本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，具體涉及一種治療脊髓損傷的藥物及其應用。
背景技術：
脊髓損傷防治與再生修復是當今神經科學的重大難題。脊髓損傷的后果嚴重，輕者喪失勞動能力，重者肢體癱瘓，大小便失禁，喪失日常生活自理能力，為社會和家人帶來很大的負擔。目前，對脊髓損傷的傳統(tǒng)治療方法有很多，但主要以手術減壓配合藥物治療為主，治療效果并不十分理想，尤其是在神經保護和神經再生方面的療效欠佳。
脊髓損傷可分為原發(fā)性損傷與繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷主要由于機械壓迫、出血所致，是被動的、不可逆的；而繼發(fā)性損傷主要由于水腫、炎癥反應、局部缺血脂質過氧化作用、鈣離子超載等所致，伴隨著細胞內一系列的代謝和基因改變，這一過程具有可逆性，是可以進行干預的。隨著對脊髓損傷繼發(fā)損傷的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)多種基因表達的改變在脊髓損傷繼發(fā)損傷中起著重要作用，因此，有效地干預這些基因的表達、改善受損脊髓的微環(huán)境應該是一種針對繼發(fā)損傷有效的治療手段。
mirna是一種小的非編碼rna，廣泛存在于各種動植物中，它通過對蛋白質表達的調控來影響細胞分化、胚胎發(fā)育等一系列重要生命活動。mirna通過2-8個核苷酸與位于靶標mrna的開放讀碼框和3'非翻譯區(qū)的互補序列進行堿基配對來實現(xiàn)對靶標的識別，結合后引起靶標失去穩(wěn)定、翻譯中止，從而對靶標蛋白進行調控，沉默先前活動的分子程序。雖然單一靶標的抑制效果是局部的，但每個mirna可以識別和抑制數百個mrna靶標，最終可導致細胞蛋白組成發(fā)生全面變化，這就為細胞命運的穩(wěn)定轉變提供了保障。研究證實，mirna與重大疾病，如腫瘤、心臟疾病、神經性疾病等都有著密切的關聯(lián)，因此利用mirna模擬物（mimics）或抑制劑（anti-mirna）作為治療藥物的設想也倍受人們關注。
骨髓間充質干細胞具有體外增殖能力強、細胞來源廣、免疫源性低、可向多種細胞分化（包括運動神經元）的同時幾乎不存在倫理爭議，并且可分泌各種營養(yǎng)因子，提高機體機能，具有廣泛的臨床應用前景。
《mir-31促進脊髓損傷后nestin和nse表達》（田峰等，中國組織化學與細胞化學雜志，第24卷第6期，2015.12）中mir-31在脊髓損傷后可能發(fā)揮著促進神經干細胞再生，改善脊髓損傷模型脊髓內微環(huán)境，促進脊髓損傷的恢復的作用。但只是單一成分的功能表達，并且是通過轉基因的技術來實現(xiàn)，未能達到廣泛應用及功能提高的效果。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明克服現(xiàn)有技術的不足，所要解決的技術問題是提供一種治療脊髓損傷的小分子核酸組合藥物及其應用，具體涉及一種治療脊髓損傷的藥物及其應用。
為解決上述技術問題，本發(fā)明所采用的技術方案為：
所述藥物包括mir-31小核酸和骨髓間充質干細胞組合物，所述的mir-31小核酸的序列為：
正義鏈：5’-aggcaagaugcuggcauagcu-3’
反義鏈：5’-agctatgccagcatcttgcct-3’。
所述的mir-31小核酸通過化學合成方法制備，經hplc純化獲得。
所述的骨髓間充質干細胞從患者體內提取，并在體外培養(yǎng)純化增殖；或者當患者身體狀況不允許從體內提取細胞時，可為其提供相同血型的骨髓間充質干細胞。
本發(fā)明所述的mir-31小核酸濃度為20nmol/ml，骨髓間充質干細胞的濃度為1×106個/ml，mir-31小核酸和骨髓間充質干細胞按照體積比1-3:1混合。給藥途徑為將脊髓損傷部位暴露出，用注射器注射mir-31小核酸組合物注射入脊髓損傷區(qū)，注射量為1-5ml，注射速度為10μl/h。
所述的藥物是指以mir-31小核酸和骨髓間充質干細胞為活性成分，或者是含有mir-31小核酸和骨髓間充質干細胞的藥物組合物。
所述的藥物組合物是指含有有效量的所述的mir-31小核酸和骨髓間充質干細胞，以及藥學上可接受的載體。
本發(fā)明還提供了一種治療脊髓損傷藥物的新用途，即將mir-31小核酸和骨髓間充質干細胞組合物在治療脊髓損傷中的應用。
mir-31小核酸分子攜帶有高親和性膽固醇分子，可以幫助其穿過細胞膜進入脊髓內影響神經干細胞的增殖分化情況。骨髓間充質干細胞可以分泌營養(yǎng)因子，幫助損傷部位快速修復。
骨髓間充質干細胞獲得容易，可分泌多種營養(yǎng)因子，改善局部微環(huán)境，有助于消除損傷部位炎癥；可向多種細胞分化，有利于修復組織形成，有效促進脊髓損傷后的修復。當與小分子核酸藥物聯(lián)合應用時，主要作用為先促進神經干細胞在體內的發(fā)育，隨后誘導其向神經元的高比例分化，填補脊髓損傷后的神經缺損，重建神經連接，恢復機體的運動功能。骨髓間充質干細胞可起到減緩脊髓損傷，降低炎癥效應，其分泌的營養(yǎng)因子可促進受損組織的恢復，與小核酸藥物同時注射可起到相互促進的作用。
與現(xiàn)有技術相比本發(fā)明具有以下有益效果：
mirna小分子核酸結合骨髓間充質干細胞，誘導神經元的高比例分化，填補脊髓損傷后的神經缺損，重建神經連接，恢復機體的運動功能。骨髓間充質干細胞可起到減緩脊髓損傷，降低炎癥效應，其分泌的營養(yǎng)因子可促進受損組織的恢復，與小核酸藥物同時注射可起到相互促進的作用。在脊髓損傷后注射入損傷處脊髓，改善損傷后的脊髓微環(huán)境，有效促進損傷脊髓的修復。
具體實施方式
以下結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。
實施例1
通過化學合成方法制備，經hplc純化獲得mir-31小分子核酸，序列為：正義鏈：5’-aggcaagaugcuggcauagcu-3’、反義鏈：5’-agctatgccagcatcttgcct-3’，骨髓間充質干細胞從患者體內提取，mir-31小核酸濃度為20nmol/ml，骨髓間充質干細胞的濃度為1×106個/ml，mir-31小分子核酸與骨髓間充質干細胞的比例為1:1混合?；旌虾笈c海藻酸鈉膠體等體積混合，在手術減壓切開硬脊膜時使用注射器將mir-31小分子核酸組合藥物注射入脊髓損傷區(qū)，注射量為1ml，注射速度為10μl/h。
實施例2
通過化學合成方法制備，經hplc純化獲得mir-31小分子核酸，序列為：正義鏈：5’-aggcaagaugcuggcauagcu-3’、反義鏈：5’-agctatgccagcatcttgcct-3’，骨髓間充質干細胞從患者體內提取，mir-31小核酸濃度為20nmol/ml，骨髓間充質干細胞的濃度為1×106個/ml，mir-31小分子核酸與骨髓間充質干細胞的比例為2:1混合?；旌虾笈c海藻酸鈉膠體等體積混合，在手術減壓切開硬脊膜時使用注射器將mir-31小分子核酸組合藥物注射入脊髓損傷區(qū)，注射量為5ml，注射速度為10μl/h。
實施例3
通過化學合成方法制備，經hplc純化獲得mir-31小分子核酸，序列為：正義鏈：5’-aggcaagaugcuggcauagcu-3’、反義鏈：5’-agctatgccagcatcttgcct-3’，骨髓間充質干細胞從患者體內提取，mir-31小核酸濃度為20nmol/ml，骨髓間充質干細胞的濃度為1×106個/ml，mir-31小分子核酸與骨髓間充質干細胞的比例為3:1混合?；旌虾笈c海藻酸鈉膠體等體積混合，在手術減壓切開硬脊膜時使用注射器將mir-31小分子核酸組合藥物注射入脊髓損傷區(qū)，注射量為2.5ml，注射速度為10μl/h。
實施例4：體外實驗中高表達mir-31小核酸對神經干細胞分化的影響
實驗方法：
體外培養(yǎng)神經干細胞，以1×106接種于六孔板上，加入mir-31小分子核酸（使用濃度30pmol/ml），共培養(yǎng)三天。提取總rna檢測，可以發(fā)現(xiàn)mir-31小分子核酸的表達顯著增高，實驗組為對照組的18倍。通過檢測神經干細胞和運動神經元的表達量可以發(fā)現(xiàn)，過表達mir-31可以提高神經干細胞標志物的表達，說明其可以促進神經干細胞的增殖，而抑制物可以促進神經干細胞的分化。這些結果為mir-31在脊髓損傷的治療中提供了理論依據和實驗基礎。
實施例5：體內實驗中高表達mir-31小核酸和骨髓間充質干細胞可以有效修復受損脊髓
實驗方法：
1、脊髓損傷模型的構建
將小鼠麻醉后置于俯臥位，在t9-t10行椎板切除術。損傷組采用nyu脊髓損傷儀，以5g×12.5mm力致傷，打擊完畢后，無菌縫合傷口。假手術組除不損傷脊髓外，其余同損傷組。術后常規(guī)人工排尿2-3次/天，直至恢復自主膀胱。采用bbb運動評分法，每天對各組動物進行評分：將小鼠放在一圓形平臺上爬行，每次3min，通過觀察動物的臀、膝、踝關節(jié)、行走、軀干運動及其協(xié)調情況進行打分，完全截癱為0分，正常為21分，最終判斷造模是否成功。
2、選擇成年fvb小鼠，雌雄各半，隨機分為10組，每組雌雄各5只。i組為模擬物治療組，ii組為模擬物治療對照組，iii組為抑制物治療組，iv組為抑制物治療對照組，v組為脊髓損傷組，vi組為假手術組。模擬物治療組、模擬物治療對照組、抑制物治療組、抑制物治療對照組均為在脊髓損傷造模后，立即用微型注射器注射相應的治療液注射至大鼠脊髓損傷區(qū)，使用時將小核酸藥物與骨髓間充質干細胞混勻，干細胞注射量為1×106個，小核酸藥物注射濃度為20nmol/ml，注射速度為10μl/h；脊髓損傷組為僅進行脊髓損傷造模，沒有進行注射；假手術組為僅暴露脊髓，未進行脊髓損傷造模。術后每天給動物腹腔注射青霉素，10萬u/kg，每日將動物的膀胱人工排空兩次，直到動物自身排尿反射恢復。每日通過bbb評分判斷動物狀態(tài)。
3、小鼠成熟的mirna小分子核酸序列：aggcaagaugcuggcauagcug，人的成熟的mirna小分子核酸序列為aggcaagaugcuggcauagcu；全基因組測序結果表明人類與小鼠基因組相似，并且人類與小鼠同為脊椎動物，在生物體發(fā)育過程中無顯著差別。
結果表明：模擬物治療組的效果顯著。
本發(fā)明可用其他的不違背本發(fā)明的精神或主要特征的具體形式來概述。因此，無論從哪一點來看，本發(fā)明的上述實施方案都只能認為是對本發(fā)明的說明而不能限制發(fā)明，權利要求書指出了本發(fā)明的范圍，而上述的說明并未指出本發(fā)明的范圍，因此，在與本發(fā)明的權利要求書相當的含義和范圍內的任何變化，都應認為是包括在權利要求書的范圍內。