本發(fā)明屬于中醫(yī)中藥技術領域，尤其涉及一種矮地茶醇提物的制備方法及其應用。

背景技術：

肥胖(obesity，ob)是一種以體內脂肪細胞(adipocyte,ad)的數(shù)目和體積增加導致體脂占體重百分比異常增高并伴有局部脂肪組織過多沉積為特點的慢性代謝性疾病。近年來，隨著社會經濟水平的提高，肥胖正以驚人的速度在全世界的成人和青少年兒童中蔓延，特別是肥胖發(fā)生的低齡化趨勢尤為突出。肥胖不僅降低患者的生活質量，而且是糖尿病、冠心病、動脈粥樣硬化、高血壓、高脂血癥以及腫瘤等多種疾病的共同危險因素。肥胖對人體健康的影響已成為全球性的公共衛(wèi)生問題，因此探索嶄新而有效的治療手段具有重要的臨床意義和社會價值?，F(xiàn)代醫(yī)學研究認為，肥胖的發(fā)生是飲食、遺傳和環(huán)境等多種因素綜合作用的結果，其關鍵環(huán)節(jié)在于脂肪細胞的過度分化。脂肪細胞來源于中胚層的骨髓間充質干細胞(bonemarrowmesenchymalstemcells,bmscs)。bmscs是一種具有多向分化潛能的干細胞，其向脂肪細胞分化是高度有序的過程，受到多種轉錄因子和復雜信號通路的調控。一旦脂肪細胞生成的生理過程被打亂，脂肪細胞過度分化，將會引起肥胖及與之相關的糖、脂代謝紊亂和多種內分泌紊亂，進而誘發(fā)糖尿病、動脈粥樣硬化、高脂血癥等疾病的發(fā)生發(fā)展。因此，從脂肪細胞分化及調控的視角，尋找有效防治肥胖的藥物并揭示其作用機理、探索肥胖防治的新靶標是營養(yǎng)代謝性疾病研究領域極其重要的研究方向。肥胖自古有之，中醫(yī)文獻對肥胖的記載始于《黃帝內經》?！鹅`樞·衛(wèi)氣失常》將肥胖分為“脂人”、“膏人”、“肉人”三種類型，記載“人有脂、有膏、有肉?！N肉堅，皮滿者，肥。腘肉不堅，皮緩者，膏。皮肉不相離者，肉?！嗾?，多氣而皮縱緩，故能縱腹垂腴。肉者，身體容大。脂者，其身收小?！薄饵S帝內經》認為肥胖發(fā)生的主要原因與飲食不節(jié)、稟賦異常、過度安逸和情志失調有關。《素問·通評虛實論》指出：“肥貴人，則膏粱之疾也?！薄端貑枴て娌≌摗分杏小跋彩掣拭蓝喾省钡挠涊d。中醫(yī)認為肥胖的病機總屬陽氣虛衰、痰濕偏盛?！妒颐劁洝犯叛灾骸胺嗜硕嗵?，乃氣虛也，虛則氣不能運化，故痰生之”。脾虛則運化轉輸無力，水谷精微失于疏布，化為膏脂痰濕，留滯體內而致肥胖；腎陽虛衰血液鼓動無力，水液失于蒸騰氣化，導致血行遲緩，痰濕內停而成肥胖。因此，中醫(yī)學治療肥胖多采用祛痰化濁、活血祛瘀之法。

苗藥矮地茶，始載于宋《圖經本草》，為紫金?？浦参镒辖鹋５母稍锶荩a于長江流域以南的各個省區(qū)，為南方地區(qū)的民間草藥。矮地茶的野生資源十分豐富，其良好的藥用價值越來越受到人們的關注。2015版《中國藥典》中記載矮地茶藥用資源的主要質控成分是巖白菜素。目前制備矮地茶藥材提取物的研究大多采用高效液相色譜法(hplc)，但該方法在藥材分析方面存在著樣品用量大，分析耗時長等不足。相比較hplc，近年來興起的超高效液相色譜法(uhplc)法具有分析速度快，分離效果好，靈敏度高、節(jié)省分析樣品等優(yōu)點。然而目前尚未見到使用uhplc法制備矮地茶醇提物及對其進行質控分析的研究報道。因此我們在研究中嘗試采用uhplc法制備了矮地茶醇提物并分析其中巖白菜素的含量。結果發(fā)現(xiàn)按照uhplc法制備的矮地茶醇提物中巖白菜素的含量為9.88mg/g，符合藥典中規(guī)定的作為質控的巖白菜素的含量標準。

在矮地茶藥用資源的功效方面，《中國藥典》中記載矮地茶具有化痰止咳，清利濕熱，活血化瘀之功效，目前關于矮地茶的臨床應用和藥理作用研究也多集中在止咳平喘、抗炎抗病毒、濕熱黃疸、經閉瘀阻、風濕痹痛、跌打損傷等作用方面。然而關于矮地茶是否具有肥胖防治作用的研究未見報道。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明提供了一種矮地茶醇提物的制備方法及其應用。

本發(fā)明的目的之一在于提供一種矮地茶醇提物的新的制備方法，該目的的實現(xiàn)包括以下步驟：

步驟一，矮地茶醇提物的制備：矮地茶藥材低溫干燥粉碎后，精密稱定0.1g，加入0.1ml甲醇，渦旋震蕩60min后，于功率200w、頻率40khz條件下超聲處理60分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液保存?zhèn)溆茫?/p>

步驟二，巖白菜素對照品的制備：精密稱定巖白菜素對照品適量，加入甲醇配制成每ml含50μg巖白菜素(即50μg/ml)的儲存溶液，備用；

步驟三，含量測定：采用超高效液相色譜法(uhplc)進行含量測定，c18色譜柱(1.7μm，2.1×100mm)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以c18(5μm，2.1mm×12.5mm)為保護柱，乙腈-甲酸水為流動相梯度洗脫；流速0.3ml/min；柱溫30±5℃。吸取對照品溶液和矮地茶醇提物溶液各2μl，進樣注入液相色譜儀進行測定；檢測波長：280nm。

本發(fā)明的另一目的在于利用所述矮地茶醇提物干預誘導成脂分化的st-2和c3h10細胞，評價矮地茶醇提物對脂肪細胞形成和分化的影響及其效果，所述脂肪細胞形成及分化模型為：以小鼠骨髓間充質干細胞系st-2和c3h10為對象；使用含成脂分化誘導試劑(包含5μg/ml胰島素、50μm吲哚美辛、0.5μm地塞米松、0.25mm3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)的α-mem培養(yǎng)基分別干預st-2和c3h10細胞誘導其向脂肪細胞分化，而后分別使用2.5mg/ml和5mg/ml的矮地茶醇提物干預誘導成脂分化的st-2和c3h10細胞，于誘導分化第3天提取細胞總rna，qpcr檢測成脂表征基因pparγ、c/ebpα和ap2的mrna表達，第5天行油紅o染色檢測細胞內脂滴形成情況，評價矮地茶醇提物對脂肪細胞形成及分化的影響。

本發(fā)明的另一目的在于利用所述矮地茶醇提物干預高脂飼料喂養(yǎng)的肥胖模型小鼠，評價矮地茶醇提物對模型小鼠體重的影響。所述肥胖模型小鼠的制備過程為：選用4周齡的c57bl/6小鼠作為對象，小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，給予高脂飼料喂養(yǎng)。矮地茶醇提物干預模型小鼠的實驗流程為：實驗分為4組，(1)正常飼料組：給予正常飼料喂養(yǎng)；(2)高脂飼料組，給予高脂飼料喂養(yǎng)；(3)矮地茶低劑量組：高脂飼料喂養(yǎng)，給予含1g/kg體重原藥材的矮地茶醇提物干預；(4)矮地茶高劑量組：高脂飼料喂養(yǎng)，給予含2g/kg體重原藥材的矮地茶醇提物干預。每組8只c57bl/6小鼠，干預周期為3個月，每個月檢測各組小鼠體重，評價矮地茶醇提物對模型小鼠體重的作用效果。

本發(fā)明的優(yōu)點及積極效果為：建立了矮地茶醇提物的uhplc提取方法，并對藥典規(guī)定的矮地茶的質控成分巖白菜素的含量進行了測定分析，結果如圖1所示。經色譜分析測得，制備的矮地茶醇提物中巖白菜素的含量為9.88mg/g，與藥典中hplc方法比較，符合質量標準。矮地茶對誘導成脂分化的st-2和c3h10細胞中脂滴形成的影響，結果如圖2(a)和2(b)所示，與對照組(vehicle組)比較，成脂誘導分化組(aim組)的脂滴明顯增多；與成脂誘導分化組(aim)組相比，2.5mg/ml和5mg/ml矮地茶組，脂滴數(shù)目均明顯減少，其中以5mg/ml矮地茶組作用最為顯著。矮地茶對誘導成脂分化的st-2和c3h10細胞中成脂表征基因pparγ、c/ebpα和ap2mrna表達的影響，結果如圖3(a)和3(b)所示，與對照組(vehicle組)比較，成脂誘導分化組(aim)組pparγ、c/ebpα和ap2的mrna表達水平明顯增加；與成脂誘導分化組(aim)組比較，2.5mg/ml和5mg/ml矮地茶組pparγ、c/ebpα和ap2的mrna表達水平明顯降低，其中以5mg/ml矮地茶組抑制效果最為顯著。低劑量(1g/kg)和高劑量(2g/kg)矮地茶干預治療均可有效降低高脂飼料喂養(yǎng)的c57bl/6小鼠體重，其中2g/kg矮地茶干預治療效果更為顯著。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例提供的矮地茶醇提物的制備方法流程圖。

圖2是本發(fā)明實施例提供的uhplc法制備的矮地茶醇提物的色譜分析示意圖；

圖中：(a)矮地茶樣品色譜圖；(b)巖白菜素對照品色譜圖。

圖3是本發(fā)明實施例提供的矮地茶抑制誘導成脂分化的st-2和c3h10細胞中的脂滴形成示意圖；

圖中：a：st-2油紅o染色結果；b：c3h10油紅o染色結果。

圖4是本發(fā)明實施例提供的矮地茶醇提物抑制成脂表征基因的mrna表達示意圖；

圖中：*，p＜0.05，與對照組(vehicle組)比較差異有統(tǒng)計學意義；#，p＜0.05，與成脂誘導分化組(aim)組比較差異有統(tǒng)計學意義。

圖5是本發(fā)明實施例提供的矮地茶醇提物對高脂飼料喂養(yǎng)小鼠體重影響的示意圖；

圖中：*，p＜0.05，與同月齡正常飼料組比較差異有統(tǒng)計學意義；#，p＜0.05，與同月齡高脂飼料組比較差異有統(tǒng)計學意義。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結合附圖對本發(fā)明的應用原理作詳細的描述。

如圖1所示，本發(fā)明實施例提供的矮地茶醇提物的制備方法包括以下步驟：

s101：矮地茶醇提物的制備：矮地茶藥材低溫干燥粉碎后，精密稱定0.1g，加入0.1ml甲醇，渦旋震蕩60min后，于功率200w、頻率40khz條件下超聲處理60分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液保存?zhèn)溆茫?/p>

s102：巖白菜素對照品的制備：精密稱定巖白菜素對照品適量，加入甲醇配制成每ml含50μg巖白菜素(即50μg/ml)的儲存溶液，備用；

s103：含量測定：采用超高效液相色譜法(uhplc)進行含量測定，c18色譜柱(1.7μm,2.1×100mm)以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以c18(5μm,2.1mm×12.5mm)為保護柱，乙腈-甲酸水為流動相梯度洗脫；流速0.3ml/min；柱溫30±5℃。吸取對照品溶液和矮地茶醇提物溶液各2μl，進樣注入液相色譜儀進行測定；檢測波長：280nm。

本發(fā)明實施例提供的矮地茶醇提物對脂肪細胞形成及分化的影響及效果評價

以小鼠骨髓間充質干細胞系st-2和c3h10為研究對象，開展以下實驗。使用含成脂分化誘導試劑(包含5μg/ml胰島素，50μm吲哚美辛，0.5μm地塞米松，0.25mm3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(ibmx)的培養(yǎng)基干預st-2、c3h10細胞誘導細胞向脂肪細胞分化。分別使用2.5mg/ml和5mg/ml的矮地茶醇提物干預誘導成脂分化的st-2和c3h10細胞，于誘導分化的第3天提取細胞總rna，qpcr檢測成脂表征基因pparγ、c/ebpα和ap2mrna的表達，第5天行油紅o染色檢測細胞內脂滴形成情況，評價矮地茶醇提物對脂肪細胞形成及分化的影響。

本發(fā)明實施例提供的矮地茶醇提物對肥胖小鼠體重的影響及效果評價

選用4周齡的c57bl/6小鼠作為研究對象開展體內實驗研究，實驗周期為3個月。小鼠及飼料購自北京華富康生物科技股份有限公司。小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，將實驗動物分組，每組8只，分組如下：(1)正常飼料組：給予正常飼料喂養(yǎng)；(2)高脂飼料組，給予高脂飼料喂養(yǎng)；(3)矮地茶低劑量組：高脂飼料喂養(yǎng)，給予含1g/kg體重原藥材的矮地茶醇提物干預；(4)矮地茶高劑量組：高脂飼料喂養(yǎng)，給予含2g/kg體重原藥材的矮地茶醇提物干預。干預周期為3個月，每個月檢測各組小鼠體重，評價矮地茶醇提物對肥胖小鼠體重的影響及效果。

下面結合附圖對本發(fā)明的應用效果作詳細的描述。

(1)建立了矮地茶醇提物的uhplc提取方法，并對藥典規(guī)定的矮地茶的質控成分巖白菜素的含量進行了測定分析，結果如圖2(a)、圖2(b)所示。經色譜分析測得，按照上述方法制備的矮地茶醇提物中巖白菜素的含量為9.88mg/g，與藥典中hplc方法比較，符合質量標準。采用uhplc法制備的矮地茶醇提物為評價矮地茶藥材質量及藥物的功能研究提供了技術支撐。

(2)矮地茶醇提物對脂肪細胞分化的影響

1)矮地茶對誘導成脂分化的st-2和c3h10細胞中脂滴形成的影響

結果如圖3(a)和3(b)所示，與對照組(vehicle組)比較，成脂誘導分化組(aim)脂滴明顯增多；與成脂誘導分化組(aim)相比，2.5mg/ml和5mg/ml矮地茶組，脂滴數(shù)目均明顯減少，其中以5mg/ml矮地茶組作用最為顯著。

2)矮地茶對誘導成脂分化的st-2和c3h10細胞中成脂表征基因pparγ、c/ebpα和ap2mrna表達的影響

結果如圖4(a)和4(b)所示，與對照組(vehicle組)比較，成脂誘導分化組(aim)pparγ、c/ebpα和ap2的mrna表達水平明顯增加；與成脂誘導分化組(aim)比較，2.5mg/ml和5mg/ml矮地茶組pparγ、c/ebpα和ap2的mrna表達水平明顯降低，其中以5mg/ml矮地茶組抑制效果最為顯著。

(3)結果如圖5所示，低劑量(1g/kg)和高劑量(2g/kg)矮地茶干預治療均可有效降低高脂飼料喂養(yǎng)的c57bl/6小鼠體重，其中高劑量矮地茶干預治療效果更為顯著。

本發(fā)明基于中醫(yī)理論認為肥胖的發(fā)生是由于水濕、痰癖、脂質等濁陰之邪增加所致，結合矮地茶的化痰止咳，清熱利濕，活血化瘀之功效，考慮矮地茶可以開發(fā)為肥胖防治藥物的潛力并有針對性地開展了矮地茶對脂肪細胞分化及肥胖防治作用的相關研究。結果發(fā)現(xiàn)：矮地茶醇提物能明顯減少誘導成脂分化的小鼠骨髓間充質干細胞系st-2和c3h10t1/2細胞中的脂滴數(shù)目和成脂表征基因pparγ、c/ebpα和ap2的mrna表達水平，其中以5mg/ml矮地茶組抑制效果最為顯著；此外矮地茶干預治療均可有效降低高脂飼料喂養(yǎng)的c57bl/6小鼠體重，其中2g/kg的矮地茶干預治療效果更為顯著。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。