改變光劑量來控制gelonin釋放到細胞溶質(zhì)中的量,此量由相對的蛋白合成來決定。
根據(jù)實施例1的設計,NHIK 3025細胞用TPPS2a和gelonin來孵育。
圖4表明超過50秒的毒性劑量以上的光劑量增加了gelonin在細胞溶質(zhì)中的組成,此組成由相對的蛋白合成來決定。
實施例4-11說明根據(jù)本發(fā)明在不同細胞系,不同的光敏物質(zhì)和毒素中方法的使用。光敏物質(zhì)細胞內(nèi)定位是溶酶體(TPPS4,TPPS2a,AlPcS2a)和溶酶體外(3-THPP)。下列簡寫被使用AlPcS2a指在鄰近苯環(huán)上帶有2個磺基的鋁酞菁;TPPS4指帶有4個磺基的中-四苯基卟吩;TPPS2a指在鄰近苯環(huán)上帶有2個磺基的中-四苯基卟吩;3-THPP指四羥苯基卟吩。所使用的細胞系是人子宮頸原位癌細胞(NHIK3025),中國倉鼠肺成纖維細胞(V79),SV40-轉(zhuǎn)化的非洲綠猴腎(CV1-猴成纖維狀細胞)(COS-7),人成骨肉瘤細胞(OHS)和小細胞肺癌細胞(H146)。所有的實驗和實施例1設計相同。實施例4.
本例涉及到在V79細胞中,在有/無gelonin作為毒素的條件下使用光敏物質(zhì)AlPcS2a(圖5)。通過選擇特定的光劑量(照射時間),圖5表明,在無毒素時,只有極少量的細胞受到破壞,表示為在蛋白合成中只有少量降低,而在有g(shù)elonin時,蛋白合成顯著下降,這表明盡管AlPcS2a細胞內(nèi)定位是溶酶體,gelonin分子通過溶酶體轉(zhuǎn)運到胞漿內(nèi)基本上不損傷細胞(Moan,J.,Berg,K.,Anholt,H.and Madslien,K.(1994)磺化鋁酞菁做為光化學治療中的敏感劑。在V79細胞中小劑量光照對定位,熒光染料和光敏感性的作用。Int.J.Cancer 58865-870)。實施例5.本例說明在基本不影響細胞生存的條件下將毒素gelonin轉(zhuǎn)遞到H146細胞中(圖6)。已知TPPS2a定位于細胞的溶酶體中(Berg,K.,Western,A.,Bommer,J和Moan,J.(1990)磺化中-四苯基卟吩在人癌細胞系中的細胞內(nèi)定位。photochem.Photobiol.52481-487;Berg,K.,Madslien,K.,Bommer,J.C.,Oftebro,R.,Wmkelman,J.C.和Moan,J.(1991)。在NHIK 3025細胞中,光誘導的磺化中-四苯基卟吩的重新定位和劑量級分的作用。photochem.photobiol.53203-210;Berg,K.和Moan,J.(1994),作為光化學靶子的溶酶體。Int.J.Cancer.59814-822)。實施例6.本例說明根據(jù)發(fā)明在V79細胞中用TPPS2a為光敏物質(zhì)的方法(圖7)。實施例7.本例說明使用TPPS2a為光敏物質(zhì),將毒素agrostin轉(zhuǎn)入NHIK3025細胞中(圖8)。實施例8.本例說明用TPPS2a將毒素saporin轉(zhuǎn)入NHIK 3025細胞中(圖9)。實施例9.這是一個對照例子,它說明并不進入內(nèi)吞小泡(即核內(nèi)體和溶酶體)的感光劑(3-THPP)(Peng,Q.,Danielsen,H.E.和Moan,J.(1994)腫瘤光動力學治療中強大的光敏物質(zhì)應用共聚焦激光掃描顯微鏡熒光檢測腫瘤細胞和組織中的光敏熒光團。在生物醫(yī)學的顯微鏡術(shù),全息照相術(shù)和干涉測定法中。SPIE Vol.208371-82),在有或無gelonin(圖10)時,3-THPP對蛋白合成的作用并無顯著差別。因此gelonin并未運送到細胞溶質(zhì)中。實施例10.
本例說明根據(jù)發(fā)明使用TPPS2a將gelonin運送到COS-7細胞中(圖11)。實施例11.
本例說明根據(jù)發(fā)明使用TPPS2a將gelonin運送到OHS細胞中(圖13)。在此細胞系中,溶酶體內(nèi)蛋白有顯著降解,此降解在本實例中可以在50μM氯喹或10mM氯化銨中孵育4小時得到抑制。實施例12.與實施例1類似,本實例說明當細胞用TPPS4和不同濃度gelonin孵育,并暴露于光時,將gelonin運送到NHIK 3025細胞中,gelonin濃度的功能(圖12)。當細胞單獨用gelonin孵育并暴露于光或用TPPS4和gelonin共同孵育不暴露于光,沒有g(shù)elonin運送到細胞中。
此例說明使用不同的感光劑和不同劑量的光,不同的分子可以被導入多種廣泛的細胞的溶質(zhì)中。只要想導入的分子和光敏物質(zhì)被運送至同一細胞分隔腔中,在不殺死細胞的光敏物質(zhì)和光照之后,外源性分子能被導入細胞溶質(zhì)。對于生物分隔腔的光化學作用依賴于那個細胞分隔腔中的光敏物質(zhì)的量,施用的光劑量和光源的光譜特性。因此,評估對培養(yǎng)的細胞的光化學作用的最好的方法是處理后24小時或更長時間內(nèi)測量細胞的存活。如上述處理以后24小時對細胞的殺傷作用和對蛋白合成的抑制之間有良好的相關(guān)性(數(shù)據(jù)沒有列出)。
權(quán)利要求
1.通過使用光敏化合物和被光敏化合物吸收的光照,將分子導入活細胞溶質(zhì)的方法,其特征在于a).光敏化合物,任選載體分子和將被運送的分子,它們結(jié)合在一起或各自被施用于活細胞和;b).經(jīng)內(nèi)吞或其它方式轉(zhuǎn)運到核內(nèi)體,溶酶體或其它細胞內(nèi)膜限制的細胞分隔腔(Compartment)中;其中c).根據(jù)光敏化合物的吸收光譜,細胞被暴露于合適波長的光照下,光照的不同劑量取決于所需的存活率,這樣核內(nèi)體,溶酶體或其它細胞內(nèi)分隔腔的膜破裂,要導入細胞溶質(zhì)的分子釋放到細胞溶質(zhì)中,并且光激活的光敏化合物的本身并不殺傷大多數(shù)的細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其特征在于,釋放到細胞溶質(zhì)的分子選自DNA、寡(脫氧)核苷酸、mRNA、反義DNA、糖、蛋白質(zhì)、肽、非膜通透性藥物,其它非膜通透性分子,和上述分子共價或非共價鍵合的組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其特征在于,釋放到細胞溶質(zhì)的分子選自能夠修飾蛋白合成活性的物質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法,其特征在于,釋放到細胞溶質(zhì)的化合物有g(shù)elonin、皂草素或agrostin或這些化合物任意的組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其特征在于,使用的光敏化合物選自卟啉類化合物、酞菁(phtalocyanines)類化合物、紅紫素類化合物、二氫卟酚類化合物、苯并卟啉類化合物、napthalocyanines類化合物、陽離子染料類化合物、四環(huán)素類化合物和趨溶酶體的弱堿類化合物及其衍生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法,其特征在于使用的光敏化合物為在鄰近的苯基上帶有2個磺基的四苯基卟吩(TPPS2a),帶有4個磺基的中-四苯基卟吩(TPPS4)或者在其鄰近的苯環(huán)上帶有2個磺基的鋁酞菁或其任意組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其特征在于使用的載體分子是位點定向的分子或者能促進光敏化合物或要釋放進細胞溶質(zhì)的分子的吸收的增強劑(enhancer)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,其特征在于通過選擇與光敏化合物濃度有關(guān)的光照劑量來調(diào)節(jié)存活細胞的組分(fraction)。
9.在溫血動物或細胞培養(yǎng)中修飾成瘤和其它細胞過程的組合物包含要釋放進細胞溶質(zhì)的化合物和光敏物質(zhì)及載體,其特征在于,它包含選自如下的成員a)有助于向細胞內(nèi)分隔腔如核內(nèi)體,溶酶體或其它細胞內(nèi)分隔腔運送的載體,其上粘附有要在細胞溶質(zhì)中釋放的細胞加工-修飾化合物和通過光激活裂解細胞內(nèi)分隔腔膜的光敏化合物,b)幾個所說的載體,其中至少一個載體上粘附有要在細胞溶質(zhì)中釋放的化合物,另一個相似或不相似的載體上粘附有光敏化合物和,c)載體分別與要在細胞溶質(zhì)中釋放的化合物以及光敏化合物一起形成的混合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物,其特征在于,所說的要在細胞溶質(zhì)中釋放的化合物是抗腫瘤化合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的組合物,其特征在于,抗腫瘤化合物是gelonin。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物,其特征在于,在細胞溶質(zhì)中釋放的化合物選自DNA、寡(脫氧)核苷酸、mRNA、反義DNA、糖、蛋白質(zhì)、肽、非膜通透性藥物、其它非膜通透性分子,上述提及的分子的共價或非共價連接的組合。
13.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物,其特征在于,光敏化合物是從下面一組含有卟啉類化合物、酞菁(phtalocyanines)類化合物、紅紫素類化合物、二氫卟吩類化合物、苯并卟啉類化合物、napthalocyanines類化合物、陽離子染料類化合物、四環(huán)素類化合物和趨溶酶體的弱堿類化合物及其衍生物。
14.根據(jù)權(quán)利要求11的組合物,其特征在于光敏化合物是在鄰近苯基上有兩個磺基的四苯基卟吩。
15.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物,其特征在于載體選自具有位點定向的分子或能促進光敏化合物或者在細胞溶質(zhì)中釋放的分子的吸收的增強劑。
16.實施根據(jù)權(quán)利要求1的方法的試劑盒,其特征在于,它包括光敏化合物以及修飾細胞膜運輸?shù)?,有助于某些細胞群或其它相關(guān)的功能的其它化合物。
全文摘要
描述了一種將分子釋放入細胞溶質(zhì)中但并不殺死大多數(shù)細胞的方法,它允許由核內(nèi)體,溶酶體或其它細胞分隔腔攝取該分子并用光激活光敏化合物以使核內(nèi)體,溶酶體或其它的細胞分隔腔的膜的破裂。
文檔編號A61K47/00GK1164829SQ95196065
公開日1997年11月12日 申請日期1995年9月4日 優(yōu)先權(quán)日1994年9月8日
發(fā)明者K·伯格, K·沙得維克, J·莫安 申請人:光固化有限公司
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