本發(fā)明涉及一種中空管結(jié)構(gòu)的多層水凝膠及其制備方法與應(yīng)用，屬于材料科學(xué)和工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

水凝膠是一類以水為分散介質(zhì)的凝膠，其中生物醫(yī)用水凝膠是近年來的發(fā)展熱點(diǎn)，被廣泛用作藥物、核酸、細(xì)菌、細(xì)胞等的載體。特別地，很多生物相容性水凝膠可以仿生細(xì)胞外基質(zhì)的成分和結(jié)構(gòu)，被用以貼附或包裹細(xì)胞進(jìn)行仿生組織及器官的構(gòu)建?；诩?xì)胞生長對(duì)水溶性環(huán)境的基本需求，水凝膠材料被認(rèn)為是一類最主要的包裹細(xì)胞用的載體材料。

一直以來，組織及器官的損傷、缺失及功能障礙影響人類健康的重大問題，生物材料和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展為病損組織及器官的修復(fù)提供了很多策略，比如組織工程支架、脫細(xì)胞支架及細(xì)胞三維打印等。不同技術(shù)手段在構(gòu)建三維類組織模型上具有不同特點(diǎn)，從幾何形態(tài)學(xué)上考慮，多層管狀結(jié)構(gòu)是組織及器官構(gòu)建的一種常見的結(jié)構(gòu)單元，廣泛存在于體內(nèi)的循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等生理系統(tǒng)中。比如，血管中存在內(nèi)皮、平滑肌和成纖維細(xì)胞組成的三層結(jié)構(gòu)，氣管也分為黏膜、黏膜下層和外膜三層。

構(gòu)建多層水凝膠管狀結(jié)構(gòu)對(duì)于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是組織及器官修復(fù)有著極其重要的意義，目前常用的構(gòu)建方法可以分為一步成型和分步成型。一步成型指的是一次形成多層凝膠結(jié)構(gòu)，典型的方法是通過多通道同軸噴頭或微流控裝置擠出分層形式的水溶膠材料，通過添加適當(dāng)?shù)慕宦?lián)劑使分層材料凝膠形成多層管狀結(jié)構(gòu)，比如在同軸噴頭的芯通道擠出ca²⁺溶液，在其他殼通道擠出海藻酸鈉溶液，即可得到離子交聯(lián)的海藻酸鈣多層中空管。這種方法適用的水凝膠材料種類及管壁的數(shù)量較為有限，同時(shí)它無法形成分叉管網(wǎng)結(jié)構(gòu)，對(duì)分叉血管的構(gòu)建存在較大短板。分步成型指的是分步形成多層凝膠結(jié)構(gòu)，最常見是分步澆筑法：比如分步將實(shí)心柱狀模板放置于不同尺寸的柱狀空腔中進(jìn)行水凝膠的澆筑和交聯(lián)，即可得到按照柱狀空腔尺寸分布的多層凝膠結(jié)構(gòu)(softmatter.2012；8(5):1643-7.)；還有研究者發(fā)明了復(fù)雜的三維分叉管模具，結(jié)合可溶性芯的使用，通過分步澆筑以期實(shí)現(xiàn)三維多層分叉血管支架的構(gòu)建(cn106178130a)。這類澆筑法依賴于模具的設(shè)計(jì)，制造過程較為繁瑣，由于水凝膠較差的力學(xué)性能，存在脫模困難以及成型尺寸的限制等難題。

水凝膠分步涂層法有望能實(shí)現(xiàn)多層管狀結(jié)構(gòu)的快速構(gòu)建，研究者于2008年首次報(bào)道基于聚電解質(zhì)涂層的多層凝膠膜結(jié)構(gòu)(nature.2008；452:76-9.)，2016年研究者報(bào)道了基于溶脹交聯(lián)的水凝膠涂層方法(pnas.2016；113(47):13295-300.)。大部分當(dāng)前的水凝膠分步涂層法，在成型一層之后，需要補(bǔ)充交聯(lián)劑或交聯(lián)反應(yīng)所需的組分再成型下一層，同時(shí)很多基于聚電解質(zhì)的交聯(lián)過程處于強(qiáng)酸或強(qiáng)堿條件并不適合活細(xì)胞的包裹。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種中空管結(jié)構(gòu)的多層水凝膠及其制備方法與應(yīng)用，本發(fā)明利用交聯(lián)劑在固-液界面可以進(jìn)行擴(kuò)散，從而激發(fā)交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生并形成凝膠層；交聯(lián)劑被裝載在固相(凝膠相)中，高分子材料溶解在液相(溶膠相)中，二者接觸時(shí)，由于交聯(lián)劑(某種小分子或離子)的擴(kuò)散，使得固-液交界面形成一層明顯的凝膠。

本發(fā)明所提供的中空管結(jié)構(gòu)的多層水凝膠的制備方法，包括如下步驟：

(1)制備含有水溶性二價(jià)陽離子鹽的溫敏凝膠芯；

(2)將所述溫敏凝膠芯浸泡于海藻酸鈉水溶液中，經(jīng)交聯(lián)反應(yīng)即在所述溫敏凝膠芯的表面形成一層海藻酸鹽凝膠；

(3)將經(jīng)步驟(2)處理后的所述溫敏凝膠芯重復(fù)步驟(2)，即在所述溫敏凝膠芯的表面形成多層所述海藻酸鹽凝膠，去除所述溫敏凝膠芯，即得到所述中空管結(jié)構(gòu)的多層水凝膠。

所述的制備方法中，步驟(1)中，所述水溶性二價(jià)陽離子鹽可為氯化鈣、硫酸鈣、氯化鋇、氯化鎂和硫酸鎂中至少一種；

所述溫敏凝膠芯中所述水溶性二價(jià)陽離子鹽的質(zhì)量-體積濃度可為0.001～0.1g/ml，具體可為0.02g/ml。

所述的制備方法中，步驟(1)中，所述溫敏凝膠芯由溫敏凝膠成型得到；

可采用下述方法制備所述溫敏凝膠芯：

①將溫敏溶液澆注到采用金屬、高分子塑料、高分子彈性體等材料制成的模具中(比如可以采用3d打印技術(shù)打印定制化模具)，等待凝膠完成即取出待用。

②用注射器吸取溫敏溶液，等待凝膠完成，截?cái)嘧⑸淦髑岸?，將凝膠芯推擠出即得到與注射器內(nèi)部尺寸一致的凝膠芯。

③采用3d打印方法，將溫敏溶液打印成想要的形狀并進(jìn)行凝膠；

上述制備過程中，將所述水溶性二價(jià)陽離子鹽溶于溫敏溶液中即可得到含有水溶性二價(jià)陽離子鹽的溫敏凝膠芯。

所述溫敏凝膠可為明膠、改性明膠、普朗尼克f127、殼聚糖基水凝膠、瓊脂糖、聚丙烯酰胺和基質(zhì)膠中任一種，它們具有溫敏可逆交聯(lián)特性；

所述改性明膠指的是通過各種化學(xué)改性得到的明膠，依然保持溫敏特性，如明膠甲基丙烯酰胺。

不同種類的溫敏凝膠，其成型溫度也不同，如，對(duì)于明膠溶液，凝膠成型溫度處于較低溫度，根據(jù)其濃度可控制在0～25℃范圍內(nèi)；對(duì)于高溫凝膠低溫溶膠的材料，凝膠成型溫度處于較高溫度，如普朗尼克f127的成型溫度可以在20～50℃。如本發(fā)明實(shí)施例中對(duì)于不同濃度的明膠，采用4℃的成型溫度，均可適用；對(duì)于不同濃度的普朗尼克f127，采用22.5℃、30℃、37℃的成型溫度，均可適用。

所述的制備方法中，步驟(1)中，所述溫敏凝膠芯的形狀具有如下1)-3)中至少一種特點(diǎn)：

1)橫截面為圓形、正方形、梯形、五角星形、多邊形或其他異形封閉圖形；

2)具有單根或多分叉結(jié)構(gòu)；所述多分叉結(jié)構(gòu)的各軸線在二維平面或三維空間內(nèi)；

3)沿軸線方向，橫截面的形狀和/或尺寸發(fā)生變化，如由粗到細(xì)、由圓柱漸變?yōu)榉街?/p>

所述的制備方法中，步驟(2)中，所述海藻酸鈉水溶液的質(zhì)量-體積濃度可為0.002～0.1g/ml，具體可為0.02～0.03g/ml、0.02g/ml或0.03g/ml，可采用低粘度、中等粘度或高粘度種類的海藻酸鈉；

所述海藻酸鈉水溶液中可含有如下1)-4)種組分中任一種：

1)膠原、纖維蛋白原、基質(zhì)膠、纖連蛋白、透明質(zhì)酸、明膠、殼聚糖和聚乙二醇中任一種，即天然或合成的蛋白、多糖等成分；

2)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、癌細(xì)胞、各種成體干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中任一種，即各種哺乳動(dòng)物原代細(xì)胞或成熟細(xì)胞系；

3)細(xì)菌或病毒；

4)藥物和/或核酸分子，比如抗癌藥物、sirna等；

如制備多分叉、多層仿生的血管網(wǎng)時(shí)，可在不同層的海藻酸水凝膠中裝載不同的細(xì)胞，如在第一層海藻酸水凝膠中裝載內(nèi)皮細(xì)胞、第二層海藻酸水凝膠中裝載平滑肌細(xì)胞、第三層海藻酸水凝膠中裝載成纖維細(xì)胞；其中所述海藻酸鈉水溶液中混合的細(xì)胞濃度可以在0.0001～20×10⁶個(gè)/ml的范圍內(nèi)。

當(dāng)不直接成型一層內(nèi)皮細(xì)胞層時(shí)，可以在形成中空管結(jié)構(gòu)后，往空腔中灌注內(nèi)皮細(xì)胞，使其貼附在管腔內(nèi)壁形成內(nèi)皮層；

經(jīng)上述方法形成的血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)可以進(jìn)行靜態(tài)培養(yǎng)、灌注培養(yǎng)、力刺激培養(yǎng)、電刺激培養(yǎng)及用其他生物反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)，或多種培養(yǎng)方式的組合；上述方法操作簡單，速度快；較容易形成多分叉結(jié)構(gòu)；較容易形成仿生多層血管結(jié)構(gòu)；可以直接包裹不同細(xì)胞進(jìn)行血管仿生。

所述的制備方法中，步驟(2)中，所述交聯(lián)反應(yīng)(即所述溫敏凝膠芯浸泡于所述海藻酸鈉水溶液中)的時(shí)間可為1s～10min，時(shí)間越長，水溶性二價(jià)陽離子往外滲透的深度越深，形成的凝膠層或管壁越厚，具體的凝膠層厚度與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系如圖3所示；

重復(fù)所述步驟(2)之前，包括將所述溫敏凝膠芯進(jìn)行如下1)-3)中任一處理的步驟：

1)置于空氣中；

2)浸泡于水中，以清洗掉表面交聯(lián)程度不強(qiáng)的海藻酸，得到更規(guī)則和明顯分層結(jié)構(gòu)；

3)浸泡于所述水溶性二價(jià)陽離子鹽的水溶液中，以補(bǔ)充交聯(lián)劑；

即將所述溫敏凝膠芯(固相)從所述海藻酸鈉水溶液(液相)中取出后進(jìn)行上述處理即中斷反應(yīng)。

重復(fù)步驟(2)時(shí)，可采用同濃度的海藻酸鈉水溶液或裝載了其他組分的同濃度或不同濃度的海藻酸鈉水溶液；再次交聯(lián)反應(yīng)的時(shí)間可以與前一次相同或不同，中斷反應(yīng)的操作可以與前一次相同或不同。

經(jīng)成型的多層海藻酸鹽水凝膠層數(shù)可以1～15層。

所述的制備方法中，步驟(3)中，當(dāng)所述溫敏凝膠芯中裝載有細(xì)胞時(shí)，在去除所述溫敏凝膠芯之前，還包括將所述表面形成多層所述海藻酸鹽凝膠的所述溫敏凝膠芯進(jìn)行孵育的步驟，在所述孵育的溫度下所述溫敏凝膠芯溶解，內(nèi)部的所述細(xì)胞可以自由游動(dòng)，貼附在形成的凝膠管腔內(nèi)壁；即凝膠芯溶解與細(xì)胞種植同時(shí)進(jìn)行，無需灌注種植，潛在的種植效率高。

對(duì)于采用明膠作為溫敏凝膠，孵育溫度可設(shè)置在30～37℃之間；孵育時(shí)間可在30分鐘～12小時(shí)之間；

去除所述溫敏凝膠芯的步驟如下：

切除表面形成多層所述海藻酸鹽凝膠的所述溫敏凝膠芯的首尾端，使所述溫敏凝膠芯溶出；

不同種類的溫敏凝膠，其溶解溫度也不同，如，對(duì)于用明膠作為溫敏凝膠材料，溶芯溫度可設(shè)置在30～70℃之間；對(duì)于用普朗尼克f127作為溫敏凝膠材料，溶芯溫度可設(shè)置在0～15℃；

可以單獨(dú)切除首端或尾端或同時(shí)切除首尾端；對(duì)于多分叉結(jié)構(gòu)，切除部位可以是任何一個(gè)或幾個(gè)或所有分叉的尾端；切除操作可以在所述溫敏凝膠芯溶解之前或之后。

本發(fā)明還提供了一種基于預(yù)制血管網(wǎng)的三維組織結(jié)構(gòu)，包括所述中空管結(jié)構(gòu)的多層水凝膠和澆注于所述中空管結(jié)構(gòu)的多層水凝膠周圍的組織細(xì)胞；

具體可按照如下步驟進(jìn)行制備：

將所述中空管結(jié)構(gòu)的多層水凝膠(血管網(wǎng))置于匹配的組織成型腔中，露出灌流培養(yǎng)的進(jìn)出口管口；在血管網(wǎng)周圍，向組織成型腔中成型含特定組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)；

所述組織成型腔可以是一個(gè)具有特定形狀的頂部開口的空腔，用以固定預(yù)制血管網(wǎng)，并成型特定組織；其材質(zhì)可以是abs、pla等塑料或者pdms等彈性體，該成型腔的制造方法可以是鑄造或直接3d打印。

關(guān)于所述成型步驟，可以向所述組織成型腔中直接澆注含細(xì)胞水凝膠或純細(xì)胞溶液；添加的含細(xì)胞成分可以進(jìn)行交聯(lián)處理或不進(jìn)行交聯(lián)處理；還可以向組織成型腔中直接打印特定的組織細(xì)胞，在預(yù)制血管網(wǎng)周圍將不同種類的水凝膠或細(xì)胞打印成不同的結(jié)構(gòu)，以促進(jìn)組織的生成；組織結(jié)構(gòu)的打印及成型腔的打印可以同時(shí)進(jìn)行；在組織成型過程中，澆注法和3d打印法可以同時(shí)或單獨(dú)進(jìn)行。

所述三維組織結(jié)構(gòu)具有如下優(yōu)點(diǎn)：1)利用預(yù)制仿生血管網(wǎng)，提高了組織的營養(yǎng)輸運(yùn)效率；2)組織拓展性好，根據(jù)目標(biāo)組織的特點(diǎn)，可以進(jìn)行不同仿生血管網(wǎng)絡(luò)的定制化制造；3)結(jié)合預(yù)制仿生血管網(wǎng)及細(xì)胞直接打印技術(shù)，可以在血管網(wǎng)的基礎(chǔ)上成型異質(zhì)細(xì)胞組分的組織，具有更強(qiáng)的仿生效果。

所述中空管結(jié)構(gòu)的多層水凝膠和所述三維組織結(jié)構(gòu)在生物工程中具有潛在的應(yīng)用，如用于：

1)組織及器官的修復(fù)與重建，可以針對(duì)心肌、肝臟、腎臟、骨、軟骨等組織工程，進(jìn)行相應(yīng)的組織構(gòu)建；

2)病理模型的研究，基于預(yù)制血管網(wǎng)，可以研究相應(yīng)生理場景下癌癥遷移等病變的規(guī)律；

3)藥物測試，基于預(yù)制血管網(wǎng)，可以模擬藥物的釋放和作用，并基于構(gòu)建的組織模型，檢測特定藥物的作用。

本發(fā)明利用海藻酸鈉與二價(jià)陽離子能發(fā)生快速離子交聯(lián)反應(yīng)的特點(diǎn)，將裝載了二價(jià)陽離子如ca²⁺離子的溫敏水凝膠浸泡在海藻酸鈉溶液中，ca²⁺被證明能透過固-液界面擴(kuò)散至海藻酸鈉溶液中，進(jìn)行凝膠反應(yīng)。ca²⁺的擴(kuò)散距離與固-液接觸時(shí)間成正相關(guān)，分離溫敏水凝膠與海藻酸鈉溶液即可中斷凝膠反應(yīng)，通過分步反應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)可控厚度的海藻酸凝膠涂層的生成，最終得到多層中空管結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明方法操作簡單，制造快速，數(shù)分鐘即可成型多達(dá)10層的水凝膠結(jié)構(gòu)；所形成的中空管幾何形態(tài)靈活，可分叉，可變直徑，可變形狀，主要取決于溫敏凝膠芯的幾何形態(tài)；制作過程所處理化環(huán)境柔和，對(duì)細(xì)胞無損傷，多層凝膠結(jié)構(gòu)可支持細(xì)胞、大分子、小分子的裝載，具有廣闊應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明制備分叉多層水凝膠中空管結(jié)構(gòu)的流程圖。

圖2為本發(fā)明制備的具有兩級(jí)分叉的、多層水凝膠中空管結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3為本發(fā)明制備方法所依據(jù)的界面滲透交聯(lián)原理示意圖。

圖4為本發(fā)明制備方法中單層凝膠層厚度與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系。

圖5為本發(fā)明制備的具有兩級(jí)分叉的、多層水凝膠中空管結(jié)構(gòu)的宏觀數(shù)碼照片。

圖6為本發(fā)明制備的具有兩級(jí)分叉的、多層水凝膠中空管結(jié)構(gòu)橫截面顯微照片。

圖7為本發(fā)明制備的含細(xì)胞多層中空管結(jié)構(gòu)的橫截面顯微照片。

圖8為本發(fā)明構(gòu)建含血管網(wǎng)的三維厚組織結(jié)構(gòu)的流程圖。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1、兩級(jí)分叉的、多層水凝膠中空管結(jié)構(gòu)的制備

按照圖1所示的流程圖進(jìn)行制備。

(1)制備兩級(jí)分叉的凝膠芯

用fdm打印機(jī)制造pla材質(zhì)的兩級(jí)分叉模具，澆注含有氯化鈣(0.02g/ml)的明膠水溶液，其中明膠的質(zhì)量體積濃度為0.05g/ml，在4℃下進(jìn)行凝膠成型(明膠溶液具有高溫溶解低溫凝膠的特性，該過程可逆)，得到兩級(jí)分叉的凝膠芯，直徑為3mm。

(2)第一層海藻酸鈣凝膠的制備

在室溫下，將制備的兩級(jí)分叉的凝膠芯浸泡在海藻酸鈉水溶液(濃度為0.02g/ml)中，等待30s，由于鈣離子(交聯(lián)劑)向海藻酸鈉溶液中的擴(kuò)散并引起交聯(lián)反應(yīng)，取出后的凝膠芯表面即包裹一層海藻酸鈣凝膠，然后浸泡在純水中10s，以清洗掉表面交聯(lián)程度不強(qiáng)的海藻酸，得到更規(guī)則和明顯分層結(jié)構(gòu)。

(3)第二層海藻酸鈣凝膠的制備

將包裹一層海藻酸鈣凝膠再次放入海藻酸鈉水溶液(濃度為0.03g/ml)中進(jìn)行第二層涂覆，交聯(lián)反應(yīng)30s后即在凝膠芯表面包裹上第二層海藻酸鈣凝膠，并浸泡在純水中10s。

(4)第三至五層海藻酸鈣凝膠的制備

與步驟(3)相同，不同之處在于：海藻酸鈉水溶液的濃度依次為0.02、0.03和0.02g/ml。交聯(lián)時(shí)間均為30s，取出后均浸泡于純水中。

涂覆完成后，通過變溫即加熱至37℃使得凝膠芯溶解，切斷首尾出口，使溶解的凝膠芯流出，即可得到中空管網(wǎng)絡(luò)，

本實(shí)施例制備的具有兩級(jí)分叉的、多層水凝膠中空管結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示，其中，左圖為整體示意圖，右圖為一分叉結(jié)構(gòu)的縱截面和橫截面示意圖，1表示制備后的多層水凝膠中空管結(jié)構(gòu)，2表示中空管縱截面示意圖，3表示中空管橫截面示意圖，4表示多層水凝膠管壁，5表示中空管芯。

本發(fā)明制備方法所依據(jù)的界面滲透交聯(lián)原理如圖3所示，左圖為交聯(lián)反應(yīng)前的狀態(tài)，右圖為交聯(lián)反應(yīng)發(fā)生后的狀態(tài)；其中，黑色圓點(diǎn)為交聯(lián)劑(實(shí)例中為ca²⁺)，折線長鏈為高分子鏈(實(shí)例中為海藻酸鈉)，黑色短箭頭所示為交聯(lián)劑的滲透方向，折線長鏈夾雜黑色圓點(diǎn)為交聯(lián)反應(yīng)后產(chǎn)生的凝膠結(jié)構(gòu)；圖標(biāo)：6表示未發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)的高分子溶液(實(shí)例中為海藻酸鈉溶液)，7表示相界面，8表示裝載交聯(lián)劑(實(shí)例中為ca²⁺)的凝膠(實(shí)例中為明膠凝膠)，9表示交聯(lián)反應(yīng)后產(chǎn)生的凝膠層。

本發(fā)明考察了交聯(lián)時(shí)間的影響，得到如圖4所示的單層凝膠層厚度與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系，反應(yīng)時(shí)間指的是裝載有交聯(lián)劑的凝膠芯浸泡在高分子溶液中的時(shí)間，從圖中可以看出，時(shí)間越長，鈣離子往外滲透的深度越深，形成的凝膠層或管壁越厚，說明交聯(lián)劑的擴(kuò)散距離隨著時(shí)間而增大，這個(gè)結(jié)果是后續(xù)進(jìn)行多層涂覆的基礎(chǔ)。

本實(shí)施例制備的具有兩級(jí)分叉的、多層水凝膠中空管結(jié)構(gòu)的宏觀數(shù)碼照片如圖5所示，可以看出，中空管內(nèi)部深色物質(zhì)為灌注進(jìn)去的培養(yǎng)液，證明分叉中空管的貫通性良好。

本實(shí)施例制備的具有兩級(jí)分叉的、多層水凝膠中空管結(jié)構(gòu)橫截面顯微照片如圖6所示，顯示出了五層明顯的分層凝膠管壁以及中空的內(nèi)芯，證明本發(fā)明方法能夠有效地構(gòu)建多層中空管結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例2、兩級(jí)分叉的、含細(xì)胞多層水凝膠中空管結(jié)構(gòu)的制備

制備方法與實(shí)施例1中基本相同，不同之處在于：

1)第一層海藻酸鈣凝膠的制備步驟中，將凝膠芯浸泡在含內(nèi)皮細(xì)胞的海藻酸鈉水溶液中(細(xì)胞濃度為2.5×10⁶個(gè)/ml)，得到第一層內(nèi)皮細(xì)胞凝膠層；

2)第二層海藻酸鈣凝膠的制備步驟中，將凝膠芯浸泡在含成纖細(xì)胞的海藻酸鈉水溶液中(細(xì)胞濃度為2.5×10⁶個(gè)/ml)，得到第二層成纖細(xì)胞凝膠層；

3)第三層海藻酸鈣凝膠的制備步驟中，將凝膠芯浸泡在含內(nèi)皮細(xì)胞的海藻酸鈉水溶液中(細(xì)胞濃度為2.5×10⁶個(gè)/ml)，得到第三層內(nèi)皮細(xì)胞凝膠層；

4)第四層海藻酸鈣凝膠的制備步驟中，將凝膠芯浸泡在含成纖細(xì)胞的海藻酸鈉水溶液中(細(xì)胞濃度為2.5×10⁶個(gè)/ml)，得到第四層成纖細(xì)胞凝膠層；

5)第五層海藻酸鈣凝膠的制備步驟中，將凝膠芯浸泡在含內(nèi)皮細(xì)胞的海藻酸鈉水溶液中(細(xì)胞濃度為2.5×10⁶個(gè)/ml)，得到第五層內(nèi)皮細(xì)胞凝膠層；

上述制備得到的含細(xì)胞多層中空管結(jié)構(gòu)的橫截面顯微照片如圖7所示，圖中亮點(diǎn)是對(duì)不同細(xì)胞進(jìn)行的熒光標(biāo)記，用以示蹤細(xì)胞，該圖顯示出了五層明顯的分層細(xì)胞管壁結(jié)構(gòu)以及中空內(nèi)芯，且細(xì)胞在其中分布均勻，證明本發(fā)明方法能夠構(gòu)建包裹異質(zhì)細(xì)胞的多層仿生中空管結(jié)構(gòu)。

本實(shí)施例中，當(dāng)不直接成型一層內(nèi)皮細(xì)胞層時(shí)，可以在形成中空管結(jié)構(gòu)后，向空腔中灌注內(nèi)皮細(xì)胞，使其貼附在管腔內(nèi)壁形成內(nèi)皮層。

還可通過如下方式制備內(nèi)皮細(xì)胞凝膠層：在成型的凝膠芯中裝載內(nèi)皮細(xì)胞，在依次涂覆了各細(xì)胞層之后，不切除端部，直接將結(jié)構(gòu)浸泡于培養(yǎng)液并在較高溫度(如30～37℃)進(jìn)行孵育。以期在孵育過程中，隨著內(nèi)部溫敏凝膠的溶解，內(nèi)部的內(nèi)皮細(xì)胞可以自由游動(dòng)，貼附在形成的凝膠管腔內(nèi)壁。一段時(shí)間(如30分鐘～12小時(shí))以后，切除首尾端，溶出溫敏凝膠及可能的多余內(nèi)皮細(xì)胞，由此形成多分叉、多層仿生血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)。該方法，凝膠芯溶解與內(nèi)皮細(xì)胞種植同時(shí)進(jìn)行，無需灌注種植，潛在的種植效率高。

本實(shí)施例形成的血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)可以進(jìn)行靜態(tài)培養(yǎng)、灌注培養(yǎng)、力刺激培養(yǎng)、電刺激培養(yǎng)及用其他生物反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)，或多種培養(yǎng)方式的組合。

實(shí)施例3、含血管網(wǎng)的三維厚組織的構(gòu)建

按照圖8所示的示意圖進(jìn)行構(gòu)建，圖標(biāo)：10表示預(yù)制造的三維分叉中空多層血管網(wǎng)，11表示三維厚組織制造過程，12表示血液或培養(yǎng)液灌注方向，13表示由步驟11制造的組織結(jié)構(gòu)，14表示多層血管壁結(jié)構(gòu)，15表示中空血管通道。

將實(shí)施例2制備的預(yù)制血管網(wǎng)置于匹配的組織成型腔中，露出灌流培養(yǎng)的進(jìn)出口管口；在血管網(wǎng)周圍，向組織成型腔中成型含特定組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，即通過步驟11制造圍繞該血管網(wǎng)的三維厚組織結(jié)構(gòu)，預(yù)先制造的血管網(wǎng)能為厚組織提供細(xì)胞所必須的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣。

本實(shí)施例中，組織成型腔可以是一個(gè)具有特定形狀的頂部開口的空腔，用以固定預(yù)制血管網(wǎng)，并成型特定組織；其材質(zhì)可以是abs、pla等塑料或者pdms等彈性體，該成型腔的制造方法可以是鑄造或直接3d打印。

本實(shí)施例中，組織成型的方式可為：①向組織成型腔中直接澆注含細(xì)胞水凝膠或純細(xì)胞溶液；②添加的含細(xì)胞成分可以進(jìn)行交聯(lián)處理或不進(jìn)行交聯(lián)處理；③向組織成型腔中直接打印特定的組織細(xì)胞，在預(yù)制血管網(wǎng)周圍將不同種類的水凝膠或細(xì)胞打印成不同的結(jié)構(gòu)，以促進(jìn)組織的生成；④組織結(jié)構(gòu)的打印及成型腔的打印可以同時(shí)進(jìn)行；⑤在組織成型過程中，澆注法和3d打印法可以同時(shí)或單獨(dú)進(jìn)行。

通過含血管網(wǎng)的三維厚組織的構(gòu)建，可以利用預(yù)制仿生血管網(wǎng)，提高組織的營養(yǎng)輸運(yùn)效率；組織拓展性好，根據(jù)目標(biāo)組織的特點(diǎn)，可以進(jìn)行不同仿生血管網(wǎng)絡(luò)的制造；結(jié)合預(yù)制仿生血管網(wǎng)及細(xì)胞直接打印技術(shù)，可以在血管網(wǎng)的基礎(chǔ)上成型異質(zhì)細(xì)胞組分的組織，具有更強(qiáng)的仿生效果。

綜上，本發(fā)明制備的預(yù)制血管網(wǎng)(如兩級(jí)分叉的、(細(xì)胞)多層水凝膠中空管結(jié)構(gòu))以及基于預(yù)制血管網(wǎng)的三維厚組織可應(yīng)用于如下方面：

1)組織及器官的修復(fù)與重建，如可針對(duì)心肌、肝臟、腎臟、骨、軟骨等組織工程，進(jìn)行相應(yīng)的組織構(gòu)建；

2)病理模型的研究，如基于預(yù)制血管網(wǎng)，可研究相應(yīng)生理場景下癌癥遷移等病變的規(guī)律；

3)藥物測試，如基于預(yù)制血管網(wǎng)，可模擬藥物的釋放和作用，并基于構(gòu)建的組織模型，檢測特定藥物的作用。