專利名稱：穩(wěn)定化的fgf組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及穩(wěn)定化的成纖維細胞生長因子(下文簡稱為FGF)蛋白質(zhì)組合物，制備穩(wěn)定化FGF蛋白質(zhì)組合物的方法，以及穩(wěn)定FGF蛋白質(zhì)的方法。
FGF首先是作為對成纖維細胞(如BALB/C3T3細胞)有強烈生長促進作用的因子分離的〔D.Gospodarowicz，Nature 249 123(1974)〕?，F(xiàn)已知道，F(xiàn)GF幾乎對衍生于中胚層的所有細胞都有生長促進作用。根據(jù)其等電點的不同，可將FGF分為堿性FGF(下文簡稱為bFGF)和酸性FGF(下文簡稱為aFGF)。bFGF和aFGF兩者對血管內(nèi)皮細胞均有很強的生長促進作用和血纖維蛋白溶酶原激活劑誘導(dǎo)作用。這些作用加在一起，提示可將其作為促進血管形成、治療創(chuàng)傷，以及預(yù)防和治療血栓形成和動脈硬化等藥物的潛在應(yīng)用。
從前，已由動物器官如牛垂體中純化了均一的FGF。但這些FGF的來源是有限的，而且由于來自于異種動物器官、故難免存在抗原性問題。近年來已建立了一種大量生產(chǎn)FGF的方法，包括使用重組DNA技術(shù)在微生物或動物細胞中表達已克隆的人FGF基因〔FEBS Letters，213，189-194(1987)歐洲專利公開(下文簡稱為EP公開)No.237，966)〕。
在其他方面，為了穩(wěn)定多肽生產(chǎn)因子，而提供了一種含水醫(yī)藥組合物、特征在于包含提供足以穩(wěn)定生長因子量的水溶性多糖，據(jù)稱該組合物可有效地阻止多肽生長因子之促細胞分裂劑活性的降低及生物活性的降低〔日本未審查專利公開No.63-152324/1988，相當(dāng)于EP公開No.267，015〕。
因為大多數(shù)FGF蛋白質(zhì)都很不穩(wěn)定，所以，它們不僅在含水溶液中會很迅速地失活，而且既使在凍干條件下也很容易降低其生物活性。此外，一個主要問題是在FGF蛋白靜脈滴注若干小時時，此給藥期間將不可避免地出現(xiàn)FGF滴度降低。
上述含有水溶性多糖的含水醫(yī)藥組合物，特別是在纖維素鏈上的每一無水葡萄糖單位所含醚基的醚取代程度至少為0.35的纖維素衍生物的情況下，當(dāng)堿是FGF蛋白時即很難形成粉末形式的固體醫(yī)藥組合物。在混合和干燥過程中，出現(xiàn)組合物滴度降低。
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，將FGF蛋白與非水溶性羥丙基纖維素混合，可顯著地提高FGF蛋白的穩(wěn)定性。
具體地說，本發(fā)明人已成功地獲得了與上述含有FGF蛋白和水溶性多糖之含水醫(yī)藥組合物比較，大大改善了FGF蛋白穩(wěn)定性的固體組合物。
依據(jù)本發(fā)明，其提供了(1)一種包含F(xiàn)GF蛋白質(zhì)和非水溶性羥丙基纖維素的穩(wěn)定化的FGF蛋白質(zhì)組合物;(2)一種制備穩(wěn)定化FGF蛋白質(zhì)組合物的方法，該方法包括將FGF蛋白質(zhì)與非水溶性羥丙基纖維素混合;以及(3)一種穩(wěn)定FGF蛋白質(zhì)的方法，該方法包括將FGF蛋白質(zhì)與非水溶性羥丙基纖維素相混合。
用于本發(fā)明的FGF蛋白質(zhì)包括堿性FGF(下文也稱之為bFGF)和酸性FGF(下文也稱之為aFGF)。用于本發(fā)明的FGF蛋白質(zhì)包括得自于哺乳動物的FGF，所說的哺乳動物包括人、猴、豬、牛、羊和馬。
FGF蛋白質(zhì)包括那些由各種器官提取的FGF，已知這些器官如腦和垂體中存在有FGF。
此外，F(xiàn)GF蛋白質(zhì)包括那些以重組DNA技術(shù)得到的FGF〔FEBS Letters 213，189-194(1987);EP公開No.237，966〕。
重組的人堿性FGF在下文中可簡稱為rhbFGF。
用于本發(fā)明的FGF蛋白質(zhì)包括FGF突變蛋白。
用于本發(fā)明之FGF突變蛋白的例子包括在Biochemical and Biophysical Research Communications 151，701-708(1988)、日本專利申請No.1-15662/1989(相當(dāng)于EP公開No.326，907Al)中公開的突變蛋白;且可包括日本專利申請No.109014/1990(申請日為1990年4月25日，相當(dāng)于歐洲專利申請No.90107737.0和美國專利申請Ser.No.511，469)中公開的至少引入一個糖基化位點的突變蛋白。
例如，用于本發(fā)明的FGF突變蛋白基本上是基于原始肽或蛋白質(zhì)之氨基酸順序的變異而得到的。所說的變異包括氨基酸的加入、結(jié)構(gòu)氨基酸的缺失以及結(jié)構(gòu)氨基酸被不同的氨基酸取代。此外，這些變異中還包括引入糖基化位點的FGF突變蛋白。
所說的氨基酸的加入包括至少加入一個氨基酸。
結(jié)構(gòu)氨基酸的缺失包括至少缺失一個FGF結(jié)構(gòu)氨基酸。
結(jié)構(gòu)氨基酸被不同的氨基酸取代包括至少一個FGF結(jié)構(gòu)氨基酸被至少一個不同的氨基酸取代。
在已加入了至少一個氨基酸的FGF突變蛋白中，所說的至少一個氨基酸不包括衍生于用于肽表達的起始密碼子和信號肽的蛋氨酸。
被加入之氨基酸的數(shù)目至少是一個，但只要不喪失FGF特性，也可以是任何數(shù)目。更可取的是氨基酸包括蛋白質(zhì)的某些或所有氨基酸順序。這些順序與FGF有同源性，并表現(xiàn)具有與FGF的氨基酸順序相似的活性。
就至少缺少一個FGF結(jié)構(gòu)氨基酸的突變蛋白中缺失的FGF結(jié)構(gòu)氨基酸的數(shù)目來說，只要不喪失FGF特性，其可以是任何數(shù)目。
缺失的結(jié)構(gòu)氨基酸的例子包括人bFGF之氨基端上的10個殘基Met-Pro-Ala-Leu-Pro-Glu-Asp-Gly-Gly-Ser，人bFGF之氨基端上的14個殘基lMet-Pro-Ala-Leu-Pro-Glu-Asp-14Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Phe-Pro人bFGF之氨基端上的41個殘基1 2 3 4 41Met-Pro-Ala-Leu-……-Val人bFGF之羧基端上的61個殘基87 88 146 147Lys-Cys-……-Val-Ser突變蛋白進一步包括在原始bFGF肽或蛋白質(zhì)的羧基端上缺失7至46個氨基酸殘基的突變蛋白。
這些缺失的優(yōu)選實例包括有rhbFGF下列氨基酸順序的缺失從氨基酸序號102開始的氨基酸順序從氨基酸序號105開始的氨基酸順序從氨基酸序號115開始的氨基酸順序從氨基酸序號119開始的氨基酸順序從氨基酸序號124開始的氨基酸順序從氨基酸序號130開始的氨基酸順序從氨基酸序號138開始的氨基酸順序就突變蛋白(其中至少一個FGF結(jié)構(gòu)氨基酸被至少一個不同的氨基酸取代)中取代前FGF結(jié)構(gòu)氨基酸的數(shù)目來說，只要不喪失FGF特性，其可以是任何數(shù)目。
取代前結(jié)構(gòu)氨基酸的例子包括半胱氨酸和胱氨酸，但較好是半胱氨酸。除半胱氨酸外，取代前的結(jié)構(gòu)氨基酸還包括天冬氨酸、精氨酸甘氨酸和纈氨酸。
當(dāng)取代前的結(jié)構(gòu)氨基酸為半胱氨酸時，較好以中性氨基酸作為被取代的氨基酸。中性氨基酸包括甘氨酸、纈氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、色氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和蛋氨酸。特別優(yōu)選的是絲氨酸和蘇氨酸。
當(dāng)取代前的結(jié)構(gòu)氨基酸為半胱氨酸以外的任何氨基酸時，則可選擇其親水性、疏水性和電荷不同于取代前之氨基酸的氨基酸作為取代氨基酸。具體地說，當(dāng)取代前的氨基酸為天冬氨酸時，取代氨基酸包括天冬酰胺、蘇氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和精氨酸。尤其可取的是天冬酰胺和精氨酸。
當(dāng)取代前的氨基酸是精氨酸時，取代氨基酸包括谷氨酰胺、蘇氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸。尤其可取的是谷氨酰胺。
當(dāng)取代前的氨基酸是甘氨酸時，取代氨基酸包括蘇氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、谷氨酸和精氨酸。特別是蘇氨酸。
當(dāng)取代前的氨基酸是絲氨酸時，取代氨基酸包括蛋氨酸、丙氨酸、亮氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺，精氨酸和天冬氨酸。特別可取的是蛋氨酸。
當(dāng)取代前的氨基酸是纈氨酸時，取代氨基酸包括絲氨酸、亮氨酸、脯氨酸、甘氨酸、賴氨酸和天冬氨酸。特別可取的是絲氨酸。
作為取代前的原有結(jié)構(gòu)氨基酸，較好選擇天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸、絲氨酸和纈氨酸。
作為取代氨基酸，較好選擇天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、絲氨酸和亮氨酸。
最為可取的取代的突變蛋白包括其中結(jié)構(gòu)氨基酸半胱氨酸被絲氨酸取代的突變蛋白。
在上述取代中，可同時進行至少兩個結(jié)構(gòu)氨基酸的取代。特別是取代兩個或三個結(jié)構(gòu)氨基酸。
可借助聯(lián)合進行兩種或三種上述加入、缺失和取代途徑得到突變蛋白。
較好是其中至少一個人bFGF結(jié)構(gòu)氨基酸被至少一個不同的氨基酸取代。具體地說，是其中70和88位上的半胱氨酸分別被絲氨酸殘基取代的rhbFGF突變蛋白CS23。
FGF突變蛋白中已至少引入了一個糖基化位點。且該突變蛋白可另外具有糖鏈。
糖基化位點包括一個其中構(gòu)成該位點的氨基酸順序如下式所示的位點Asn-X-Y(其中X可以是任何氨基酸殘基，Y是Thr、Ser或Cys)。
X較好是Pro以外的氨基酸，較好是Gly、Tyr、Arg、Ser、Lys、Val或Ala，更好是Gly、Lys Val或Ala。Y較好是Thr或Ser。
加到FGF突變蛋白中的糖可以是見于已知糖基化蛋白中的任何一種糖。這類糖的例子包括N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、半乳糖、巖藻糖和氰酸(Cyalic acid)。
糖基鏈中糖的數(shù)目至少為一個較好，更好是10至20個。
可利用定點誘變方法產(chǎn)生突變蛋白。這一技術(shù)是已知的，如參見R.F.Lather and J.P.Lecoq，Genetic Engineering，pp，31-50，Academic Press(1983)。在M.Smith and S.Gillam，Genetic EngineeringPrinciples and Methods，Vol.3，pp.1-32，Plenum Press(1981)中則描述了針對寡核苷酸的誘變。
例如可經(jīng)下列步驟制得編碼突變蛋白的結(jié)構(gòu)基因(a)使含有單股FGF結(jié)構(gòu)基因的單股DNA與誘變的寡核苷酸引物雜交(上述引物互補于一個區(qū)域，該區(qū)域含有被該單股取代的半胱氨酸密碼子，或者在某些情況下包含一個與該密碼子配對的反義三聯(lián)子，條件是其不適用于與上述密碼子不同的其他氨基酸密碼子，或者在某些情況下不同的反義三聯(lián)子)，
(b)使用DNA聚合酶延長該引物，以形成突變的異源雙鏈，以及(c)復(fù)制該突變異源雙鏈。
然后分離轉(zhuǎn)化該已突變基因的噬菌體DNA并導(dǎo)入質(zhì)粒中。
用如此得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗?，并在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得轉(zhuǎn)化體，從而能夠產(chǎn)生突變蛋白。
非水溶性羥丙基纖維素的例子包括低取代的羥丙基纖維素，其為纖維素的低取代的羥丙基醚。
低取代的羥丙基纖維素在105℃干燥1小時，含有不低于5.0%和不高于16.0%的羥丙基(參見美國藥典，第21修訂版，附錄5180～5181頁;和日本藥典，第11修訂版，D-773～D-780。
用于本發(fā)明之低取代羥丙基纖維素的例子包括低取代的羥丙基纖維素(LH-11，LH-20，LH-21，LH-22和LH-31，Shin-Etsu Chemical，Japan)。
本發(fā)明中，F(xiàn)GF蛋白質(zhì)對非水溶性羥丙基纖維素的重量比例可約為1∶0.01至1，000，000，較好約為1∶1至100，000，更好約為1∶500至20，000，最好約為1∶500至10，000。
此外，本發(fā)明的組合物可進一步含有選自糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、氯化鈉和阿拉伯膠的一種或多種成分。
糖包括蔗糖、海藻糖、麥芽糖、果糖、肌醇和直鏈淀粉等。蛋白質(zhì)包括酪蛋白、白蛋白、白明膠和蛋清等。氨基酸包括半胱氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和甘氨酸等。
本發(fā)明中，F(xiàn)GF蛋白質(zhì)對糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、氯化鈉和/或阿拉伯膠的重量比可約為1∶0.01至1，000，000，較好約為1∶1至100，000，更好約為1∶500至20，000，最好約為1∶500至10，000。
本發(fā)明的組合物是將FGF蛋白質(zhì)與非水溶性羥丙基纖維素混合，例如將FGF蛋白質(zhì)的水溶液加到非水溶性羥丙基纖維素粉末中，然后混合而得到的。較好將FGF蛋白質(zhì)水溶液的pH調(diào)到約3至10，最好調(diào)到約5至9。
上述加入和混合過程可在約10至30℃下，較好在約10至20℃下進行。
可用一般常用的攪拌和成粒裝置〔如研缽、Pony混合器(Hosokawa Tekkosho，Japan)、Vertical?；瘷C(Fuji Sangyo)和Super混合器(Hosokawa Tekkosho)〕、流化成粒裝置〔如Glad(Okawara Seisakusho)〕和滾壓成粒裝置〔如CF(Freund)〕充分地進行混合。
例如可將如此混合的組合物于室溫(約10～30℃)、減壓(約10mmHg或更低)下干燥或凍干，從而可得到生物活性穩(wěn)定的固體組合物。
可在非水溶性羥丙基纖維素與FGF蛋白質(zhì)混合的同時加入糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、氯化鈉和/或阿拉伯膠，或者將它們與非水溶性羥丙基纖維素混合后再加入FGF蛋白質(zhì)。可按與生產(chǎn)含非水溶性羥丙基纖維素和FGF蛋白質(zhì)的組合物之方法相似的方法生產(chǎn)同時含上述物質(zhì)的組合物。
上述混合中，可使用以硫酸葡聚糖穩(wěn)定的FGF蛋白質(zhì)的水溶液。
硫酸葡聚糖的例子包括葡聚糖硫酸酯、環(huán)糊精硫酸酯及β-1，3-葡聚糖硫酸酯。這些都是D-葡萄糖聚合物的硫酸酯衍生物。萄聚糖硫酸酯中硫含量一般不超過約3%(重量)，較好不超過12至20%(重量)，更好不超過約16至20%(重量)。特別優(yōu)選的是葡聚糖硫酸酯。
葡聚糖硫酸酯包括由蔗糖經(jīng)微生物如腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的作用所產(chǎn)生之葡聚糖的硫酸酯。葡聚糖硫酸酯是主要含α(1→6)鍵之葡聚糖的部分硫酸酯，其中的硫含量一般至少約為12%(重量)，較好約為16至20%(重量)。其平均分子量范圍約為1，000至40，000，000優(yōu)選分子量范圍為3，000至500，000。葡聚糖硫酸酯很易溶于水，是一種用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法制得的已知化合物。
環(huán)糊精硫酸酯中環(huán)糊精包括由淀粉經(jīng)微生物如浸麻芽孢桿菌(Bacillus macerans)作用所產(chǎn)生的環(huán)糊精。環(huán)糊精具有由α(1→4)鍵連接的D-葡萄糖分子的環(huán)結(jié)構(gòu)，且包括α型(6分子)、β型(7分子)和γ型(8分子)。本發(fā)明中，上述任何形式的均可使用。
環(huán)糊精硫酸酯是由環(huán)糊精按本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法經(jīng)硫化作用制得的有關(guān)硫化的方法可參見美國專利№.2，923，704和日本未審查專利公開No.50-36422/1975。
環(huán)糊精硫酸酯中硫含量一般至少約為3%(重量)，較好約為12至24%(重量)。環(huán)糊精硫酸酯很易溶于水。
只要是硫含量至少為大約12%(重量)，環(huán)糊精硫酸酯的硫化作用即可達到任何程度。特別是可優(yōu)先使用硫含量約為16至21%(重量)的環(huán)糊精硫酸酯?？墒褂糜胁煌蚧潭鹊牧蛩狨セ旌衔?，或者是有單一硫化程度的純化的硫酸酯?？砂聪率龇椒ㄟM行純化，例如濃縮含β-環(huán)糊精硫酸酯之堿金屬鹽的反應(yīng)溶液，將其蒸發(fā)至干，將該冷凝物溶解于水并使得所得水溶液與親水溶劑混合，以分離所需產(chǎn)物。
β-1，3-葡聚糖硫酸酯中的β-1，3-葡聚糖包括由產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)和土壤桿菌屬(Agrobacterium)微生物產(chǎn)生的直鏈β-1，3-葡聚糖。其可以是經(jīng)水解直鏈β-1，3-葡聚糖得到的低分子量聚合物形式的，并且有直鏈β-1，3-葡聚糖的相似結(jié)構(gòu)。
Curdlan(也稱為加熱可形成凝膠的多糖PS，并可由Wako Pure Chemical Industries Ltd.，Japan購得)是由產(chǎn)堿桿菌屬或土壤桿菌屬微生物產(chǎn)生的非水溶性、加熱可形成凝膠的無支鏈葡聚糖，并且只有直鏈β-1，3-葡聚糖鍵〔日本專利公開號.43-7000/1968，48-32673/1973和48-32674/1976〕。
產(chǎn)生Curdlan的Alcaligenes faecalis Var.Myxogenes NTK-U菌株、Agrobacterium radiobacter菌株和Agrobacterium radiobacter U-19菌株均列在第15版American Type Culture Collection，Catalogue of Strains(1982)中，分別為ATCC-21680、ATCC-6466和ATCC21679。
日本未審查專利公開號55-83798/1980中已詳細描述了Curdlan之部分水解物的性質(zhì)及其制備方法。
據(jù)此，直鏈β-1，3-葡聚糖是具有下列結(jié)構(gòu)式的化合物
其中n是4至大約1，000的整數(shù)。
只要其平均聚合度(DP)不超過1，000，上述的任何β-1，3-葡聚糖均可使用。特別是可優(yōu)先使用其平均聚合度(DP)約為6至300，且更好約為15至200的部分水解產(chǎn)物。
式(Ⅰ)中的n與下列方程式代表的DP有關(guān)DP-2＝n。
直鏈β-1，3葡聚糖的硫酸酯是由β-1，3-葡聚糖或其低聚物的中間體單糖單位的三個羥基及其兩末端上單糖單位的羥基經(jīng)磺化作用而產(chǎn)生的。一般使用每個單糖單位平均取代程度(DS)為0.5至3的硫酸酯，但優(yōu)先使用平均取代程度(DS)為1至2的硫酸酯。
可按下述方法完成直鏈β-1，3-葡聚糖或其低分子量聚合物的硫酸鹽化使硫酸化劑如氯磺酸或硫酸酐對其進行作用，或用硫酸酐和有機堿如吡啶、二甲基甲酰胺、三甲胺或二甲基苯胺的復(fù)合物與之反應(yīng)〔J.Biol.Chem.239，2986(1964)〕β-1，3-葡聚糖硫酸酯很易溶于水，并且毒性很低。β-1，3-葡聚糖硫酸酯中的硫含量一般至少約為5%(重量)，較好為10～24%(重量)。
葡聚糖硫酸酯對溫血動物的毒性很小。因此可對溫血動物經(jīng)胃腸道外或口服途徑給于含F(xiàn)GF蛋白和葡聚糖硫酸酯的穩(wěn)定化組合物。
可使用游離狀態(tài)或其鹽形式的葡聚糖硫酸酯。這類鹽例子包括鈉鹽、鉀鹽、銨鹽和三甲銨鹽。
當(dāng)使葡聚糖硫酸酯與FGF蛋白質(zhì)在水介質(zhì)中接觸時，游離葡聚糖硫酸酯即可加到其分子上，然后加入適當(dāng)量的堿或酸以達到所需的pH。加入堿后，葡聚糖硫酸酯便以鹽的形式或作為游離葡聚糖硫酸酯與其鹽的混合物存在于含水介質(zhì)中。
如果使FGF蛋白與葡聚糖硫酸酯在另外加有二價或三價羧酸的含水介質(zhì)中接觸，則FGF蛋白會更為穩(wěn)定。
二價羧酸的例子包括酒石酸、馬來酸、蘋果酸和富馬酸。
三價羧酸包括檸檬酸和異檸檬酸。
上述羧酸可以游離化合物或其鹽的形式使用。鹽的例子包括鈉鹽、鉀鹽和銨鹽。
此外，可向其中加入游離羧酸，然后加入適當(dāng)量的堿或酸，以達到所需的pH。在加入堿之后，羧酸即可以其鹽或游離酸與其鹽之混合物的形式存在于含水介質(zhì)中。
當(dāng)使FGF蛋白與葡聚糖硫酸酯在含水介質(zhì)中接觸時，所加入之葡聚糖硫酸酯的量較好為相對于每1mol FGF蛋白約0.1至100mol，更好為大約0.5至4mol。
含水介質(zhì)中葡聚糖硫酸酯的濃度較好為大約0.0005～5%(W/V)，更好為大約0.01～1%(W/V)。
含水介質(zhì)中FGF蛋白的濃度較好為大約0.0005～5%(W/V)，更好為大約0.01～1%(W/V)。
含水介質(zhì)中羧酸的濃度較好為大約1mM至1M，更好為大約10mM至500mM。
為使它們在含水介質(zhì)中接觸，可將FGF蛋白、葡聚糖硫酸酯和羧酸按彼此需要量在含水介質(zhì)中混合。
含水介質(zhì)可以是任何一種介質(zhì)，如蒸餾水，較好是使用生理鹽水和葡萄糖溶液。作為含水介質(zhì)，也可使用緩沖液，如磷酸鹽緩沖液和三(羥甲基)氨基甲烷-HCl緩沖液。
當(dāng)FGF蛋白、葡萄糖硫酸酯和羧酸按所需量彼此混合時，可將它們分別作為水溶液混合，或者分別作為固體物混合，然后再溶解于含水介質(zhì)中。混合時的溫度一般約為0～40℃，pH較好約為3～10，更好約為5～9。混合所需時間一般約為1至30分鐘。
從而得到了用葡聚糖硫酸酯穩(wěn)定了的FGF蛋白水溶液。
本發(fā)明中，可用腸道聚合物(enteric Polymer)包被含F(xiàn)GF蛋白和非水溶性羥丙基纖維素的上述組合物。
用于本發(fā)明的腸道聚合物的例子包括鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素、羧甲基乙基纖維素、乙酸纖維素鄰苯二甲酸酯、乙酸羥甲基纖維素琥珀酸酯以及丙烯酸聚合物〔如異丙烯酸-丙烯酸乙酯共聚物(Eudragit L300-55和Eudragit L100-55)異丁烯酸-丙烯酸甲酯共聚物(Eudragit L-100)以及異丁烯酸-異丁烯酸甲酯共聚物(Eudragit S100)，Rohm，West Germany〕。
可用已知方法進行包被。即使用盤涂法、流化涂層法或輥涂法等方法將在水或有機溶劑中分散或溶解包被基劑所得到的分散液或溶液噴布在片劑、顆?；蛭⒓氼w粒上。當(dāng)用包衣劑包被組合物時，可望被包被之組合物的溫度為大約25～70℃，較好為大約25～50℃包被涂層量為腸溶性聚合物約占組合物的20-300%，較好為50～100%。
此外，也可以加熱并液化本發(fā)明的固體組合物(粉末)和聚甘油顆粒的脂肪酸酯，以得到顆粒。該顆粒中。本發(fā)明固體組合物的有效成分(FGF蛋白)可得以穩(wěn)定地洗提和釋放，并能長時間保持穩(wěn)定。
當(dāng)聚甘油的脂肪酸酯是一種混合物時，它并不會顯示出清楚的熔點，而可在某一特定溫度下軟化。本說明書中，“熔點”包括混合物所能顯示出的軟化點。
只要是由聚甘油與脂肪酸結(jié)合形成的酯，上面使用的聚甘油脂肪酸酯可以是任何一種單酯、二酯和聚酯。與硬化油等不同，聚甘油的脂肪酸酯具有表現(xiàn)非晶體多態(tài)性的性質(zhì)，并且很少與有效成分(如藥物)相互作用。
聚甘油是一種在一個分子中結(jié)合有“n個(在環(huán)狀聚甘油中)至n+2個(在直鏈或支鏈聚甘油中)羥基及n-1個(在直鏈或支鏈聚甘油中)至n個(在環(huán)狀聚甘油中)醚的多元醇”〔Polyglycerin Ester，P 12，Sakamoto Yakuhin Kogyo Co.Ltd.，Japan(May 2，1986)編輯出版)。例如，可使用由下式代表的化合物
其中n代表聚合度，且為2或2以上的整數(shù)。n一般為2至50，較好為2至20，更好為2至10。聚甘油是直鏈或支鏈的。
這類聚甘油的具體實例包括二甘油、三甘油、四甘油、五甘油、六甘油、七甘油、八甘油、九甘油、十甘油、十五甘油、二十甘油和三十甘油。這些聚甘油中，常用的是四甘油、六甘油和十甘油。
脂肪酸包括有8至40個碳原子，較好有12至22個碳原子的飽和和不飽和高級脂肪酸。這些脂肪酸的例子包括棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、豆蔻酸、月桂酸、蓖麻酸、辛酸、癸酸和山萮酸。這些脂肪酸中，優(yōu)選的是硬脂酸、油酸，月桂酸和蓖麻酸。
聚甘油脂肪酸酯的具體實例包括辛酰一(十)甘油酯、辛酰二(三)甘油酯、月桂酰一(四)甘油酯、月桂酰一(六)甘油酯、月桂酰一(十)甘油酯、油酰一(四)甘油酯、油酰一(六)甘油酯、油酰一(十)甘油酯、油酰二(三)甘油酯、油酰二(四)甘油酯、油酰倍半(十)甘油酯、油酰七(四)甘油酯、油酰五(六)甘油酯油酰十(十)甘油酯、亞油酰一(七)甘油酯、亞麻酰二(三)甘油酯、亞麻酰二(四)甘油酯、亞麻酰二(六)甘油酯、硬脂酰一(四)甘油酯、硬脂酰一(六)甘油酯、硬脂酰一(十)甘油酯、硬脂酰三(四)甘油酯、硬脂酰三(六)甘油酰、硬脂酰倍半(六)甘油酯、硬脂酰五(四)甘油酯、硬脂酰五(六)甘油酯、硬脂酰十(十)甘油酯、棕櫚酰一(四)甘油酯、棕櫚酰一(六)甘油酯、棕櫚酰一(十)甘油酯、棕櫚酰三(四)甘油酯、棕櫚酰三(六)甘油酯、棕櫚酰倍半(六)甘油酯、棕櫚酰五(四)甘油酯、棕櫚酰五(六)甘油酯及棕櫚酰十(十)甘油酯。優(yōu)選的聚甘油脂肪酸酯的例子包括硬脂酰五(四)甘油酯(如PS-310，Sakamoto Yakuhin Co.，Japan)、硬脂酰一(四)甘油酯(如MS-310，Sakamoto Yakuhin Co.)、硬酯酰五(六)甘油酯(如PS-500，Sakamoto Yakuhin Co.)、硬脂酰倍半(六)甘油酯(如SS-500，Sakamoto Yakuhin Co.)和硬脂酰一(十)甘油酯。
這些聚甘油的脂肪酸酯可單獨使用或作為其一種或多種的混合物使用。
聚甘油脂肪酸酯的熔點約為40至80℃，較好約40至60℃。
聚甘油脂肪酸酯的分子量一般為200至15，000，較好為300至2，000。其親水-親脂平衡值(HLB)為1至20，較好為1至15，可借助調(diào)節(jié)HLB來控制該粉末之有效成分的洗提率。也可借助二種或多種聚甘油脂肪酸酯的混合來調(diào)整HLB。
聚甘油的脂肪酸酯還可以與脂類一起使用。作為脂類的非水溶性材料可依據(jù)制備目的等因素來選用。脂類的優(yōu)選軟化點或熔點約為40至120℃，特別是大約40至90℃。
脂類的具體例子包括脂肪和油(如蓖麻油、棉籽油、大豆油、菜籽油和牛脂)的硬化產(chǎn)物;蠟如蜂蠟、巴西棕櫚蠟、鯨蠟、Iecitin石蠟和微晶石蠟;脂肪酸如硬脂酸和棕櫚酸，或脂肪酸鹽如脂肪酸的鈉鹽和鉀鹽;脂肪醇如硬脂醇和鯨蠟醇;以及甘油酯。這些脂類中，較好是硬化棉籽油、硬化蓖麻油、硬化大豆油、巴西棕櫚蠟、微晶石蠟、硬脂酸及硬脂醇。
脂對聚甘油脂肪酸酯的比例通常為每100份(重量)聚甘油脂脂酸酯對100份(重量)或較少些的脂類，并可在上述范圍內(nèi)適當(dāng)選擇具體比例。
在顆粒狀組合物制備中，最好使用球形聚甘油脂肪酸酯顆粒，以使大量粉末(本發(fā)明的固體組合物)粘附到聚甘油的脂肪酸酯上，或使所說的酯含有大量粉末，并得到與聚甘油脂肪酸酯顆粒的形狀和大小相適應(yīng)的顆粒狀組合物。當(dāng)使用聚甘油脂肪酸酯的球形顆粒時，可向其中摻入大量粉末(本發(fā)明的固體組合物)，如約占總顆粒狀組合物重量80%的粉末。再者，可得到表面相當(dāng)平滑且大小分布很窄的球形顆粒狀組合物。在某些情況下，也可在其中摻入占顆粒狀組合物80%以上，如約85%(重量)的粉末。
可用噴霧冷卻，特別是噴霧冷凝方法制得聚甘油脂肪酸酯的球形顆粒。可借助旋轉(zhuǎn)具有平滑表面的園盤如鋁制園盤并在其上面滴注熔融的聚甘油脂肪酸酯進行噴霧冷凝。對旋轉(zhuǎn)園盤的大小無特殊限制，但一般直徑約為5～100cm，較好約為10～20cm。旋轉(zhuǎn)盤的轉(zhuǎn)速及熔融之聚甘油脂肪酸酯的滴速可依據(jù)對顆粒大小等的要求而定。旋轉(zhuǎn)盤的轉(zhuǎn)速一般為大約10至6，000rpm，較好約為900至6000rpm，更好約為1，000至3，000rpm?？砂春愣ㄋ俣?如2～200g/分鐘、較好為5～100g/分鐘)滴加熔融的聚甘油脂肪酸酯。
可根據(jù)所需的顆粒狀組合物的大小選擇所用聚甘油脂肪酸酯顆粒的大小，雖然對此無特殊限制，但一般約為10至150目，較好是約為25至100目。
本發(fā)明的固體組合物(粉末)可與粉末稀釋劑一起使用。這類稀釋劑的例子包括賦形劑如乳糖、玉米淀粉、Avicel(微晶纖維素Asahi Chemical Industry，Japan)、糖粉和硬脂酸鎂;粘合劑如淀粉、明膠、阿拉伯膠粉、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素及聚乙烯吡啶烷酮;崩解劑如羧甲基纖維素鈣和低取代的羥丙基纖維素;著色劑;香味劑;吸收劑;防腐劑;潤濕劑;抗靜電劑及崩解延緩劑。
可根據(jù)顆粒狀組合物的預(yù)期大小、藥物活性成分的含量等因素確定粉末(本發(fā)明的固體組合物)對上述聚甘油之脂肪酸酯的比例，但一般為每100份(重量)聚甘油脂肪酸酯加10至1，000份(重量)，較好為50至500份(重量)。
可按照常規(guī)流化床造粒方法，經(jīng)加熱和流化制成顆粒。造粒方法中使用的加熱溫度為接近于上述聚甘油脂肪酸酯的熔點，較好在聚甘油脂肪酸酯之熔點至比該熔點低5℃的溫度范圍內(nèi)。如加熱溫度太高，聚甘油脂肪酸酯顆粒會趨向融合聚結(jié)，形成大小分布寬的顆粒狀組合物，另一方面，如果加熱溫度太低，則難于使粉末(本發(fā)明的固體組合物)與聚甘油脂肪酸酯顆粒形成顆粒。
可經(jīng)浮動聚甘油脂肪酸酯和粉末(本發(fā)明的固體組合物)形成流化床，然后于所需溫度進行加熱并流化而制成顆粒?？筛鶕?jù)存在或不存在粉末粒子來證實是否已完全制成了顆粒。
當(dāng)在顯微鏡下觀察顆粒狀的組合物時，可見它通常與具有與聚甘油脂肪酸酯顆粒相應(yīng)的形狀，且所說的粉末(本發(fā)明的固體組合物)至少部分地包埋在聚甘油的脂肪酸酯顆粒中，更好是粘結(jié)在其中。
如此得到的本發(fā)明的組合物是固態(tài)的。
本發(fā)明的組合物包括含有上述固體組合物的醫(yī)藥組合物(如軟膏和栓劑)。即，作為軟膏，本發(fā)明的固體組合物被分散在軟膏基質(zhì)中。作為栓劑，則本發(fā)明的固體組合物被分散在栓劑基質(zhì)中。
因為本發(fā)明的FGF組合物是穩(wěn)定化了的，所以很適于用作藥物。
本發(fā)明的穩(wěn)定化的FGF蛋白組合物本身或其與可藥用添加劑(如載體、賦形劑和稀釋劑)形成的醫(yī)藥組合物(如片劑、膠囊劑、顆粒、細顆粒、粉劑、軟膏和栓劑)，可以很安全地經(jīng)胃腸道外或口服途徑用于溫血動物(如人、小鼠、大鼠、倉鼠、兔、狗和貓)。
可按已知方法將這種制劑配制成適于口服給藥的劑型，如片劑、膠囊劑、粉劑、顆粒和細顆粒。在這些劑型中，所用的添加劑有賦形劑(如乳糖、玉米淀粉、輕硅石粉和微晶纖維素)、粘合劑(如α淀粉、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素和聚乙烯吡啶烷酮)、崩解劑(如羧甲基纖維素鈣、淀粉和低取代的羥丙基纖維素)、表面活性劑〔如吐溫80(Kao Atlas，Japan)、Pluronic F68(Asahi Denka Kogyo，Japan)和聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物〕、抗氧化劑(如L-半胱氨酸、亞硫酸鈉和抗壞血酸鈉)及潤滑劑(如硬脂酸鎂和滑石)。
對于片劑、顆粒和細顆粒劑，可以按照已知方法進行包被，以掩敝味道或賦予胃內(nèi)溶解性、腸道溶解性或提高延遲釋放。作為包衣劑，可使用羥甲基甲基纖維素、乙基纖維素、羥甲基纖維素、羥丙基纖維素、聚亞氧乙基乙二醇、吐溫80、Pluronic F68、蓖麻油、醋酸纖維素鄰苯二甲酸酯、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、醋酸羥丙基甲基纖維素琥珀酸酯、丙烯酸聚合物(Eudrgit L100-SS和L-100，Rohm，West Germany)、羧甲基乙基纖維素、聚乙烯醇縮乙醛二乙氨基乙酸酯、蠟和色素如滑石、二氧化鈦和氧化鐵紅。這些包衣劑可包被一層或多層，并可單獨或以兩種或兩種以上聯(lián)合使用。
按已知方法進行包被。即使用盤涂方法，流化涂層方法或輥涂方法，將在水或有機溶劑中分散或溶解包衣基質(zhì)所得到的分散液或溶液噴灑在片劑、顆?；蚣氼w粒上。片劑、顆粒和細顆粒包被涂層可在約25至70℃下進行，較好在約25至50℃下進行。
可使用下列添加劑按已知方法制備軟膏和栓劑。
用于制備軟膏的添加劑的例子包括凡士林、蜂蠟、石蠟、液體石蠟、膽固醇、硬脂醇、含水羊毛脂、鯨蠟醇和聚乙二醇。
用于制備栓劑的添加劑的例子包括可可脂，氫化植物油、單酸甘油酯、三酸甘油酯、甘油基明膠和聚乙二醇。
本發(fā)明的FGF蛋白質(zhì)組合物對成纖維細胞有生長促進作用，且有高穩(wěn)定性和低毒性。因此，該FGF蛋白質(zhì)組合物可用作燒傷、創(chuàng)傷、手術(shù)后組織損傷等的治療促進藥物，也可基于其動脈血管生成作用用作血栓形成、動脈硬化等的治療藥物。另外，還可用作加速細胞培養(yǎng)的試劑。
當(dāng)將本發(fā)明的FGF蛋白質(zhì)組合物作為上述藥物使用時，可按適當(dāng)量給予上述溫血動物，給藥劑量可根據(jù)給藥途徑及病征等因素而定，但一般為每天每公斤體重給1ng～100ng FGF蛋白質(zhì)。
下文實施例中使用的重組人bFGF突變蛋白CS23(以下簡稱rhbFGF突變蛋白CS23)是按照Biochemical and Biophysical Research Communications 151，701-708(1988)中所述方法或歐洲專利公開No.281，822 A2中所述方法制備的。使用重組體大腸桿菌MM294/pTB762(IFO14613，F(xiàn)ERM BP-1645，CCTCC NO.M88005)，按歐洲專利公開No.281，822 A2之實施例1、2、7和24中所述方法制備和純化用于下文所述實施例中的rhbFGF突變蛋白CS23。
上述的重組體大腸桿菌MM294/pTB 762已保藏在Institute for Fermentation，Osaka(IFO)Japan和Fermentation Research Institute，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry of International Trade and Industry(FRI)，Japan。有關(guān)登記號和保藏日期示于表1中。就在FRI的保藏來說，最初是按照FERMP保藏登記號保藏的。所說的保藏樣品已根據(jù)布達佩斯條約重新保藏并且該轉(zhuǎn)化體已按FERM BP登記號儲存在FRI。
參考實施例1用下述方法檢測下述實施例中的FGF活性。
以兩步法用含有10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋樣品，然后以每孔50μl的量加入Nunc 96孔微量滴定板(平底)中，各孔接入50μl(2×103個細胞)購自American Type Culture Collection的胎牛心肌內(nèi)皮細胞(CRL 1395)，并培養(yǎng)3天。然后用20μl MTT〔3-(4，5-二甲基吡咯-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物〕〔〔Journal of Immunological Method 93，157(1986)〕溶液(5mg/ml PBS，Sigma)。4.5小時后，向其中加入100μl 10%SDS-0.01NHCl，然后將滴定板放置過夜。過夜后用Titertek Multiscan測定590nm處吸光率〔Tada et al.，Journal of Immunological Method 93，157(1986)〕。
實施例1將平均分子量為7，500的葡聚糖硫酸鈉(Seikagaku Kogyo，Japan)加到含rhbFGF突變蛋白CS23(濃度為450μg/ml)的50mM檸檬酸鈉溶液(pH8.0)中，以使其濃度達到210μg/ml。然后將1ml所得溶液加到5g低取代的羥丙基纖維素(下文簡稱為L-HPC)(LH-20，羥丙基為13.0至16.0%，Shin-Etsu Chemical)中，并充分攪拌。于室溫(約20℃)及減壓(約5mmHg)條件下將所得混合物干燥20小時，得到含rhbFGF突變蛋白CS23和L-HPC的粗制粉末組合物。
作為對照，按上述同樣方法制備含rhbFGF突變蛋白CS23和乳糖的粉末狀組合物，不同的是用5g乳糖代替L-HPC。
用參考實施例1中所述方法測定這些組合物的余留活性，結(jié)果示于表2中。
表 2添加劑 余留FGF活性(%)L-HPC 127乳糖 8實施例2將平均分子量為7，500的葡聚糖硫酸鈉加到含rhbFGF突變蛋白CS23(濃度為500μg/ml)的50mM檸檬酸鈉溶液(pH8.0)中，以使其濃度達到233μg/ml。然后分別將各1ml所得溶液加到5g L-HPC(LH-11，羥丙基為10.0～13.0%，Shin-Etsu Chemical)和5g乳糖中，并充分攪拌。凍干如此得到的混合物，得到分別含有rhbFGF突變蛋白CS23和L-HPC，以及rhbFGF突變蛋白CS23和乳糖的粉末狀組合物。
這些組合物的余留活性示于表3中。
表 3添加劑 余留FGF活性(%)L-HPC 85乳糖 11實施例3使用實施例1中制得的含rhbFGF突變蛋白CS23和L-HPC的粉末組合物，按下述方法制備顆粒。
將85g nonpareils(20至28月)置于mini CF裝置(Freund)內(nèi)，并用具有下列組分的粉末包被涂層，噴淋速度為5g/分鐘，轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速為400rpm，同時以2.5ml/分鐘的速度噴灑50ml的1%(W/V)羥丙基纖維素(羥丙基基團為53.4至77.5%)。于40℃真空下將所得產(chǎn)物干燥16小時，然后通過園孔篩篩分，得到粒度為12至32目的球形顆粒。
〔粉末〕實施例1中制得的含rhbGFG突變蛋白CS23的粉末組合物 20g細糖粉 20g玉米淀粉 20g然后，將如此制得的60g顆粒置于mini CF裝置(Freund)內(nèi)，經(jīng)噴灑有下列組分的腸溶性膜溶液進行包衣，噴淋速度為5ml/分鐘，此時轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速為400rpm，調(diào)節(jié)空氣溫度至40℃，顆粒溫度至35℃，得到腸溶性顆粒。
〔腸溶性膜溶液〕羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯 20g蓖麻油 2g滑石 0.4g丙酮 200ml實施例4將2ml含有rhbFGF突變蛋白CS23(濃度為1mg/ml)的50mM檸檬酸鈉溶液(pH7.0)加到2g L-HPC(LH-20，Shin-Etsu Chemical)中，充分攪拌該混合物，然后于室溫(約20℃)和減壓(約5mmHg)下干燥20小時，得到粉末組合物。所得組合物的余留活性為100%。
實施例5將2ml含有rhbFGF突變蛋白CS23(濃度為1mg/ml)的50mM檸檬酸鈉溶液(pH7.0)加到1.6g L-HPC(LH-20，Shin-Etsu Chemical)和0.4g糖粉(粉末狀蔗糖)的混合物中，充分攪拌所得混合物，然后于室溫(約20℃)和減壓(約5mmHg)下干燥20小時，得到粉末狀組合物。如此制得的組合物在制備后即刻、40℃下2個月后、40℃下6個月后分別顯示有下列的余留活性L-HPC+糖粉制備后即刻 95%40℃下2個月后 81%40℃下6個月后 81%
實施例6(1)將500g硬脂酰單(四)甘油酯(MS-310，Sakamoto Yakuhin Co.)加到500g硬脂酰五(四)甘油酯(PS-310，Sakamoto Yakuhin Co.)中，并將混合物于90℃加熱熔融。所得熔融物以20g/分鐘速率滴在以1，000rpm旋轉(zhuǎn)的鋁盤(直徑15cm)上，以制備聚甘油脂肪酸酯的球形顆粒，所得顆?？赏ㄟ^32目篩，但不能通過42目篩。
將100g如上制得的聚甘油脂肪酸酯球形顆粒、5g實施例4中制得的粉末組合物和95g L-HPC(LH-20，Shin-Etsu Chemical)置于流化造粒機(FD-3S型，F(xiàn)uji Sangyo)中。調(diào)整供氣溫度至54℃，加熱該混合物并使之流化。之后證實浮動于流化床中的L-HPC粒子消失，停止加熱并進行冷卻，從而得到顆粒。
(2)將100g上述(1)中制得的rhbFGF突變蛋白CS23的顆粒置于流化造粒機(FD-3S型，F(xiàn)uji Sangyo)中，并以溶液給進速率為2g/分鐘及輸入空氣溫度為48℃的條件下，用包衣溶液〔即100g羥丙基纖維素鄰苯二甲酸酯(Shin-Etsu Chemical)在1升1∶1丙酮和乙醇混合物中制成的溶液〕進行包被涂層，得到含rhbFGF突變蛋白CS23的包衣的顆粒組合物。
實施例7將2ml含rhbFGF突變蛋白CS23(濃度為1mg/ml)的50mM檸檬酸鈉溶液(pH7.0)加到1.6g L-HPC(LH-20，Shin-Etsu Chemical)和0.4g人血清白蛋白(HSA)、酪蛋白或純化明膠(作為蛋白質(zhì))的混合物中，充分攪拌所得混合物，然后于室溫(約20℃)及減壓(約5mmHg)條件下干燥20小時，得到不同的粉末狀組合物。
實施例8將2ml含rhbFGF突變蛋白CS23(濃度為1mg/ml)的50mM檸檬酸鈉溶液(pH7.0)加到1.6g L-HPC(LH-20，Shin-Ftsu Chemical)和0.4g氯化鈉的混合物中，并充分攪拌所得混合物，然后于減壓(約5mmHg)下室溫(約20℃)干燥20小時，得到粉末狀組合物。
實施例9將2ml含rhbFGF突變蛋白CS23(濃度為1mg/ml)的50mM檸檬酸鈉溶液(pH7.0)加到1.6g L-HPC(LH-20，Shin-Etsu Chemical)和0.4g L-半胱氨酸(作為氨基酸)的混合物中，并充分攪拌所得混合物，然后于減壓下(約5mmHg)室溫(約20)干燥20小時，得到粉末狀組合物。
實施例10將2ml含rhbFGF突變蛋白CS23(濃度為1mg/ml)的50mM檸檬酸鈉溶液(pH7.0)加到1.2g L-HPC(LH-20，Shin-Etsu Chemical)、0.4g L-半胱氨酸和0.4g氯化鈉的混合物中，充分攪拌所得混合物，然后于減壓(約5mmHg)下室溫(約20℃)干燥20小時，得到粉末狀組合物。
實施例11將2ml含rhbFGF突變蛋白CS23(濃度為1mg/ml)的50mM檸檬酸鈉溶液(pH7.0)加到1.2g L-HPC(LH-20，Shin-Ftsu Chemical)、0.4g L-半胱氨酸和0.4g糖粉的混合物中。充分攪拌所得混合物后于減壓(約5mmHg)下室溫(約20℃)干燥20小時，得到粉末狀組合物。
實施例12將2ml含rhbFGF突變蛋白CS23(濃度為1mg/ml)的50mM檸檬酸鈉溶液(pH7.0)加到1.6g L-HPC(LH-20，Shin-Etsu Chemical)和0.4g阿拉伯膠的混合物中，充分攪拌所得混合物后于減壓(約5mmHg下室溫(約20℃)干燥20小時，得到粉末狀組合物。
實驗實施例1將平均分子量為7，500的葡聚糖硫酸鈉加到含rhbFGF突變蛋白CS23(濃度為200μg/ml)的50mM檸檬酸鈉溶液(pH8.0)中，從而使rhbFGF濃度變?yōu)?3.2μg/ml。然后取1ml等份的所得溶液分別加到1g L-HPC(LH-20)和1g羥丙基纖維素(羥丙基基團為61%)中。充分攪拌所得溶液。將如此得到的混合物于減壓(約5mmHg)下室溫(20℃)干燥20小時，得到分別含有rhbFGF突變蛋白CS23和L-HPC、rhbFGF突變蛋白CS23和羥丙基纖維素的粉末組合物。這些組合物的余留活性示于表4中。
表 4添加劑 余留FGF活性(%)L-HPC 100羥丙基纖維素 4權(quán)利要求
1.制備穩(wěn)定化的FGF蛋白質(zhì)組合物的方法，該方法包括使FGF蛋白質(zhì)與非水溶性羥丙基纖維素混合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中非水溶性羥丙基纖維素是低取代的羥丙基纖維素。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中低取代的羥丙基纖維素含有不低于5.0%和不高于16.0%的羥丙氧基基團。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中FGF蛋白質(zhì)是FGF突變蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中FGF蛋白質(zhì)是其至少一個人堿性FGF組成氨基酸被至少一個不同的氨基酸取代了的突變蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，該方法包括進一步用腸道聚合物對組合物進行包衣涂層。
7.穩(wěn)定FGF蛋白質(zhì)的方法，該方法包括使FGF蛋白質(zhì)與非水溶性羥丙基纖維素混合。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中非水溶性羥丙基纖維素是低取代的羥丙基纖維素。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中低取代的羥丙基纖維素含有不低于5%和不高于16.0%的羥基丙氧基基團。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中FGF蛋白質(zhì)是FGF突變蛋白。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中FGF蛋白質(zhì)是其至少一個人堿性FGF組成氨基酸被至少一個不同的氨基酸取代了的突變蛋白。
12.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，該方法包括進一步用腸道聚合物對組合物進行包衣涂層。
全文摘要
公開了(1)一種穩(wěn)定化的FGF蛋白質(zhì)組合物，該組合物包含F(xiàn)GF蛋白質(zhì)和非水溶性羥丙基纖維素；(2)一種制備穩(wěn)定化FGF蛋白質(zhì)組合物的方法，該方法包括使FGF蛋白質(zhì)與非水溶性羥丙基纖維素混合，以及(3)一種穩(wěn)定FGF蛋白質(zhì)的方法，該方法包括使FGF蛋白質(zhì)與非水溶性羥丙基纖維素混合，從而得到穩(wěn)定化了的FGF蛋白質(zhì)，以固態(tài)形式得到的組合物具有改善的穩(wěn)定性。
文檔編號A61K47/38GK1049106SQ9010339
公開日1991年2月13日 申請日期1990年7月6日 優(yōu)先權(quán)日1989年7月7日
發(fā)明者秋山洋子, 吉岡稔, 北森信之 申請人:武田藥品工業(yè)株式會社