本發(fā)明涉及藥物制備領域，尤其涉及一種胰島細胞來源外泌體在制備改善小鼠葡萄糖代謝的藥物中的應用。

背景技術：

外泌體(exosome)直徑大約在40-100nm，是一種由細胞分泌的、具備脂質膜性結構的納米級小囊泡，在電鏡下呈現出特征性“碟形”的橢圓或碟狀的囊泡結構。exosome的雙脂膜富含膽固醇、卵磷脂和鞘磷脂，表面嵌有結合蛋白，膜內存在有2000余種蛋白質、900多種mrna及200多種mirna，能通過多種方式向受體細胞傳遞信息，在生理和病理過程中扮演調控炎癥的角色。

迄今為止的研究已經證實在生理或疾病狀態(tài)下分泌于細胞外環(huán)境中的外泌體，具備降低氧化應激反應、抑制細胞凋亡、誘導細胞增殖以及促血管生成等多種功能，因而在調控機體炎癥反應、修復組織損傷等病理生理進展中發(fā)揮重要作用。所以，胰島細胞來源外泌體可以適用于制備治療多種疾病類的藥物。但是，現有技術領域中，應用胰島細胞來源外泌體制備藥物這一領域存在空白，還尚待研究。

技術實現要素：

為了克服上述現有技術的不足，本發(fā)明提供了一胰島細胞來源外泌體在制備改善小鼠葡萄糖代謝的藥物中的應用，其為制備治療糖尿病的藥物提供了一種新的途徑。

本發(fā)明提供的胰島細胞來源外泌體在制備改善小鼠葡萄糖代謝的藥物中的應用，所述的胰島細胞來源外泌體從min6細胞中提取。

較佳地，所述的胰島細胞來源外泌體的提取包括以下步驟：

取min6細胞培養(yǎng)，待細胞融合度達到70-80％后，移除培養(yǎng)液，并用緩沖液清洗，沖洗后加入去外泌體血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)后，提取上清液中的外泌體純化，得到所述的胰島細胞來源外泌體。

較佳地，所述的純化包括以下步驟：

將所述的上清液中的外泌體提取得到提取液后，通過多次不同離心速度分別去除殘余細胞、細胞碎片、其他雜質和超微結構后，上清液再次超速離心后，去除上清液得到沉淀，將所述的沉淀溶解后得到所述的胰島細胞來源外泌體。

較佳地，所述的去外泌體血清培養(yǎng)基為去外泌體的高糖dmem培養(yǎng)液。

更佳地，所述的去外泌體的高糖dmem培養(yǎng)液的制備包括以下步驟：

取高糖dmem培養(yǎng)液，離心過夜后取上清液后，過膜后4℃保存，得到所述的去外泌體的高糖dmem培養(yǎng)液。

與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明將胰島細胞來源外泌體應用在藥物中，能夠顯著改善小鼠葡萄糖代謝，延長小鼠生存期，為人類糖尿病的治療提供了一種新的途徑。

附圖說明：

圖1為本發(fā)明實施例1中移植后糖尿病小鼠生存期結果圖；

圖2a為本發(fā)明實施例中注射后第17天糖耐量損傷小鼠葡萄糖耐量結果圖；

圖2b為本發(fā)明實施例1中注射后第35天糖耐量損傷小鼠葡萄糖耐量結果圖；

圖3為本發(fā)明實施例2中透射電子顯微鏡下觀察到胰島細胞來源外泌體的形態(tài)結果圖；

圖4為本發(fā)明實施例2中高分辨率可調電阻脈沖檢測胰島細胞來源外泌體直徑的結果圖；

圖5為本發(fā)明實施例2中westernblot法檢測外泌體的特異性標志物cd9的結果圖；

具體實施方式

下面結合具體的實施例對本發(fā)明作進一步地說明，以更好地理解本發(fā)明。

實施例1：

一、胰島細胞來源外泌體的提取

取常規(guī)培養(yǎng)min6細胞，待細胞融合度達到70-80％水平后，移除原培養(yǎng)液，并用pbs緩沖液清洗3遍后，加入10ml去外泌體血清培養(yǎng)基于10cm培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，提取上清液于-80℃冰箱中凍存。

二、胰島細胞來源外泌體的純化步驟如下：

步驟(1)：取之前凍存的外泌體提取液，4℃離心×300g、10分鐘，棄殘余細胞；

步驟(2)：4℃離心×2000g、10分鐘，去除細胞碎片；

步驟(3)：4℃離心×10000g、30分鐘，去除其他雜質沉淀和超微結構；

步驟(4)：4℃離心×100000g、70分鐘后，小心去除上清液，加入適量pbs混勻；

步驟(5)：4℃離心×100000g、70分鐘后，去除上清液、取100ul溶解沉淀，得到純化的外泌體，進行后續(xù)實驗或置于-80℃冰箱中凍存。

三、將胰島細胞來源外泌體制備成改善小鼠葡萄糖代謝的藥物，在鏈脲佐菌素(stz)誘導糖尿病小鼠造模成功后注入小鼠體內，監(jiān)測小鼠生存期。

stz誘導糖尿病小鼠造模步驟如下：

步驟(1)：取400mgstz溶于ph為4.5的100ml檸檬酸緩沖液中配制成4g/l的stz注射液。

步驟(2)：野生型c57品系小鼠，體重在20-25g水平，周齡在6-8周，每只小鼠給予腹腔內注射stz溶液一次，劑量為200mg/kg，待到空腹血糖水平超過11mmol/l。

步驟(3)：1％戊巴比妥鈉麻醉小鼠，打開小鼠腹腔，暴露胰腺，取1ml注射針將胰島細胞來源外泌體藥物注射入原位胰腺組織中，縫合腹膜及皮膚，關閉腹腔。在原位移植外泌體后11天，再給予尾靜脈注射胰島細胞來源外泌體藥物，劑量為100ug/只。

圖1為注射后糖尿病小鼠生存期結果圖。結果顯示胰腺來源外泌體藥物對糖尿病小鼠的生存期具有明顯改善作用。

四、胰島細胞來源外泌體藥物在stz誘導糖耐量損傷小鼠造模成功后第10天通過胰腺原位注射至小鼠體內，監(jiān)測小鼠血糖。

stz誘導糖耐量損傷小鼠造模步驟如下：

步驟(1)：6-8周野生型c57品系小鼠腹腔內注射步驟二中stz注射液140mg/kg；

步驟(2)：在stz誘導后第7天，第17天及第35天行ipgtt試驗，stz誘導后第10天注射胰島細胞來源外泌體藥物。

胰島細胞來源外泌體藥物注射方法同上。

圖2a-b為注射后后糖耐量損傷小鼠腹腔葡萄糖耐量實驗(ipgtt)結果。結果顯示胰島細胞來源外泌體移植后，stz處理第17天(圖2a)和第35天(圖2b)胰島細胞來源外泌體移植小鼠葡萄糖耐量明顯改善。

實施例2：胰島細胞來源外泌體藥物鑒定

一、透射電子顯微鏡觀察形態(tài)

步驟如下：

步驟(1)：取直徑2nm的銅網、加入20ul的胰島細胞來源外泌體藥物，靜置3-5分鐘后，用濾紙吸干周邊液體；

步驟(2)：加入3％磷鎢酸溶液，室溫下負染5分鐘，后置于透射電子顯微鏡下觀察、并拍照。

二、高分辨率可調電阻脈沖檢測

步驟如下：

步驟(1)：利用izon顆粒分析儀，取10ul的胰島細胞來源外泌體藥物加入990ul的pbs中混懸均勻，按操作要求加入100ul液體后，檢測胰島細胞來源外泌體直徑大小。

步驟(2)：圖3為透射電子顯微鏡下觀察到胰島細胞來源外泌體的形態(tài)；圖4為高分辨率可調電阻脈沖檢測胰島細胞來源外泌體直徑結果。

三、westernblot法檢測外泌體的特異性標志物

圖5為利用westernblot法檢測外泌體特異性標志物cd9的結果。

本發(fā)明將胰島細胞來源外泌體應用在藥物中，能夠顯著改善小鼠葡萄糖代謝，延長小鼠生存期，為人類糖尿病的治療提供了一種新的途徑。

以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發(fā)明進行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發(fā)明的范圍內。