本發(fā)明涉及β-欖香烯的新應(yīng)用，特別是β-欖香烯在治療脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

β-欖香烯（β-elemene）是一種提取于中藥莪術(shù)和溫郁金中的有效成分，化學(xué)分子式c15h24，分子量204.351。目前，β-欖香烯注射液已被廣泛用于抗腫瘤臨床治療中，其中已被揭示的抗腫瘤機(jī)制有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)放化療敏感性，增強(qiáng)腫瘤免疫等。近年來(lái)的研究顯示，β-欖香烯還具有廣泛的生物學(xué)作用，如抗病毒、抗凝血、胃黏膜保護(hù)，血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)和降血壓等作用。

脊髓損傷常發(fā)生于青壯年，發(fā)病率逐年升高，是一種高致殘和高致死的疾病。脊髓損傷可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡，神經(jīng)傳導(dǎo)的破壞，進(jìn)而引起運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)功能障礙，造成患者喪失生活及勞動(dòng)能力，從而給家庭以及社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。然而，現(xiàn)今臨床上針對(duì)脊髓損傷的治療方法存在廣泛爭(zhēng)議，缺乏有效的治療方法，主要原因是脊髓經(jīng)歷原發(fā)性和繼發(fā)性損傷后，神經(jīng)細(xì)胞凋亡，而其再生恢復(fù)能力極其有限。脊髓損傷的治療一直是醫(yī)學(xué)界的難題之一，其治療方法和手段研究也一直受到大家的重視。

脊髓損傷的藥物治療一直是在臨床治療中占有重要的地位。將治療藥物盡可能的集中到脊髓損傷部位，可以顯著提高藥物的生物利用度和療效。β-欖香烯為天然植物有效成分，安全性較高，不具有一般化學(xué)藥物的副作用。靜脈注射ld50為270.07±18.93mg/kg，口服ld50大于5g/kg。將β-欖香烯注射液與生物可降解材料3%海藻酸鈉混合（1:1，v/v）成含藥的水凝膠，置放于脊髓損傷部位，用于脊髓損傷的修復(fù)再生治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種β-欖香烯治療脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)中的應(yīng)用；

上述的β-欖香烯包括β-欖香烯單體和以β-欖香烯為活性成分的各種藥物制劑；

上述的β-欖香烯可以是局部給藥方式，也可以口服或注射全身給藥方式；

本發(fā)明試驗(yàn)研究表明，采用含有β-欖香烯活性成分的注射劑，與生物可降解材料3%海藻酸鈉混合（1:1，v/v）成含藥的水凝膠，以局部給藥方式，在損傷后立即置放于sd大鼠脊髓損傷部位。320μg/kgβ-欖香烯，具有較好的恢復(fù)大鼠運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能的作用。β-欖香烯源于天然植物成分，安全性較高，無(wú)不良反應(yīng)。

本發(fā)明的有益效果是：

1)β-欖香烯是從中藥莪術(shù)和姜科植物溫郁金中提取的天然成分，安全性較高，避免其他一般化學(xué)合成治療藥品的毒副作用；在價(jià)格上避免如神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療的高昂費(fèi)用；

2)β-欖香烯在較低的濃度范圍有療效。在體外顯著降低缺氧損傷造成的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活（＜40μg/ml）；在體內(nèi)，一次性局部給予β-欖香烯（320μg/kg）顯著降低sd大鼠脊髓損傷后的脊髓組織中促凋亡蛋白bax、cleaved-caspase3的表達(dá)，上調(diào)抗凋亡蛋白bcl-2的表達(dá)，并促進(jìn)了脊髓運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)；

3)采用與海藻酸鈉混合形成水凝膠，局部定點(diǎn)的置放，提高β-欖香烯的利用度和效率；較小的β-欖香烯用量就可以在局部達(dá)到有效的作用劑量；這進(jìn)一步降低了藥物的用量，減少毒副作用，也進(jìn)一步降低了治療成本。而且含有藥物的海藻酸鈉水凝膠(1:1，v/v,海藻酸鈉終濃度1.5%)，降解速度快，不會(huì)在體內(nèi)余留。

附圖說(shuō)明

圖1β-欖香烯結(jié)構(gòu)圖。

圖2β-欖香烯對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的增殖（a），細(xì)胞毒性ldh檢測(cè)(b)，損傷運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活作用（c）。a圖中，*p＜0.05，**p＜0.01，與正常對(duì)照組相比。

圖3β-欖香烯減輕損傷運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的凋亡（annexinv/pi檢測(cè)）的對(duì)比圖。a圖中，**p＜0.01，與對(duì)照組相比；b圖中，##p＜0.01,與氯化鈷處理組相比。

圖4β-欖香烯促進(jìn)大鼠脊髓損傷后后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的bbb評(píng)分對(duì)比圖，其中，*p0.05，**p<0.01，與脊髓損傷組（sci）相比。

圖5免疫蛋白印跡檢測(cè)證實(shí)β-欖香烯降低大鼠脊髓損傷后促凋亡相關(guān)蛋白bax、cleaved-caspase3的表達(dá)，升高抗凋亡蛋白bcl-2的表達(dá)。**p＜0.01，與假手術(shù)組（sham）相比；##p＜0.01，與脊髓損傷組（sci）相比，其中a圖是幾種蛋白的形態(tài)參數(shù)圖，b圖是cleaved-caspase蛋白量/β-actin蛋白量的對(duì)比圖，c圖是bax蛋白量/β-actin蛋白量的對(duì)比圖，d圖是bcl-2/β-actin蛋白量的對(duì)比圖。

實(shí)施例1。

β-欖香烯促進(jìn)離體培養(yǎng)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的增殖。

vsc4.1脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，5,000個(gè)細(xì)胞每孔種于96孔板，第2天90%鋪滿培養(yǎng)皿底部。β-欖香烯處理濃度為5、10、20、40μg/ml。經(jīng)過(guò)24h的孵育，細(xì)胞加入cck-8工作液，培養(yǎng)箱孵育4h，酶標(biāo)儀450nm測(cè)光吸收值。如圖2a所示，cck-8檢測(cè)顯示β-欖香烯顯著促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的增殖，20μg/ml濃度作用最明顯。同時(shí)，收集上清液離心后加入ldh工作液，避光37℃孵育半小時(shí)，酶標(biāo)儀580nm測(cè)光吸收值。如圖2b所示，ldh檢測(cè)顯示β-欖香烯對(duì)神經(jīng)元無(wú)細(xì)胞毒性。

實(shí)施例2。

β-欖香烯促進(jìn)離體培養(yǎng)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活。

vsc4.1脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，采用氯化鈷誘導(dǎo)細(xì)胞化學(xué)缺氧模型。先加入β-欖香烯進(jìn)行預(yù)處理4h，然后加入氯化鈷（600μm）處理24h。加入cck-8工作液，培養(yǎng)箱孵育4h，酶標(biāo)儀450nm測(cè)光吸收值。cck-8檢測(cè)如圖2c顯示：氯化鈷顯著降低神經(jīng)元的存活率；β-欖香烯（5、10、20μg/ml）提前處理4h可以顯著提高神經(jīng)元的存活，并且在一定劑量?jī)?nèi)呈濃度依賴(lài)性。

實(shí)施例3。

β-欖香烯減輕運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元凋亡。

vsc4.1脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，5×10⁵個(gè)細(xì)胞種于6cm板，第2天90%鋪滿培養(yǎng)皿底部。先加入β-欖香烯（20μg/ml）預(yù)處理4h，然后加入氯化鈷處理24h。最后吸去培養(yǎng)基，pbs洗滌，胰酶消化后，將1×10⁶細(xì)胞重懸于100μlbindingbuffer，加入annexin-v-fitc(20μg/ml)，輕輕混勻，避光冰上放置15分鐘。轉(zhuǎn)至流式檢測(cè)管，加入400μlpbs，每個(gè)樣品臨上機(jī)前加入1μlpi（50μg/ml），2分鐘后迅速檢測(cè)。同時(shí)以不加annexinv-fitc及pi的一管作為陰性對(duì)照。檢測(cè)結(jié)果如圖3顯示：氯化鈷顯著誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的凋亡；β-欖香烯預(yù)處理可以顯著降低神經(jīng)元的凋亡。

實(shí)施例4。

β-欖香烯促進(jìn)脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

大鼠擊打挫傷脊髓損傷模型的建立：8周齡雌性sd大鼠，手術(shù)暴露t10段脊髓，通過(guò)nyuⅱ型擊打儀將5g重量的擊打錘從5cm高度處垂直擊打t10端脊髓，制造脊髓損傷模型（sci）。分三組，每組11只：sci+溶劑組；sci+低濃度β-欖香烯組（80μg/kg）；sci+高濃度β-欖香烯組（320μg/kg）。給藥方式：將包含了β-欖香烯注射液的海藻酸鈉（1:1,v/v）與可吸收性明膠海綿局部敷于損傷脊髓背部，然后逐層縫合肌肉與皮膚。術(shù)后由兩名熟悉bbb評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的非實(shí)驗(yàn)人員獨(dú)立觀察大鼠，進(jìn)行bbb評(píng)分（basso,beattie&bresnahanlocomotorratingscale，bbb）來(lái)評(píng)價(jià)其后肢的運(yùn)動(dòng)恢復(fù)情況。即在大鼠脊髓損傷的4周之內(nèi)，觀察其右后肢的運(yùn)動(dòng)恢復(fù)情況。脊髓損傷造模型前所有動(dòng)物的后肢運(yùn)動(dòng)功能正常，即bbb評(píng)分為21±0。脊髓損傷后，所有大鼠的后肢體高位截癱，bbb評(píng)分為0±0。在整個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察期4周內(nèi)，如圖4所有大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)逐步改善，后期可以觀察到后肢抓面著地承重。與sci組相比較，術(shù)后第1周至第4周，β-欖香烯高濃度組的bbb評(píng)分有顯著的改善(p<0.01)；而且從第二周開(kāi)始，β-欖香烯高濃度組的bbb評(píng)分就與sci組相比有顯著的提高(p<0.01)，以后bbb評(píng)分逐漸的升高。雖然β-欖香烯低濃度組在第2、3周較sci組有差異，但第四周與sci組無(wú)明顯差異。

另外每組3只大鼠術(shù)后運(yùn)用蛋白裂解液提取損傷部位脊髓組織總蛋白，通過(guò)westernblot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白bcl-2，bax，cleaved-caspase3的蛋白表達(dá)量。如圖5結(jié)果顯示β-欖香烯能降低脊髓損傷誘導(dǎo)的促凋亡蛋白bax，cleaved-caspase3的表達(dá)，上調(diào)抗凋亡蛋白bcl-2的表達(dá)。

本發(fā)明的實(shí)施例證實(shí)了一定濃度的β-欖香烯對(duì)于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用，且無(wú)藥物毒性。大鼠脊髓損傷的模型進(jìn)一步證實(shí)通過(guò)β-欖香烯局部應(yīng)用可以顯著提高bbb評(píng)分，促進(jìn)了運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，可能與其降低促凋亡蛋白bax，cleaved-caspase3的表達(dá)，上調(diào)抗凋亡蛋白bcl-2的表達(dá)，從而有更多的神經(jīng)元存活有關(guān)。

具體實(shí)施方案

本發(fā)明采用β-欖香烯注射液（大連金港藥業(yè)），與海藻酸鈉（3%）混合（1:1，v/v）成水凝膠，脊髓損傷外科手術(shù)中置放于損傷脊髓背側(cè)表面，以促進(jìn)神經(jīng)元的存活，減輕神經(jīng)元的凋亡，有利于脊髓損傷后的修復(fù)再生。下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述。以下實(shí)施例僅為本發(fā)明的幾個(gè)具體實(shí)施例，但發(fā)明構(gòu)想并不局限于此，凡利用此構(gòu)思對(duì)本發(fā)明進(jìn)行非實(shí)質(zhì)性改動(dòng)形成的技術(shù)方案均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。