本發(fā)明涉及石榴皮抗腹瀉的有效部位，進(jìn)一步涉及石榴皮抗腹瀉的有效組分，本發(fā)明還涉及石榴皮抗腹瀉的有效部位及有效組分在制備治療腹瀉的藥物中的應(yīng)用，屬于腹瀉的治療領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：腹瀉，指排便的次數(shù)比平時(shí)的習(xí)慣次數(shù)明顯增加，大便稀，不成形，甚至水樣便，排便總量明顯增多。多種疾病可造成腹瀉癥狀。石榴皮為抗腹瀉傳統(tǒng)藥物，但至今關(guān)于石榴皮抗腹瀉的有效部位、有效成分尚未有研究。因此，研究石榴皮抗腹瀉的有效部位，進(jìn)一步分析有效部位的主要化學(xué)成分，對(duì)于開(kāi)發(fā)新型抗腹瀉藥物、實(shí)現(xiàn)腹瀉的有效治療等，將具有重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供石榴皮抗腹瀉的有效部位，并進(jìn)一步提供所述有效部位中的有效組分；本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供石榴皮抗腹瀉的有效部位及有效組分在制備治療腹瀉的藥物中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：本發(fā)明首先公開(kāi)了石榴皮抗腹瀉的有效部位，所述有效部位為石榴皮水提物的乙酸乙酯萃取部位。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了所述乙酸乙酯萃取部位的制備方法，包括：將石榴皮水提物懸浮于水中，用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，即得。其中，所述石榴皮水提物的制備包括：將石榴皮粉碎、過(guò)篩，得到的粉狀石榴皮加水煮沸，過(guò)濾，將濾液減壓蒸發(fā)，即得石榴皮水提物粉末。按照g/ml計(jì)，粉狀石榴皮：水＝1：5-20；優(yōu)選的，粉狀石榴皮：水＝1：10。所述煮沸的時(shí)間為30-120min，優(yōu)選為60min；所述煮沸的次數(shù)為1-3次，優(yōu)選為2次。煮沸期間需連續(xù)攪拌。所述過(guò)濾優(yōu)選為用4層紗布過(guò)濾；所述減壓蒸發(fā)的溫度為60℃。本發(fā)明所述石榴皮為石榴科植物石榴punicagranatuml.的干燥果皮。本發(fā)明所述的水為蒸餾水。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了所述石榴皮抗腹瀉的有效部位在制備治療腹瀉的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還公開(kāi)了一種治療腹瀉的藥物組合物，包括：治療上有效量的所述石榴皮抗腹瀉的有效部位和藥學(xué)上可接受的輔料或載體。抗腹瀉驗(yàn)證結(jié)果表明，石榴皮水提物具有明顯的抗腹瀉作用。本發(fā)明將石榴皮水提物分別用乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，得到乙酸乙酯萃取部位、正丁醇萃取部位和水剩余部位?？垢篂a實(shí)驗(yàn)表明，乙酸乙酯萃取部位的低中高劑量組均具有明顯的抗腹瀉作用，而其他部位活性不顯著。因此，本發(fā)明確定乙酸乙酯萃取部位為石榴皮抗腹瀉作用的活性部位。本發(fā)明進(jìn)一步對(duì)乙酸乙酯萃取部位的化學(xué)成分進(jìn)行分析，結(jié)果表明石榴皮乙酸乙酯萃取部位主要含有安石榴林、安石榴苷(a、b)和鞣花酸三個(gè)含量比較高的成分。本發(fā)明對(duì)有效成分抗腹瀉作用的驗(yàn)證表明，雖然安石榴林、安石榴苷(a、b)、鞣花酸各自單獨(dú)用藥并未表現(xiàn)出抗腹瀉活性，但上述三種化合物按有效部位含量混合組成的有效組分具有明顯的抗腹瀉作用。說(shuō)明，安石榴林、安石榴苷、鞣花酸組合物具有協(xié)同作用，三者組成的有效組分可以起到很好的抗腹瀉作用，具有開(kāi)發(fā)為新型抗腹瀉藥物的潛力。本發(fā)明對(duì)有效組分中安石榴林、安石榴苷和鞣花酸的配比優(yōu)化結(jié)果表明，按照質(zhì)量比計(jì)，安石榴林：安石榴苷：鞣花酸為0.3939：0.3775：0.2285，抗腹瀉效果顯著。因此，本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了石榴皮抗腹瀉的有效組分，所述有效組分包括：安石榴林、安石榴苷和鞣花酸。按照質(zhì)量比計(jì)，安石榴林：安石榴苷：鞣花酸＝0-1：0-1：0-1；優(yōu)選的，安石榴林：安石榴苷：鞣花酸＝0.3939：0.3775：0.2285。本發(fā)明所述的安石榴苷包括安石榴苷a和安石榴苷b，是安石榴苷a和安石榴苷b的混合物。本發(fā)明對(duì)安石榴苷中安石榴苷a和安石榴苷b的混合比例沒(méi)有特殊限制。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了所述石榴皮抗腹瀉的有效組分在制備治療腹瀉的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還公開(kāi)了一種治療腹瀉的藥物組合物，包括：治療上有效量的所述石榴皮抗腹瀉的有效組分和藥學(xué)上可接受的輔料或載體。有效組分抗腹瀉活性的驗(yàn)證結(jié)果表明，本發(fā)明所述石榴皮抗腹瀉的有效組分對(duì)腹瀉的抑制率達(dá)到53.2％，抗腹瀉效果顯著。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所述石榴皮抗腹瀉的有效組分對(duì)小鼠腸推進(jìn)運(yùn)動(dòng)的抑制作用顯著，而且對(duì)蓖麻油誘導(dǎo)的小腸積液的抑制效果顯著。本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：本發(fā)明篩選出石榴皮抗腹瀉作用的活性部位為石榴皮水提物的乙酸乙酯萃取部位，具有明顯的抗腹瀉作用。本發(fā)明進(jìn)一步對(duì)有效部位的化學(xué)成分進(jìn)行分析，確定乙酸乙酯萃取部位主要成分為安石榴林、安石榴苷和鞣花酸?？垢篂a實(shí)驗(yàn)證明，安石榴林、安石榴苷和鞣花酸組成的有效組分具有顯著的抗腹瀉作用，具有開(kāi)發(fā)為新型抗腹瀉藥物的潛力。附圖說(shuō)明圖1為石榴皮乙酸乙酯萃取部位色譜圖；圖2為安石榴苷a、安石榴苷b對(duì)照品色譜圖；圖3為安石榴林對(duì)照品色譜圖；圖4為鞣花酸對(duì)照品色譜圖；圖5為混料有效成分配比優(yōu)化結(jié)果。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1石榴皮抗腹瀉有效組分及組分最佳配伍的研究1、材料1.1藥品與試劑石榴皮(granatipericarpium)購(gòu)自哈爾濱世一堂藥材藥店，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)教研室吳軍凱副教授鑒定為石榴科植物石榴punicagranatuml.的干燥果皮。蓖麻油(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20140920)；鹽酸洛哌丁胺(西安楊森制藥有限公司，批號(hào)：130718112，規(guī)格：每粒2mg)；乙醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20150110，分析純)，用于hplc的甲醇購(gòu)自merck(darmstadt，germany)。甲酸(85％v/v)由carloerba(milan，italy)提供。水通過(guò)來(lái)自millipore(milford，ma，usa)的milli-qplus系統(tǒng)純化。0.45mmptfe膜過(guò)濾器購(gòu)自watersco.(milford，ma)。1.2動(dòng)物清潔級(jí)、健康昆明小鼠，7周齡，♀各半，體質(zhì)量為(20±2)g，購(gòu)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)：scxk(黑)2015-006；清潔級(jí)wistar大鼠，♀各半，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)：scxk(黑)2015-014。2、方法與結(jié)果2.1石榴皮水提物與萃取部位的制備使用機(jī)械粉碎機(jī)將空氣干燥的石榴皮粉碎，并通過(guò)4號(hào)篩。為了獲得藥材石榴皮水提物(pgrae)，取100g粉狀石榴皮加1000ml蒸餾水煮沸60min，期間需連續(xù)攪拌，共煮沸兩次。將所得的溶液合并后用4層紗布過(guò)濾，濾液在60℃下減壓蒸發(fā)，得到石榴皮水提物粉末32.4g。將10克得到的水提物粉末懸浮于蒸餾水中，然后分別用兩種不同的溶劑(乙酸乙酯，正丁醇)萃取，分別得到乙酸乙酯部位1.83g、正丁醇部位4.5g和水剩余部位2.3g。2.2水提物抗腹瀉作用的驗(yàn)證(蓖麻油致腹瀉模型)取體重20±2g健康昆明系小鼠30只，雌雄各半，禁食不禁水18h后，隨機(jī)分成五組，每組6只，分別是腹瀉模型組(生理鹽溶液pss10ml/kg)、陽(yáng)性對(duì)照組(洛哌丁胺5mg/kg)、pgrae高劑量組(400mg/kg)、pgrae中劑量組(200mg/kg)、pgrae低劑量組(100mg/kg)，將各組小鼠均經(jīng)灌胃給藥60min后，將各組小鼠均灌胃給予0.2ml蓖麻油。然后，將小鼠單獨(dú)安置在有白色內(nèi)襯濾紙的鼠籠中。記錄初次腹瀉時(shí)間，每隔一小時(shí)，對(duì)干便、半干便、稀便的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，共記錄4小時(shí)。在4小時(shí)后的計(jì)算稀便率和平均稀便率，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可以看出，石榴皮水提物具有明顯的抗腹瀉作用，這與文獻(xiàn)(e.y.qnais,a.s.elokda,y.y.abughalyun,f.a.abdulla,antidiarrhealactivityoftheaqueousextractofpunicagranatum.(pomegranate)peels,pharmbiol,45(2007)715-720)報(bào)道相一致。表1石榴皮水提物初次腹瀉時(shí)間及稀便抑制率注：與空白對(duì)照組相比，*p<0.05，**p<0.01。2.3止瀉部位的篩選取體重20±2g健康昆明系小鼠60只，禁食不禁水18h后，隨機(jī)分成十組，每組6只。隨機(jī)分為腹瀉模型組(生理鹽溶液pss10ml/kg)、乙酸乙酯部位(100，200和400mg/kg)、正丁醇部位(100，200和400mg/kg)和含水殘余物部位(100，200和400mg/kg)10組。灌胃給藥60min后，再每只灌胃給予0.2ml蓖麻油。記錄初次腹瀉時(shí)間，每隔一小時(shí)，對(duì)干便、半干便、稀便的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，共記錄4小時(shí)。在4小時(shí)后的計(jì)算稀便率和平均稀便率，比較并篩選出止瀉部位，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，乙酸乙酯部位低中高劑量組均有明顯的抗腹瀉作用，而其他部位活性不顯著。因此，乙酸乙酯部位為抗腹瀉作用的活性部位。表2各萃取部位初次腹瀉時(shí)間及稀便抑制率注：與空白對(duì)照組相比，*p<0.05，**p<0.01；a1-3：乙酸乙酯萃取部位；b1-3：正丁醇萃取部位；c1-3：含水殘余物部位。2.4乙酸乙酯部位化學(xué)成分比對(duì)色譜條件：色譜柱：unitaryc18(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：由0.1％甲酸水溶液(溶劑a)和甲醇(溶劑b)組成；柱溫：25±5℃；流速：1.0ml/min；進(jìn)樣量：20μl；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm。梯度洗脫條件：0-44.2min，a由95％下降到32.8％，b由5％上升到67.2％。石榴皮乙酸乙酯萃取部位色譜圖見(jiàn)圖1。經(jīng)對(duì)照品比對(duì)(圖2-圖4)，確定石榴皮乙酸乙酯萃取部位主要含有“安石榴林、安石榴苷a、安石榴苷b、鞣花酸”4個(gè)含量比較高的成分。2.5有效成分抗腹瀉作用的驗(yàn)證為驗(yàn)證乙酸乙酯部位主要化學(xué)成分是否為有效成分，將其主要化學(xué)成分進(jìn)行了活性測(cè)定，本試驗(yàn)分為5組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。a組：腹瀉模型組，給予生理鹽水；b組：有效組分組(26.9mg/kg，按200mg/kg乙酸乙酯部位中劑量組中安石榴林、安石榴苷、鞣花酸三種成分的含量計(jì)算，各自含量為10.1mg/kg、13.0mg/kg、3.8mg/kg)；根據(jù)等劑量不等效原則，c、d、e組采用與b組等劑量計(jì)算，c組：安石榴林組26.9mg/kg；d組：安石榴苷組26.9mg/kg(購(gòu)買的對(duì)照品是安石榴苷a、b的混合物)；e組：鞣花酸組26.9mg/kg。由表3可以看出，雖然安石榴林、安石榴苷、鞣花酸各自單獨(dú)用藥，并未表現(xiàn)出抗腹瀉活性，但三種化合物混合組成的有效組分具有明顯的抗腹瀉作用。因此，本發(fā)明得出結(jié)論，安石榴林、安石榴苷、鞣花酸組合物具有協(xié)同作用，組成的有效組分可以起到很好的抗腹瀉作用，具有開(kāi)發(fā)為新抗腹瀉藥物的潛力。表3有效成分抗腹瀉作用的驗(yàn)證與對(duì)照組比較，*p<0.05，效果顯著；**p<0.01，效果極為顯著。2.6基于混料設(shè)計(jì)有效成分最佳配比的研究應(yīng)用minitab軟件，采用混料設(shè)計(jì)單純型重心設(shè)計(jì)的方法，以安石榴林、安石榴苷、鞣花酸為自變量，腹瀉次數(shù)為因變量，篩選最佳配比組合，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果見(jiàn)表4。表4混料設(shè)計(jì)及結(jié)果方差分析結(jié)果見(jiàn)表5，從中可以看出除了線性項(xiàng)不顯著外，其他都顯著，說(shuō)明了成分之間的組合具有較好的協(xié)同作用。以目標(biāo)值最小的方式，利用minitab軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步優(yōu)化，得出最佳組合為安石榴林0.3939，安石榴苷0.3775，鞣花酸0.2285(圖5)。以總給藥量26.9mg/kg計(jì)，每kg小鼠給予的有效組分含有安石榴林10.6mg，安石榴苷10.2mg，鞣花酸6.1mg。表5方差分析表表6響應(yīng)優(yōu)化目標(biāo)下限望目上限權(quán)重重要性c8最小值0012112.7最新配比的有效組分抗腹瀉活性驗(yàn)證2.7.1腹瀉抑制率的測(cè)定為驗(yàn)證最新配比的有效組分的作用，將其進(jìn)行了活性測(cè)定，本試驗(yàn)分為3組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。a組：陰性對(duì)照組，給予蒸餾水；b組：有效組分處理組26.9mg/kg(安石榴林10.6mg/kg，安石榴苷10.2mg/kg，鞣花酸6.1mg/kg)。表7有效成分抗腹瀉作用的驗(yàn)證與對(duì)照組比較，*p<0.05，效果顯著；**p<0.01，效果極為顯著。2.7.2蓖麻油誘導(dǎo)的小鼠腸道轉(zhuǎn)運(yùn)取體重20±2g健康昆明系小鼠18只，雌雄各半，禁食不禁水18h后，隨機(jī)分為腹瀉模型組(生理鹽溶液pss10ml/kg)、陽(yáng)性對(duì)照組(洛哌丁胺5mg/kg)、有效組分組(26.9mg/kg)，每組6只。灌胃給藥60min后，各組再分別灌服0.2ml墨水。20min后脫頸處死，解剖并取出自幽門到肛門的全部腸管，迅速用5％甲醛溶液固定，5min后取出，將腸管輕輕拉直，測(cè)定腸管總長(zhǎng)度及墨水在腸管內(nèi)推進(jìn)的距離，按照公式計(jì)算各組墨水推進(jìn)率并取其平均值。根據(jù)墨水推進(jìn)率和藥物抑制率來(lái)判定藥物對(duì)腸推進(jìn)運(yùn)動(dòng)的抑制作用。推進(jìn)率＝碳末在腸內(nèi)推進(jìn)的距離/腸管全長(zhǎng)×100％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8。表8碳沫推進(jìn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與對(duì)照組比較，*p<0.05，效果顯著；**p<0.01，效果極為顯著。2.7.3蓖麻油誘導(dǎo)的大鼠小腸積液作用取體重200±20g健康昆明系小鼠18只，雌雄各半，禁食不禁水18h后，隨機(jī)分為腹瀉模型組(生理鹽溶液pss10ml/kg)、陽(yáng)性對(duì)照組(洛哌丁胺5mg/kg)、有效組分組(26.9mg/kg)，每組6只。給藥60min后，各組再分別灌服1ml蓖麻油。30min后脫頸處死。打開(kāi)腸腔分離腸系膜，在胃幽門部和結(jié)腸部結(jié)扎，取下后再擠出內(nèi)容物于刻度試管中，測(cè)定體積。結(jié)果見(jiàn)表9。表9腸腔積液測(cè)定實(shí)驗(yàn)與對(duì)照組比較，*p<0.05，效果顯著；**p<0.01，效果極為顯著。當(dāng)前第1頁(yè)12