抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤生長的組合物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤生長的組合物及其應(yīng)用。所述組合物由提高序列表序列1所示蛋白（PTEN）表達(dá)的物質(zhì)和抑制序列表序列3所示蛋白（B）表達(dá)的物質(zhì)組成。實(shí)驗(yàn)證明，恢復(fù)蛋白PTEN協(xié)同抑制蛋白B的表達(dá)與單獨(dú)恢復(fù)蛋白PTEN的表達(dá)或單獨(dú)抑制蛋白B的表達(dá)相比，重組膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的AKT磷酸化水平明顯下調(diào)，細(xì)胞增殖、集落形成受到明顯的抑制，細(xì)胞停在G0/G1時期的比例和細(xì)胞凋亡率顯著提高；移植小鼠體內(nèi)的膠質(zhì)瘤在經(jīng)恢復(fù)蛋白PTEN協(xié)同抑制蛋白B的表達(dá)治療的第20—48天腫瘤體積沒有增長，且腫瘤重量在治療的第48天幾乎為0。本發(fā)明為神經(jīng)膠質(zhì)瘤提供了一種新的有效的聯(lián)合治療方案，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤生長的組合物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤生長的組合物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)膠質(zhì)瘤，又稱膠質(zhì)細(xì)胞瘤，簡稱膠質(zhì)瘤，是神經(jīng)上皮或支持細(xì)胞所衍生。腦膠質(zhì)瘤起源于腦部神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是成人中最常見的原發(fā)性腦腫瘤，占顱腦腫瘤比例的40-50%ο腦部神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞由星形細(xì)胞(astrocytoma)、室管腔細(xì)胞(ependymal)和寡樹突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞共同組成。在腦膠質(zhì)瘤中，起源于星形膠質(zhì)細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的星形細(xì)胞瘤具有最高發(fā)病率。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)和病人的存活情況，星形細(xì)胞瘤被分為四個等級:纖維性星形細(xì)胞瘤(I級)，彌漫性星形細(xì)胞瘤(II級)，間變性星形細(xì)胞瘤(III級)，多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM，IV級)。其中，間變性星形細(xì)胞瘤和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤屬于惡性膠質(zhì)瘤，而且預(yù)后不佳。尤其是多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，盡管采取手術(shù)，放療以及化療的聯(lián)合治療，病人也只有不到12個月的生存期。
[0003]神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的多藥耐藥性是化療失敗的最主要原因。研究發(fā)現(xiàn)在GBM型腦膠質(zhì)瘤中，染色體7p的擴(kuò)增和染色體IOq上的等位基因丟失頻繁地發(fā)生。更進(jìn)一步研究表明染色體7p的擴(kuò)增源于EGFR (epidermal growth factor receptor)蛋白的上調(diào)表達(dá)而染色體IOq丟失的基因則是腫瘤抑制基因PTEN(phosphatase and tensinhomologue)。EGFR的擴(kuò)增和PTEN的丟失，導(dǎo)致了 PI3K/AKT信號通路的過度活躍，這可能是GBM高度惡性表型和化療耐藥性的重要原因。因此，PI3K/AKT信號通路的過度激活和腦膠質(zhì)瘤的形成與發(fā)展之間的關(guān)系將成為很有吸引力的GBM基因治療研究內(nèi)容。

【發(fā)明內(nèi)容】

`[0004]本發(fā)明的目的是提供一種抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤生長的組合物及其應(yīng)用。
[0005]所述組合物由如下A)和B)兩種物質(zhì)組成:
[0006]A)在離體細(xì)胞中表達(dá)PTEN蛋白的物質(zhì)；
[0007]B)抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中pllO β蛋白表達(dá)的物質(zhì)。
[0008]所述Α)物質(zhì)可為PTEN蛋白、PTEN蛋白的編碼基因或編碼PTEN蛋白的載體；
[0009]所述Α)物質(zhì)和所述B)物質(zhì)分別獨(dú)立包裝。
[0010]在上述組合物中，所述PTEN蛋白具體可為序列表序列I所示蛋白；所述ρΙΙΟβ蛋白具體可為序列表序列3所不蛋白。
[0011]PTEN蛋白是腫瘤抑制基因PTEN所表達(dá)的蛋白，PllO β蛋白是PIK3CB基因所表達(dá)的ΡΙ3Κ β亞型脂激酶的一個催化亞單位pllO。
[0012]在上述組合物中，所述A)物質(zhì)為含有所述PTEN蛋白編碼基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、重組細(xì)胞或重組病毒；
[0013]所述B)物質(zhì)為所述pllO β蛋白的抑制劑，該抑制劑可為抑制所述ρΙΙΟβ蛋白表達(dá)的干擾RNA、所述干擾RNA的編碼基因或含有所述干擾RNA的編碼基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體或重組細(xì)胞；也可為磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑如LY294002或Wortmannin。
[0014]磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)為一種由調(diào)節(jié)亞單位p85或plOl和催化亞單位pllO組成的脂激酶，通過催化磷脂酰肌醇4，5- 二磷酸(PIP2)磷酸化為磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸(PIP3)而激活下游的Akt等從而對細(xì)胞的增殖、生存和代謝等起關(guān)鍵作用。
[0015]在上述組合物中，所述A)物質(zhì)中的所述PTEN蛋白的編碼基因?yàn)樾蛄斜硇蛄?所示的DNA分子；
[0016]所述B)物質(zhì)中的所述干擾RNA為短發(fā)夾RNA或由所述短發(fā)夾RNA衍生的小干擾RNA ；
[0017]所述短發(fā)夾RNA的核苷酸序列由一個莖環(huán)序列及兩個分別位于所述莖環(huán)序列兩側(cè)的反向重復(fù)序列組成，所述兩個反向重復(fù)序列分別為序列表序列5和序列表序列6所示序列。
[0018]在上述組合物中，所述A)物質(zhì)中的所述重組表達(dá)載體是將所述PTEN蛋白編碼基因插入載體pRetro-on的BamH I和NotI位點(diǎn)間得到的重組載體；
[0019]所述B)物質(zhì)中的所述由所述短發(fā)夾RNA衍生的小干擾RNA —條鏈的核苷酸序列如序列表序列5所示，另一條鏈的核苷酸序列如序列表序列6所示；
[0020]在上述組合物中，所述B)物質(zhì)中的所述干擾RNA的編碼基因?yàn)橛尚蛄斜硇蛄?和序列表序列8的單鏈DNA組成的雙鏈DNA分子。
[0021]在上述組合物中，所述B)物質(zhì)中的所述重組表達(dá)載體為將所述干擾RNA的編碼基因插入載體PRNAT-U6.Ι/Neo的BamH I和Hind III位點(diǎn)間得到的重組載體。
[0022]本發(fā)明保護(hù)上述任一所`述組合物在制備下述任一所述產(chǎn)品(或藥物)中的應(yīng)用:
[0023]I)降低神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的AKT磷酸化水平的產(chǎn)品(或藥物)；
[0024]2)抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和/或集落形成的產(chǎn)品(或藥物);
[0025]3)抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期進(jìn)程(或提高神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞停在G0/G1時期的比例)的產(chǎn)品(或藥物);
[0026]4)促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的產(chǎn)品(或藥物)；
[0027]5)抑制動物體內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤生長的產(chǎn)品(或藥物)。
[0028]本發(fā)明所述神經(jīng)膠質(zhì)瘤或神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞為缺失序列表序列I所示蛋白的神經(jīng)膠質(zhì)瘤或神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述神經(jīng)膠質(zhì)瘤或神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞來源于人類U251膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株或SHG-44膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株。
[0029]本發(fā)明還保護(hù)抑制所述pllO β蛋白表達(dá)的干擾RNA、所述干擾RNA的編碼基因或含有所述干擾RNA的編碼基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體或重組細(xì)胞。
[0030]所述干擾RNA可為短發(fā)夾RNA或由所述短發(fā)夾RNA衍生的小干擾RNA ；
[0031]所述短發(fā)夾RNA的核苷酸序列由一個莖環(huán)序列及兩個分別位于所述莖環(huán)序列兩側(cè)的反向重復(fù)序列組成，所述兩個反向重復(fù)序列分別為序列表序列5和序列表序列6所示序列；
[0032]所述小干擾RNA —條鏈的核苷酸序列如序列表序列5所示，另一條鏈的核苷酸序列如序列表序列6所示；
[0033]所述干擾RNA的編碼基因具體可為由序列表序列7和序列表序列8的單鏈DNA組成的雙鏈DNA分子。[0034]實(shí)驗(yàn)證明，恢復(fù)蛋白PTEN (序列表序列I所示蛋白)協(xié)同抑制PllO β蛋白(序列表序列3所示蛋白，簡稱蛋白B)的表達(dá)與單獨(dú)恢復(fù)蛋白PTEN的表達(dá)或單獨(dú)抑制蛋白B的表達(dá)相比，重組膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的AKT磷酸化水平明顯下調(diào)，細(xì)胞增殖、集落形成受到明顯的抑制，細(xì)胞停在G0/G1時期的比例和細(xì)胞凋亡率顯著提高；移植小鼠體內(nèi)的膠質(zhì)瘤在經(jīng)恢復(fù)蛋白PTEN協(xié)同抑制蛋白B的表達(dá)治療的第20— 48天腫瘤容積沒有增長，且腫瘤重量在治療的第48天幾乎為O。本發(fā)明為神經(jīng)膠質(zhì)瘤提供了一種新的有效的聯(lián)合治療方案，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1為各重組膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中目的基因或蛋白的表達(dá)檢測。其中，圖A為Westernblot檢測轉(zhuǎn)染PTEN基因的重組表達(dá)載體后的重組膠質(zhì)瘤細(xì)胞系UP中PTEN表達(dá)，左側(cè)泳道為對照U251，右側(cè)泳道為UP ;圖B為實(shí)時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染PIK3CA基因的RNA干擾重組表達(dá)載體后的重組膠質(zhì)瘤細(xì)胞系UA中PIK3CA基因的相對表達(dá)量，UC為對照；圖C為實(shí)時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染PIK3CB基因的RNA干擾重組表達(dá)載體后的重組膠質(zhì)瘤細(xì)胞系Ul和U2中PIK3CB基因的相對表達(dá)量，UC為對照。
[0036]圖2為Western blot檢測重組膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中AKT的磷酸化水平。其中，圖A為Western blot結(jié)果，圖B為各重組膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的ρ-ΑΚΤ/ΑΚΤ值相對于對照UPC，中ρ-ΑΚΤ/ΑΚΤ值的百分比。
[0037]圖3為培養(yǎng)I一6天時各重組膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的細(xì)胞存活率。
[0038]圖4為各重組膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的集落形成分析。其中，圖A為克隆形成的熒光照片，標(biāo)尺代表500 μ m，圖B為相對克隆數(shù)，**表示兩組數(shù)據(jù)在P < 0.01有極顯著差異。
[0039]圖5為各重組膠質(zhì)瘤細(xì)胞系錨地依賴性的集落形成分析。其中，圖A為克隆形成的結(jié)晶紫染色圖，圖B為相對克·隆數(shù)，**表示兩組數(shù)據(jù)在P < 0.01有極顯著差異。
[0040]圖6為各重組膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的細(xì)胞周期檢測。其中，圖A為流式細(xì)胞圖，圖B為不同細(xì)胞周期所占比例的柱形統(tǒng)計圖。
[0041]圖7為各重組膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡檢測。其中，圖A為經(jīng)Annexin V-PE試劑處理的流式細(xì)胞圖；圖B為DAPI染色的細(xì)胞核形態(tài)圖，標(biāo)尺代表250 μ m ;圖C為細(xì)胞凋亡率的柱形統(tǒng)計圖，**表示兩組數(shù)據(jù)在P < 0.01有極顯著差異。
[0042]圖8為各重組膠質(zhì)瘤細(xì)胞系移植小鼠體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果。其中，圖A為移植第48天的小鼠外觀；圖13為移植第20—48天小鼠體內(nèi)腫瘤體積變化線形圖；圖C為移植第48天小鼠體內(nèi)腫瘤重量的柱形統(tǒng)計圖；*表示與UPC’相比差異顯著(P < 0.05) 表示與UPC’相比差異極顯著(P < 0.01)。
【具體實(shí)施方式】
[0043]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0044]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0045]下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)均設(shè)置三次重復(fù)，結(jié)果取平均值。
[0046]實(shí)施例1、RNA干擾重組表達(dá)載體構(gòu)建
[0047]1、RNA干擾靶序列的選擇[0048]I)針對序列表序列3所示蛋白(簡稱為蛋白B)的全長cDNA序列(如序列表序列4所示，即PIK3CB基因)，選擇如下兩段DNA序列為RNA干擾抑制序列表序列3所示蛋白表達(dá)的靶序列:
[0049]sh-Ι:序列表序列 4 的第 1166-1184 位(SP 5’ -CCACTGGAATTTGATATTA-3 ’ )；
[0050]sh-2:序列表序列 4 的第 439-457 位(B卩 5’ -GGATCCTGAAGTAAATGAA-3’ )；
[0051]序列表序列4中第17位至第3229位為開放閱讀框，編碼序列表序列3所示的蛋白，該蛋白為PI3K β亞型脂激酶的一個催化亞單位pllO。
[0052]2)針對PI3K α亞型脂激酶的一個催化亞單位pllO (簡稱為蛋白A)的全長cDNA序列(NCBI號:NM_002645，即PIK3CA基因)，選擇如下一段DNA序列為RNA干擾抑制該蛋白表達(dá)的靶序列:
[0053]sh-A: 5，-CCACTGGAATTTGATATTA-3，。
[0054]3)對照:不針對任何人類基因，選擇如下一段DNA序列為RNA干擾的對照靶序列:
[0055]sh-C: 5，-GTGGACTCTTGAAAGTACTAT-3，。
[0056]2、小干擾 RNA (siRNA)
[0057]根據(jù)步驟I的靶序列，抑制蛋白B表達(dá)的兩種siRNA (siRNA-1和siRNA_2)的序列如下:
[0058]I) siRNA-Ι
[0059]siRNA-1-F:5’ -CCACUGGAAUUUGAUAUUA-3，；
`[0060]siRNA-1-R:5，-UAAUAUCAAAUUCCAGUGG-3，；
[0061]2) siRNA-2
[0062]siRNA-2-F:5’ -GGAUCCUGAAGUAAAUGAA-3’(序列表序列 5 所示)；
[0063]siRNA-2-R:5’ -UUCAUUUACUUCAGGAUCC-3’(序列表序列 6 所示)。
[0064]根據(jù)步驟I的靶序列，抑制蛋白A表達(dá)的siRNA (siRNA-A)的序列如下:
[0065]3) siRNA-A
[0066]siRNA-A-F:5，-CCACUGGAAUUUGAUAUUA-3，；
[0067]siRNA-A-R:5，-UAAUAUCAAAUUCCAGUGG-3，；
[0068]根據(jù)步驟I的靶序列，對照的siRNA (siRNA-C)的序列如下:
[0069]4) siRNA-C
[0070]siRNA-C-F:5，-GUGGACUCUUGAAAGUACUAU-3，；
[0071]siRNA-C-R:5，-AUAGUACUUUCAAGAGUCCAC-3，。
[0072]3、短發(fā)夾 RNA (shRNA)
[0073]衍生步驟2所示siRNA的shRNA的序列分別如下(小寫字母表示莖環(huán)序列，大寫字母表示兩個短的反向重復(fù)序列):
[0074]I) shRNA-Ι (衍生 siRNA-Ι):
[0075]5， -CCACUGGAAUUUGAUAUUAaactcgagttUAAUAUCAAAUUCCAGUGG-3，；
[0076]2) shRNA-2 (衍生 siRNA-2):
[0077]5， -GGAUCCUGAAGUAAAUGAAaactcgagttUUCAUUUACUUCAGGAUCC-3，；
[0078]3) shRNA-A (衍生 siRNA-A):
[0079]5，-CCACUGGMUUUGAUAUUAaactcgagttUMUAUCAMUU(XAGUGG-3，；[0080]4) shRNA-C (衍生 siRNA-C):
[0081 ]5，-GUGGACUCUUGAMGUACUAUaactcgagttAUAGUACUUUCMGAGU(XAC-3，。
[0082]4、編碼siRNA及shRNA的DNA分子的設(shè)計與合成
[0083]I)以sh-Ι為靶點(diǎn)的表達(dá)shRNA-Ι的雙鏈DNA分子(DNA-1)的兩條單鏈DNA序列如下:
[0084]DNA-1-F:
[0085]5’-gatccCCACTGGAATTTGATATTAaactcgagttTAATATCAAATTCCAGTGGttttttggaaa_3，
[0086]DNA-1-R:
[0087]5’-agcttttccaaaaaaCCACTGGAATTTGATATTAaactcgagttTAATATCAAATTCCAGTGG￡-3，
[0088]2)以sh-2為靶點(diǎn)的表達(dá)shRNA-2的雙鏈DNA分子(DNA-2)的兩條單鏈DNA序列如下:
[0089]DNA-2-F:
[0090]5’-gatccGGATCCTGAAGTAAATGAAaactcgagttTTCATTTACTTCAGGATCCttttttggaaa-3'(序列表序列7所示)；
[0091]DNA-2-R:
[0092]5’-agcttttccaaaaaaGGATCCTGAAGTAAATGAAaactcgagttTTCATTTACTTCAGGATCC￡-3’(序列表序列8所示)；
[0093]3)以sh-A為靶點(diǎn)的表達(dá)shRNA-A的雙鏈DNA分子(DNA-A)的兩條單鏈DNA序列如下:
[0094]DNA-A-F:
[0095]5’-gatccGCCACTGGAATTTGATATTAaactcgagttTAATATCAAATTCCAGTGGttttttggaaa_3
[0096]DNA-A-R:
[0097]5’-agcttttccaaaaaaCCACTGGAATTTGATATTAaactcgagttUAAUAUCAAATTCCAGTGG￡-3，
[0098]4)以sh-C為靶點(diǎn)的表達(dá)shRNA-C的雙鏈DNA分子(DNA-C)的兩條單鏈DNA序列如下:
[0099]DNA-C-F:
[0100]5’-gatccGUGGACUCUUGAAAGUACUAUaactcgagttAUAGUACUUUCAAGAGUCCACttttttggaaa-3';
[0101]DNA-C-R:
[0102]5’-agcttttccaaaaaaGUGGACUCUUGAAAGUACUAUaactcgagttAUAGUACUUUCAAGAGUCCAQg-3，。
[0103]5、RNA干擾重組表達(dá)載體構(gòu)建
[0104]I)分別取步驟4中合成的互補(bǔ)的單 鏈DNA混合，退火獲得四種雙鏈DNA分子，分別取這四種雙鏈DNA進(jìn)行磷酸化處理，獲得四種雙鏈DNA反應(yīng)體；
[0105]2)取載體pRNAT-U6.Ι/Neo(南京金斯瑞生物科技有限公司)先用BamH I和HindIII酶切后，回收PRNAT-U6.Ι/Neo的載體骨架片段；
[0106]3)將步驟2)獲得的pRNAT-U6.Ι/Neo的載體骨架片段與步驟I)獲得的四種雙鏈DNA反應(yīng)體分別連接，得到四種RNA干擾重組表達(dá)載體pRNA1-sh-1、pRNA1-sh_2、pRNAi_sh_A 和 pRNAi_sh_C ;經(jīng)測序證實(shí),載體 pRNAi_sh_l 為載體 pRNAT_U6.1/Neo 的 BamH
I和Hind III位點(diǎn)間插入了步驟4的雙鏈DNA分子DNA-1獲得的重組載體；載體pRNA1-sh_2為載體pRNAT-U6.Ι/Neo的BamH I和Hind III位點(diǎn)間插入了步驟4的雙鏈DNA分子DNA-2獲得的重組載體；載體pRNA1-sh-A為載體pRNAT-U6.Ι/Neo的BamHI和Hind III位點(diǎn)間插入了步驟4的雙鏈DNA分子DNA-A獲得的重組載體；載體pRNA1-sh_C為載體pRNAT_U6.1/Neo的BamH I和Hind III位點(diǎn)間插入了步驟4的雙鏈DNA分子DNA-C獲得的重組載體。
[0107]實(shí)施例2、蛋白PTEN的重組表達(dá)載體構(gòu)建
[0108]將蛋白PTEN (如序列表序列I所不)的編碼基因(如序列表序列2所ττΟ插入到多西環(huán)素誘導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pRetro-on (BD Clontech公司)的BamH I和NotI位點(diǎn)間，獲得重組表達(dá)載體PTEN/pRetro-on,經(jīng)測序證實(shí),載體PTEN/pRetro-on是在pRetro-on的BamH I和NotI位點(diǎn)間插入了序列表序列2所示的DNA分子。
[0109]實(shí)施例3、恢復(fù)蛋白PTEN協(xié)同抑制蛋白B的表達(dá)對重組膠質(zhì)瘤細(xì)胞中AKT磷酸化水平的影響
[0110]人類U251膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(U251):在中國典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫的編號為 3115CNCB00312 ；
[0111]人類SHG-44膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(SHG-44):中國科學(xué)院細(xì)胞庫，目錄編號為TCHu48 ；
·[0112]U251和SHG-44均為PTEN缺失的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株；
[0113]實(shí)施例3— 5的重組膠質(zhì)瘤細(xì)胞除特別說明外的培養(yǎng)條件如下:
[0114]培養(yǎng)基:DMEM培養(yǎng)基(Gibco，貨號12800-017)，輔以10%熱滅活胎牛血清(FBS)，4mM谷氨酰胺,50units/ml青霉素和50 μ g/ml鏈霉素；
[0115]培養(yǎng)條件:37 °C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0116]1、穩(wěn)定重組膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的構(gòu)建
[0117]將實(shí)施例2獲得的載體PTEN/pRetro-on用Pheonix細(xì)胞(Orbingen)包裝,取病毒上清液在MOI=I (即感染時病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值為I)下感染U251細(xì)胞；感染的細(xì)胞在添加I μ g/ml嘌呤霉素的培養(yǎng)基中篩選直到未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞完全消失，獲得了含有載體PTEN/pRetro-on的U251重組膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(命名為UP)。
[0118]按Iipofectamine 2000 (Invitrogen)試劑說明書將實(shí)施例1步驟5獲得的四種 RNA 干擾重組表達(dá)載體 pRNA1-sh-1、pRNAi_sh_2、pRNA1-sh-A 和 pRNAi_sh_C 分別按照
2μ g:1 X 106個細(xì)胞的比例轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞或含有載體PTEN/pRetro-on的U251重組膠質(zhì)瘤細(xì)胞，用添加了 600 μ g/ml G418的培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，獲得表1所示的重組膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。
[0119]表1.重組膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中所含有的載體
[0120]
【權(quán)利要求】
1.一種抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤生長的組合物，由如下A)和B)兩種物質(zhì)組成: A)在離體細(xì)胞中表達(dá)PTEN蛋白的物質(zhì)； B)抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中pllOβ蛋白表達(dá)的物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于:所述PTEN蛋白為序列表序列I所示蛋白；所述ρΙΙΟβ蛋白為序列表序列3所不蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組合物，其特征在于: 所述Α)物質(zhì)為含有所述PTEN蛋白編碼基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、重組細(xì)胞或重組病毒; 所述B)物質(zhì)為抑制所述pllO β蛋白表達(dá)的干擾RNA、所述干擾RNA的編碼基因或含有所述干擾RNA的編碼基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體或重組細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于: 所述Α)物質(zhì)中的所述PTEN蛋白的編碼基因?yàn)樾蛄斜硇蛄?所不的DNA分子；所述B)物質(zhì)中的所述干擾RNA為短發(fā)夾RNA或由所述短發(fā)夾RNA衍生的小干擾RNA ；所述短發(fā)夾RNA的核苷酸序列由一個莖環(huán)序列及兩個分別位于所述莖環(huán)序列兩側(cè)的反向重復(fù)序列組成，所述兩個反向重復(fù)序列分別為序列表序列5和序列表序列6所示序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的組合物，其特征在于:` 所述Α)物質(zhì)中的所述重組表達(dá)載體是將所述PTEN蛋白編碼基因插入載體pRetro-on的BamH I和NotI位點(diǎn)間得到的重組載體； 所述B)物質(zhì)中的所述由所述短發(fā)夾RNA衍生的小干擾RNA —條鏈的核苷酸序列如序列表序列5所示，另一條鏈的核苷酸序列如序列表序列6所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一所述的組合物，其特征在于: 所述B)物質(zhì)中的所述干擾RNA的編碼基因?yàn)橛尚蛄斜硇蛄?和序列表序列8的單鏈DNA組成的雙鏈DNA分子。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6中任一所述的組合物，其特征在于: 所述B)物質(zhì)中的所述重組表達(dá)載體為將所述干擾RNA的編碼基因插入載體PRNAT-U6.Ι/Neo的BamH I和Hind III位點(diǎn)間得到的重組載體。
8.權(quán)利要求1-7中任一所述組合物在制備下述任一所述產(chǎn)品中的應(yīng)用: O降低神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的AKT磷酸化水平的產(chǎn)品； 2)抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和/或集落形成的產(chǎn)品； 3)抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期進(jìn)程的產(chǎn)品； 4)促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的產(chǎn)品； 5 )抑制動物體內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的產(chǎn)品。
9.抑制pllOβ蛋白表達(dá)的干擾RNA、所述干擾RNA的編碼基因或含有所述干擾RNA的編碼基因的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體或重組細(xì)胞； 所述ρΙΙΟβ蛋白具體可為序列表序列3所不蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的干擾RNA，其特征在于:所述干擾RNA為短發(fā)夾RNA或由所述短發(fā)夾RNA衍生的小干擾RNA ； 所述短發(fā)夾RNA的核苷酸序列由一個莖環(huán)序列及兩個分別位于所述莖環(huán)序列兩側(cè)的反向重復(fù)序列組成，所述兩個反向重復(fù)序列分別為序列表序列5和序列表序列6所示序列； 所述小干擾RNA —條鏈的核苷酸序列如序列表序列5所示，另一條鏈的核苷酸序列如序列表序列6所示； 所述干擾RNA的編碼基因具體可為由序列表序列7和序列表序列8的單鏈DNA組成的雙鏈DNA分子。`
【文檔編號】A61P35/00GK103784962SQ201210429837
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年11月1日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月1日
【發(fā)明者】黃來強(qiáng), 陳紅波, 申曉萌, 周蘭貞, 鄭義, 梅林 , 王麗君 申請人:清華大學(xué)深圳研究生院