本發(fā)明涉及細(xì)胞生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種高濃度人間充質(zhì)干細(xì)胞提取物及其制備方法。

背景技術(shù)：

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells,msc)是一組源于基質(zhì)的異質(zhì)細(xì)胞群，可以從人體大多數(shù)組織獲取。它們具有自我更新能力、組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)能力，可以向中胚層譜系分化，例如：脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等，此外還能夠向其它胚層譜系細(xì)胞分化，例如向表皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞分化。

間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)體系中含有多種大量的活性成分，如：干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(scf)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fgf)、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vegf)、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(egf)、細(xì)胞集落刺激因子、白細(xì)胞介素(il)、膠原蛋白、透明質(zhì)酸等80余種活性物質(zhì)。目前，已經(jīng)有將間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于損傷修復(fù)和自身免疫性疾病的報(bào)道,但是由于活性細(xì)胞的存活條件比較苛刻，很容易死亡因此由活細(xì)胞所起的作用也會(huì)大打折扣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種高濃度人間充質(zhì)干細(xì)胞提取物及其制備方法，利用高濃度的間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子，為間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用提供高效、快捷、方便的途徑。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種高濃度人間充質(zhì)干細(xì)胞提取物的制備方法，包括以下步驟：

(1)人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)：從細(xì)胞庫(kù)中選取p2-p6的人間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇，接種批次記為第一批次、第二批次、第三批次，接種密度分別為最大融合度的50％-60％、35％-45％、20％-30％；細(xì)胞接種完成，放于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，溫度37℃，二氧化碳體積比濃度5％；

(2)第一批次細(xì)胞融合度達(dá)到70％-80％時(shí)，以生理鹽水清洗細(xì)胞2次，用復(fù)方電解質(zhì)注射液進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；

(3)饑餓培養(yǎng)12-24小時(shí)后，第一批次細(xì)胞融合度達(dá)90％-95％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，3000-4500g條件下離心5-8min除去沉淀，取離心后上清備用；

(4)取培養(yǎng)的第二批次細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70％-80％，以生理鹽水清洗第二批次細(xì)胞2次，用步驟(3)中細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；

(5)饑餓培養(yǎng)12-24小時(shí)后，第二批次細(xì)胞融合度達(dá)90％-95％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，3000-4500g條件下離心5-8min除去沉淀，取離心后上清備用；

(6)取培養(yǎng)的第三批次細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70％-80％，以生理鹽水清洗第三批次細(xì)胞2次，用步驟(5)中細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；

(7)饑餓培養(yǎng)12-24小時(shí)后，第三批次細(xì)胞融合度達(dá)90％-95％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，3000-4500g條件下離心5-8min除去沉淀，取離心后上清，得到高濃度間充質(zhì)干細(xì)胞提取物。

上述高濃度人間充質(zhì)干細(xì)胞提取物的制備方法得到的高濃度人間充質(zhì)干細(xì)胞提取物。

本發(fā)明有益效果：將細(xì)胞進(jìn)行饑餓培養(yǎng)，使得細(xì)胞分泌的各種活性成分的濃度都得到了提高，并且在短時(shí)間內(nèi)使用饑餓上清重復(fù)饑餓間充質(zhì)干細(xì)胞，使細(xì)胞提取物濃度進(jìn)一步增加。而高濃度的間充質(zhì)干細(xì)胞提取物為干細(xì)胞提取物提供了高效的制備方法。

附圖說(shuō)明

圖1本發(fā)明實(shí)施例1的方法培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞圖；

圖2實(shí)施例1不同饑餓次數(shù)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞提取物中有效因子分泌量比較圖；

圖3本發(fā)明實(shí)施例2的方法培養(yǎng)的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞圖；

圖4實(shí)施例2不同饑餓次數(shù)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞提取物中有效因子分泌量比較圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明：

本發(fā)明的高濃度人間充質(zhì)干細(xì)胞提取物的制備方法，包括以下步驟：

(1)人間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)：從細(xì)胞庫(kù)中選取p2-p6的人間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇，接種批次記為第一批次、第二批次、第三批次，接種密度分別為最大融合度的50％-60％、35％-45％、20％-30％；細(xì)胞接種完成，放于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，溫度37℃，二氧化碳體積比濃度5％；

(2)第一批次細(xì)胞融合度達(dá)到70％-80％時(shí)，以生理鹽水清洗細(xì)胞2次，用復(fù)方電解質(zhì)注射液進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；

(3)饑餓培養(yǎng)12-24小時(shí)后，第一批次細(xì)胞融合度達(dá)90％-95％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，3000-4500g條件下離心5-8min除去沉淀，取離心后上清備用；

(4)取培養(yǎng)的第二批次細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70％-80％，以生理鹽水清洗第二批次細(xì)胞2次，用步驟(3)中細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；

(5)饑餓培養(yǎng)12-24小時(shí)后，第二批次細(xì)胞融合度達(dá)90％-95％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，3000-4500g條件下離心5-8min除去沉淀，取離心后上清備用；

(6)取培養(yǎng)的第三批次細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70％-80％，以生理鹽水清洗第三批次細(xì)胞2次，用步驟(5)中細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；

(7)饑餓培養(yǎng)12-24小時(shí)后，第三批次細(xì)胞融合度達(dá)90％-95％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，3000-4500g條件下離心5-8min除去沉淀，取離心后上清，得到高濃度間充質(zhì)干細(xì)胞提取物。

上述高濃度人間充質(zhì)干細(xì)胞提取物的制備方法得到的高濃度人間充質(zhì)干細(xì)胞提取物

制備的高濃度人間充質(zhì)干細(xì)胞提取物可用于損傷修復(fù)和炎癥治療等。

實(shí)施例1

(1)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)：從細(xì)胞庫(kù)中選取p4的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇，細(xì)胞總數(shù)4.2*10⁷。接種批次記為第一批次、第二批次、第三批次，接種密度分別為最大融合度的60％(每瓶接種細(xì)胞數(shù)：9*10⁶,接種細(xì)胞三瓶)、40％(每瓶接種細(xì)胞數(shù)：6*10⁶，接種細(xì)胞兩瓶)、20％(接種細(xì)胞數(shù)：3*10⁶，接種細(xì)胞一瓶),培養(yǎng)體系均為40ml。培養(yǎng)細(xì)胞所用完全培養(yǎng)基為無(wú)酚紅dmem/df12和體積比濃度為10％胎牛血清，接種細(xì)胞瓶為t-175培養(yǎng)瓶。細(xì)胞接種完成，放于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，溫度37℃，二氧化碳體積比濃度5％；

(2)培養(yǎng)30小時(shí),此時(shí)第一批次細(xì)胞融合度達(dá)到75％時(shí)，見(jiàn)(圖1)，以生理鹽水清洗細(xì)胞2次，每瓶用40ml復(fù)方電解質(zhì)注射液(中國(guó)大冢制藥有限公司生產(chǎn)的復(fù)方電解質(zhì)葡萄糖mg3注射液)進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；

(3)饑餓培養(yǎng)18小時(shí)后，第一批次細(xì)胞融合度達(dá)95％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，4000g條件下離心8min除去沉淀，取離心后上清放于4℃?zhèn)溆茫?/p>

(4)取培養(yǎng)的第二批次細(xì)胞，此時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)到70％，以生理鹽水清洗第二批次細(xì)胞2次，用步驟(3)中細(xì)胞培養(yǎng)上清40ml進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；

(5)饑餓培養(yǎng)18小時(shí)后，第二批次細(xì)胞融合度達(dá)95％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，4000g條件下離心8min除去沉淀，取離心后上清放于4℃?zhèn)溆茫?/p>

(6)取培養(yǎng)的第三批次細(xì)胞，此時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)到70％，以生理鹽水清洗第三批次細(xì)胞2次，用步驟(5)中細(xì)胞培養(yǎng)上清40ml進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；(7)饑餓培養(yǎng)24小時(shí)后，第三批次細(xì)胞融合度達(dá)90％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，4000g條件下離心8min除去沉淀，取離心后上清放于4℃?zhèn)溆谩z測(cè)步驟(3)、步驟(5)和步驟(7)中的備用上清細(xì)胞因子含量，見(jiàn)(圖2)。

實(shí)施例2

(1)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)：從細(xì)胞庫(kù)中選取p5的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇，細(xì)胞總數(shù)3.84*10⁷。接種批次記為第一批次、第二批次、第三批次，接種密度分別為最大融合度的50％(每瓶接種細(xì)胞數(shù)：8*10⁶,接種細(xì)胞三瓶)、35％(每瓶接種細(xì)胞數(shù)：5.6*10⁶，接種細(xì)胞兩瓶)、20％(接種細(xì)胞數(shù)：3.2*10⁶，接種細(xì)胞一瓶),培養(yǎng)體系均為40ml。培養(yǎng)細(xì)胞所用完全培養(yǎng)基為無(wú)酚紅amem和體積比濃度為10％胎牛血清，接種細(xì)胞瓶為t-175培養(yǎng)瓶。細(xì)胞接種完成，放于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，溫度37℃，二氧化碳濃度5％；

(2)培養(yǎng)35小時(shí),此時(shí)第一批次細(xì)胞融合度達(dá)到70％時(shí)，見(jiàn)(圖3)，以生理鹽水清洗細(xì)胞2次，每瓶用40ml復(fù)方電解質(zhì)注射液進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；

(3)饑餓培養(yǎng)18小時(shí)后，第一批次細(xì)胞融合度達(dá)95％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，4000g條件下離心8min除去沉淀，取離心后上清放于4℃?zhèn)溆茫?/p>

(4)取培養(yǎng)的第二批次細(xì)胞，此時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)到70％，以生理鹽水清洗第二批次細(xì)胞2次，每瓶用步驟(3)中細(xì)胞培養(yǎng)上清40ml進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；

(5)饑餓培養(yǎng)18小時(shí)后，第二批次細(xì)胞融合度達(dá)95％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，4000g條件下離心8min除去沉淀，取離心后上清放于4℃?zhèn)溆茫?/p>

(6)取培養(yǎng)的第三批次細(xì)胞，此時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)到75％，以生理鹽水清洗第三批次細(xì)胞2次，用步驟(5)中細(xì)胞培養(yǎng)上清40ml進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；

(7)饑餓培養(yǎng)24小時(shí)后，第三批次細(xì)胞融合度達(dá)90％，收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，4000g條件下離心8min除去沉淀，取離心后上清放于4℃?zhèn)溆?。檢測(cè)步驟(3)、步驟(5)和步驟(7)的細(xì)胞因子含量,見(jiàn)(圖4)。

綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實(shí)施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的有識(shí)之士可以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實(shí)施例，但這種實(shí)施例都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。