本發(fā)明涉及姜黃素微膠制備，具體涉及一種具有抗氧化活性疏水性多孔硅姜黃素微膠及其制備方法。

背景技術(shù)：

姜黃素(curcumin)是從姜科植物姜黃中提取的一種天然酚類色素。研究表明，姜黃素作為藥品在抗炎、抑菌、抗氧化、抗人類免疫缺陷病毒、保護(hù)肝臟和腎臟、抗纖維化、抑制腫瘤細(xì)胞增殖以及治療類風(fēng)濕方面具有很好的生物活性。盡管姜黃素在實(shí)驗(yàn)研究中表現(xiàn)出很好的生物活性及應(yīng)用前景，但其本身的一些特性卻阻礙了其在實(shí)際運(yùn)用中的發(fā)展，如水溶性低、生物利用度差、易被氧化、口感辛辣難以入口等。目前，姜黃素在功能性食品的開發(fā)以及臨床治療上最大的挑戰(zhàn)就是其水溶性低，如何提高姜黃素的水溶性已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。為了解決上述問題，有學(xué)者運(yùn)用脂質(zhì)體、殼聚糖、淀粉及高分子共聚物等可降解的生物材料作為載體來提高姜黃素的生物利用率。盡管這些生物材料在提高姜黃素的水溶性及藥物緩釋方面具有一定優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)，但還存在穩(wěn)定性差、機(jī)械強(qiáng)度差、容易滲漏等一系列弊端。介孔材料是指孔徑介于2-50nm的一類多孔材料，因其具有極高的比表面積、規(guī)則有序的孔道結(jié)構(gòu)、狹窄的孔徑分布、孔徑大小連續(xù)可調(diào)等特點(diǎn)，使得其在藥物輸送體系中廣為應(yīng)用。多孔硅是一種具有海綿狀疏松結(jié)構(gòu)的硅材料，自從canhan于1990年首次報(bào)道了多孔硅在室溫下可以發(fā)出高效率的可見光以來，多孔硅材料被學(xué)者們重視及研究，廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域。多孔硅由于其孔徑大小可調(diào)、表面易于修飾、具有生物相容性以及生物可降解性等特性而被應(yīng)用于藥物輸送及緩釋體系中。研究表明，多孔硅在體內(nèi)可以降解為無毒的硅酸，易被腸胃道吸收，通過腎臟和尿道排除體外。其孔徑在10-50nm之間時(shí)，被包載的藥物在其孔道中無法結(jié)晶，多保持為無定形態(tài)，這大大增加了被包載藥物的溶解度和溶出速度。將多孔硅作為藥物載體的研究確實(shí)很多，目前還未發(fā)現(xiàn)以疏水性多孔硅作為載體來加載姜黃素的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種疏水性多孔硅姜黃素微膠囊；該微膠囊以疏水性多孔硅作為新型載體加載姜黃素，疏水性多孔硅可有效提高姜黃素的水溶性和穩(wěn)定性，同時(shí)提高其生物利用率；修飾的疏水性多孔硅對(duì)姜黃素的加載率(每毫克多孔硅加載姜黃素的量)高，每毫克多孔硅加載姜黃素的量大，可有效清除dpph自由基和超氧根陰離子o2-·。

本發(fā)明還提供該疏水性多孔硅姜黃素微膠囊的制備方法。

技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)使上述目的，如本發(fā)明所述的一種具有抗氧化活性的疏水性多孔硅姜黃素微膠囊，其特征在于，由疏水性多孔硅、姜黃素母液和雙蒸水按質(zhì)量體積比10：1-1.5：1-1.5(mg/ml/ml)制備而成。優(yōu)選的比例為10：1：1(mg/ml/ml)。

其中，所述疏水性多孔硅由單晶硅片通過電化學(xué)刻蝕形成多孔硅薄膜再制成微米級(jí)多孔硅顆粒，最后加入十八烷基硅烷修飾得到。

所述姜黃素母液的濃度為1-1.5mg/ml，溶劑優(yōu)選為無水乙醇。

本發(fā)明所述的疏水性多孔硅姜黃素微膠囊的制備方法，包括以下步驟：

(1)將單晶硅片在超聲波下處理，然后置于nh4oh、h2o2和h2o的混合液中加熱，再浸泡在hcl、h2o2和h2o混合液中加熱，沖洗后將硅片浸泡在乙醇中備用；

(2)將步驟(1)備用硅片用刻蝕液避光環(huán)境下進(jìn)行刻蝕得到多孔硅薄膜；

(3)用剝離液將刻蝕好的多孔硅薄膜剝離下來于乙醇溶液中超聲，制備成微米級(jí)多孔硅顆粒；

(4)將微米級(jí)多孔硅顆粒離心，棄去澄清液，將微米級(jí)多孔硅顆粒表面上殘留的乙醇溶液吹干，然后加入甲苯、十八烷基硅烷，混合均勻加熱進(jìn)行修飾；修飾后離心，棄去修飾液，所得多孔硅微粒用甲苯和乙醇分別沖洗，真空條件下干燥，得到疏水性多孔硅；

(5)將步驟(4)中疏水性多孔硅中加入姜黃素母液和雙蒸水進(jìn)行姜黃素加載；得到疏水性多孔硅姜黃素微膠囊。

其中，步驟(1)所述單晶硅片為p型硼參雜，電阻為0.0008-0.0012ω。

步驟(2)所述刻蝕液為體積比1:1-1.2的含體積分?jǐn)?shù)48％的氫氟酸水溶液無水乙醇；優(yōu)選比例為1:1。

步驟(2)所述刻蝕的刻蝕電流30-60ma/cm²，刻蝕時(shí)間600-650秒。

步驟(3)所述剝離液為體積比1:28-30的含體積分?jǐn)?shù)48％的氫氟酸水溶液和無水乙醇；優(yōu)選體積比為1:29。

步驟(4)所述甲苯、十八烷基硅烷與吹干的微米級(jí)多孔硅顆粒的體積質(zhì)量比為1.5-1.6：0.4-0.5：50(ml/ml/mg)；優(yōu)選比例為1.6：0.4：50(ml/ml/mg)。

步驟(5)所述姜黃素加載條件為通過水浴靜置、磁力攪拌或搖床震蕩，在溫度為25℃-65℃，加載2h-24h。

本發(fā)明的原理如圖1所示，該疏水性多孔硅姜黃素微膠囊利用疏水性多孔硅巨大的比表面積和體積、可控的尺寸大小和納米孔道、容易被改性修飾等特有優(yōu)勢(shì)作為姜黃素的載體，通過多孔硅表面的疏水性吸附同樣具有疏水性的姜黃素。當(dāng)多孔硅-姜黃素微膠囊輸送在一定地點(diǎn)時(shí)，多孔硅降解，姜黃素釋放出來。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明的疏水性多孔硅姜黃素微膠囊可有效提高姜黃素的水溶性和穩(wěn)定性，以疏水性多孔硅作為新型載體加載姜黃素，修飾的疏水性多孔硅對(duì)姜黃素的加載量大可以達(dá)到最大值22.3％，每毫克多孔硅加載姜黃素的量為22.3μg，在ph7.4和5的介質(zhì)中，姜黃素的釋放率分別為85.29％和81.61％，且都還呈繼續(xù)上升的趨勢(shì)，在ph為8.5的介質(zhì)中，當(dāng)釋放8h時(shí)姜黃素釋放率已達(dá)到最大值，為94.54％；可有效清除dpph自由基和超氧根陰離子o2-·，對(duì)dpph自由基的清除率為47.54％，超氧根陰離子o2-·的清除率為63.64％。同時(shí)本發(fā)明的制備方法簡(jiǎn)單方便，原料來源廣，成本低，提高其生物利用率。

本發(fā)明以疏水性多孔硅作為新型載體加載姜黃素，制備一種新型的疏水性多孔硅姜黃素微膠囊，并通過對(duì)其加載率和緩釋特性的研究，為姜黃素在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供相關(guān)信息。

附圖說明

圖1為基于疏水性多孔硅加載姜黃素及緩釋原理圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1制備的疏水性多孔硅顆粒結(jié)構(gòu)表征示意圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1制備的疏水性多孔硅-姜黃素微膠囊表征示意圖；

圖4為疏水性多孔硅-姜黃素微膠囊在不同的ph介質(zhì)中的釋放特性關(guān)系圖；

圖5為疏水性多孔硅-姜黃素微膠囊釋放液對(duì)dpph自由基的清除作用關(guān)系圖；

圖6為疏水性多孔硅-姜黃素微膠囊釋放液對(duì)對(duì)超氧根陰離子o2-·的清除作用關(guān)系圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。

本發(fā)明所用無水乙醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，氫氟酸購(gòu)自阿拉丁公司，姜黃素(色譜級(jí)>98％)購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，氨水(nh4oh)，甲醇，過氧化氫(h2o2)購(gòu)于南京化學(xué)試劑有限公司，十八烷基硅烷購(gòu)于百靈威科技，硅片(0.0008-0.0012ω-cm,(100),硼參雜)購(gòu)自于siltronix公司。

本發(fā)明所用的儀器主要有：

nj320脈沖刻蝕儀，廈門納精分析儀器有限公司

otl1200型管式爐，南京大學(xué)儀器廠

kq-300de型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司

molresearch1005a分析型超純水機(jī)，上海摩勒生物科技有限公司

聚四氟乙烯刻蝕槽實(shí)驗(yàn)室自制

sz-2自動(dòng)雙重純水蒸餾器，上海滬西分析儀器廠有限公司

uv6100a紫外分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司

am-3250b型磁力攪拌器，天津奧特賽恩斯儀器有限公司

phs-3c精密ph計(jì)，上海三信儀表廠

tdz5-ws臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司

shimadzuauy220分析天平，日本島津公司

eppendorf5415型冷凍離心機(jī)，艾本德中國(guó)有限公司

hitachi,s-3400n掃描電鏡，日本日立公司

華東電子dg5033a型酶標(biāo)儀，南京電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司

zqty-70臺(tái)式全溫振蕩全溫培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司

hh-s2數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠。

實(shí)施例1

(1)選用p型硼參雜單晶硅片，電阻為0.0008-0.0012ω，裁成3×3cm的備用硅片，分別用丙酮、甲醇、去離子水在超聲波下處理15min。然后置于nh4oh：h2o2：h2o＝1：1：5(v/v/v)混合液中，75℃水浴加熱15min，再浸泡在hcl：h2o2：h2o＝1:1:5(v/v/v)混合液中，75℃水浴加熱15min，最后依次用去離子水、乙醇沖洗；處理好的硅片使用前浸泡在乙醇中，防止再次污染；

(2)將步驟(1)備用硅片采用含體積分?jǐn)?shù)48％的氫氟酸水溶液(hf)：無水乙醇(c2h5oh)＝1:1(v/v)的刻蝕液在避光環(huán)境下進(jìn)行刻蝕，刻蝕電流30-60ma/cm²，刻蝕時(shí)間600-650秒，得到多孔硅薄膜；

(3)用3.3％剝離液(hf:c2h5oh，1:29，v/v)將刻蝕好的多孔硅薄膜，剝離下來于乙醇溶液中超聲30min，制備成微米級(jí)多孔硅顆粒；

(4)制備的微米級(jí)多孔硅顆粒于離心機(jī)中1914×g離心10min，棄去澄清液，用氮?dú)鈱駶?rùn)的微米級(jí)多孔硅顆粒表面上殘留的乙醇溶液吹干得到微米級(jí)多孔硅顆粒50mg，至無液體流動(dòng)即可；然后加入甲苯1.6ml，十八烷基硅烷0.4ml，混合均勻后于80℃水浴鍋中加熱24h。修飾完成后于離心機(jī)中1914×g離心10min，棄去修飾液，所得多孔硅微粒用甲苯?jīng)_洗一次，乙醇沖洗三次，再將濕潤(rùn)的多孔硅微粒于管式爐中真空條件下，60℃干燥2h，得到疏水性多孔硅；

(5)將10mg疏水性多孔硅加入1ml的姜黃素母液(1mg/ml)和1ml的雙蒸水，通過水浴靜置，在溫度為65℃，加載24h。

本實(shí)施例制備的疏水性多孔硅結(jié)構(gòu)表征如圖2所示；觀察制備好干燥后的多孔硅顆粒外觀，并取少量置于高分辨熱場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡下觀察樣品整體形貌和孔徑的大小。其中a為孔硅水橫斷面電鏡圖，b為多孔硅水平面電鏡圖，c為多孔硅顆粒電鏡圖，d為多孔硅側(cè)表面電鏡圖。由圖2可知，疏水性多孔硅顆粒具有多孔結(jié)構(gòu)，比表面積大，加載率高，孔徑屬于介孔級(jí)，可使加載進(jìn)入的姜黃素以無定形態(tài)存在。

本實(shí)施例制備的疏水性多孔硅姜黃素微膠囊表征如圖3所示；將少量干燥的載有姜黃素的多孔硅于高分辨熱場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡下觀察多孔硅微粒的表面形態(tài)、孔徑大小以及微粒整體形貌，用普通照相機(jī)拍照觀察多孔硅顆粒的外觀形態(tài)顏色。其中a為多孔硅-姜黃素微膠囊正面電鏡圖，b為多孔硅-姜黃素微膠囊橫斷面電鏡圖，c為多孔硅-姜黃素微膠囊顆粒電鏡圖，d為多孔硅-姜黃素微膠囊顏色圖。從圖3可以看出姜黃素確實(shí)是加載到了疏水性多孔硅中。

實(shí)施例2

與實(shí)施例1的步驟(1)-(5)基本相同，不同之處在于，步驟(2)刻蝕液為體積比1:1.2的含體積分?jǐn)?shù)48％的氫氟酸水溶液無水乙醇；步驟(3)剝離液(hf:c2h5oh，1:28，v/v)；步驟(4)微米級(jí)多孔硅顆粒50mg中加入甲苯1.5ml，十八烷基硅烷0.5ml，步驟(5)將疏水性多孔硅10mg中加入1.5ml的姜黃素母液(1.5mg/ml)和1.5ml的雙蒸水，通過磁力攪拌，在溫度為45℃，加載2h。

實(shí)施例3

與實(shí)施例1的步驟(1)-(5)基本相同，不同之處在于，步驟(3)剝離液(hf:c2h5oh，1:30，v/v)；步驟(5)將疏水性多孔硅10mg中加入1.2ml的姜黃素母液(1.2mg/ml)和1.2ml的雙蒸水，通過搖床震蕩，在溫度為25℃，加載12h。

實(shí)施例4

采用直接釋藥法測(cè)試姜黃素在多孔硅表面的釋放，進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)。

于含有3ml不同ph(5、7.4、8.5)40％乙醇-生理鹽水釋放介質(zhì)的10ml離心管中投入10mg實(shí)施例1制備的多孔硅姜黃素微膠囊，在37℃的恒溫?fù)u床(180r/min)中避光搖動(dòng)，分別于0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10h在1914×g的條件下離心5min，取上清液0.5ml于2ml離心管中，同時(shí)向釋放介質(zhì)中補(bǔ)液0.5ml。取出的上清液再于高轉(zhuǎn)速下(17226×g)離心10min，取出上清液200μl于96孔板上于酶標(biāo)儀測(cè)405nm波長(zhǎng)處的吸光值。計(jì)算姜黃素的累計(jì)釋放量。

如圖4所示，實(shí)施例1制備的疏水性多孔硅姜黃素微膠囊在不同ph(5、7.4、8.5)的40％乙醇-生理鹽水中釋放良好，釋放10h時(shí)，在ph7.4和5的介質(zhì)中，姜黃素的釋放率分別為85.29％和81.61％，且都還呈繼續(xù)上升的趨勢(shì)。在ph為8.5的介質(zhì)中，當(dāng)釋放8h時(shí)姜黃素釋放率已達(dá)到最大值，為94.54％。實(shí)施例2和3制備的疏水性多孔硅姜黃素微膠囊釋放量結(jié)果與實(shí)施例1類似。

實(shí)施例5

加載率的計(jì)算：

姜黃素加載率采用差值法計(jì)算，即加載到多孔硅上姜黃素的量等于原始姜黃素的量減去加載后游離的姜黃素的量。游離姜黃素的量計(jì)算方法如下：加載后的多孔硅混懸液置于離心機(jī)中1914×g離心10min，將上清液吸出轉(zhuǎn)入10ml的棕色容量瓶中，沉淀的多孔硅用40％的乙醇洗滌一遍，雙蒸水清洗兩遍，洗滌液均轉(zhuǎn)入10ml的棕色容量瓶中，最后用乙醇定容。將容量瓶中的姜黃素溶液用0.45μm的有機(jī)濾膜過濾，過濾液用乙醇稀釋5倍在426nm處測(cè)紫外吸光值，計(jì)算加載后游離姜黃素的濃度。

實(shí)施例1制備疏水性多孔硅-姜黃素微膠囊，姜黃素的加載率達(dá)到22.3％，每毫克多孔硅的姜黃素加載量為22.3μg。實(shí)施例2和3制備的疏水性多孔硅姜黃素微膠囊加載率結(jié)果與實(shí)施例1類似。

實(shí)施例6

多孔硅-姜黃素微膠囊釋放液對(duì)dpph自由基的體外清除試驗(yàn)：

準(zhǔn)確稱取10mg實(shí)施例1制備的干燥的多孔硅姜黃素(psi-cur)微膠囊于10ml離心管中，加入2ml無水乙醇，在振蕩器下震蕩10min，使多孔硅姜黃素與乙醇充分混合后，在1914×g下離心10min，上清液即為釋放出來的姜黃素溶液。在96孔板中200μl的反應(yīng)體系中，加入20μl姜黃素釋放液，然后加入180μl60μm的dpph工作液，震蕩混合后在530nm處用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，每隔5min測(cè)一次，連續(xù)測(cè)40min。

空白對(duì)照組中姜黃素用20μl無水乙醇代替，其余與實(shí)驗(yàn)組一致。以上操作均在室溫下避光進(jìn)行。反應(yīng)體系中混合液在530nm處的吸光值即代表dpph自由基的含量?？紤]到姜黃素本身的吸光值，以加入姜黃素釋放液20μl和無水乙醇180μl為姜黃素的本底吸收值。清除率(％)＝[a0-(ax-ax0)]/a0×100％。其中，a0為空白對(duì)照組的吸光值，ax為加入姜黃素待測(cè)液后的吸光值，ax0為姜黃素待測(cè)液的本底吸收值。

如圖5所示，本發(fā)明實(shí)施例1制備的疏水性多孔硅姜黃素微膠囊釋放液對(duì)dpph自由基的作用成時(shí)間依賴性，作用40min后清除率達(dá)47.54％。實(shí)施例2和3制備的疏水性多孔硅姜黃素微膠囊清除率結(jié)果與實(shí)施例1類似。

實(shí)施例7

多孔硅-姜黃素微膠囊釋放液對(duì)對(duì)超氧根陰離子o2-·體外清除試驗(yàn)：

在10ml離心管中加入130mmol/l的甲硫氨酸溶液0.1ml，20μmol/l的核黃素溶液0.1ml，750μmol/l的nbt溶液0.2ml，磷酸鹽緩沖液(ph7.8，50mm)3.2ml，再加入實(shí)施例6中得到的姜黃素釋放液0.4ml?？瞻讓?duì)照組中姜黃素溶液換為0.4ml的無水乙醇。各反應(yīng)液等距離放在紫外燈下光照2min，光照核黃素產(chǎn)生的o2-·能將nbt還原為藍(lán)色的產(chǎn)物，于紫外分光光度計(jì)下測(cè)定590nm波長(zhǎng)處的吸光值，計(jì)算多孔硅姜黃素微膠囊對(duì)超氧根陰離子o2-·的清除率。清除率計(jì)算公式為清除率(％)＝(a空白-a樣品)/a空白×100％。同時(shí)采用相同的條件，相同的體積不同濃度20mg/ml、40mg/ml、60mg/ml、80mg/ml、100mg/ml的維生素(vc)在作為對(duì)比，比較對(duì)超氧根陰離子o2-·的清除力。

如圖6所示，實(shí)施例1制備的疏水性多孔硅姜黃素微膠囊釋放液對(duì)超氧根陰離子o2-·的清除力達(dá)60.08％，相當(dāng)于80mg/ml的維生素對(duì)超氧根陰離子o2-·的清除力。實(shí)施例2和3制備的疏水性多孔硅姜黃素微膠囊清除率結(jié)果與實(shí)施例1類似。