本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種促進(jìn)乙型肝炎病毒清除的益生菌組合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus，hbv)是一種dna病毒，屬于嗜肝dna病毒科(hepadnaviridae)，是目前世界上最常見的流行性病毒之一。hbv慢性感染與肝硬化及肝癌關(guān)系密切，是肝細(xì)胞肝癌(hcc)最為重要的誘發(fā)因素。血清學(xué)證據(jù)證實全球人口中有30％曾感染過hbv，其中約2.5億人是hbv慢性感染者。清除慢性感染的hbv是從根本上治愈hbv相關(guān)肝細(xì)胞肝癌的關(guān)鍵，也是目前hcc臨床治療的難點。

現(xiàn)常用的乙肝抗病毒藥物一共有兩大類，共五種，分別是干擾素類(普通干擾素、長效干擾素)和核苷類(拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋)。自1997年，第一種具有抗hbv活性的口服抗病毒藥物拉夫米定投入使用并取得了良好的治療效果，隨后恩替卡韋和替諾福韋等更高抗性的藥物也相繼問世，長期口服抗病毒藥物有效的抑制了hbv活性，降低了肝硬化及肝癌的發(fā)病率。但是同時也伴隨著多種缺點，首先，這些抗病毒藥物僅對少數(shù)hbv患者有效，如有明顯病毒血癥、高水平alt和肝臟纖維化的患者；其次，治療成本較高且可能產(chǎn)生病毒抗性；最后，目前盡管口服抗病毒藥具有公認(rèn)的安全性和耐受性，但長期使用仍可能導(dǎo)致一些高危人群的累積毒性，如恩替卡韋與臨床前研究中的致癌作用有關(guān)。

治療乙肝除了抗病毒藥物之外，還有其它多種策略，例如，tlr7激動劑gs-9620、pd1和pd-l1抑制劑等調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫細(xì)胞抗hbv；nvr3-778、glp-2、aln-hbv等多種小分子藥物抑制hbv復(fù)制周期；以及利用sirna沉默hbv基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)而阻斷蛋白合成。但是，這些治療策略的效果均不理想，相對于乙肝難以治愈的現(xiàn)狀，通過乙肝疫苗預(yù)防乙肝仍是目前的主要手段。因此，探索新的、安全的、經(jīng)濟(jì)的、耐受性良好的治療手段仍迫在眉睫。

已有研究表明，在影響肝炎發(fā)展和預(yù)后的眾多因素中，腸道菌群平衡起著非常重要的作用，臨床研究發(fā)現(xiàn)，hbv患者的腸道菌群與健康人相比發(fā)生了顯著的改變。但目前的研究主要集中在腸道菌群平衡與肝炎發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系上，而對于如何通過外源益生菌清除乙型肝炎病毒目前尚未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種促進(jìn)乙型肝炎病毒清除的益生菌組合物及應(yīng)用。本發(fā)明的益生菌組合物能夠通過干預(yù)腸道菌群以促其對hbv的清除，實現(xiàn)對乙肝的治療。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面，提供益生菌組合物在制備促進(jìn)乙型肝炎病毒清除的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

所述益生菌組合物選自：雙歧桿菌、乳桿菌、大腸桿菌和糞腸球菌中的一種或多種。

作為一種優(yōu)選的方案，所述益生菌組合物由雙歧桿菌5-10份、乳桿菌4-6份、大腸桿菌1-3份和糞腸球菌2-4份組成。

作為另一種優(yōu)選的方案，所述益生菌組合物由雙歧桿菌5-10份和大腸桿菌1-3份組成。

上述的益生菌組合中，所述雙歧桿菌包括但不限于：兩歧雙歧桿菌(bifidobacteriumbifidum)、動物雙歧桿菌(bifidobacteriumanimalis)或長型雙歧桿菌(bifidobacteriumlongum)。

所述的乳桿菌包括但不限于：嗜酸乳桿菌(lactobacillusacidophilus)、保加利亞乳桿菌(lactobacillusbulgaricus)或鼠李糖乳桿菌(lactobacillusrhamnosus)。

所述的大腸桿菌優(yōu)選為尼氏大腸桿菌。

優(yōu)選的，所述益生菌組合物中的益生菌均為活菌；進(jìn)一步的，所述益生菌組合物中的活菌含量不低于1×10⁷cfu/g。

優(yōu)選的，所述益生菌組合物是有效劑量益生菌作為活性成分制成的活菌制劑。

所述產(chǎn)品包括：藥物、食品或保健品。

本發(fā)明的第二方面，提供一種促進(jìn)乙型肝炎病毒清除的益生菌組合物，所述益生菌組合物選自：雙歧桿菌、乳桿菌、大腸桿菌和糞腸球菌中的一種或多種。

優(yōu)選的，上述益生菌組合物中，活菌含量均不低于1×10⁷cfu/g。

本發(fā)明的第三方面，提供一種促進(jìn)乙型肝炎病毒清除的藥物制劑，所述藥物制劑由上述的益生菌組合和藥學(xué)上可接受的輔料制成。

所述藥物制劑的劑型是口服制劑。

進(jìn)一步的，所述藥物制劑的劑型為片劑、膠囊劑、滴丸劑、凝膠劑或散劑。

所述藥學(xué)上可接受的輔料為藥物制劑中的常規(guī)輔料，優(yōu)選為微晶纖維素、甜菜堿、淀粉、羧甲基纖維素鈉中的一種或多種。

本發(fā)明的第四方面，提供上述益生菌組合和/或藥物制劑在調(diào)節(jié)動物腸道菌群中的用途。

需要說明的是，在本文中所使用的術(shù)語“動物”所指的動物種類不受特別限制，該動物可以為任何具有腸道器官的動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選大鼠、小鼠、人，最優(yōu)選人。

本發(fā)明的第五方面，提供一種治療乙型肝炎的方法，該方法包括給予面臨乙型肝炎風(fēng)險或經(jīng)診斷患有乙型肝炎的受試者有效量的上述益生菌組合。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明從調(diào)節(jié)乙型肝炎病毒患者腸道菌群平衡出發(fā)，篩選出了能促進(jìn)乙型肝炎病毒清除的益生菌組合物，并通過體外動物實驗驗證了本發(fā)明的益生菌組合在血清hbsag水平、血清hbvdna水平、肝組織pgrna及cccdna水平，均表現(xiàn)出顯著促進(jìn)hbv清除的作用，可以用于乙肝的治療，與現(xiàn)有治療乙肝的策略相比，采用本發(fā)明的益生菌組合進(jìn)行治療，安全經(jīng)濟(jì)并具有良好的耐受性，對于臨床治療乙肝具有重要意義。

附圖說明

構(gòu)成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本申請的進(jìn)一步理解，本申請的示意性實施例及其說明用于解釋本申請，并不構(gòu)成對本申請的不當(dāng)限定。

圖1：益生菌活性的驗證結(jié)果；圖中，(a)pbs、(b)益生菌a、(c)益生菌b涂板結(jié)果圖。

圖2：整體實驗流程圖。

圖3：益生菌組合物促進(jìn)hbv清除的效果圖；圖中，(a)血清hbsag水平(b)血清hbvdna水平(c)肝組織pgrna水平(d)肝組織cccdna水平。

圖4：高通量測序中pca分析益生菌改變腸道菌群的結(jié)構(gòu)圖。

具體實施方式

應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說明都是例示性的，旨在對本申請?zhí)峁┻M(jìn)一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本申請所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語僅是為了描述具體實施方式，而非意圖限制根據(jù)本申請的示例性實施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)在本說明書中使用術(shù)語“包含”和/或“包括”時，其指明存在特征、步驟、操作、器件、組件和/或它們的組合。

正如背景技術(shù)所介紹的，目前的研究主要集中在腸道菌群平衡與肝炎發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系上，而對于如何通過外源益生菌清除乙型肝炎病毒目前尚未見報道，基于此，本申請?zhí)岢隽艘环N促進(jìn)乙型肝炎病毒清除的益生菌組合物及其應(yīng)用。

在本申請的一種實施方案中，提供了一種促進(jìn)乙型肝炎病毒清除的益生菌組合物，所述益生菌組合物由雙歧桿菌5-10份、乳桿菌4-6份、大腸桿菌2-4份和糞腸球菌1-3份組成。

在本申請的另一種實施方案中，提供了一種促進(jìn)乙型肝炎病毒清除的益生菌組合物，所述益生菌組合物由雙歧桿菌5-10份和大腸桿菌2-4份組成。

本申請還通過體外動物實驗驗證了上述實施方案中的益生菌組合物干預(yù)對于hbv小鼠(尾靜脈高壓paav/hbv1.2質(zhì)粒)清除hbv能力的影響，結(jié)果表明，上述的益生菌組合在血清hbsag水平、血清hbvdna水平、肝組織pgrna及cccdna水平，均表現(xiàn)出顯著促進(jìn)hbv清除的作用。由此提出了上述益生菌組合物在制備促進(jìn)乙型肝炎病毒清除的藥物中用途。

需要說明的是，腸道菌群是一個大的生態(tài)系統(tǒng)，腸道菌群平衡的調(diào)節(jié)是目前研究的難點所在，通過外源加入益生菌來調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，進(jìn)而促進(jìn)對體內(nèi)乙型肝炎病毒的清除更是目前技術(shù)上的空白。因為外源加入益生菌要發(fā)揮作用必須達(dá)到足夠的活性菌數(shù)量，益生菌的活性問題也限制了益生菌的廣泛應(yīng)用；另一方面，由于腸道菌群是一個大的生態(tài)系統(tǒng)，若盲目的采用外源益生菌的加入進(jìn)行調(diào)節(jié)，很容易引起新發(fā)菌群的失調(diào)。本申請通過反復(fù)的試驗，對益生菌的種類選擇和用量復(fù)配進(jìn)行考察，研究發(fā)現(xiàn)，相較于其他的益生菌或者其組合，采用本申請的益生菌組合物能夠恢復(fù)腸道菌群平衡，促進(jìn)乙型肝炎病毒的清除，同時不會引發(fā)新的菌群失調(diào)。

為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更加清楚地了解本申請的技術(shù)方案，以下將結(jié)合具體的實施例和對比例詳細(xì)說明本申請的技術(shù)方案。

本發(fā)明實施例中所用的試驗材料均為本領(lǐng)域常規(guī)的試驗材料，均可通過商業(yè)渠道購買得到。

本發(fā)明實施例中所用到的益生菌均為常規(guī)的市售產(chǎn)品，例如可以從中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(cicc)購買得到；或者從益生菌生產(chǎn)廠家購買得到。

實施例1：促進(jìn)乙型肝炎病毒清除的益生菌組合物

由兩歧雙歧桿菌8份、嗜酸乳桿菌5份、尼氏大腸桿菌1份和糞腸球菌3份組成；該益生菌組合物命名為益生菌a(probiotica)。

上述益生菌組合物中的益生菌均為活菌；活菌含量不低于1×10⁷cfu/g。

實施例2：促進(jìn)乙型肝炎病毒清除的益生菌組合物

由兩歧雙歧桿菌8份、尼氏大腸桿菌1份組成；該益生菌組合物命名為益生菌b(probioticb)。

上述益生菌組合物中的益生菌均為活菌；活菌含量不低于1×10⁷cfu/g。

試驗例1：本發(fā)明的益生菌組合物對hbv清除作用的考察

1.試驗方法：

將實施例1和實施例2制備的益生菌組合物用無菌pbs稀釋后，按一定劑量灌胃給尾靜脈高壓paav/hbv1.2質(zhì)粒構(gòu)建的hbv小鼠，通過檢測血清hbsag、hbvdna等水平考察本發(fā)明的益生菌組合物對hbv的清除作用。具體方法如下：

(1)準(zhǔn)備益生菌懸液：

在超凈臺中，將益生菌組合物用無菌1×pbs稀釋至1×10⁷cfu/ml，分裝至1.5mlep管中，在4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)驗證益生菌活性：

將益生菌懸液稀釋后涂布于lb平板中，每個平板中涂約50-100cfu；37℃、厭氧培養(yǎng)18h左右，觀察lb平板中菌落的有無及數(shù)量；若有菌落則證明益生菌為活菌可用于灌胃，若菌落數(shù)目可達(dá)100cfu則證明灌胃劑量合適。

(3)動物試驗：

動物試驗的試驗流程圖如圖2所示。

1)由于小鼠腸道菌群在其6周左右即達(dá)到穩(wěn)態(tài)，故在小鼠3周時即灌胃益生菌干預(yù)小鼠腸道菌群，隨后再尾靜脈高壓paav/hbv1.2質(zhì)粒以構(gòu)建hbv小鼠模型。

2)將3周齡、雄性c57bl/6j小鼠分為兩組，一組為control組，灌胃1×pbs；另一組為probiotic組，灌胃益生菌，灌胃劑量均為100μl/mice。

3)持續(xù)灌胃2周后，即小鼠5周齡時進(jìn)行尾靜脈高壓paav/hbv1.2質(zhì)粒以構(gòu)建hbv小鼠模型，高壓劑量為10μg質(zhì)粒稀釋于小鼠體重8％的1×pbs中，并在5秒內(nèi)完成尾靜脈高壓注射。

4)此后仍每天持續(xù)灌胃，持續(xù)6周，并且每周收集一次血清、糞便，尾靜脈高壓一周后的血清或糞便命名為1wpi(weekspostinjection)并依次類推。

5)血清收集方法：小鼠內(nèi)眥采血約100-200μl，靜置30min后，12000rpm，5min，吸取血清至一新1.5mlep管，可收集約50-100μl血清，存于-80℃，血清應(yīng)避免反復(fù)凍融。

6)糞便收集方法：在超凈臺中收集糞便，將小鼠置于鼠籠中，牙簽采集小鼠排出的糞便于無菌1.5mlep管中，收集約200mg糞便后將ep管置于冰上，再收集下一只小鼠糞便，最終將糞便存于-80℃，并避免反復(fù)凍融。

采用elisa檢測血清hbsag：

酶聯(lián)免疫法檢測血清hbsag的原理是在微孔條上預(yù)包被純化的乙肝表面抗體(hbsab)，配以酶標(biāo)記抗體(hbsab-hrp)及tmb等其它試劑，采用夾心法原理檢測血清hbsag。具體方法如下：

1)將血清用1×pbs稀釋，不同時間點的血清按不同的稀釋倍數(shù)稀釋使最終的od450-od630數(shù)值處于標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之內(nèi)，以便于計算準(zhǔn)確的hbsag濃度。

2)平衡：將試劑盒各組分從盒中取出，平衡至室溫，取出所需數(shù)量微孔板，剩余者使用自封袋封存。

3)配液：濃縮洗滌液配制前使結(jié)晶充分融化并搖勻，將其和蒸餾水按1:19稀釋后方可使用。

4)編號：取所需數(shù)量微孔條固定于支架。

5)稀釋：每孔加入20μl樣品稀釋液。

6)加樣：分別在相應(yīng)孔中加入100μl陰、陽性對照血清或待測樣本。

7)溫育：37℃溫育60min。

8)加酶：分別在每孔中加入酶標(biāo)記抗體50μl。

9)溫育：37℃溫育30min。

10)洗滌：用洗滌液洗滌5次，每次洗滌應(yīng)保持30-60秒的浸泡時間，洗滌后扣干。

11)顯色：每孔加底物a、b各50μl，輕拍混勻，37℃暗置30min。

12)終止：每孔加入終止液50μl，輕拍混勻。

13)測定：終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀雙波長450nm/630nm測定各孔o(hù)d值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出相應(yīng)hbsag濃度。

qpcr檢測血清hbvdna：

使用乙型肝炎病毒(hbv)核酸定量檢測試劑盒(pcr-熒光探針法)實現(xiàn)血清中hbvdna的定量檢測；首先采用磁珠法純化技術(shù)實現(xiàn)病毒核酸純化，樣本前處理液將樣本中的病毒顆粒富集，然后裂解液將病毒顆粒裂解，釋放出病毒核酸，磁珠表面具有大量的羧基修飾，經(jīng)rm活化液活化，這些羧基會吸附蛋白質(zhì)雜質(zhì)而不會吸附核酸，因此可將核酸分離純化；pcr熒光探針法采用pcr反應(yīng)液擴(kuò)增hbv基因組目的片段，擴(kuò)增反應(yīng)同時將特異性熒光探針?biāo)舛尫虐l(fā)光基團(tuán)，通過檢測及分析自由發(fā)光基團(tuán)受激光產(chǎn)生的熒光信號可實現(xiàn)對hbvdna的檢測和定量。具體方法如下：

1)在1.5mlep管中加入100μl樣品前處理液、100μl待測血清樣本(對照品、定量標(biāo)準(zhǔn)品視作樣品同樣處理)，振蕩混勻；

2)15000g4℃離心10min，吸棄上清(離心時注意固定離心管方向、吸棄上清時盡可能不碰沉淀)；

3)加入25μl裂解液，徹底振蕩混勻，100℃干浴或沸水浴10min；

4)15000g4℃離心10min；

5)配制qpcr反應(yīng)體系(pcr反應(yīng)液29.6μl，活化液15μl，taq酶0.4μl，ung酶0.06μl)，充分混勻，在8聯(lián)排中每孔加入22.5μl上述配制的溶液，再加入第4)步中上清2.5μl，qpcr擴(kuò)增條件為37℃5min；95℃5min；95℃15s，60℃40s，45個循環(huán)；熒光信號收集設(shè)置在60℃，反應(yīng)體系為25μl。

pcr檢測肝組織cdna的pgrna水平：

具體方法如下：

1)利用trizol一步法提取肝組織rna，首先將組織樣品按50-100μg/ml加入trizol，利用電動勻漿器勻化組織；

2)室溫放置5min，加200μl氯仿，充分振蕩15s；

3)室溫放置2-15min，4℃，12000rpm，離心15min；

4)離心后混合物將會出現(xiàn)分層現(xiàn)象，分為三層：底層是氯仿層，中間層是dna和蛋白質(zhì)的白色云霧層，上層是水相層含有rna；

5)吸取上層水相于另一新1.5mlep管中，加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻；

6)室溫靜置10min，4℃，12000rpm，離心10min；

7)小心吸棄上清，在ep管底部形成的白色沉淀即為rna，加入1ml冷的含depc的75％乙醇，洗滌沉淀；

8)4℃，12000rpm，離心5min；

9)棄乙醇，室溫干燥，加20-30μl1％depc水充分溶解，測量rna濃度及純度，存于-80℃或立即進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實驗；

10)將提的rna逆轉(zhuǎn)錄為cdna，首先在冰浴的1.5mlep管中加入1μgrna，1μloligo(dt)18primer，無核酸酶的水定量至12μl，混勻；

11)65℃水浴5min，瞬離后冰上靜置；

12)再在管中加入5×reactionbuffer4μl，ribolockrnaseinhibitor1μl，10mmdntpmix2μl，revertaidm-mulvrt1μl，混勻；

13)42℃水浴60min；

14)70℃水浴5min終止反應(yīng)，cdna可暫存于-20℃；

15)以逆轉(zhuǎn)錄獲得的cdna為模板，擴(kuò)增actin及pgrna，擴(kuò)增體系均為25μl(2×pcrmix12.5μl，cdna1μl，上、下游引物各0.5μl，ddh2o10.5μl),擴(kuò)增條件為(95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃30s，28個循環(huán)；72℃5min；4℃保存)；

16)配制1％瓊脂糖凝膠，將pcr產(chǎn)物進(jìn)行電泳，110v30min，在瓊脂糖凝膠成像儀中成像。

qpcr檢測肝組織dna的cccdna水平：

具體方法如下：

1)利用試劑盒提取肝組織中dna，首先取米粒大小肝組織加入200μl緩沖液ga，20μlproteinasek溶液，混勻；

2)56℃水浴4h或過夜(可適當(dāng)將組織搗碎)；

3)加入200μl緩沖液gb，充分顛倒混勻，70℃放置10min，溶液應(yīng)變清亮，瞬離以去除管蓋內(nèi)壁的水珠；

4)加人200μl無水乙醇，充分振蕩混勻15s，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀；

5)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)；

6)向吸附柱cb3中加入500μl緩沖液gd，12000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱cb3放入收集管中；

7)向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，12000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱cb3放入收集管中，重復(fù)此操作一次；

8)將吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm離心2min，倒掉廢液；

9)將吸附柱cb3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；

10)將吸附柱cb3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200μl雙蒸水，室溫放置2-5min，12000rpm離心2min，將溶液收集到離心管中；

11)檢測所得dna樣品的濃度和純度，可放于-20℃冰箱保存；

12)檢測cccdna前，所得樣品中需要加入plasmid-safetmatp-dependentdnase(pasd)酶(epicentre)(此酶能夠有效的降解非完整雙鏈的dna，提高h(yuǎn)bvcccdna的含量)，反應(yīng)體系為(25mmatp2μl，10×reactionbuffer5ul，plasmid-safednase(10u)1ul，dna2ug，雙蒸水補齊至50μl)，37℃水浴1h，70℃水浴30min終止反應(yīng)，保存于-20℃冰箱；

13)以酶消化處理的dna為模板，qpcr擴(kuò)增cccdna，以未處理的dna為模板擴(kuò)增β-globin(β-globin是一種管家基因，將cccdna以β-globin為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)化)擴(kuò)增體系均為20μl(2×qpcrmix10μl，cdna1μl/1μg，上、下游引物各0.5μl，ddh2o補齊至20μl),擴(kuò)增條件為(95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃30s，28個循環(huán)；72℃5min；4℃保存)。

提取糞便基因組dna用于高通量測序檢測糞便菌群：

具體方法如下：

1)稱取糞便樣本180-220mg至2ml離心管中，并將管子置于冰上；

2)向樣本中加入1.4ml緩沖液gsl，間歇振蕩1min至樣本混勻；

3)70℃孵育5min；

4)渦旋15s，12000rpm離心1min，轉(zhuǎn)移上清液1.2ml至新的2ml離心管；

5)加入一個抑制劑吸附片inhibitex，振蕩至吸附片徹底打開重懸，室溫孵育1min，使吸附片能充分作用；

6)12000rpm離心3min，將所得上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管，可重復(fù)離心一次；

7)轉(zhuǎn)移所得上清液200μl至新的1.5ml離心管，加入15μlproteinasek；

8)加入200μl緩沖液gb，渦旋15s；

9)70℃孵育10min；

10)加入200μl無水乙醇，渦旋混勻；

11)將上一步所得溶液加入到一個吸附柱cr2中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱cr2放入收集管中；

12)向吸附柱cr2中加入500μl緩沖液gd，12000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱cr2放入收集管中；

13)向吸附柱cr2中加入600μl漂洗液pw，12000rpm離心30s，倒掉廢液，吸附柱cr2放入收集管中，重復(fù)洗滌一次；

14)將吸附柱cr2放回收集管中，12000rpm離心2min，倒掉廢液，將吸附柱cr2置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；

15)將吸附柱cr2轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50μl雙蒸水，室溫放置2-5min，12000rpm離心2min，將溶液收集到離心管中。

16)采用高通量測序檢測糞便菌群，利用pca分析益生菌組合對腸道菌群的改變。

2.試驗結(jié)果：

(1)益生菌活性的驗證結(jié)果：

益生菌的涂板結(jié)果如圖1所示，由圖1可以看出：涂布益生菌a及益生菌b的平板均有菌落生長且菌落數(shù)目可達(dá)100cfu，故兩種益生菌均為活菌可用于灌胃。

(2)血清hbsag水平、血清hbvdna水平、肝組織pgrna水平和肝組織cccdna水平的檢測結(jié)果：

血清hbsag水平的檢測結(jié)果如圖3a所示，血清hbvdna水平的檢測結(jié)果如圖3b所示，肝組織pgrna水平的檢測結(jié)果如圖3c所示，肝組織cccdna水平的檢測結(jié)果如圖3d所示。由上述檢測結(jié)果可以看出：本發(fā)明的益生菌組合(益生菌a、益生菌b)均可應(yīng)用于加快hbv的清除。

(3)高通量測序檢測糞便菌群的實驗結(jié)果：

高通量測序中pca分析益生菌改變腸道菌群的結(jié)構(gòu)圖如圖4所示，pca分析(principalcomponentanalysis)，即主成分分析，是一種對數(shù)據(jù)進(jìn)行簡化分析的技術(shù)，這種方法可以有效的找出數(shù)據(jù)中最“主要”的元素和結(jié)構(gòu)，去除噪音和冗余，將原有的復(fù)雜數(shù)據(jù)降維，揭示隱藏在復(fù)雜數(shù)據(jù)背后的簡單結(jié)構(gòu)。通過分析不同樣本群落組成可以反映樣本間的差異和距離，pca運用方差分解，將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上，坐標(biāo)軸取能夠最大反映樣品間差異的兩個特征值。如樣本物種組成越相似，反映在pca圖中的距離越近。從圖中可以發(fā)現(xiàn)益生菌組小鼠的糞便菌群與對照組小鼠的糞便菌群各自成群，說明益生菌的確改變了小鼠的腸道菌群，而且通過改變的腸道菌群促進(jìn)hbv清除。

以上所述僅為本申請的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本申請，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本申請可以有各種更改和變化。凡在本申請的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本申請的保護(hù)范圍之內(nèi)。