專利名稱：使用1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-d-葡糖醇的n-烷基衍生物治療乙型肝炎病毒感染的制作方法
相關(guān)申請本申請是1994年1月13日遞交的共同未決申請流水號08/181,519的后續(xù)申請。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及抑制乙型肝炎病毒的新方法，更具體地說，本發(fā)明涉及使用1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-葡糖醇的N-烷基衍生物以抑制受所說病毒感染的細(xì)胞中乙肝病毒的復(fù)制和分泌。
乙型肝炎病毒(HBV)是急性和慢性肝病的病原體[阿約拉等，世界健康組織公報(bào)，66,443-455(1988)]。盡管可得到有效的疫苗[目前使用的兩種HBV疫苗是麥克公司的Recombivax HB和史密斯克蘭.比徹姆公司的Engerix-B]，但世界上仍有3億多人受病毒的慢性感染[埃德等，肝病進(jìn)展，潑伯和沙夫納編輯(Grune & Stratton，奧拉多，F(xiàn)L)，第8卷，PP.367-394(1986)]。對他們而言，疫苗沒有治療作用。根據(jù)理查德.杜馬博(國家傳染病基金會的高級官員)的報(bào)道，僅美國每年估計(jì)有300,000例HBV感染發(fā)生[醫(yī)學(xué)世界新聞34(18).20-21(1993)]。受HBV慢性感染的病人中有25-40％會發(fā)展成嚴(yán)重的肝病。因此，發(fā)現(xiàn)有效的抗HBV療法很重要。
α-干擾素已被用于治療HBV感染，在某些病人中結(jié)果是樂觀的[Hoofnagle和Jones，第9屆肝病研討會，231-233(1989)；和Perrillo，第9屆肝病研討會240-248(1989)]。目前美國FDA允許的慢性HBV感染的唯一治療藥物是重組干擾素α-2b(內(nèi)含子A，先靈-普勞分司)。由于20個(gè)病人中有6個(gè)出現(xiàn)與藥物相關(guān)的肝臟障礙，故最近停止了使用核苷類似物fialuridine治療慢性乙型肝炎的臨床試驗(yàn)。因此很需要安全的乙型肝炎的藥物治療。
最新報(bào)道表明病毒編碼的DNA聚合酶是令人感興趣的目標(biāo)，所述DNA聚合酶行使逆轉(zhuǎn)錄酶的作用[Doong等，美國國家科學(xué)院院刊，88，8495-8499(1991)；Lee等，抗微生物試劑化學(xué)33.336-339(1989)；Price等，美國國家科學(xué)院院刊86，8541-8544(1989)；和Venkateswaran等，美國國家科學(xué)院院刊84，274-278(1987)]。
尚未有針對其他病毒介導(dǎo)過程的抗病毒干涉方法。針對HBV的有效抗病毒療法可能涉及多種策略，包括影響宿主免疫系統(tǒng)的藥劑以及那些影響病毒生命周期之不同步驟的藥劑。因此探查病毒生命周期中其他非聚合酶介導(dǎo)的步驟受干涉作用的傷害的可能性是令人感興趣的。
1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-葡糖醇(也已知為1-脫氧野尻霉素或DNJ)及其N-烷基衍生物是已知的N-連接寡糖加工酶，α-葡糖苷酶I和II的抑制劑。Saunier等，生物化學(xué)雜志257，14155-14161(1982)；Elbein，生化研究年鑒56，497-534(1987)。作為葡糖糖類似物，它們也具有抑制葡糖基轉(zhuǎn)移酶的潛力。Newbrun等，口腔生物學(xué)進(jìn)展28，516-536(1983)；Wang等，四面體通訊34，403-406(1993)。它們抗葡糖苷酶的抑制活性導(dǎo)致了這些化合物作為抗高血糖劑和抗病毒劑的開發(fā)。例見PCT國際申請WO87/03903和美國專利4,065,562；4,182,767；4,533,668；4,639,436；4,849,430；4,957,926；5,011,829；和5,030,638。
到目前為止，由于缺乏允許的為檢測目的的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，故有關(guān)抑制劑對乙型肝炎病毒(HBV)的作用的研究很少。即至今為止，沒有繁殖和生產(chǎn)性地用病毒感染組織培養(yǎng)物的能力已成為發(fā)現(xiàn)有用抗HBV劑的嚴(yán)重局限。
在一項(xiàng)研究中已報(bào)道了N-甲基脫氧野尻霉素可抑制小鼠肝炎病毒(MHV)的形成，因此細(xì)胞表面E2的出現(xiàn)得以延遲。見Repp等，生物化學(xué)雜志280，15873-15879(1985)；Datema等，臨床藥理學(xué)33，221-286，260(1987)。然而MHV與乙型肝炎病毒(HBV)不相關(guān)。在一個(gè)方面，HBV是嗜肝DNA病毒家族的成員，它是人體中小的病毒病原體。HBV大小約為42nm，其DNA基因組的大小為3.5Kb。
另一方面，MHV是冠狀病毒家族的成員，它是大的含RNA病毒，盡管可導(dǎo)致上呼吸道感染的人冠狀病毒病原體是常見的，但MHV不是人的病原體。MHV的大小約為100-150nm(相當(dāng)多效)，其RNA基因組的大小約為30Kb。HBV和MHV之間幾乎無相似性。參照K.Holmes，病毒學(xué)，第二版，B.Fields編輯PP.841-856，Raven Press，紐約，紐約州，1990可得到冠狀病毒(包括MHV)的其他背景信息和完整的描述。
最近有兩個(gè)不同的科學(xué)團(tuán)體報(bào)道丁型肝炎病毒(HDV)的分泌并不依賴于HBVsAg的糖基化，從中可明顯看出不能從一種病毒的結(jié)果預(yù)測另一種病毒的結(jié)果。W.Hui-Lin等，摘要115，和C.Gurean等，摘要117，1994年會議提交的論文摘要，“乙肝病毒的分子生物學(xué)”10月3-6日，1994年。巴斯德研究所，巴黎，法國。
HDV并未指定其自身的被膜蛋白，它與HBV感染相同的細(xì)胞，并使用HBVS抗原(HBV被膜蛋白)以制成感染性的、成熟的HDV顆粒。區(qū)別在于HBV的分泌依賴糖基化作用和聚糖修飾。即盡管HBV和HDV由相同的被膜蛋白組成，但HDV的分泌不依賴于糖基化作用，而HBV對糖基化作用非常敏感。
Pizer等，病毒學(xué)雜志34，134-153(1980)；Datema等，文獻(xiàn)同上，270頁中描述了糖基化作用抑制劑衣霉素對乙型肝炎病毒細(xì)胞培養(yǎng)物系統(tǒng)的作用。然而，衣霉素不必要地并完全地阻止了N-連接的寡糖類加入到新近合成的多肽中。即用衣霉素治療可導(dǎo)致對蛋白質(zhì)N-連接糖基化作用的完全抑制，對細(xì)胞非常有毒。而且，對受HBV感染的細(xì)胞進(jìn)行衣霉素治療不會導(dǎo)致HBV分泌的顯著降低。
本發(fā)明的簡要描述根據(jù)本發(fā)明，提供了一種抑制受乙型肝炎病毒(HBV)感染的細(xì)胞中所說病毒的方法。此方法包括用有效量的1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-葡糖醇的N-烷基衍生物治療所說細(xì)胞以抑制HBV病毒顆粒的復(fù)制和分泌，其中所說烷基基團(tuán)含有3至6個(gè)碳原子。N-烷基基團(tuán)優(yōu)選為丁基。
在本發(fā)明較優(yōu)選的說明實(shí)施例中，N-丁基-1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-葡糖醇(NB-DNJ)在經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Hep G2.2.15細(xì)胞和經(jīng)HBV感染的HepG2細(xì)胞中都表現(xiàn)出可抑制HBV顆粒的分泌并可導(dǎo)致HBV DNA的胞內(nèi)滯留。
HepG2細(xì)胞是熟知的，廣泛分布的，很容易得到的人肝癌細(xì)胞。美國專利4,393,133中描述了HepG2細(xì)胞系的建立和特征。此細(xì)胞系的樣品也可得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，Maryland)，入藏登記號為ATCC HB 8065，還可得自歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(PortonDown UK)。在Broze和Miletich，美國國家科學(xué)院院刊84，1886-1890(1987)和美國專利4,996,852；5,106,833和5,212,091中，這些細(xì)胞已被用作多種蛋白質(zhì)的來源，例如，組織因子抑制劑(TFI)，此抑制劑也已知為與脂蛋白相關(guān)的凝聚抑制劑(LACI)。
HepG 2.2.15細(xì)胞是Hep G2細(xì)胞的衍生物，可如Sells等人在美國國家科學(xué)院院刊84，1005-1009(1987)中的描述制備。
由于以前報(bào)道過用衣霉素治療產(chǎn)生HBV的細(xì)胞會導(dǎo)致正常的HBV顆粒分泌，因此本發(fā)明的方法可抑制HBV顆粒的分泌非常出乎意料。見Grippon等，乙肝病毒分子生物學(xué)，圣迭哥，加州，摘要67頁(1992)。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)衣霉素可抑制HBV病毒顆粒而不是亞病毒顆粒的分泌。
經(jīng)由本發(fā)明方法的治療而導(dǎo)致的胞內(nèi)HBV DNA的增加也是出乎意料的。
由于每分子HBV被膜蛋白僅含有一個(gè)或兩個(gè)N-連接的聚糖，故DNJ的N-烷基衍生物抑制這種適度(由重量計(jì))糖基化的蛋白質(zhì)及它們的病毒粒子(毒粒)產(chǎn)物的分泌的能力與它們對含有重度糖基化之被膜蛋白的HIV的分泌的較小作用相比是令人驚奇的。還驚奇地發(fā)現(xiàn)含有大的共羧基末端的蛋白質(zhì)LHB和中等大小MHB的HBV病毒粒子和顆粒比富含小SHB的顆粒對N-丁基DNJ更加敏感。
使用規(guī)定的DNJ N-烷基衍生物的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它們相對而言無毒性。例如，已知N-丁基衍生物在其可抑制HIV復(fù)制的有效濃度(EC50＝43μM)下是無毒的(TD50，5mM)。例見Bryant等，第10屆國際艾滋病會議摘要，柏林，6月7-11日，1993年。本文也顯示了受HBV感染并經(jīng)1000μg/ml DNJ的N-丁基衍生物治療的HepG2.2.15細(xì)胞中有90％可與未經(jīng)處理的對照一樣存活。
鑒于本文所闡明的結(jié)果，可相信能抑制HBV毒粒轉(zhuǎn)運(yùn)或糖基化修飾途徑之步驟的其他化合物對于在組織培養(yǎng)物和哺乳動(dòng)物宿主中抑制HBV形態(tài)發(fā)生也是有用的。
本發(fā)明的詳細(xì)描述由于說明書是以特別指出并清楚要求了認(rèn)為形成本發(fā)明的主題物質(zhì)的權(quán)利要求結(jié)束的，故可相信從以下結(jié)合附圖的說明性的詳細(xì)描述中能更好地理解本發(fā)明。


圖1表示HBV被膜蛋白的基因圖譜。最上方的線表示HB基因的線性圖譜，其上顯示出pre S1、preS2和S區(qū)域。此圖譜下方的數(shù)字表示區(qū)域的界限，以氨基酸數(shù)目表示，不同的HBV株此數(shù)目有所不同。右手欄中的百分?jǐn)?shù)值表示對每個(gè)HB而言，非、一-、和二-糖基化蛋白質(zhì)的份額，此值來自Gerlich和Bruss，乙肝病毒的分子生物學(xué)，A.Mclachlan編輯，CRC出版，pp.109-144(1992)，和臨床實(shí)踐中的乙肝疫苗，R.W.Ellis編輯，Marcel Dekker公司，pp，41-82(1992)。
圖2分兩部分，即圖2A和2B，它們表示在培養(yǎng)基中和經(jīng)N-丁基脫氧野尻霉素(NBDNJ)處理的培養(yǎng)物細(xì)胞中HBV DNA的放射自顯影。在所示濃度的NBDNJ存在下，更換一次培養(yǎng)基，將HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)6天。6天后(培養(yǎng)的第7天)收集細(xì)胞和培養(yǎng)基，經(jīng)膜與HBV探針雜交檢測出的病毒DNA的放射自顯影即可顯現(xiàn)出來。
圖2A從2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)基中回收的DNA的Southern印跡的放射自顯影，所述細(xì)胞維持在不含NBDNJ的培養(yǎng)基中(泳道1和2)；以及在含以下NBDNJ濃度的培養(yǎng)基中200μg/ml(泳道3)；500μg/ml(泳道4)；和1000μg/ml(泳道5)。
圖2B經(jīng)EcoRI完全消化的總胞內(nèi)DNA的Southern印跡放射自顯影，所述DNA來自維持于無NBDNJ(泳道1)和有下述NBDNJ濃度存在的培養(yǎng)基中的細(xì)胞泳道2200μg/ml；泳道3500μg/ml；泳道41000μg/ml；泳道5經(jīng)EcoRI消化的，分離自由未經(jīng)處理的2.2.15細(xì)胞制備的毒粒DNA。
泳道6質(zhì)粒DNA作為雜交對照。箭頭表示對松環(huán)HBV基因組(A)和線性化3.2Kb基因組(B)而言預(yù)期的遷移率。
圖3分四部分，即圖3A、3B、3C和3D，它們表示經(jīng)HBV感染并經(jīng)NBDNJ處理的細(xì)胞和HepG2細(xì)胞培養(yǎng)基中HBV DNA的凝膠電泳和直方圖。
圖3A和圖3C經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分辨毒粒的DNA，所述毒粒可與MHB的單克隆抗體免疫沉淀。
泳道1分子量標(biāo)記物；泳道2空白；泳道3未接受NBDNJ的細(xì)胞的培養(yǎng)基；泳道4和5接受200μg/ml NBDNJ的細(xì)胞的培養(yǎng)基；
泳道8和9700μg/ml NBDNJ；10和111000μg/ml NBDNJ。
這些帶是經(jīng)光密度法成象的，峰下的面積示于圖3C，其中取每個(gè)NBDNJ濃度的兩個(gè)樣品的平均值作圖。
圖3B和圖3D經(jīng)PCR擴(kuò)增得自在圖3A中經(jīng)HBV感染并經(jīng)NBDNJ處理的培養(yǎng)物胞內(nèi)的DNA，泳道中含有得自下列樣品的經(jīng)擴(kuò)增的DNA泳道1和2無NBDNJ；泳道3和4200μg/ml NBDNJ；泳道5和6500μg/ml NBDNJ；泳道7和8700μg/ml NBDNJ；泳道9和101000μg/ml NBDNJ。
圖3D圖3B凝膠光密度掃描平均峰下的面積直方圖。
圖4分六部分，即圖4A、4B、4C、4D、4E和4F，它們表示非分級分離培養(yǎng)基和部分純化的毒粒制品中存在的HBV抗原。使用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法檢測等體積所示樣品中的HBV被膜抗原。檢測3天培養(yǎng)物中非分級分離培養(yǎng)基(圖4A、4B和4C)或部分純化病毒(圖4D、4E和4F)樣品的HBVSHB(“S”)(圖4A和4D)，LHB“PreS1”(圖4B和4E)或MHB“PreS2”(圖4C和4F)的抗原表位。培養(yǎng)物保持在所示濃度的NBDNJ中，此濃度用沿X軸所示的毫摩爾單位表示。
為了比較，2.28mM大約相當(dāng)于500μg/ml NBDNJ。Y軸表示平板讀數(shù)器讀出的任意OD單位的ELISA反應(yīng)的比色信號。
圖5分三部分，即圖5A、5B和5C，它們表示經(jīng)NBDNJ處理的培和未經(jīng)處理的培養(yǎng)物培養(yǎng)基中的LHB和MHB的Western印跡分析。經(jīng)SDS-PAGE(13.5％丙烯酰胺)分辨培養(yǎng)基(圖5A)或部分純化的毒粒、得自未經(jīng)處理(圖5B)和經(jīng)NBDNJ處理(圖5C)之培養(yǎng)物的HB纖絲和球體的聚乙二醇(PEG)沉淀物，轉(zhuǎn)移到固定化電解質(zhì)(immobilin)紙上，并與PreS1和PreS2特異性的單克隆抗體一起保溫。
-泳道如圖5各部分的頂端所示，純化自人血清的1.0μg HBV(基因型D)被用作對照。
-圖5各部分的右邊顯示以千道爾頓(Kd)計(jì)的分子量標(biāo)記物(mw)。
-左邊的箭頭表示LHB(S1)和MHB(S2)多肽。
HBV被膜含有三個(gè)共羧基末端的蛋白質(zhì)(HB)，稱作大(LHB)、中等(MHB)和小(SHB)蛋白(見圖1)。這些蛋白質(zhì)是由單個(gè)開放閱讀框架(ORF)的交替翻譯起始得到的[Ganem.Hepadnaviruses，Mason和Seeger編輯(Springer-Verlag)，pp.61-84(1991)]。所有三種HB蛋白都與S區(qū)的氨基酸146處的復(fù)合型N-連接寡糖類一起出現(xiàn)[見圖1和Gerlich和Bruss，乙肝病毒的分子生物學(xué)，A.Mclachlan編輯.CRC出版.pp.109-144(1992)，臨床實(shí)踐中的乙肝疫苗，R.W.Ellis編輯.Marcel Dekker公司，pp.41-82(1992)]。
MHB(但LHB從不)也與PreS2區(qū)域的雜合型寡糖類一起出現(xiàn)。在HBV自然感染過程中，肝臟產(chǎn)生了大量過量的HB蛋白，它們是以直徑為20nM的纖絲或球狀亞病毒顆粒的形式分泌的[Ganem.Hepadna-viruses.pp.61-84(1991)；Gerlich和Bruss，乙肝病毒的分子生物學(xué)和臨床實(shí)踐中的乙肝疫苗，文獻(xiàn)同上]。HB圓球體最充足，它比HB纖絲和HBV顆粒含有少5至10倍的LHB。在所有三種類型的顆粒中，MHB是較少的成分[Gerlich和Bruss，乙肝病毒的分子生物學(xué)和臨床實(shí)踐中的乙肝疫苗，文獻(xiàn)同上]。
HBV的形態(tài)發(fā)生是復(fù)雜的，據(jù)信預(yù)裝配的病毒核心顆粒吸附到已插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)膜的病毒被膜(表面)蛋白的胞質(zhì)側(cè)[Gerlich和Bruss，乙肝病毒的分子生物學(xué)和臨床實(shí)踐中的乙肝疫苗，文獻(xiàn)同上]。
得到被膜后，毒粒芽出ER腔，通過高爾基體將它們從ER腔中轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外液中。不成熟的糖蛋白在N-連接的寡糖類上含有三個(gè)末端葡萄糖殘基。
據(jù)認(rèn)為末端葡萄糖殘基的去除在不成熟的糖蛋白從ER遷移到高爾基體的過程中起到重要作用[Datema和Romero，臨床藥理學(xué)33.22 1-286(1987)]。亞氨基糖NBDNJ是α-葡糖苷酶I的潛在抑制劑，所述酶是可從新生寡糖類去除末端葡萄糖殘基的細(xì)胞酶，已發(fā)現(xiàn)此酶可在體外抑制細(xì)胞毒人免疫缺損病毒(HIV)的形成[Karpas等，美國國家科學(xué)院院刊85.9229-9233(1988)；美國專利4,849,430；Walker等，美國國家科學(xué)院院刊84.8120-8124(1987)]。由于HBV的分泌需要都具有N-連接寡糖類的LHB和SHB，故試驗(yàn)了NBDNJ對病毒合成的作用。
為了進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明，實(shí)行了以下的實(shí)施例，但應(yīng)理解本發(fā)明不受這些特定實(shí)施例或本文所述細(xì)節(jié)的限制。
實(shí)施例方法細(xì)胞和培養(yǎng)基HepG2細(xì)胞購自歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(Porton Down.UK)。HepG2 2.15[2.2.15、Sells和Chen，美國國家科學(xué)院院刊84.1005-1009(1987)]細(xì)胞得自Dr.George Acs(Mt.Sinai醫(yī)學(xué)院，紐約，美國)。
所有組織培養(yǎng)物維持在5％CO2氛、添加有10％熱滅活的胎牛血清(Techgen，倫敦，英國)，50單位/ml青霉素和鏈霉素，1mM谷氨酰胺(GIBCO)的RPMI1640(GIBCO)培養(yǎng)基中。對于2.2.15細(xì)胞而言，可如Sells和Chen.美國國家科學(xué)院院刊84.1005-1009(1987)中所述，在培養(yǎng)基中加入200μg/ml抗生素G418(Genticin，GIBCO)。
與碘化丙錠一起保溫后，使用FACscan細(xì)胞計(jì)數(shù)器(BectonDickinson公司，Sunnyvale，加州，美國)經(jīng)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)測量細(xì)胞的生存能力[Platt和Jacob，歐洲生物化學(xué)雜志208，187-193(1992)]。
HepG2細(xì)胞的感染超速離心后，經(jīng)過在40和46％蔗糖之間的沉降，從人血清或培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中純化HBV[Seifer等，病毒學(xué)179.300-311(1990)]。在0.02M的磷酸鉀緩沖液，pH7.4中透析毒粒，濃縮，37℃下用V8蛋白酶(得自金黃色葡萄球菌，Sigma化學(xué)公司)處理過夜，通過20％蔗糖/0.01M Tris.pH7.4、0.14M Nacl、0.005M EDTA(TNE)墊層離心8小時(shí)。將沉淀物重新懸浮于生長培養(yǎng)基中，然后用來接種HepG2細(xì)胞。
亞氨基糖化合物NBDNJ的合成是已知技術(shù)，它描述于Fleet等，F(xiàn)EBS通訊237，128-132(1988)。NBDNJ由G.D.Searle/孟山都公司以化合物SC-48334提供。
病毒DNA的檢測如Sells和Chen，美國國家科學(xué)院院刊84，1005-1009(1987)中所述，用聚乙二醇(PEG)8000(Sigma公司)沉淀大約5×106個(gè)細(xì)胞的培養(yǎng)基，澄清后，重新懸浮于0.5ml磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)中，用BeckmanT100.3轉(zhuǎn)子，以50,000rpm的轉(zhuǎn)速(約75,000×g)，穿過PBS中的20％蔗糖墊層沉降5小時(shí)。
如Sells和Chen，美國國家科學(xué)院院刊84，1005-1009(1987)]中所述，從沉淀物中制備DNA。為了進(jìn)行Southern印跡[Maniatis等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約(1982)]，可經(jīng)1.2％瓊脂糖電泳分辨DNA，轉(zhuǎn)移到H+鍵(Amersham)濾紙上，并與放射性的32p(Amersham)HBV探針(由試劑盒制造商(Amersham)所述，經(jīng)使用pHBV為模板的隨機(jī)引物法制備)雜交[Foster等，美國國家科學(xué)院院刊88.2888-2892(1991)]。
通過用PreS2抗原表位的單克隆抗體沉淀培養(yǎng)基可檢測經(jīng)來自血清的HBV感染的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)基中的子代病毒。使用與病毒基因組相關(guān)的核苷酸2815和190(以EcoRI位點(diǎn)為核苷酸1)為引物經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增得自免疫沉淀毒粒的DNA。用標(biāo)準(zhǔn)方法從細(xì)胞裂解物中制備DNA[Maniatis等，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港，紐約(1982)]。
經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測HBV蛋白本文所用的單克隆抗體是已知的，Heerman等，病毒學(xué)雜志52.396-402(1984)中描述了PreS1的抗體(MA18/7)；Heerman等，Intervirology2814-21(1987)中描述了PreS2的抗體(Q19/10)，也見Gerlich和Bruss.乙肝病毒的分子生物學(xué)，A.McLachlan等，CRC出版109-144(1992)和臨床實(shí)踐中的乙肝疫苗，R.W.Ellis編輯，Marcel.Dekker公司，pp.41-82(1992)；Heerman等，肝病病毒和肝病，Zuckermann編輯，A.R.Liss.697-701(1988)中描述了S的抗體(C20-2)。
在微量滴定孔中保溫樣品，此孔被LHB、MHB或SHB抗原表位的特異性單克隆抗體包被(4℃下過夜)并經(jīng)PBS中的1％BSA封閉。與病毒樣品保溫1小時(shí)(37℃)之后，用PBS/0.1％吐溫20非離子型去污劑將板洗滌4次。
通過與過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗HB抗體(Behring)一起保溫，隨后在鄰苯二胺(0.33mg/ml PBS-過氧化物溶液)中展開即可檢測束縛抗原。在Behring平板讀數(shù)器上讀出光密度，對一系列樣品稀釋度的純化病毒和總培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)以確保適當(dāng)?shù)亩拷Y(jié)果。
Western印跡如Gultekin和Heerman，分析生物化學(xué)172，320-329(1989)所述，將樣品溶解于負(fù)載緩沖液中，通過13.5％SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分辨樣品，轉(zhuǎn)移至PVDF(Millipore)膜上并用5％奶粉封閉。在室溫下，含1％牛血清白蛋白(BSA)的TNE中，與第一抗體保溫過夜，并在室溫下，于TNE中，與第二抗體(與過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG血清)保溫1小時(shí)之后，按制造商的說明中的描述，在過氧化物-二氨基聯(lián)苯胺(Sigma)，PBS中將膜展開。
結(jié)果NBDNJ減少了2.2.15細(xì)胞釋放劑培養(yǎng)基中的與毒粒相關(guān)的HBVDNA的量2.2.15細(xì)胞得自HepG2細(xì)胞系，它緩慢地將感染性的HBV以及亞病毒顆粒(HB顆粒和球體)分泌到培養(yǎng)基中[Heerman等，病毒學(xué)雜志52，396-402(1984)；和Sells等，美國國家科學(xué)院院刊84，1005-1009(1987)]。
為了測定NBDNJ對HBV產(chǎn)生和分泌的作用，將2.2.15細(xì)胞維持在含有不同濃度NBDNJ的培養(yǎng)基中達(dá)6天，在第3天更換一次培養(yǎng)基。在化合物中放6天后，從病毒中分離DNA(在以上“方法”中有述)。如圖2A所示，通過與放射性標(biāo)記的HBV DNA探針進(jìn)行Southern印跡雜交即可檢測出病毒的DNA。
在得自未經(jīng)處理的培養(yǎng)基的樣品中檢測到以松環(huán)和線形基因組長度的DNA的預(yù)期遷移率遷移的病毒特異性的DNA(泳道1和2)[Sells等，病毒學(xué)雜志62.2836-2844(1988)]。在得自經(jīng)NBDNJ處理之細(xì)胞培養(yǎng)基的病毒特異性DNA中存在明顯的依賴于劑量的增長(泳道3、4和5)。經(jīng)光密度法量化圖2A中所示的放射自顯影。光密度法表明500μg/ml(2.28mM)和1000μg/ml的NBDNJ分別導(dǎo)致90和99％的減少。經(jīng)FAC分析碘化丙錠染色細(xì)胞和[35]-S甲硫氨酸摻入蛋白質(zhì)測定出在1000μg/ml NBDNJ中維持6天的細(xì)胞中有90％同未經(jīng)處理的對照一樣有生活力，故減少并非由于NBDNJ的毒性。
經(jīng)NBDNJ處理的2.2.15細(xì)胞含有水平增高的胞內(nèi)HBV DNANBDNJ介導(dǎo)的在培養(yǎng)基中與毒粒相關(guān)的HBV DNA的減少可能是由于病毒DNA合成的減少，或者也可能是由于如毒粒裝配，轉(zhuǎn)運(yùn)或從細(xì)胞中泌出的后合成事件造成的。為了區(qū)別這些可能性，可比較未經(jīng)處理和經(jīng)NBDNJ處理的2.2.15細(xì)胞中胞內(nèi)HBV特異性DNA的量。
從經(jīng)處理和未經(jīng)處理的細(xì)胞中制備總細(xì)胞DNA，并用EcoRI完全消化使病毒基因組線性化。電泳分辨出大致等于微克量的消化產(chǎn)物(經(jīng)溴化乙錠染色并與細(xì)胞特異性探針雜交測定)，進(jìn)行Southern印跡并與HBV特異性探針雜交(圖2B)。在分離自未經(jīng)處理的2.2.15細(xì)胞的DNA中(泳道1)和分離自對照培養(yǎng)基的毒粒中(泳道5)檢測到以3.2Kb帶遷移的單位長度的HBV基因組。
泳道2、3和4分別含有得自經(jīng)200、500和1000μg/ml NBDNJ處理之細(xì)胞的DNA。與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，經(jīng)NBDNJ處理的細(xì)胞中明顯存在依賴于劑量的HBV DNA量的增加。對此放射自顯影的光密度測定表明，當(dāng)調(diào)節(jié)加樣差異時(shí)，利用與細(xì)胞MHC類III基因G1雜交作為加樣對照經(jīng)200、500和1000μg/ml NBDNJ處理過的細(xì)胞分別顯示出1.7、3.0、5.1倍的HBV拷貝豐度的增長。
經(jīng)HBV感染并經(jīng)NBDNJ處理的HepG2細(xì)胞釋放較少的子代病毒2.2.15細(xì)胞是研究穩(wěn)定轉(zhuǎn)染環(huán)境中HBV產(chǎn)生的有用系統(tǒng)。然而，這些細(xì)胞中HBV前基因組的合成可利用整合的病毒DNA模板而不是共價(jià)閉合的環(huán)狀病毒DNA模板，后者在自然感染過程中出現(xiàn)[Sells等，病毒學(xué)雜志62，2836-2844(1988)]。另外，這些細(xì)胞產(chǎn)生了釋放至培養(yǎng)基中的裸露核心顆粒以及多種亞基因組病毒DNA產(chǎn)物[Sells等，文獻(xiàn)同上]。
用經(jīng)蛋白酶修飾的HBV感染HepG2細(xì)胞，第二天，用對照培養(yǎng)基或含有不同濃度NBDNJ的培養(yǎng)基取代培養(yǎng)物培養(yǎng)基。感染5天后，用PreS2區(qū)核心部分特異性的單克隆抗體免疫沉淀子代毒粒。試驗(yàn)HBV特異性引物經(jīng)PCR擴(kuò)增HBV特異性的DNA序列。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分辨反應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng)溴化乙錠染色后成像(圖3A)。通過光密度分析法量化519個(gè)堿基對的產(chǎn)物(箭頭，圖3A)，圖示于圖3C中。盡管PCR會低估樣品中原始DNA濃度之間的差異，但顯而易見經(jīng)蛋白酶處理過的病毒感染，然后又經(jīng)700μg/ml(3.2mM)NBDNJ處理之細(xì)胞的培養(yǎng)基比未經(jīng)處理的樣品含有低一個(gè)數(shù)量級的病毒DNA。這些結(jié)果表明NBDNJ介導(dǎo)的釋放至培養(yǎng)基中的HBV的降低并不是經(jīng)2.2.15轉(zhuǎn)染之細(xì)胞系統(tǒng)所特有的。
經(jīng)HBV轉(zhuǎn)染并經(jīng)NBDNJ處理的HepG2細(xì)胞含有數(shù)量增加的胞內(nèi)HBV DNA由于經(jīng)HBV感染并經(jīng)NBDNJ處理的HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)基與2.2.15細(xì)胞類似，與降低量的毒粒相關(guān)DNA有關(guān)，故有興趣弄清楚經(jīng)處理的細(xì)胞內(nèi)是否伴隨有病毒DNA的增長。從對應(yīng)于圖3A和C中所示的樣品中制備總細(xì)胞DNA，使用PCR擴(kuò)增胞內(nèi)HBV特異性的DNA。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分辨反應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng)光密度法(圖3D)分析溴化乙錠染色的凝膠(圖3B)。很顯然，經(jīng)HBV感染，后來又經(jīng)NBDNJ處理過的HepG2細(xì)胞比未經(jīng)處理的細(xì)胞積累了更多量的病毒DNA。
經(jīng)NBDNJ處理和未經(jīng)處理的2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)基含有類似量的HBV被膜抗原2.2.15細(xì)胞可分泌毒粒以及亞病毒顆粒[Sells等，病毒學(xué)雜志62.2836-2844(1988)]。NBDNJ介導(dǎo)的培養(yǎng)基中毒粒相關(guān)DNA的減少可能是所有含HB顆粒分泌普遍減少的反映?；蛘呦∮卸玖ｎw粒選擇性減少，其他形式蛋白(大大過量)相對過剩。
為了區(qū)分這些可能性，通過ELISA和Western分析測定培養(yǎng)基中被膜抗原的量和特征。對澄清培養(yǎng)基中存在的SHB、MHB和LHB抗原的ELISA分析示于圖4A、B和C。此結(jié)果表明培養(yǎng)基中SHB(S)和LHB(PreS1)抗原的總量沒有顯著的變化。培養(yǎng)基中MHB(PreS2)抗原的總量有適度的，劑量依賴型的降低。在最高NBDNJ濃度(4.5mM或大約1000μg/ml)下大約降低2.5倍。這些結(jié)果經(jīng)Western印跡分析得以證實(shí)。圖5A表示對照培養(yǎng)物和經(jīng)1000μg/ml NBDNJ處理的培養(yǎng)基的Western印跡。此處表明經(jīng)NBDNJ處理過的培養(yǎng)基(圖5A、泳道3)和未經(jīng)處理的培養(yǎng)基(圖5A，泳道2)含有相似量的MHB(S2)和LHB(S1)抗原。
因此，NBDNJ不會導(dǎo)致培養(yǎng)基中SHB和LHB抗原量的普遍降低。然而經(jīng)ELISA測定，經(jīng)1000μg/ml NBDNJ處理的2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)基中MHB抗原的量降低了兩倍。
經(jīng)NBDNJ處理的2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)基含有沉降為完整毒粒的降低量的HBV被膜抗原為測定完整毒粒中存在的HB的量，經(jīng)超速離心通過蔗糖梯度分級分離培養(yǎng)基。濃縮得自經(jīng)處理和未經(jīng)處理培養(yǎng)物并沉降于40-46％蔗糖處的分泌毒粒，通過ELISA檢測HB蛋白。結(jié)果示于圖4D、4E和4F中。在含有毒粒的樣品中容易檢測到所有形式的HB，所述毒粒是從未經(jīng)處理的2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)基中制備的。
另一方面，在由2.25和4.5mM(分別約為500和1000μg/ml，作為比較)NBDNJ處理過的細(xì)胞培養(yǎng)基制備的樣品中實(shí)際上沒有可檢測到的HB蛋白。這表明在這些樣品的培養(yǎng)基中完整病毒的量有所降低。
對含有完整病毒、纖絲或球體的蔗糖梯度級分的Western印跡分析證實(shí)了ELISA結(jié)果(圖5B未經(jīng)處理的培養(yǎng)物，5C經(jīng)NBDNJ處理過的培養(yǎng)物)。經(jīng)SDS凝膠電泳分辨蔗糖梯度的等體積級分，轉(zhuǎn)移到膜上，與LHB(PresS1)特異性的抗體一起保溫，成像，再進(jìn)一步與MHB(PreS2)抗原表位特異性的抗體一起保溫。得自人血清的部分純化的HBV示于泳道5(圖5B和5C)以作為對照。
泳道1中分辨了遠(yuǎn)離含毒粒級分的級分(梯度底部附近)以顯示出抗體的特異性。如蔗糖中的沉降及存在(對毒粒而言)和缺乏(對亞病毒顆粒而言)病毒DNA所限定的，泳道2、3和4(圖5B和圖5C)含有含完整病毒、HB纖絲和球體的級分(分別地)。制備自經(jīng)NBDNJ處理的培養(yǎng)物的毒粒、纖絲和球體中存在的所有HB蛋白的量都有所降低(比較圖5B和5C中的泳道2、3和4)。MHB(PreS2抗原表位)的降低更加嚴(yán)重。用光密度法量化圖5B和5C中所示的圖像。
光密度法分析表明與未經(jīng)處理的樣品相比，經(jīng)NBDNJ處理過的毒粒樣品中LHB約降低4倍。在相同泳道(圖5C，泳道2與圖5B，泳道2相比)中MHB降低了12倍。應(yīng)注意到用于分離不同形式HB蛋白的梯度導(dǎo)致不同形式蛋白的級分“加富”。即，含毒粒的級分可能也含有纖絲和球體。正如免疫學(xué)分析的判斷，相對于圓球體和纖絲而言，它可能導(dǎo)致低估NBDNJ對毒粒釋放的作用。
然而，Western印跡分析的結(jié)果與ELISA結(jié)果是一致的，即經(jīng)NBDNJ處理的培養(yǎng)物含有近似量的總HB抗原，但毒粒級分中含大大減少的抗原物質(zhì)。
可用常規(guī)方法將本文所述的抑制性化合物給受HBV感染的病人施用，優(yōu)選以藥用可接受的稀釋劑和載體的制劑形式施用。這些化合物可以游離胺的形式或其鹽的形式被使用。藥用可接受的鹽衍生物的例子如HCl鹽。
這些抑制性化合物也可以前藥的形式被使用，如美國專利5,043,273和5,103,008中所述的6-磷酸化衍生物以及美國專利5,003,072；5,144,037；和5,221,746中所述的0-?；苌铩?yōu)選的這種衍生物是1，5-(丁基亞氨基)-1，5-二脫氧-D-葡糖醇，四丁酸鹽。
所施用活性化合物的量必須是有效量，即在醫(yī)學(xué)上有利的，但不存在超出其使用所帶來好處的毒性作用的量。預(yù)期成年人每天的劑量的正常范圍為大約1至1000毫克活性化合物。盡管可使用非腸道的施用形式，但優(yōu)選的施用途徑是以膠囊、片劑、糖漿、酏劑等形式口服。參考本領(lǐng)域一般的教科書，如雷明頓藥理科學(xué)，Arthur Osol編輯，第16版，1980，Mack出版公司，Easton.PA.，U.S.A即可制備出治療劑量的于藥用可接受的稀釋劑和載體中的合適的活性化合物制劑。
本領(lǐng)域技術(shù)人員在不背離本發(fā)明精神和范圍的情況下，讀過本公開文本之后，多種其他實(shí)施例對他們而言將是顯而易見的。所有這種實(shí)施例將包括在所附權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.在受感染的人宿主中治療乙型肝炎病毒感染的方法，包括給所說宿主施用有效量的1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-葡糖醇的N-烷基衍生物以抑制乙型肝炎病毒毒粒的復(fù)制和分泌，其中所說烷基基團(tuán)含有3至6個(gè)碳原子。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中烷基基團(tuán)是丁基。
3.如權(quán)利要求1的方法，其中有效抑制量是約1至1000mg。
全文摘要
本發(fā)明公開了治療乙型肝炎病毒(HBV)感染的方法，包括給受感染的宿主施用1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-葡糖醇的N-烷基衍生物，其中烷基基團(tuán)含有3至6個(gè)碳原子。
文檔編號A61P31/20GK1149253SQ94195049
公開日1997年5月7日 申請日期1994年12月23日 優(yōu)先權(quán)日1994年1月13日
發(fā)明者T·M·布羅克, B·S·布盧姆堡, R·A·德韋克 申請人:G·D·瑟爾公司, 孟山都公司