本發(fā)明涉及細(xì)胞分裂素ortho-topolinriboside(otr)作為一種去甲基化試劑對人乳腺癌細(xì)胞株的抗腫瘤作用，屬于生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

乳腺癌是乳房腺上皮細(xì)胞在多種致癌因子作用下，發(fā)生了基因突變，致使細(xì)胞增生失控。由于癌細(xì)胞的生物行為發(fā)生了改變，呈現(xiàn)出無序、無限制的惡性增生。它的組織學(xué)表現(xiàn)形式是大量的幼稚化的癌細(xì)胞無限增殖和無序狀地?fù)頂D成團(tuán)，擠壓并侵蝕破壞周圍的正常組織，破壞乳房的正常組織結(jié)構(gòu)。乳腺細(xì)胞發(fā)生突變后便喪失了正常細(xì)胞的特性，組織結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞連接松散，癌細(xì)胞很容易脫落游離，隨血液或淋巴液等播散全身，形成早期的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，給乳腺癌的臨床治愈增加了很大困難。全身重要臟器的轉(zhuǎn)移如肺轉(zhuǎn)移、腦轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移等都將直接威脅人的生命，因此乳腺癌是嚴(yán)重危及人體生命的惡性腫瘤。乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在我國占全身各種惡性腫瘤的7％～10％，僅次于子宮頸癌，但近年來有逐年上升趨勢。乳腺癌的治療方法包括手術(shù)、化學(xué)藥物、放射以及晚近的生物治療等。近年來，乳腺癌的化療進(jìn)展圍繞新制劑和聯(lián)合用藥的發(fā)展，主要目的在于增加緩解率、減輕癥狀、延緩疾病進(jìn)程、延長無病生存期并最終改善患者的生命質(zhì)量。

乳腺癌是除非上皮來源腫瘤中女性最常見的惡性腫瘤。在美國平均每3名女性中就有一名患乳腺癌，是女性腫瘤致死中的第二大原因，給政府經(jīng)濟(jì)造成了很大的損失。目前，乳腺癌主要是以手術(shù)治療為主，而化療，放療等也作為相當(dāng)重要的輔助治療應(yīng)用于臨床。這種手術(shù)加化療的治療方法一直可以取得很好的療效，甚至于可以保住乳房。近年來，乳腺癌的化療已逐步成為其治療的首選方式，包括術(shù)后輔助化療和術(shù)前的新輔助化療。但由于化療藥物的濫用和腫瘤本身的異質(zhì)性或是其他原因，越來越多的腫瘤耐藥性報道給乳腺癌的化療帶來了很大的挑戰(zhàn)。目前流行病學(xué)調(diào)查表明，乳腺癌防治形勢不容樂觀，世界范圍內(nèi)，乳腺癌發(fā)病率已占女性惡性腫瘤發(fā)病率的第一位，并且乳腺癌的發(fā)病率每年仍在不斷增長；在我國，乳腺癌發(fā)病率每年以近3％的速度增長，已經(jīng)成為乳腺癌發(fā)病率上升速度最快的國家之一。它的發(fā)病率和致死率在女性惡性腫瘤中逐年上升，并呈年輕化趨勢。隨著治療手段和醫(yī)療技術(shù)的提高，乳腺癌的綜合治療已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)展，但目前還沒有找到有效的根治方法，乳腺癌患者的5年生存率較40年前相比，只從20％提高到目前的26％，其侵襲性和轉(zhuǎn)移率仍然很高。隨著我國人口城市化的加速，乳腺癌發(fā)生率及病死率有逐年上升的趨勢。近年來綜合治療提高了乳腺癌的治療效果，但仍有相當(dāng)一部分患者復(fù)發(fā)或?qū)ΤＲ?guī)治療耐藥。乳腺癌不僅給女性的造成身心上的痛苦，同時也給患者家庭、社會帶來了經(jīng)濟(jì)上的較大損失。因此，如何能安全、經(jīng)濟(jì)、有效的提高乳腺癌的治療效果，已成為醫(yī)學(xué)界以及乳腺癌患者群體非常關(guān)心的一個問題。隨著對惡性腫瘤發(fā)病的基因和分子機(jī)制研究的不斷深入，以腫瘤細(xì)胞中特有的結(jié)構(gòu)、功能區(qū)域、分子基團(tuán)、生物酶以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為治療位點，通過調(diào)節(jié)或阻斷這些分子功能達(dá)到治療疾病目的的靶向治療藥物已經(jīng)問世。傳統(tǒng)的治療以聯(lián)合化療為主，而患者的完全緩解率和長期無病生存率均較低，然而常用的化療藥物如阿霉素和環(huán)磷酰胺具有一系列毒副作用。因此，尋找有效提高治療效率，毒副作用小的天然藥物來治療乳腺癌是十分必要的。

近年來越來越多的研究方向定為針對乳腺癌患者的個體化治療，其中細(xì)胞凋亡的研究成為個體化治療的熱點之一。細(xì)胞增殖的幅度和細(xì)胞凋亡的幅度之間是否動態(tài)平衡決定著腫瘤組織對放化療及激素療法的反應(yīng)效果，而這些腫瘤的治療療法都與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有密切的關(guān)系。

n6-2-芐胺羥基-9-呋喃核糖基嘌呤(ortho-topolinriboside，otr)是一種存在于黎明時楊樹葉子內(nèi)合成的天然核苷類芳香族細(xì)胞分裂素。2010年根據(jù)美國國立癌癥研究中心(nic)測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，otr對人的9大瘤系60種腫瘤細(xì)胞系(nic60)具有非常顯著的體外增殖抑制活性，其中對乳腺癌細(xì)胞株的藥物敏感性較強(ic50≦10μm)。并且通過藥物體內(nèi)篩選模型-中空纖維法發(fā)現(xiàn)otr在體內(nèi)對一些腫瘤模型小鼠無明顯的急性毒性反應(yīng)。上述結(jié)果充分表明otr作為一種核苷類細(xì)胞分裂素具有很強的抗腫瘤臨床應(yīng)用潛力和臨床藥用研發(fā)價值。目前關(guān)于otr是否通過誘導(dǎo)凋亡作用并發(fā)揮抗腫瘤功效的研究尚未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了otr在人乳腺癌細(xì)胞株中抗腫瘤的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

一種誘導(dǎo)凋亡試劑在人乳腺癌細(xì)胞中的應(yīng)用，步驟如下：

(1)細(xì)胞培養(yǎng)：將人乳腺癌細(xì)胞株mcf-7懸浮于含有滅活胎牛血清的無菌rpmi1640培養(yǎng)液中，置于濃度為5％co2、相對濕度為90％、溫度為37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞長至培養(yǎng)瓶底面積的70％～80％傳代1次；

(2)藥物配制：otr用0.1％dmso溶解，繼續(xù)用無菌rpmi1640培養(yǎng)基將溶解好的otr稀釋至濃度為0.1μm～50μm，過濾除菌，室溫保存；

(3)處理細(xì)胞：將處于對數(shù)生長期的5×10³～1×10⁴個細(xì)胞接種于每孔含有100μlrpmi1640培養(yǎng)液的96孔板中，設(shè)置5組實驗，每組4個復(fù)孔，第1組：空白對照組；第2組：0.1％dmso組；第3組：1μmotr組；第4組：10μmotr組；第5組：50μmotr組，分別向各組中加入對應(yīng)的藥物，置于濃度為5％co2、相對濕度為90％、溫度為37℃的培養(yǎng)箱中孵育1～4天，細(xì)胞計數(shù)；

(4)檢測細(xì)胞增殖抑制率：將處于對數(shù)生長期的5×10³～1×10⁴個細(xì)胞接種于每孔含有100μlrpmi1640培養(yǎng)液的96孔板中，依據(jù)步驟(3)處理細(xì)胞的方法再一次處理細(xì)胞，置于濃度為5％co2、相對濕度為90％、溫度為37℃的培養(yǎng)箱中孵育1～4天，各4個復(fù)孔；采用mtt進(jìn)行檢測，每孔細(xì)胞懸液中加20μlmtt溶液，置于37℃，co2培養(yǎng)箱中孵育3h，測定490nm處各組細(xì)胞的吸光度，記錄數(shù)據(jù)；

(5)細(xì)胞亞倍體峰檢測凋亡：將生長狀態(tài)活躍的mcf-7細(xì)胞用otr處理36h后，用流式管分裝成五個樣品，按照annexinv-fitc凋亡檢測試劑盒說明書配制染色緩沖液，每個樣品加入500μl染色緩沖液37℃避光孵育30min，最后用pbs洗一次；300目篩網(wǎng)過濾后用bdfacscalibur流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，計算細(xì)胞凋亡率。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明的數(shù)據(jù)建立在otr對人的9大瘤系60種腫瘤細(xì)胞系具有非常顯著的體外增殖抑制活性，其中對乳腺癌細(xì)胞株的藥物敏感性較強的基礎(chǔ)之上。

附圖說明

圖1為細(xì)胞分裂素otr對人乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用。

圖2為不同濃度otr處理mcf-7細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目變化。2(a)對照組。2(b)10μmotr處理48h后mcf-7細(xì)胞數(shù)量變化。

圖3為otr對人乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用。3(a)對照組。3(b)10μmotr處理48h后mcf-7細(xì)胞的細(xì)胞周期。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖和技術(shù)方案，進(jìn)一步說明本發(fā)明的具體實施方式。

本發(fā)明使用的細(xì)胞、試劑盒以及試劑：人乳腺癌mcf-7細(xì)胞株，胎牛血清、谷氨酰胺(gln)、雙抗(青霉素/鏈霉素)，rpmi1640培養(yǎng)基，mtt試劑盒，annexinv-fitc/pi細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，otr。

實施例1

otr對人乳腺癌細(xì)胞的體外增殖抑制活性：將復(fù)蘇的人乳腺癌細(xì)胞mcf-7培養(yǎng)于含有10％fbs滅活胎牛血清、1％谷氨酰胺、1％青霉素/1％鏈霉素(雙抗)的無菌rpmi1640培養(yǎng)液中，置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在37℃、5％co2及飽和濕度下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞長至70％～80％左右傳代1次。繼續(xù)培養(yǎng)得到生長狀態(tài)活躍的人乳腺癌細(xì)胞，收集細(xì)胞。將處于對數(shù)生長期的5×10³個細(xì)胞接種于每孔含有100μlrpmi1640培養(yǎng)液的96孔板中，按照實驗需求，處理組分別加入0.1％dmso、0.3μm、1.5μm、15μm、30μm濃度的otr，放入培養(yǎng)箱中孵育1～4天，各4個復(fù)孔。采用mtt試劑盒進(jìn)行檢測，每孔細(xì)胞懸液中加20μlmtt溶液，置于37℃，co2培養(yǎng)箱中孵育3h。測定490nm處各組細(xì)胞的吸光度，記錄數(shù)據(jù)，采用重復(fù)測量資料的方差分析方法來分析各組數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖2所示。圖1可見，施用不同濃度的otr對人乳腺癌細(xì)胞mcf-7的增殖速率顯著低于con和dmso組，表明otr可以抑制人乳腺癌細(xì)胞mcf-7的增殖速率。

實施例2

otr誘導(dǎo)mcf-7細(xì)胞凋亡：將生長狀態(tài)活躍的mcf-7細(xì)胞用10μm的otr處理48h后，按照annexinv-fitc凋亡檢測試劑盒說明書配制染色緩沖液，每個樣品加入500μl染色緩沖液37℃避光孵育30min，最后用pbs洗一次。300目篩網(wǎng)過濾后用bdfacscalibur流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測，計算細(xì)胞凋亡率。結(jié)果如圖3所示，圖3可見，出現(xiàn)早期以及晚期凋亡細(xì)胞群。早期凋亡與對照組(1.87％)相比，otr處理組(9.43％)mcf-7細(xì)胞顯著性增加(圖3)，且晚期凋亡對照組(11.14％)也少于otr處理組(22.12％)，說明在相同實驗條件下，otr能誘導(dǎo)mcf-7細(xì)胞發(fā)生凋亡。