一種瑪卡提取物、制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物有效成分提取領(lǐng)域，具體涉及一種瑪卡提取物、制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]瑪卡主要出產(chǎn)于南美洲安第斯山脈和中國(guó)云南麗江，是一種十字花科植物。葉子橢圓，根莖形似小圓蘿卜，可食用，是一種純天然食品，營(yíng)養(yǎng)成份豐富。瑪咖中含有豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、糖類、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分和生物堿、芥子油苷等功效成分。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究者關(guān)注到瑪卡對(duì)于提高人體免疫力、平衡人體荷爾蒙分泌及促進(jìn)生育能力的效用，但對(duì)于其起效機(jī)理知之甚少。目前瑪卡市場(chǎng)非常火爆，瑪卡產(chǎn)品有幾個(gè)加工的形式，如微粉(粉末，片劑)，冷凍干燥，水醇提取物等;但現(xiàn)有技術(shù)簡(jiǎn)單粗礦，提取效率低下、提取不完全，產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)成分流失嚴(yán)重，雜質(zhì)較多，副作用大，人體吸收率低，難以發(fā)揮瑪卡的多種功效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明提供了一種瑪卡提取物的制備方法及由該制備方法得到的瑪卡提取物，并提供了其在制備提高免疫力藥物、促進(jìn)生育能力藥物中的應(yīng)用。
[0004]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0005]本發(fā)明一方面提供了一種瑪卡提取物的制備方法，包括以下步驟:
[0006]步驟1、將瑪卡洗凈、瀝干并制成粉末；
[0007]步驟2、加入甲醇溶液和濃鹽酸，超聲得到粗提液；
[0008]步驟3、將步驟2中的粗提液濃縮至無(wú)醇味(無(wú)甲醇)，得到濃縮粗提液；
[0009]步驟4、將步驟3中的濃縮粗提液用大孔樹脂吸附；
[0010]步驟5、按水一柱體積、20 %乙醇三柱體積、50 %乙醇四柱體積、75 %乙醇三柱體積、95 %乙醇一柱體積的順序洗脫大孔樹脂，收集洗脫液；
[0011 ] 步驟6、將由20 %乙醇第三柱體積和50 %乙醇第一至第三柱體積得到的洗脫液進(jìn)行超低溫冷凍干燥處理，得到瑪卡提取物。
[0012]進(jìn)一步地，步驟2中甲醇溶液的濃度為40%-70%。
[0013]進(jìn)一步地，步驟2中濃鹽酸加入的比例為0.5%-2%。
[0014]進(jìn)一步地，步驟2中甲醇溶液加入的量為I克瑪卡對(duì)應(yīng)4毫升甲醇溶液。
[0015]進(jìn)一步地，步驟2中甲醇溶液、水和濃鹽酸分成兩次加入，并分別進(jìn)行超聲提取，時(shí)間均為40-60分鐘。
[0016]進(jìn)一步地，步驟3中使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(減壓蒸餾)進(jìn)行濃縮，濃縮溫度為40-60°C，濃縮粗提液濃縮至原體積的I /4。
[0017]進(jìn)一步地，步驟4中的大孔樹脂為DlOl樹脂。
[0018]進(jìn)一步地，步驟4中大孔樹脂的用量為與濃縮粗液體等體積。
[0019]本發(fā)明另一方面提供了根據(jù)上述制備方法得到的瑪卡提取物，及其在制備提高免疫力藥物、促進(jìn)生育能力藥物中的應(yīng)用。
[0020]本發(fā)明提供了一種瑪卡有效成分精提取的方式，所得提取物有顯著的增強(qiáng)能量代謝能力。且本發(fā)明首次采取的加酸顯色法提純過(guò)柱工藝，對(duì)于中草藥無(wú)色或淺色提取液的分離提供了一種新的高效思路。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，適合大規(guī)模工藝生產(chǎn)。
[0021]以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，以充分說(shuō)明本發(fā)明的目的、技術(shù)特征和技術(shù)效果。
【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1示出了本發(fā)明較優(yōu)實(shí)施例中的工藝流程簡(jiǎn)圖；
[0023]圖2示出了本發(fā)明較優(yōu)實(shí)施例中制備的瑪卡提取物對(duì)細(xì)胞的CCK-8細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[0024]圖3示出了本發(fā)明較優(yōu)實(shí)施例中制備的瑪卡提取物對(duì)細(xì)胞的ATP含量檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述。
[0026]實(shí)施例1
[0027]1、制備瑪卡提取物
[0028]將200克瑪卡樣品洗凈、瀝干并研磨制成粉末;將70 %甲醇和濃鹽酸以99:1比例配置提取液，其中鹽酸能使瑪卡中色素顯紅色，從而有利于下一步的層析;將上述提取液分兩次加入，第一次加入500毫升，第二次加入300毫升，每次加入后用超聲(300w，SB5200D)提取約I小時(shí)，得到粗提液;將粗提液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無(wú)醇味(約200毫升)，得到濃縮粗提液;稱取200克DlOl大孔樹脂(柱體積約200毫升)，將步驟3中得到的濃縮粗提液過(guò)柱，吸附約2小時(shí)；按水一柱體積、20 %乙醇三柱體積、50 %乙醇四柱體積、75 %乙醇三柱體積、95 %乙醇一柱體積的順序洗脫上述大孔樹脂，得到不同組分的層析液；以100毫升/瓶收集，并使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾至無(wú)醇味(每10ml濃縮至1ml);以10ml層析液為單位，于是得到水-1，水-2，20%乙醇-1，20%乙醇-2，20%乙醇-3，20%乙醇-4，20%乙醇-5，20%乙醇-6，
50%乙醇-1，50 %乙醇-2，50 %乙醇-3，50 %乙醇-4，50 %乙醇_5，50 %乙醇_6，50 %乙醇-7，50%乙醇-8，75%乙醇-1，75%乙醇-2，75%乙醇-3，75%乙醇-4，75%乙醇-5，75%乙醇-6，95%乙醇-1，95%乙醇-2共24個(gè)樣本。
[0029]2、CCK_8測(cè)定細(xì)胞存活率
[0030]CCK-8(Cell Counting Kit_8)試劑可用于簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析，其基本原理為:該試劑中含有WST-8(化學(xué)名:2_(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4_ 二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽)，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鑰硫酸二甲酯的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物，生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。用DMEM配置成含馬血清9 %，牛血清6 %，雙抗0.5 %的培養(yǎng)液，在96孔板內(nèi)以每孔1.5萬(wàn)個(gè)pc 12細(xì)胞接種，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)后加入上述24個(gè)樣本的瑪卡提取物，瑪卡提取物與培養(yǎng)液比例為1:9;72小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞存活率。檢測(cè)結(jié)果表明，瑪卡提取物毒性小，尤其是由20%乙醇第三柱體積(對(duì)應(yīng)于樣本20 %乙醇-5，20 %乙醇-6)和50 %乙醇第一至第三柱體積得到的除醇濃縮后的提取物(對(duì)應(yīng)于樣本50%乙醇-1，50%乙醇-2，50%乙醇-3，50%乙醇-4，50%乙醇-5，50%乙醇-6)，其不僅無(wú)毒性，且具有一定的促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示(c表示只加培養(yǎng)液的對(duì)照組)。
[0031 ] 3、ATP含量測(cè)定和Bradford蛋白質(zhì)測(cè)定
[0032]用DMEM配置成含馬血清9%，牛血清6 %，雙抗0.5 %的培養(yǎng)液，在24孔板內(nèi)以每孔10萬(wàn)個(gè)pcl2細(xì)胞接種;在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)后加入上述24個(gè)樣本的瑪卡提取物，瑪卡提取物與培養(yǎng)液的體積比為1:9;在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)后檢測(cè)ATP和蛋白質(zhì)濃度。以羅氏(Roche)ATP檢測(cè)試劑盒和BCA試劑，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算出樣品中ATP增加的量。檢測(cè)結(jié)果表明，經(jīng)瑪卡提取物處理24小時(shí)后的細(xì)胞其ATP含量超空白組I倍以上，均高于其他增加ATP的藥物，尤其是由20%乙醇第三柱體積(對(duì)應(yīng)于樣本20 %乙醇-5，20 %乙醇-6)和50 %乙醇第一至第三柱體積得到的除醇濃縮后的提取物(對(duì)應(yīng)于樣本50 %乙醇-1，50 %乙醇-2，50 %乙醇-3，50 %乙醇-4，50 %乙醇-5，50 %乙醇_6)，使細(xì)胞的ATP含量增加近3倍，遠(yuǎn)高于市場(chǎng)上增加能量代謝藥物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示(c表示只加培養(yǎng)液的對(duì)照組)。該提取物有望應(yīng)用在制備提高免疫力藥物、促進(jìn)生育能力藥物中。
[0033]根據(jù)實(shí)施例1可知，最有藥用價(jià)值的瑪卡提取物可由20%乙醇第三柱體積和50%乙醇第一至第三柱體積的洗脫液制備得到。以下示出的是較優(yōu)的瑪卡提取物的制備方法。
[0034]實(shí)施例2
[0035]瑪卡提取物的制備方法包括以下步驟:
[0036]步驟1、將200克瑪卡洗凈、瀝干并制成粉末；
[0037]步驟2、將40%甲醇和濃鹽酸以98: 2比例配置提取液，將該提取液分兩次加入，第一次加入500毫升，第二次加入500毫升，每次加入后用超聲提取約40分鐘，得到粗提液；
[0038]步驟3、將步驟2中的粗提液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無(wú)醇味(約200毫升)，得到濃縮粗提液；
[0039]步驟4、稱取200克DlOl大孔樹脂(柱體積約200毫升)，將步驟3中得到的濃縮粗提液過(guò)柱，吸附約2小時(shí)；
[0040]步驟5、按水一柱體積、20 %乙醇三柱體積、50 %乙醇四柱體積、75 %乙醇三柱體積、95 %乙醇一柱體積的順序洗脫上述大孔樹脂，收集洗脫液；
[0041 ] 步驟6、將由20%乙醇第三柱體積和50%乙醇第一至第三柱體積得到的洗脫液進(jìn)行超低溫冷凍干燥處理，得到瑪卡提取物。
[0042]實(shí)施例3
[0043]瑪卡提取物的制備方法包括以下步驟:
[0044]步驟1、將100克瑪卡洗凈、瀝干并制成粉末；
[0045]步驟2、將50%甲醇和濃鹽酸以99.5:0.5比例配置提取液，將該提取液分兩次加入，第一次加入250毫升，第二次加入250毫升，每次加入后用超聲提取約50分鐘，得到粗提液；
[0046]步驟3、將步驟2中的粗提液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無(wú)醇味(約100毫升)，得到濃縮粗提液；
[0047]步驟4、稱取100克DlOl大孔樹脂(柱體積約100毫升)，將步驟3中得到的濃縮粗提液過(guò)柱，吸附約2小時(shí)；
[0048]步驟5、按水一柱體積、20 %乙醇三柱體積、50 %乙醇四柱體積、75 %乙醇三柱體積、95 %乙醇一柱體積的順序洗脫上述大孔樹脂，收集洗脫液；
[0049]步驟6、將由20%乙醇第三柱體積和50%乙醇第一至第三柱體積得到的洗脫液進(jìn)行超低溫冷凍干燥處理，得到瑪卡提取物。
[0050]以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例，提供了一種瑪卡有效成分精提取的方式，所得提取物有顯著的增強(qiáng)能量代謝能力。且本發(fā)明首次采取的加酸顯色法提純過(guò)柱工藝，對(duì)于中草藥無(wú)色或淺色提取液的分離提供了一種新的高效思路。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，適合大規(guī)模工藝生產(chǎn)。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)無(wú)需創(chuàng)造性勞動(dòng)就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過(guò)邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可以得到的技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種瑪卡提取物的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟: 步驟1、將瑪卡洗凈、瀝干并制成粉末； 步驟2、加入甲醇溶液和濃鹽酸，超聲得到粗提液； 步驟3、將步驟2中的所述粗提液濃縮至無(wú)醇味，得到濃縮粗提液； 步驟4、將步驟3中的所述濃縮粗提液用大孔樹脂吸附； 步驟5、按水一柱體積、20 %乙醇三柱體積、50 %乙醇四柱體積、75 %乙醇三柱體積、95 %乙醇一柱體積的順序洗脫所述大孔樹脂，收集洗脫液； 步驟6、將由20 %乙醇第三柱體積和50 %乙醇第一至第三柱體積得到的洗脫液進(jìn)行超低溫冷凍干燥處理，得到所述瑪卡提取物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟2中所述甲醇溶液的濃度為40%-70%。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟2中所述濃鹽酸加入的比例為0.5%-2%。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟2中所述甲醇溶液加入的量為I克瑪卡對(duì)應(yīng)4毫升甲醇溶液。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟2中所述甲醇溶液、水和濃鹽酸分成兩次加入，并分別進(jìn)行超聲提取，時(shí)間均為40-60分鐘。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟3中使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，濃縮溫度為40-60 °C，所述濃縮粗提液濃縮至原體積的I/4。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟4中的所述大孔樹脂為DlOl樹脂。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟4中所述大孔樹脂的用量為與所述濃縮粗液體等體積。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的制備方法得到的瑪卡提取物。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的瑪卡提取物在制備提高免疫力藥物、促進(jìn)生育能力藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種瑪卡提取物的制備方法，包括以下步驟：將瑪卡洗凈、瀝干并制成粉末；加入甲醇溶液、水和濃鹽酸，超聲得到粗提液；將步驟2中的粗提液濃縮至無(wú)醇味，得到濃縮粗提液；將步驟3中的濃縮粗提液用大孔樹脂吸附；按水一柱體積、20％乙醇三柱體積、50％乙醇四柱體積、75％乙醇三柱體積、95％乙醇一柱體積的順序洗脫大孔樹脂，收集洗脫液；將由20％乙醇第三柱體積和50％乙醇第一至第三柱體積得到的洗脫液進(jìn)行超低溫冷凍干燥處理，得到瑪卡提取物。由上述方法制備的瑪卡提取物對(duì)細(xì)胞ATP濃度增加效果明顯，有效成分純度高，該方法操作簡(jiǎn)單、成本低廉，適合大規(guī)模生產(chǎn)。
【IPC分類】A61K36/31, A61P15/08, A61P37/04
【公開號(hào)】CN105708879
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610266314
【發(fā)明人】呂君蔚, 李 浩, 丁顯廷, 姜慧
【申請(qǐng)人】上海交通大學(xué)