本發(fā)明屬于細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在豬小腸粘膜下層膠原蛋白膜（sis膜）上培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

關(guān)節(jié)軟骨是關(guān)節(jié)中的透明軟骨組織，其包埋有關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，在關(guān)節(jié)運動中起降低磨損和緩沖震蕩的作用。但由于缺乏血管和淋巴分布，關(guān)節(jié)軟骨組織的自我修復(fù)能力較差。即使偶爾發(fā)生自發(fā)性修復(fù)反應(yīng)，新生的組織通常是纖維軟骨組織，與正常的透明軟骨組織在生化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)等方面有很大不同。因此，臨床手術(shù)是修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷的主要手段。目前的關(guān)節(jié)修復(fù)手術(shù)主要包括：關(guān)節(jié)鏡修復(fù)法、骨軟骨移植以及基于細(xì)胞移植的軟骨修復(fù)。在基于細(xì)胞移植的修復(fù)方法中，自體軟骨細(xì)胞移植由于取材方便可靠，且移植后較少排斥反應(yīng)，故應(yīng)用最為廣泛。

自體軟骨細(xì)胞移植經(jīng)歷了近三十年的發(fā)展和改進，目前已經(jīng)發(fā)展到基質(zhì)誘導(dǎo)的自體軟骨細(xì)胞移植的階段，即將體外擴增培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞預(yù)先種植在體外三維支架上，使培養(yǎng)的細(xì)胞事先得以固定，再移植入關(guān)節(jié)軟骨缺損處進行修復(fù)。然而，基質(zhì)誘導(dǎo)的自體軟骨細(xì)胞移植關(guān)鍵因素之一的種子細(xì)胞：自體的軟骨細(xì)胞，需從患者的非負(fù)重區(qū)采集，僅能得到少量的健康關(guān)節(jié)軟骨組織，從而體外分離出軟骨細(xì)胞的數(shù)量是非常有限的。

基質(zhì)誘導(dǎo)的自體軟骨細(xì)胞移植的另外一個關(guān)鍵因素是三維支架，目前有天然材料和合成材料兩類。天然材料包括：殼聚糖、葡聚糖、藻酸鈣、硫酸軟骨素等，這些材料生物相容性、細(xì)胞親和性好，有利于細(xì)胞的黏附和增殖；但通常力學(xué)性能差，且在體內(nèi)的降解速度快于新生組織的形成速度。而合成材料則包括：聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乙醇酸等等；可批量生產(chǎn)、形態(tài)結(jié)構(gòu)可控性強、力學(xué)性能穩(wěn)定；但是生物相容性、細(xì)胞親和性差，使其在細(xì)胞的黏附、增殖、分化和成熟方面又不如天然材料，甚至有一些降解產(chǎn)物還可能引發(fā)炎癥反應(yīng)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服上述的技術(shù)難點，本發(fā)明所采用的sis膜為豬小腸粘膜下層經(jīng)處理后獲得的天然細(xì)胞外基質(zhì)材料，具有良好的力學(xué)性能，生物相容性好，無免疫排斥反應(yīng)；其一面較為粗糙，有利于軟骨細(xì)胞的黏附，而另一面為光滑面，在植入體內(nèi)時，面向關(guān)節(jié)腔保護受損部位，植入體內(nèi)后，降解和再生同步，是一種良好的軟骨組織工程支架材料。另一方面，體外分離出的軟骨細(xì)胞經(jīng)過體外擴增達(dá)到所需數(shù)量后，接種到sis膜進行培養(yǎng)得到的這種復(fù)合有自體軟骨細(xì)胞的組織工程產(chǎn)品，植入體內(nèi)后，可以對缺損關(guān)節(jié)軟骨組織進行有效的修復(fù)。

在本發(fā)明的實施過程中，所述的在sis膜上培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的方法具體包括以下步驟：

1.原代軟骨細(xì)胞的制備方法：在無菌條件下，取關(guān)節(jié)軟骨，用pbs液洗凈血液，浸泡在無血清的培養(yǎng)中。將上述軟骨組織轉(zhuǎn)入超凈臺，棄去無血清培養(yǎng)基，加入0.25%的胰蛋白酶在37℃，5%co2培養(yǎng)箱中消化30分鐘，胰酶的量以浸沒軟骨組織即可。棄去胰酶，用無血清的培養(yǎng)基洗2~3次，將軟骨組織削剪成3~4mm3的碎塊，置于50mm的培養(yǎng)皿，浸泡在無血清的培養(yǎng)基中。用無菌手術(shù)剪將上述軟骨組織剪碎至1mm3大小，將軟骨組織碎粒和培養(yǎng)基全部轉(zhuǎn)移到50ml的離心管中，離心5分鐘，棄上清液，離心機的轉(zhuǎn)速為1400rpm。用型膠原酶消化軟骨組織。以1800rpm的轉(zhuǎn)速，離心15分鐘，棄上清液，離心管底部的沉淀即為軟骨細(xì)胞。將軟骨細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%青霉素、鏈霉素的nutrientmixture培養(yǎng)基重懸，按照1×10⁵個/ml左右的密度接種在t25的培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天換一半的培養(yǎng)液，1周換全部的培養(yǎng)液。

2.軟骨細(xì)胞的傳代制備方法：在無菌條件下，當(dāng)軟骨細(xì)胞貼壁長到培養(yǎng)器底面積的80%左右，進行傳代培養(yǎng)。吸走全部培養(yǎng)基，貼壁緩慢加入10%pbs溶液，洗2次，棄掉pbs液。加入1-2ml的0.25%胰蛋白酶，37℃消化1~2分鐘。加入5倍胰蛋白酶體積的含10%胎牛血清的nutrientmixture培養(yǎng)基終止消化。將所有細(xì)胞懸液移入離心管后，以1400rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液。加入含10%胎牛血清的nutrientmixture培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1×10⁵個/ml左右的密度接種在50mm的培養(yǎng)皿中，置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天換一半的培養(yǎng)液，1周換全部的培養(yǎng)液。

3.將體外擴增的軟骨細(xì)胞接種到無菌的sis膜上進行培養(yǎng)的方法：sis膜在接種細(xì)胞前需要平鋪于培養(yǎng)器的底部，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基完全浸泡1小時。將計劃接種的軟骨細(xì)胞，用10%pbs溶液，洗2次，棄掉pbs液。加入適量0.25%的胰蛋白酶，在37℃消化1∽2分鐘。加入5倍胰酶體積含10%胎牛血清的nutrientmixture培養(yǎng)基終止消化。將所有細(xì)胞懸液移入離心管后，以1400rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液。加入含10%胎牛血清的nutrientmixture培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進行細(xì)胞計數(shù)。吸走浸泡sis膜的培養(yǎng)基，將細(xì)胞懸液接種在sis膜上后，置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天換一次培養(yǎng)液。

步驟1所述的型膠原酶消化軟骨組織，是指用1%型膠原酶在37℃消化過夜，或者用1%型膠原酶在37℃的搖床中消化1.5小時，或者使用2%型膠原酶在37℃的搖床中消化45分鐘。

步驟1所述的型膠原酶消化軟骨組織，其中型膠原酶的量應(yīng)浸沒軟骨組織。

步驟3所述的sis膜為左上角有缺口標(biāo)記的正方塊或者長方塊。

步驟3所述的sis膜的正方塊或者長方塊的底面積大小約為1mm2~5mm2。

步驟3所述的sis膜平鋪于培養(yǎng)器的底部，為sis膜的缺口在左上角，此時sis膜的粗糙面朝下，緊貼容器底部。

步驟3所述的培養(yǎng)器為6孔板或者35mm的培養(yǎng)皿。

步驟3所述的接種的軟骨細(xì)胞為在體外擴增的第二代或第三代的軟骨細(xì)胞。

步驟3所述的接種的軟骨細(xì)胞的體外擴增時間為4~6周。

步驟3所述的接種到sis膜上的軟骨細(xì)胞懸液密度為1×10⁶個/ml~3×10⁶個/ml。

步驟3所述的sis膜在接種細(xì)胞后，表面壓上無菌的不銹鋼金屬環(huán)。

步驟3所述的軟骨細(xì)胞在sis膜上培養(yǎng)的時間為10~20天。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有以下優(yōu)點。

1.豬小腸粘膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)的膠原蛋白膜（sis膜），為天然細(xì)胞外基質(zhì)材料，力學(xué)性能好，為軟骨細(xì)胞提供機械支撐和生長空間。

2.sis膜，有兩面，一面較為粗糙，有利于軟骨細(xì)胞的黏附、增殖，而另一面為光滑面，在植入體內(nèi)時，面向關(guān)節(jié)腔保護受損部位。

3.sis膜含有多種生長因子，包括成纖維細(xì)胞生成因子（fgf-2）、轉(zhuǎn)化生長因子(tgf-13)和血管內(nèi)皮生長因子(vegf)等，這些生長因子能夠促進細(xì)胞粘附、增殖和分化，在組織的修復(fù)重建及細(xì)胞的生長和分化起到積極的作用。

4.sis膜在植入體內(nèi)后的降解速度和新生組織的形成速度是同步的。

5.sis膜無細(xì)胞，無抗原，生物相容性好、無免疫排斥反應(yīng)。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要的附圖作簡單地介紹，顯而易見，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明實施例的一部分，而不是全部附圖。對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)提供的附圖獲得其他的附圖。

圖1為光學(xué)顯微鏡下（40×）的第三代軟骨細(xì)胞的形態(tài)圖。

圖2軟骨細(xì)胞接種到sis膜上od值的生長曲線。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案，進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有付出創(chuàng)造性勞動的前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細(xì)闡述。除豬小腸粘膜下層脫細(xì)胞基質(zhì)的膠原蛋白膜由上海白衣緣生物工程有限公司生產(chǎn)提供外，其他無特殊說明，本發(fā)明所涉及的實驗材料及試劑均可通過商業(yè)渠道購買獲得。如35ml的培養(yǎng)皿購自康寧公司。

實施例一

1.原代軟骨細(xì)胞的制備。

1）在超凈臺內(nèi)，將膝關(guān)節(jié)軟骨組織（來源九院骨科），棄去無血清培養(yǎng)基，加入0.25%的胰蛋白酶在37℃，5%培養(yǎng)箱中消化30分鐘，胰酶的量以浸沒軟骨組織即可。

2）棄去胰酶，用無血清的培養(yǎng)基洗滌2~3次，將軟骨組織削剪成3~4mm3的碎塊，置于50mm的培養(yǎng)皿，浸泡在無血清的培養(yǎng)基中。

3）用無菌手術(shù)剪將上述軟骨組織剪碎至1mm3大小，將軟骨碎粒和培養(yǎng)基全部轉(zhuǎn)移到50ml的離心管中，離心5分鐘，棄上清液，離心機的轉(zhuǎn)速為1400rpm。

4）用1%型膠原酶浸沒軟骨組織，在37℃消化過夜。

5）以1800rpm的轉(zhuǎn)速，離心15分鐘，棄上清液，離心管底部的沉淀即為軟骨細(xì)胞。

6）將軟骨細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%青霉素、鏈霉素的nutrientmixture培養(yǎng)基重懸，按照1×10⁵個/ml左右的密度接種在t25的培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

7）每3天換一半的培養(yǎng)液，1周換全部的培養(yǎng)液。

2.軟骨細(xì)胞的傳代制備。

1）當(dāng)軟骨細(xì)胞貼壁長到培養(yǎng)器底面積的80%左右，吸走全部培養(yǎng)基，貼壁緩慢加入10%pbs溶液，洗2次，棄掉pbs液。

2）加入1.5ml的0.25%胰蛋白酶，在37℃消化1.5分鐘。

3）加入7.5ml含10%胎牛血清的nutrientmixture培養(yǎng)基終止消化。

4）將所有細(xì)胞懸液移入離心管后，以1400rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液。

5）加入含10%胎牛血清的nutrientmixture培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1×10⁵個/ml左右的密度接種在50mm的培養(yǎng)皿中，置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

6）每3天換一半的培養(yǎng)液，1周換全部的培養(yǎng)液。

3.在sis膜上接種、培養(yǎng)軟骨細(xì)胞。

1）將2mm2的sis膜，缺口在左上角（此時sis膠原膜的粗糙面朝下），平鋪于35mm的培養(yǎng)皿底部，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基完全浸泡1小時。

2）將第三代軟骨細(xì)胞用10%pbs溶液，洗2次，棄掉pbs液。

3）加入1.5ml的0.25%胰蛋白酶溶液，在37℃消化1.5分鐘。

4）加入7.5ml含10%胎牛血清的nutrientmixture培養(yǎng)基終止消化。

5）將所有細(xì)胞懸液移入離心管后，以1400rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液。

6）加入含10%胎牛血清的nutrientmixture培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進行細(xì)胞計數(shù)。

7）浸泡好的sis膜在接種細(xì)胞之前，吸走所有培養(yǎng)基，按照1×10⁶個/ml個/ml左右的密度接種在sis膜上，在接種細(xì)胞后，sis膜表面壓上無菌的不銹鋼金屬環(huán)置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

8）每2天換一次培養(yǎng)液。

實施例二

檢測sis膜上活的軟骨細(xì)胞的含量。

1.分別在第1，2，3，4，5，7，9，11，13天取出長有軟骨細(xì)胞的sis膜，采用cellcountingkit-8細(xì)胞增殖及毒性檢測試劑盒檢測sis膜上活的軟骨細(xì)胞的含量，具體檢測步驟按照cck-8試劑盒說明進行。

1）用無血清培養(yǎng)基將cck-8試劑配制成濃度為10%的溶液。

2）將長有軟骨細(xì)胞的sis膜轉(zhuǎn)入另一6孔板或者35mm的培養(yǎng)皿，鋪平，加入10%的cck-8溶液。

3）將6孔板或者35mm的培養(yǎng)皿置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2∽4小時，cck-8試劑和活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶持續(xù)反應(yīng)使溶液顏色不斷加深，o.d值不斷增加。

4）每個檢測點的培養(yǎng)時間須是相同的。

5）吸取培養(yǎng)后的溶液10μl于96孔板中。

6）用酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測吸光度。

2.記錄并分析實驗數(shù)據(jù)，得到實驗結(jié)果如下：

1）利用cck-8法所得的實驗數(shù)據(jù)，繪制軟骨細(xì)胞在sis膜上的生長曲線，明確了軟骨細(xì)胞在該膠原膜上的生長時間（圖2）。

2）軟骨細(xì)胞在sis膜上培養(yǎng)，1∽7天為潛伏期，增殖速率很慢。

3）軟骨細(xì)胞在sis膜上培養(yǎng)，第7天以后細(xì)胞增殖明顯。