本申請為申請?zhí)?01410425510.3、申請日2014.08.26、發(fā)明名稱“甲病毒在制備抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用”的中國發(fā)明專利申請的分案申請。

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種甲病毒在制備抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤源于正常細(xì)胞中基因和表觀遺傳學(xué)的積累變化，這種改變驅(qū)使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒阅[瘤。這個(gè)復(fù)雜病理變化過程決定了不同腫瘤在發(fā)生、維持以及轉(zhuǎn)移中機(jī)制的多樣性。目前，手術(shù)切除、化療和放療是臨床治療腫瘤常用的方法，然而手術(shù)切除腫瘤易復(fù)發(fā)，放、化療毒副作用大。

15～20％人類的癌癥與病毒感染有關(guān)，如乙型肝炎病毒(hbv)、丙型肝炎病毒(hcv)與肝癌、人乳頭瘤病毒(hpv)與宮頸癌等。

甲病毒屬病毒屬于披膜病毒科，是一類有包膜結(jié)構(gòu)的單正鏈rna病毒，主要通過節(jié)肢動(dòng)物作為傳播媒介。29種甲病毒中有13種可引起人、畜疾病(davidm.knipe,peterm.howley,chapter23,alphaviruses,fieldsvirology6thedition：651-685,2013)。

甲病毒委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒可作為載體轉(zhuǎn)導(dǎo)樹突細(xì)胞治療腫瘤(morantp,burgentsje,longb,etal:alphaviralvector-transduceddendriticcellsaresuccessfultherapeuticvaccinesagainstneu-overexpressingtumorsinwild-typemice.vaccine25:6604-6612,2007)。然而，這種病毒曾引起人類發(fā)熱、抽搐、流產(chǎn)甚至死亡，因此選擇性與安全性問題嚴(yán)重影響病毒在抗腫瘤治療中的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種安全有效的病毒抗腫瘤藥物。

本發(fā)明的進(jìn)一步目的在于提供一種針對特定腫瘤類型的安全有效的病毒抗腫瘤藥物。

本發(fā)明的進(jìn)一步目的在于針對特定的個(gè)體/腫瘤提供一種安全有效的病毒抗腫瘤藥物。

本發(fā)明的進(jìn)一步目的在于提供一種有效的抗腫瘤用藥系統(tǒng)及用藥方法。

本發(fā)明的進(jìn)一步目的在于提供一種更為有效的抗腫瘤藥物和腫瘤治療方法。

發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的。

發(fā)明提供了甲病毒在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述的甲病毒為m1病毒或蓋塔病毒。

m1病毒(alphavirusm1)屬于甲病毒屬(alphavirus)，于1964年從中國海南島庫蚊屬(culex)蚊蟲中分離得到(lixd,etal:isolationofgetahvirusfrommosquitoscollectedonhainanisland,china,andresultsofaserosurvey.southeastasianjtropmedpublichealth23:730-734,1992.)。2008年m1病毒的全基因組序列被測定(zhaiyg,etal:completesequencecharacterizationofisolatesofgetahvirus(genusalphavirus,familytogaviridae)fromchina.jgenvirol89:1446-1456,2008.)。其獲取方式可選但不限于通過上述文獻(xiàn)方法獲得，或者通過以下保藏信息獲得(保藏編號：cctccv201423；保藏時(shí)間：2014年7月17日；分類命名：alphavirusm1；保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏地址：湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué))。

本發(fā)明研究者此前對m1病毒的研究結(jié)果表明，其對一些腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用，例如對大鼠惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞c6，人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞u251和u-87；然而，對另外一些腫瘤細(xì)胞則不具備殺傷作用，例如對人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞t98g。這些研究并不能確定m1病毒具備有效抗腫瘤效應(yīng)。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了該病毒所適用的腫瘤類型，以提高m1病毒作為抗腫瘤藥物時(shí)的治療有效性。

進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明以m1病毒作為抗腫瘤藥物所適用的腫瘤類型包括肝癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌、胃癌中的一種或多種。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，m1病毒對各種腫瘤細(xì)胞引起不同程度的細(xì)胞死亡。m1病毒(moi＝10)處理腫瘤細(xì)胞48小時(shí)，胰腺癌、鼻咽癌、前列腺癌和黑色素瘤細(xì)胞死亡率超過50％；結(jié)直腸癌(lovo、hct-8、sw620和sw480)、肝癌(hep3b、huh-7和huh-6)、膀胱癌和乳腺癌細(xì)胞死亡率超過40％；膠質(zhì)瘤、宮頸癌、肺癌細(xì)胞死亡率超過30％；胃癌細(xì)胞死亡率超過20％。上述結(jié)果提示m1病毒作為抗腫瘤藥物效果最顯著的針對以下癌癥類型：胰腺癌、鼻咽癌、前列腺癌和黑色素瘤；其次為：結(jié)直腸癌、肝癌、膀胱癌和乳腺癌；再其次為：膠質(zhì)瘤、宮頸癌、肺癌；而最不顯著的為胃癌。

鑒于m1病毒屬于蓋塔相似病毒，其與蓋塔病毒同源性高達(dá)97.8％，本領(lǐng)域技術(shù)人員有理由認(rèn)可，基于m1病毒的抗腫瘤效果，蓋塔病毒也可類似地與m1病毒起到相似的作用和效果。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種可以針對特定個(gè)體/腫瘤更為準(zhǔn)確有效地給予治療方案和治療藥物的方法，以及針對特定個(gè)體/腫瘤相關(guān)的藥物。

發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)，所述的病毒適合用于治療zap低表達(dá)腫瘤或zap陰性腫瘤，優(yōu)選用于治療zap低表達(dá)的實(shí)體瘤或zap陰性的實(shí)體瘤。

m1病毒治療腫瘤的有效性，與腫瘤zap表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)。m1病毒的復(fù)制受到zap的抑制，并且zap在多種腫瘤中低表達(dá)或陰性，m1病毒可選擇性地治療zap低表達(dá)或zap陰性的腫瘤/個(gè)體。

zap是鋅指ccch型抗病毒蛋白1縮寫，其英文名是zincfingerccch-typeantiviralprotein1，它由zc3hav1基因編碼。文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)胞內(nèi)zap通過誘導(dǎo)rna降解和翻譯抑制的機(jī)制來抑制某些病毒的復(fù)制，比如埃博拉病毒和馬爾堡病毒，但zap對其他病毒復(fù)制無抑制作用，例如水皰疹性口炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒和黃熱病病毒等。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)m1病毒能夠顯著在zap低表達(dá)/zap陰性的細(xì)胞株中引起細(xì)胞死亡，m1病毒在荷瘤動(dòng)物體內(nèi)富集于zap低表達(dá)/zap陰性的腫瘤組織，并抑制腫瘤生長，同時(shí)m1病毒抑制zap低表達(dá)/zap陰性的人離體活腫瘤組織的存活。

發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)在多個(gè)不同種類腫瘤中，zap的表達(dá)量在腫瘤組織中低于癌旁非瘤組織。臨床多種腫瘤病理標(biāo)本的免疫組化分析表明，在69％的肝癌、52％的結(jié)直腸癌和61％的膀胱癌組織中zap表達(dá)水平顯著低于相對應(yīng)的癌旁非瘤組織。m1病毒可用于選擇性治療zap低表達(dá)/zap陰性的腫瘤。

發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果首次證明m1病毒的復(fù)制受到zap抑制，zap表達(dá)水平是m1病毒選擇性引起腫瘤細(xì)胞死亡和抑制腫瘤生長的決定因素。發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)m1病毒抗腫瘤效果與zap的表達(dá)水平直接相關(guān)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，敲低zap后的腫瘤細(xì)胞感染m1病毒，腫瘤細(xì)胞存活率較未敲低zap的細(xì)胞顯著降低。因此，作為一種可選的優(yōu)選治療方案，可以在給予癌癥患者m1病毒治療時(shí)，同時(shí)或預(yù)先給予zap抑制劑，以提高腫瘤對m1病毒的敏感性。

因此，為了進(jìn)一步提高m1病毒作為抗腫瘤藥物治療的有效率，在治療方案的選擇中，可以首先判斷患者腫瘤的zap表達(dá)情況，再針對性地給予m1病毒的治療方案，以此來提高治療方案的有效性，避免無效給藥所造成的時(shí)間上的拖延和藥物濫用。例如，在給藥前先測定患者腫瘤zap表達(dá)情況，如果是zap低表達(dá)或zap陰性的腫瘤，可直接給以m1病毒治療；如果是zap正常表達(dá)/zap高表達(dá)腫瘤，則可在m1病毒給藥前或同時(shí)給予zap抑制劑(例如zap表達(dá)或功能抑制劑，zap干擾片段，或者zap抗體等)，以提高腫瘤對m1病毒的敏感性，提高治療有效性。腫瘤zap表達(dá)量的高低直接影響到m1治療的有效性。zap表達(dá)量越低的腫瘤越有利于m1的治療效果。判斷某個(gè)體/腫瘤是否適于利用m1進(jìn)行治療，可先檢測腫瘤zap的表達(dá)水平。判斷zap表達(dá)水平高低可以優(yōu)選但不限于以下方式：

zap低或高表達(dá)是指兩組(個(gè))樣本之間zapmrna或者蛋白質(zhì)數(shù)量比較后得出的結(jié)論，如果一組(個(gè))樣本比另外一組(個(gè))zapmrna或者蛋白質(zhì)數(shù)量少或多稱為該樣本zap低或高表達(dá)；zap陰性是指樣本完全不表達(dá)zapmrna或蛋白。用于zapmrna和蛋白質(zhì)的數(shù)量比較的樣本可以是腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞、腫瘤組織與癌旁非瘤組織，或者m1治療有效與無效的腫瘤。

作為一種可選的方式，腫瘤的zap高、低或陰性表達(dá)均指腫瘤組織與相應(yīng)癌旁非瘤組織比較，zapmrna和蛋白質(zhì)的數(shù)量多、少或者無表達(dá)。若前者的zap的mrna或蛋白質(zhì)均一化表達(dá)量比后者少(即腫瘤組織較癌旁非瘤組織的zap均一化表達(dá)量比值<1)，則屬于zap低表達(dá)，適于利用m1進(jìn)行治療。更為有效的治療對象為腫瘤組織較癌旁非瘤組織的zap均一化表達(dá)量比值<0.8的腫瘤，更優(yōu)選<0.6，更優(yōu)選<0.4，更優(yōu)選<0.3，更優(yōu)選<0.2，更優(yōu)選<0.1，最為優(yōu)選的，是腫瘤組織zap陰性。這些腫瘤組織與相應(yīng)癌旁非瘤組織包括但不限于病理穿刺手術(shù)或外科切除手術(shù)來源組織樣本。臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在有些腫瘤組織中zap表達(dá)量甚至高于癌旁非瘤組織，這些腫瘤或腫瘤患者將不適宜直接利用m1進(jìn)行治療。

zapmrna或蛋白檢測方法包括但不限于qrt-pcr、northernblot、westernblot、免疫組織化學(xué)、elisa等。為準(zhǔn)確判定不同樣本之間zapmrna或蛋白數(shù)量的差異，首先計(jì)算出每一個(gè)樣本zapmrna或蛋白的均一化表達(dá)量。均一化表達(dá)量是指每個(gè)樣本的zapmrna或蛋白值和樣本內(nèi)參zapmrna或蛋白平相除，進(jìn)行均一化處理得出該樣本zap均一化表達(dá)量。在不同檢測方法中內(nèi)參可以不同，其共同特征是在不同細(xì)胞或組織樣本中內(nèi)參表達(dá)量一致，這樣經(jīng)過均一化處理的不同樣本的zap表達(dá)量才具備可比性，用于判斷樣本之間zapmrna或蛋白的數(shù)量差異。

在本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施例中(圖4)，m1病毒對人離體培養(yǎng)的活肝癌組織和結(jié)直腸癌組織具有不同的抑制生長效果(表2和表3)，腫瘤生長抑制率超過10％的樣本合計(jì)達(dá)到32例，而腫瘤生長抑制率小于等于10％的19例。進(jìn)一步通過qrt-pcr方法分析這兩組每個(gè)腫瘤組織中zap和內(nèi)參mrna的表達(dá)水平(各自2^-ct值)，用每個(gè)樣本的2^-ct-zap除以2^{-ct-內(nèi)參}獲得各自zap均一化表達(dá)量。對上述兩組樣本的zap均一化表達(dá)量統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，抑制率超過10％樣品組的zap均一化表達(dá)量為0.117±0.890，低于抑制率小于等于10％組(0.791±0.108)，二者均數(shù)比值為0.148。

作為另一種可選的方式，腫瘤的zap高、低或陰性表達(dá)指腫瘤細(xì)胞(例如來源于腫瘤患者的培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞)與正常細(xì)胞比較，zapmrna和蛋白質(zhì)的數(shù)量多、少或者無表達(dá)。若前者的zap的mrna或蛋白質(zhì)均一化表達(dá)量比后者少(即腫瘤細(xì)胞較正常細(xì)胞的zap均一化表達(dá)量比值<1)，則屬于zap低表達(dá)，適于利用m1進(jìn)行治療。更為有效的治療對象為腫瘤細(xì)胞較正常細(xì)胞的zap均一化表達(dá)量比值<0.8的腫瘤，更優(yōu)選<0.6，更優(yōu)選<0.4，更優(yōu)選<0.3，更優(yōu)選<0.2，更優(yōu)選<0.1，最為優(yōu)選的，是腫瘤細(xì)胞zap陰性。

在本發(fā)明的一個(gè)示例性實(shí)施例中(圖3c)，運(yùn)用westernblot方法測定hepg2肝癌細(xì)胞細(xì)胞株和l-02正常肝細(xì)胞株zap蛋白表達(dá)水平差異，同時(shí)測定作為不同樣本之間表達(dá)量一致的標(biāo)準(zhǔn)參照β-actin，westernblot檢測條帶灰度代表被檢測分子數(shù)量，zap均一化蛋白表達(dá)量＝zap條帶灰度平均值/β-actin條帶灰度平均值。hepg2的zap均一化蛋白表達(dá)量與l-02的比值為0.8，zap在hepg2低表達(dá)。在感染m1病毒后，hepg2細(xì)胞存活率只有70.4％±3.5％，而同樣處理的l-02存活率達(dá)100.3±10.0％，二者存活率差異具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在另一個(gè)示例性實(shí)施例中(圖3a和圖3b)，腫瘤細(xì)胞株t24、scaber、lovo和hep3b的zap無論mrna(圖3a)還是蛋白質(zhì)(圖3b)在通過qrt-pcr和westernblot檢測后，分別與各自內(nèi)參比較后的均一化表達(dá)量為未檢出或接近于0(<0.1)，即zap表達(dá)陰性或接近陰性(<0.1)；m1感染后這些腫瘤細(xì)胞后引起細(xì)胞死亡，細(xì)胞存活率顯著下降到t2421.1％、scaber11.5％、lovo6.9％和hep3b3.8％(表1)。而圖3a和圖3b中的正常細(xì)胞l-02和heb中zap無論mrna(圖3a)還是蛋白質(zhì)的均一化表達(dá)量與上述腫瘤細(xì)胞的比值大于1，屬于zap高表達(dá)，在m1感染后沒有引起這些正常細(xì)胞存活率明顯下降，l-02為100.3％，heb98.8％(表1)。

由此，發(fā)明同時(shí)提供了一種抗腫瘤用藥系統(tǒng)，其特征在于包括zap表達(dá)水平檢測試劑，以及甲病毒；所述的甲病毒為m1病毒或蓋塔病毒。通過先檢測患者腫瘤的zap表達(dá)水平，再針對性地采取合適的給藥方案。

同時(shí)，發(fā)明還提供了一種抗腫瘤藥物，其包括甲病毒和zap抑制劑；所述甲病毒為m1病毒或蓋塔病毒。所述的zap抑制劑為zap表達(dá)或功能抑制劑、zap干擾片段或者zap抗體等。

為了避免m1病毒同時(shí)對正常細(xì)胞的殺傷作用，優(yōu)選地，所給予的zap抑制劑針對性地給予或靶向于腫瘤組織，為腫瘤靶向性zap抑制劑。

作為可選的實(shí)施方案，本發(fā)明所提供的抗腫瘤藥物可以是注射劑、片劑、膠囊、貼劑等。作為優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的抗腫瘤藥物是注射劑；優(yōu)選地，可采用靜脈注射。

作為可選的給藥方式，本發(fā)明m1病毒可以通過靜脈或瘤內(nèi)注射方式給藥。瘤內(nèi)注射方式每天給予2×10⁵pfu/kg～2×10⁹pfu/kg；以靜脈注射的方式每天給予2×10⁶pfu/kg～2×10¹⁰pfu/kg。與溶劑對照組相比，m1病毒組顯著抑制了腫瘤的生長。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明所提供的抗腫瘤藥物，可用于治療多種腫瘤，包括肝癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌、胃癌。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證明m1病毒引起多種腫瘤細(xì)胞的死亡；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明m1病毒在體內(nèi)顯著抑制肝癌、結(jié)直腸癌的生長；在人離體活腫瘤組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明m1病毒顯著抑制肝癌、結(jié)直腸癌組織存活。

本發(fā)明所提供的抗腫瘤藥物，可優(yōu)先的治療zap低表達(dá)/zap陰性腫瘤，包括但不限于肝癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、胰腺癌、鼻咽癌、肺癌、胃癌。

本發(fā)明所提供的抗腫瘤藥物，具有選擇性抗腫瘤作用，安全性良好。m1病毒能選擇性引起腫瘤細(xì)胞死亡，而對正常細(xì)胞的存活無影響，表明m1病毒具有腫瘤細(xì)胞選擇性；在荷瘤裸鼠體內(nèi)，經(jīng)尾靜脈注射的m1病毒能高度富集于腫瘤組織，而在正常組織內(nèi)病毒量較低，二者病毒量相差約10²～10⁶倍，進(jìn)一步闡明了m1病毒的腫瘤選擇性。同時(shí)給予m1病毒并不影響裸鼠體重和精神狀態(tài)，表明m1病毒安全性良好。

本發(fā)明首次針對特定的個(gè)體/腫瘤提供安全有效的病毒抗腫瘤藥物。本發(fā)明藥物選擇性地治療zap低表達(dá)/zap陰性的腫瘤，由此提高了用藥有效率，防止無效給藥和藥物濫用。

本發(fā)明提供了更為有效的用藥方法和用藥系統(tǒng)，通過先檢測患者腫瘤的zap表達(dá)水平，再針對性地給予藥物治療，或者輔以其他手段給予治療，可以提高m1病毒的治療針對性和有效性。

本發(fā)明提供了更為有效的抗腫瘤藥物和腫瘤治療方法，在給藥前或給藥同時(shí)，輔以zap抑制劑，從而可以提高了腫瘤對藥物的敏感性。

附圖說明

圖1m1病毒顯著引起腫瘤細(xì)胞病變效應(yīng)；

a)m1病毒感染引起腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)病變；

b)m1病毒感染對正常細(xì)胞株形態(tài)學(xué)沒有影響，control表示optipro^tmsfm培養(yǎng)基對照組，m1表示m1病毒感染實(shí)驗(yàn)組。

圖2m1病毒有效抑制荷瘤鼠腫瘤生長；

a)m1病毒瘤內(nèi)注射后對hep3b荷瘤鼠腫瘤體積與動(dòng)物體重的影響，m1表示m1病毒處理組，溶劑表示optipro^tmsfm培養(yǎng)基溶劑對照組，n＝9；

b)m1病毒瘤內(nèi)注射后對lovo荷瘤鼠腫瘤體積與動(dòng)物體重的影響，n＝11；

c)m1病毒靜脈注射后對hep3b荷瘤鼠腫瘤體積與動(dòng)物體重的影響，n＝9；

d)qrt-pcr檢測靜脈注射m1病毒后在hep3b荷瘤鼠的組織分布，n＝6；

腫瘤體積與體重?cái)?shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，anova法統(tǒng)計(jì)；箭頭表示m1病毒處理組，圓圈表示optipro^tmsfm培養(yǎng)基對照組，ns表示無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；i.t表示瘤內(nèi)注射，i.v表示靜脈注射；*表示未檢測到m1病毒的mrna表達(dá)。

圖3m1病毒選擇性引起zap低表達(dá)/zap陰性腫瘤細(xì)胞死亡；

a)zapmrna表達(dá)量在不同細(xì)胞中的差異表達(dá)；nd表示未檢測到zap的mrna表達(dá)；

b)zap的蛋白表達(dá)量在不同細(xì)胞中的差異表達(dá)；β-actin是內(nèi)參；

c)細(xì)胞zap蛋白水平與m1病毒感染引起的細(xì)胞存活率改變。β-actin是內(nèi)參，students’t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，**p<0.01；

d)m1病毒顯著引起敲低zap水平后的正常細(xì)胞l-02、腫瘤細(xì)胞plc和hct116死亡。空心圓/空心三角/空心倒三角表示干擾敲低zap，實(shí)心圓/實(shí)心三角/實(shí)心倒三角表示亂碼干擾陰性對照，采用students’t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，*/#/&表示p<0.05，&&表示p<0.01，ns表示無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；

e)在敲低zap的正常細(xì)胞l-02、腫瘤細(xì)胞plc和hct116中m1病毒相對滴度增加，采用students’t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，*表示p<0.05；

f)在敲低zap的正常細(xì)胞l-02、腫瘤細(xì)胞plc和hct116中m1病毒rna表達(dá)增加，采用students’t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，*表示p<0.05，**表示p<0.01；

g)在敲低zap的正常細(xì)胞l-02、腫瘤細(xì)胞plc和hct116中m1病毒蛋白ns3，e1表達(dá)增加，gapdh作為內(nèi)參；

h)過表達(dá)zap部分阻斷由m1病毒引起的腫瘤細(xì)胞死亡，采用students’t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，#表示p<0.05，ns表示無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；

i)過表達(dá)zap的腫瘤細(xì)胞中病毒m1病毒相對滴度減少，采用students’t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，**表示p<0.01；

j)過表達(dá)zap的腫瘤細(xì)胞中病毒m1病毒的rna減少，采用students’t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，**表示p<0.01；

k)過表達(dá)zap的腫瘤細(xì)胞中，m1病毒的蛋白ns3，e1表達(dá)增加，β-actin作為內(nèi)參。

圖4m1病毒對人離體活腫瘤組織抑制率與zapmrna表達(dá)水平負(fù)相關(guān)；

qrt-pcr檢測zap的mrna表達(dá)，比較m1病毒無效組(抑制率≤10％)與m1病毒有效組(抑制率>10％)zap相對表達(dá)量的差別，m1病毒處理抑制率小于等于10％的腫瘤組織zap均一化表達(dá)量中位數(shù)是0.414，大于10％的腫瘤組織zap表達(dá)量中位數(shù)為0.075。采用秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，p<0.05。

圖5zap在多種腫瘤臨床病理組織中低表達(dá)；

a)免疫組化染色檢測臨床腫瘤病理組織中zap的表達(dá)情況，n：癌旁非瘤組，t：腫瘤組；

b)在多種腫瘤臨床病理組織中，腫瘤組zap表達(dá)顯著低于癌旁非瘤組，n：癌旁非瘤組，t：腫瘤組；n與t秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，***p<0.001；

c)在多種腫瘤臨床病理組織中，腫瘤組織zap表達(dá)低于癌旁非瘤組織的病例比率。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施方式是對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不局限于以下的實(shí)施例介紹，凡依照本發(fā)明的原理或理念所作的等同的變化或變通都應(yīng)視為本發(fā)明保護(hù)的范疇。

在沒有特別指明的情況下，本發(fā)明采用的材料及實(shí)驗(yàn)方法為常規(guī)材料及方法。

實(shí)施例1m1病毒選擇性引起腫瘤細(xì)胞死亡

1)m1病毒顯著引起腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)病變

材料：

肝細(xì)胞癌hep3b、人膀胱移行細(xì)胞癌t24、人結(jié)直腸癌lovo，人永生化正常肝細(xì)胞株l-02，m1病毒，高糖dmem培養(yǎng)基，f-12培養(yǎng)基，倒置相差顯微鏡。

方法：

a)細(xì)胞的培養(yǎng)：人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株hep3b細(xì)胞株，人膀胱移行上皮細(xì)胞癌細(xì)胞株t24，人永生化正常肝細(xì)胞株l-02，生長在含10％fbs、100u/ml青霉素及0.1mg/ml鏈霉素的dmem完全培養(yǎng)基中；人結(jié)直腸癌細(xì)胞株lovo生長在含10％fbs、100u/ml青霉素及0.1mg/ml鏈霉素的f-12完全培養(yǎng)基中。所有細(xì)胞株均置于5％co2,37℃恒溫密閉式孵箱(相對濕度95％)內(nèi)培養(yǎng)傳代，倒置顯微鏡觀察生長情況。大約2～3天傳代一次，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于正式實(shí)驗(yàn)。

b)細(xì)胞顯微鏡下觀察：選擇對數(shù)生長期細(xì)胞，dmem或f-12完全培養(yǎng)液(含10％胎牛血清、1％雙抗)制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞以2.5×10⁴/孔的密度接種在24孔培養(yǎng)板內(nèi)。用m1病毒(moi＝1)感染48小時(shí)后，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。

結(jié)果：

相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，hep3b細(xì)胞，t24細(xì)胞和lovo細(xì)胞均是單層貼壁生長，并且細(xì)胞緊密排列，表型一致。而m1病毒(moi＝1)處理48h后，細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了明顯改變，較對照組細(xì)胞，感染病毒組細(xì)胞數(shù)目明顯減少，胞體收縮成球狀，折光率明顯增強(qiáng)，呈死亡病變樣，如圖1a。如圖1b顯示了m1病毒感染對正常細(xì)胞的影響，采用同樣滴度的m1病毒感染l-02細(xì)胞，沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目，形態(tài)有明顯的變化。結(jié)果表明m1病毒對腫瘤細(xì)胞有選擇性引起細(xì)胞死亡，而對正常細(xì)胞存活沒有影響。

2)m1病毒選擇性地降低腫瘤細(xì)胞株存活

材料：

34株腫瘤細(xì)胞株(見表1)、3株人永生化正常細(xì)胞株(見表1)、m1病毒、高糖dmem培養(yǎng)基、f-12培養(yǎng)基、mtt(四甲基偶氮唑藍(lán))。

方法：

a)接種細(xì)胞、給藥處理：選擇對數(shù)生長期細(xì)胞，dmem(或f-12)完全培養(yǎng)液(含10％胎牛血清、1％雙抗)制成細(xì)胞懸液，以每孔4×10³/孔的密度接種在96孔培養(yǎng)板內(nèi)。12小時(shí)后見細(xì)胞完全貼壁，實(shí)驗(yàn)分實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組：m1病毒(moi＝10)感染細(xì)胞；對照組：高糖dmem溶劑對照組，兩組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

b)mtt與細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)：培養(yǎng)至48h時(shí)，每孔加入mtt15μl(5mg/ml)，繼續(xù)孵育4小時(shí)，此時(shí)鏡檢可觀察到、活細(xì)胞內(nèi)形成的顆粒狀藍(lán)紫色甲臜結(jié)晶。

c)溶解甲臜顆粒：小心吸去上清，加dmso100μl/孔溶解形成的結(jié)晶，在微型振蕩器上震蕩5min，然后在酶聯(lián)檢測儀上用波長570nm檢測各孔的光密度(od值)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞存活率＝藥物處理組od值/對照組od值×100％。

結(jié)果:

如表1所示，m1病毒(moi＝10)處理腫瘤細(xì)胞48小時(shí)，胰腺癌、鼻咽癌、前列腺癌和黑色素瘤細(xì)胞死亡率超過50％；結(jié)直腸癌(lovo、hct-8、sw620和sw480)、肝癌(hep3b、huh-7和huh-6)、膀胱癌和乳腺癌細(xì)胞死亡率超過40％；膠質(zhì)瘤、宮頸癌、肺癌細(xì)胞死亡率超過30％；胃癌細(xì)胞死亡率超過20％。而3株正常細(xì)胞(l-02、heb和sv-huc-1)以及plc和hct116細(xì)胞存活率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著變化。結(jié)果表明m1病毒感染選擇性引起大部分腫瘤細(xì)胞死亡。

表1.m1病毒顯著降低腫瘤細(xì)胞存活率

(附：**p<0.01,*p<0.05,ns：差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,統(tǒng)計(jì)方法：students’t檢驗(yàn)，-：未統(tǒng)計(jì)。)

實(shí)施例2m1病毒選擇性有效抑制腫瘤生長

1)在荷瘤鼠體內(nèi)m1病毒有效抑制腫瘤生長

材料：

m1病毒、人肝癌細(xì)胞株hep3b、人結(jié)直腸癌細(xì)胞株lovo、58只4周齡雌性balb/c裸鼠

方法：

a)荷瘤鼠模型建立：將5×10⁶hep3b或者lovo細(xì)胞注入到4周齡balb/c裸鼠背側(cè)皮下。

b)瘤內(nèi)給藥：當(dāng)hep3b腫瘤體積達(dá)到約50mm³或lovo腫瘤體積達(dá)到約70mm³時(shí)，開始瘤內(nèi)注射給藥，12天內(nèi)共注射6次(2×10⁶pfu/次)m1病毒，optipro^tmsfm培養(yǎng)基注射為溶劑對照組。每兩天測量腫瘤的長寬和體重，腫瘤的體積依據(jù)公式：長×寬²/2。

c)靜脈給藥：當(dāng)hep3b細(xì)胞腫瘤體積達(dá)到約50mm³時(shí)，靜脈注射m1病毒(3×10⁷pfu/次)，隔三天后，接受第二次靜脈注射。optipro^tmsfm培養(yǎng)基注射為溶劑對照組。每三天測量體重和腫瘤的長寬，腫瘤的體積依據(jù)公式：長×寬²/2。

結(jié)果：

在balb/c裸鼠上建立了皮下荷瘤hep3b(圖2a和2c)和lovo(圖2b)裸鼠模型后，連續(xù)多次瘤內(nèi)(圖2a和圖2b)或靜脈注射(圖2c)給予m1病毒，觀察裸鼠腫瘤體積與動(dòng)物體重變化狀況。在hep3b裸鼠模型中，采用瘤內(nèi)注射給藥方式如圖2a，第20天終止實(shí)驗(yàn)，溶劑對照組腫瘤體積平均值為0.368±0.051cm³，m1病毒組腫瘤體積平均值為0.172±0.058cm³，統(tǒng)計(jì)表明m1病毒顯著抑制hep3b荷瘤鼠腫瘤生長，并且m1病毒組裸鼠平均體重(16.4±1.54g)與對照組裸鼠平均體重(17.0±1.16g)比較無顯著差異，且精神狀態(tài)良好，表明m1病毒安全性良好；在lovo裸鼠模型中，采用瘤內(nèi)給藥方式如圖2b，第24天終止實(shí)驗(yàn)，對照組腫瘤體積平均值為0.546±0.087cm³，m1病毒組腫瘤體積平均值為0.389±0.049cm³，統(tǒng)計(jì)表明m1病毒顯著抑制lovo荷瘤鼠腫瘤生長，并且m1病毒組裸鼠平均體重(18.9±1.40g)與對照組裸鼠平均體重(19.4±1.86g)相比，無顯著差異，且精神狀態(tài)良好，表明m1病毒安全性良好；在hep3b裸鼠模型中，采用靜脈注射給藥方式如圖2c，第21天終止實(shí)驗(yàn)，對照組腫瘤平均體積為0.247±0.067cm³，m1病毒組腫瘤平均體積為0.134±0.057cm³，統(tǒng)計(jì)表明m1病毒顯著抑制hep3b荷瘤鼠腫瘤生長，并且m1病毒組裸鼠平均體重(17.2±2.50g)與對照組平均裸鼠體重(17.5±2.16g)相比，無顯著差異，且精神狀態(tài)良好，表明m1病毒安全性良好；

2)m1病毒選擇性的富集于腫瘤組織

材料：

24只4周齡雌性balb/c裸鼠、肝癌細(xì)胞株hep3b、trizol，組織勻漿機(jī)、實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀

β-actin引物：

正義鏈(seqidno.1：gatcattgctcctcctgagc)

反義鏈(seqidno.2：actcctgcttgctgatccac)

m1病毒非結(jié)構(gòu)蛋白ns1引物：

正義鏈(seqidno.3：gttccaacaggcgtcaccatc)

反義鏈(seqidno.4：acacattcttgtctagcacagtcc)

方法：

向4周齡的裸鼠背側(cè)皮下注入5×10⁶hep3b細(xì)胞。4天后，每只小鼠尾靜脈注入m1病毒(3×10⁷pfu)。給藥后分別與第1、2、3以及4天處死裸鼠，收集組織樣品(包括腫瘤、心、肝、脾、肺、腎、腦、肌肉)，并抽提組織rna。然后，用qrt-pcr的方法檢測m1病毒的量，以檢測m1病毒非結(jié)構(gòu)蛋白ns1代表m1病毒量，同時(shí)檢測β-actin內(nèi)參，相對m1病毒rna量按照公式計(jì)算：2^-(ct-ns1^-ct-內(nèi)參⁾。^ct-ns1、^ct-內(nèi)參來自appliedbiosystems7500fastreal-timepcrsystem儀器讀數(shù)。

結(jié)果：

如圖2d所示，在裸鼠皮下hep3b腫瘤模型體中，在4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)上m1病毒在腫瘤組織內(nèi)的數(shù)量超過其他器官組織10²～10⁶倍以上，說明m1病毒選擇性的富集于腫瘤組織。

實(shí)施例3m1病毒選擇性引起zap低表達(dá)/zap陰性腫瘤細(xì)胞死亡

m1病毒選擇性引起zap低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞死亡，而對正常細(xì)胞無影響，zap的表達(dá)水平是m1病毒選擇性的決定性因素。在正常細(xì)胞和zap正常表達(dá)/高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中通過干擾rna，敲低zap的表達(dá)水平后，m1病毒能夠顯著的引起細(xì)胞死亡。同時(shí)，在低表達(dá)zap的腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)zap能部分阻斷由m1病毒引起的腫瘤細(xì)胞死亡。

1)m1病毒不引起zap表達(dá)水平高的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞死亡

材料：

m1病毒、人肝細(xì)胞l-02、人膠質(zhì)細(xì)胞heb、人膀胱癌細(xì)胞scaber及t24、人肝癌細(xì)胞株hep3b和plc、人肝癌細(xì)胞株hepg2、人結(jié)直腸癌細(xì)胞株lovo和hct116；westernbolt：細(xì)胞總蛋白抽提液(mammalianproteinextractionreagent，thermo)、zap抗體(thermo，usa)、β-actin抗體(neomarker，usa)；抽提rna、pcr：rna提取試劑trizol、實(shí)時(shí)定量pcr儀appliedbiosystems7500fastreal-timepcrsystem(life，usa)、

zap引物：

zap正義鏈(seqidno.5：tcacgaactctctggactgaa)

zap反義鏈(seqidno.6：acttttgcatatctcgggcataa)

β-actin引物同實(shí)施例2。

方法：

選擇對數(shù)生長期細(xì)胞，dmem或f-12完全培養(yǎng)液(含10％的胎牛血清、1％的雙抗)制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞以2×10⁵/皿的密度接種在35mm皿內(nèi)。提取rna,pcr檢測細(xì)胞中zapmrna表達(dá)量，本實(shí)驗(yàn)內(nèi)參為β-actin。zapmrna均一化表達(dá)量計(jì)算按照公式進(jìn)行：zap均一化mrna表達(dá)量＝2^-(ct-zap^–ct-內(nèi)參⁾。^ct-zap、^ct-內(nèi)參來自appliedbiosystems7500fastreal-timepcrsystem儀器讀數(shù)，表示pcr擴(kuò)增過程中，熒光信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的閾值所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。

抽提細(xì)胞總蛋白、定量，進(jìn)行westernblot實(shí)驗(yàn)(電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗和二抗、顯影)。通過成像儀軟件imagelab對zap和內(nèi)參β-actin條帶灰度掃描，檢測條帶灰度，計(jì)算zap均一化蛋白表達(dá)量按照以下公式進(jìn)行：zap均一化蛋白表達(dá)量＝zap條帶灰度/內(nèi)參條帶灰度。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值計(jì)算zap均一化蛋白表達(dá)量。

結(jié)果：

如圖3a和3b所示，zap在腫瘤細(xì)胞scaber、t24、hep3b和lovo中mrna(圖3a)和蛋白(圖3b)均一化表達(dá)量幾乎檢測不到，顯著低于正常細(xì)胞(l-02和heb)以及腫瘤細(xì)胞(plc、hct116)。

m1病毒引起zap低表達(dá)/陰性的腫瘤細(xì)胞死亡，但不導(dǎo)致zap高表達(dá)的細(xì)胞細(xì)胞死亡。正常細(xì)胞(l-02和heb)和部分腫瘤細(xì)胞(plc、hct116)在感染m1病毒后存活率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的改變，l-02為100.3％，heb98.8％(表1)。而腫瘤細(xì)胞scaber、t24、hep3b和lovo在感染m1病毒后，細(xì)胞存活率顯著下降到t2421.1％、scaber11.5％、lovo6.9％和hep3b3.8％(表1)。

如圖3c和表1所示，hepg2肝癌細(xì)胞zap蛋白均一化表達(dá)量低于l-02正常細(xì)胞，比值為0.8。l-02細(xì)胞感染m1病毒后存活率并無明顯改變，而hepg2細(xì)胞在感染m1病毒后存活率降低到70.4％，二者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這進(jìn)一步說明m1病毒選擇性導(dǎo)致zap低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞死亡。

2)m1病毒顯著引起敲低zap水平后的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞死亡

材料：

m1病毒、人肝細(xì)胞l-02、人肝癌細(xì)胞plc、人結(jié)直腸癌細(xì)胞hct116、zaprna干擾片段、mtt(甲基偶氮唑藍(lán))、lipofectamine^tmrnaimax(invertrogen，usa)westernbolt：細(xì)胞總蛋白抽提液(mammalianproteinextractionreagent，thermo)、zap抗體(thermo，usa)、m1病毒ns3抗體(beijingproteininnovation)、m1病毒e1抗體(beijingproteininnovation)、gapdh抗體(cst，usa)；抽提rna、pcr：trizol、實(shí)時(shí)定量pcr儀(appliedbiosystems7500fastreal-timepcrsystem)、β-actin、m1病毒非結(jié)構(gòu)蛋白ns1引物同實(shí)施例2：

zap干擾片段(sirna)設(shè)計(jì)針對靶序列seqidno.7：5’ccaagagtagcacttgtta3’

sirna正義鏈(seqidno.8：5’ccaagaguagcacuuguuadtdt3’)

sirna反義鏈(seqidno.9：3’dtdtgguucucaucgugaacaau5’)

zap亂碼干擾片段對照(sinc)：正義鏈和反義鏈的核苷酸比例與sirna片段一樣但是排列順序完全隨機(jī)。

方法：

選擇對數(shù)生長期細(xì)胞，dmem完全培養(yǎng)液(10％胎牛血清、1％雙抗)制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞以1×10⁵/孔的密度接種在6孔板內(nèi)。24小時(shí)后，加入rnaimax包裹的sirna片段。48小時(shí)后，感染m1病毒。感染48小時(shí)后，處理樣本。

每孔加入mtt20μl(5mg/ml)，4小時(shí)后檢測吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率，sizap實(shí)驗(yàn)組以zaprna干擾片段處理，sinc對照組以zap亂碼干擾片段處理。

a)收集細(xì)胞上清液，用tcid50的方法檢測病毒滴度。

b)抽提rna樣本，pcr，通過檢查m1病毒非結(jié)構(gòu)蛋白ns1量來檢測m1病毒量，β-actin為內(nèi)參。

c)抽提蛋白質(zhì)樣本，westernblot檢測zap蛋白表達(dá)和m1病毒蛋白ns3和e1，內(nèi)參是gapdh，zap均一化表達(dá)量計(jì)算除內(nèi)參gapdh代替β-actin外，其他同實(shí)施例3之1)。

d)試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；與各自對照組比較進(jìn)行students’t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，*/#/&表示p<0.05，**/&&表示p<0.01，ns表示無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié)果：

如圖3d-3g所示，以zaprna干擾片段處理人正常肝細(xì)胞l-02、人肝癌細(xì)胞plc和人結(jié)直腸癌細(xì)胞hct116后，zap蛋白表達(dá)量顯著下降至檢測不到(圖3g)，而m1病毒蛋白ns3和e1蛋白明顯增加；在感染m1病毒(moi＝100)后，顯著引起敲低zap水平后的l-02細(xì)胞(sizap組)存活率降低為69.7％±3.45％，plc細(xì)胞存活率降低為63.9％±11.5％，hct116細(xì)胞存活率降低為49.6％±1.21％(圖3d)；如圖3e所示，在感染m1病毒48小時(shí)后敲低zap(sizap組)的l-02細(xì)胞中相對m1病毒滴度為相應(yīng)sinc組的4.10±1.38倍，hct116細(xì)胞(sizap組)為相應(yīng)sinc組的3.39±1.27倍，plc細(xì)胞(sizap組)為相應(yīng)sinc組的32.6±2.34倍。同時(shí)如圖3f所示，在感染m1病毒48小時(shí)后敲低zap(sizap組)，的l-02細(xì)胞中m1病毒rna表達(dá)量是相應(yīng)sinc組的16.3±8.20倍，hct116細(xì)胞中是相應(yīng)sinc組的8.82±4.02倍，plc細(xì)胞中是相應(yīng)sinc組的30.5±12.23倍；以上結(jié)果表明m1病毒顯著引起敲低zap水平后的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞死亡。

3)過表達(dá)zap拮抗m1病毒引起的腫瘤細(xì)胞死亡

材料：

m1病毒、人肝癌細(xì)胞hep3b、表達(dá)gfp的preceiver-m02-gfp質(zhì)粒(空白對照質(zhì)粒，廣州復(fù)能基因)、表達(dá)zap的preceiver-m02-zap質(zhì)粒(過表達(dá)zap質(zhì)粒)、fugenehd轉(zhuǎn)染試劑、mtt(甲基偶氮唑藍(lán))

抽提rna、pcr：trizol、實(shí)時(shí)定量pcr儀(appliedbiosystems7500fastreal-timepcrsystem)、β-actin、m1病毒非結(jié)構(gòu)蛋白ns1引物同實(shí)施例2。

westernbolt：細(xì)胞總蛋白抽提液(mammalianproteinextractionreagent，thermo)、zap抗體(thermo，usa)、m1病毒ns3抗體(beijingproteininnovation)、m1病毒e1抗體(beijingproteininnovation)、gapdh抗體(cst，usa)。

方法：

選擇對數(shù)生長期細(xì)胞，dmem完全培養(yǎng)液(10％的胎牛血清、1％的雙抗)調(diào)制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞以1×10⁵/孔的密度接種在6孔板內(nèi)。24小時(shí)后，分別轉(zhuǎn)染過表達(dá)gfp對照質(zhì)粒和過表達(dá)zap質(zhì)粒，獲得表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞和zap過表達(dá)的細(xì)胞。48小時(shí)后，感染m1病毒。感染48小時(shí)后，處理樣本并檢測：

a)mtt法檢測細(xì)胞存活率，每孔加入mtt20μl(5mg/ml)，4小時(shí)后570nm波長檢測吸光度值，其他處理同實(shí)施例1。

b)收集細(xì)胞上清液，用tcid50的方法檢測病毒滴度。

c)抽提樣品總rna樣本，qrt-pcr法檢測m1病毒rna表達(dá)量，其計(jì)算按照實(shí)施例2方法進(jìn)行。

d)收集蛋白質(zhì)樣本，westernblot檢測zap蛋白表達(dá)量和m1病毒蛋白ns3、e1蛋白表達(dá)量，處理方法同實(shí)施例3之1)。

e)每次試驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。與各自對照組比較，采用students’t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，#表示p<0.05，**表示p<0.01，ns表示差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果：

如圖3k所示，人肝癌細(xì)胞hep3b轉(zhuǎn)染了zap過表達(dá)質(zhì)粒后，通過imagelab軟件對不同樣本的zap和內(nèi)參β-actin條帶進(jìn)行灰度掃描后計(jì)算各自zap均一化蛋白表達(dá)量。zap均一化蛋白表達(dá)量zap過表達(dá)組是1.61±0.05，過表達(dá)gfp對照組是0.03±0.01，均數(shù)前者是后者的53.7倍；m1病毒蛋白ns3和e1蛋白明顯增加；

如圖3h所示，過表達(dá)zap部分阻斷m1病毒感染引起的hep3b細(xì)胞死亡。使用不同m1病毒滴度感染后48小時(shí)，當(dāng)moi＝0.1時(shí)，過表達(dá)zap組細(xì)胞存活率均數(shù)為74.7％±8.94％，顯著高于過表達(dá)gfp對照組細(xì)胞存活率(59.0％±6.27％)；當(dāng)moi＝1時(shí)，過表達(dá)zap組細(xì)胞存活率均數(shù)為69.4％±6.95％，顯著高于過表達(dá)gfp對照組存活率(51.4％±5.31％)；當(dāng)moi＝10時(shí)，過表達(dá)zap組細(xì)胞存活率均數(shù)為63.7％±6.04％，顯著高于過表達(dá)gfp對照組存活率(40.5％±3.19％)；

如圖3i所示，感染m1病毒后過表達(dá)zap的hep3b細(xì)胞中m1相對病毒滴度是相應(yīng)過表達(dá)gfp對照組的31.5±11.6％。同時(shí)，感染m1病毒后過表達(dá)zap的hep3b細(xì)胞中m1病毒rna表達(dá)量是相應(yīng)過表達(dá)gfp對照組的9.5±4.7％。

實(shí)施例4m1病毒抑制zap低表達(dá)人離體活腫瘤組織(exvivo)生長

材料：

dmem高糖培養(yǎng)基、tecia(tissueculture-mttendpointcomputerimageanalysischemo-sensitivitytest)、β-actin和zap引物同實(shí)施例3之1)。

方法：

a)人離體活肝癌組織和結(jié)直腸癌組織培養(yǎng)

離體活組織由中山大學(xué)腫瘤防治中心手術(shù)切除獲得，保存于4℃，4小時(shí)內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，所有病例均經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診。在無菌條件下取出瘤組織，切成直徑0.5～1mm組織塊，放置于24孔培養(yǎng)板上，每孔4～6塊，每孔加入1mldmem培養(yǎng)基。培養(yǎng)1小時(shí)后，用藥敏試驗(yàn)專用圖像分析儀攝取腫瘤組織塊的投射照明圖像，測定比較每孔瘤塊面積(area，a)分析m1病毒對人離體活腫瘤組織的抑制作用。

b)藥物處理及組織活性測定

腫瘤組織在co2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小時(shí)，狀態(tài)穩(wěn)定后，加入10⁷pfu的m1病毒和陽性對照藥物5-氟尿嘧啶(5-fu，10mg/l),感染96小時(shí)后，加mtt(5mg/ml)50μl/孔，培養(yǎng)3小時(shí)，再用藥敏試驗(yàn)用藥敏試驗(yàn)專用圖像分析儀攝取腫瘤組織塊的漫射光照明圖像，測定每孔瘤塊被甲臜藍(lán)染的面積和顯色程度(bluearea，ba)，按下式計(jì)算組織存活率(survivalfraction，sf)：

腫瘤組織抑制率(cellinhibition，ci)：ci＝(1-sf)×100％，ba藥物處理表示m1病毒/5-fu處理組的藍(lán)染面積，a藥物處理表示m1病毒/5-fu處理組的瘤塊面積，ba對照表示溶劑對照處理組的藍(lán)染面積，a對照表示溶劑對照處理組的瘤塊面積。

c)zapmrna均一化表達(dá)量檢測

按照m1病毒對腫瘤抑制率10％為標(biāo)準(zhǔn)，將全部上述病例組織分為兩組，分別抽提樣本rna，qrt-pcr法檢測zapmrna、β-actin(內(nèi)參)水平，比較兩者zap均一化表達(dá)量的差別，采用秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析；計(jì)算zap均一化表達(dá)量方法同實(shí)施例3之1)。

結(jié)果：

a)如表2所示，在肝癌組織中，抑制率超過10％的病例比例m1病毒組為59.5％，高于5-fu組(53.8％)，證明m1病毒在有效率上高于目前臨床治療肝癌的藥物5-fu。

表2m1病毒、5-fu抑制人離體活肝癌組織存活率

b)如表3所示，在結(jié)直腸癌組織中，抑制率超過10％的病例比例m1病毒組為71.4％，高于5-fu組(61.5％)，證明m1病毒在有效率上高于目前臨床治療結(jié)直腸癌的藥物5-fu。

表3m1病毒、5-fu抑制人離體活結(jié)直腸癌組織生長

c)將上述m1病毒處理后的人離體活腫瘤組織按照抑制率10％為標(biāo)準(zhǔn)分為兩組，進(jìn)一步分析這些組織中zapmrna表達(dá)水平與抑制率的相關(guān)性。m1病毒處理抑制率超過10％的樣品組zap均一化表達(dá)量為0.117±0.890，低于抑制率小于等于10％組(0.791±0.108)，二者均數(shù)比值為0.148。如圖4所示，m1病毒處理抑制率小于等于10％的腫瘤組織zap均一化表達(dá)量中位數(shù)是0.414，大于10％的腫瘤組織zap表達(dá)量中位數(shù)為0.075。采用秩和檢驗(yàn)的方法統(tǒng)計(jì)表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p<0.05，說明m1病毒能夠選擇性的引起zap低表達(dá)/zap陰性的腫瘤組織死亡。

實(shí)施例5zap在多種腫瘤臨床病理組織中低表達(dá)

材料：

來自506位患者8張組織芯片(包括肝癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌以及配對癌旁組織)，zap抗體(thermo，usa)，aperio全自動(dòng)數(shù)字病理切片掃描儀

方法：

將來自多中心的8張組織芯片進(jìn)行免疫組化染色(ihc)，aperio掃描儀掃描并用配套軟件計(jì)算染色密度，檢測zap均一化表達(dá)量；zap均一化表達(dá)量＝視野內(nèi)zap染色強(qiáng)度/視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)目，視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)目用作均一化標(biāo)準(zhǔn)。

結(jié)果：

應(yīng)用組織免疫化學(xué)方法，發(fā)明人檢測了zap在人多種腫瘤病理樣本表達(dá)情況，圖5a顯示了人肝癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌病理組織樣本中zap的免疫組化染色代表性圖譜，zap染色在腫瘤組織中相對癌旁組織較淺。

如圖5b所示，對肝癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌和各自相應(yīng)癌旁非瘤組織zap蛋白均一化表達(dá)量的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明在上述每種腫瘤組織中平均的zap蛋白均一化表達(dá)量顯著低于各自癌旁非瘤組織，zap在腫瘤組織中低表達(dá)。全部肝癌腫瘤組織的平均zap均一化表達(dá)量為5.83±8.49，顯著低于相應(yīng)癌旁非瘤組織(11.8±11.5)，二者均值比值為0.494；全部結(jié)直腸癌腫瘤組織的平均zap均一化表達(dá)量為2.41±3.60，顯著低于相應(yīng)癌旁非瘤組織(8.30±8.94)，二者均值比值為0.290；全部膀胱癌癌腫瘤組織的平均zap均一化表達(dá)量為2.93±4.63，低于癌旁非瘤組織(10.3±8.36)，二者均值比值為0.284；

如圖5c表明，在所分析全部肝癌病例中，zap低表達(dá)的病例數(shù)占比69％；在所分析全部結(jié)直腸癌病例中，zap低表達(dá)的病例占比52％；在所分析全部膀胱癌病例中，zap低表達(dá)的病例占比61％。因此zap成為m1病毒抗腫瘤治療肝癌、結(jié)直腸癌以及膀胱癌的選擇性分子標(biāo)記。

實(shí)施例6m1病毒制備方法

材料：

非洲綠猴腎細(xì)胞vero，高糖dmem培養(yǎng)基，optipro^tmsfm培養(yǎng)基(1×)，m1病毒，100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，離心機(jī)

方法：

選擇對數(shù)生長期細(xì)胞，dmem完全培養(yǎng)基(含10％胎牛血清、1％雙抗)制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞接種在100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)。待細(xì)胞的融合度達(dá)到80％～90％時(shí)，換成optipro^tmsfm培養(yǎng)基。再加入50μl(moi＝0.01)m1病毒感染，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)大面積病變(約36小時(shí))，收集細(xì)胞上清。2000～3000rpm離心5min，小心吸出上清，混勻分裝，于-80℃冰箱保存。

上述實(shí)施例為本發(fā)明的示例性實(shí)施方式及效果說明，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均未脫離本發(fā)明的內(nèi)容，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>廣州威溶特醫(yī)藥科技有限公司

<120>甲病毒在制備抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用

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