本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2012年4月27日的申請(qǐng)?zhí)枮?01280020407.x(pct申請(qǐng)?zhí)枺簆ct/us2012/035431)、發(fā)明名稱為“用于誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的致耐受性合成納米載體”的分案申請(qǐng)。

相關(guān)申請(qǐng)

本申請(qǐng)根據(jù)美國(guó)法典第35篇第119條要求2011年4月29日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/480,946、2011年7月29日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/513,514、2011年9月6日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/531,147、2011年9月6日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/531,153、2011年9月6日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/531,164、2011年9月6日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/531,168、2011年9月6日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/531,175、2011年9月6日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/531,180、2011年9月6日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/531,194、2011年9月6日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/531,204、2011年9月6日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/531,209、2011年9月6日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/531,215的權(quán)益，這些臨時(shí)申請(qǐng)各自的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用結(jié)合在此。

本發(fā)明涉及給予具有免疫抑制劑和一種抗原的b細(xì)胞表位和/或mhcii類限制性表位的合成納米載體組合物的方法，其中這些組合物可以產(chǎn)生調(diào)節(jié)性b細(xì)胞；以及有關(guān)組合物。這些方法允許通過(guò)apc有效攝取來(lái)使免疫應(yīng)答向有利于對(duì)抗原特異的調(diào)節(jié)性b細(xì)胞發(fā)展的方向轉(zhuǎn)變。

背景技術(shù)：

用于產(chǎn)生與所不希望的免疫應(yīng)答相關(guān)聯(lián)的免疫抑制的常規(guī)策略是基于廣泛作用的免疫抑制性藥物。另外，為了維持免疫抑制，免疫抑制劑藥物療法通常是一個(gè)終生的命題。令人遺憾的是，使用廣泛作用的免疫抑制劑與嚴(yán)重副作用(如腫瘤、感染、腎毒性以及代謝紊亂)的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)。因此，新的免疫抑制劑療法將是有益的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在一方面，提供了一種包括向受試者給予一種組合物的方法，該組合物包含：(i)第一群體的合成納米載體和(ii)第二群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，這些第二群體的合成納米載體與一種抗原的b細(xì)胞表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)。在另一方面，提供了一種包括通過(guò)給予一種組合物而在受試者中產(chǎn)生抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的方法，該組合物包含：(i)第一群體的合成納米載體和(ii)第二群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，這些第二群體的合成納米載體與一種抗原的b細(xì)胞表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)。在另一方面，提供了一種包括根據(jù)一個(gè)治療方案向受試者給予一種組合物的方法，該治療方案先前已經(jīng)顯示在一個(gè)或多個(gè)測(cè)試受試者中產(chǎn)生抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞；其中該組合物包含：(i)第一群體的合成納米載體和(ii)第二群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，這些第二群體的合成納米載體與一種抗原的b細(xì)胞表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施例中，該組合物處于在受試者中有效產(chǎn)生抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的量。在另一個(gè)實(shí)施例中，該組合物處于在受試者中有效產(chǎn)生抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的量。

在一個(gè)實(shí)施例中，該第一群體和該第二群體是相同的群體。在另一個(gè)實(shí)施例中，該第一群體和第二群體是不同的群體。

在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括提供或鑒定受試者。

在另一個(gè)實(shí)施例中，該抗原是一種治療性蛋白、一種自身抗原或一種過(guò)敏原，或與一種炎性疾病、一種自身免疫性疾病、器官或組織排斥、或移植物抗宿主病相關(guān)聯(lián)。

在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括在給予該組合物之前和/或之后評(píng)定受試者中的抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的產(chǎn)生。

在另一個(gè)實(shí)施例中，該受試者具有或正處于具有一種炎性疾病、一種自身免疫性疾病、一種過(guò)敏癥、器官或組織排斥、或移植物抗宿主病的風(fēng)險(xiǎn)中。在另一個(gè)實(shí)施例中，該受試者已經(jīng)歷或?qū)⒁?jīng)歷移植。在另一個(gè)實(shí)施例中，該受試者具有或正處于具有針對(duì)一種治療性蛋白的所不希望的免疫應(yīng)答的風(fēng)險(xiǎn)中，該治療性蛋白是正被給予或?qū)⒁唤o予該受試者的。

在另一個(gè)實(shí)施例中，向該受試者給予一個(gè)或多個(gè)維持劑量的包含該第一群體和第二群體的合成納米載體的組合物。

在另一個(gè)實(shí)施例中，該給予是通過(guò)靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、透粘膜、經(jīng)口、皮下、肺部、鼻內(nèi)、皮內(nèi)或肌肉內(nèi)給予而進(jìn)行的。在另一個(gè)實(shí)施例中，該給予是通過(guò)吸入或靜脈內(nèi)、皮下或透粘膜給予而進(jìn)行的。

在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括給予一種可移植的移植物或治療性蛋白。在另一個(gè)實(shí)施例中，當(dāng)該治療性蛋白作為一個(gè)或多個(gè)單元被提供時(shí)，該可移植的移植物或治療性蛋白的給予是通過(guò)腸胃外、動(dòng)脈內(nèi)、鼻內(nèi)或靜脈內(nèi)給予或通過(guò)注射至淋巴結(jié)或眼前房或通過(guò)局部給予至感興趣的器官或組織而進(jìn)行的。

在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括收集所產(chǎn)生的這些抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞。

在另一個(gè)實(shí)施例中，這些免疫抑制劑包括一種抑制素、一種mtor抑制劑、一種tgf-β信號(hào)劑、一種皮質(zhì)類固醇、一種線粒體功能抑制劑、一種p38抑制劑、一種nf-κβ抑制劑、一種腺苷受體激動(dòng)劑、一種前列腺素e2激動(dòng)劑、一種磷酸二酯酶4抑制劑、一種hdac抑制劑或一種蛋白酶體抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，該mtor抑制劑是雷帕霉素或一種雷帕霉素類似物。

在另一個(gè)實(shí)施例中，平均在這些第一和/或第二群體的合成納米載體上的免疫抑制劑和/或抗原的負(fù)載是在0.0001％與50％之間(重量/重量)。在另一個(gè)實(shí)施例中，平均在這些第一和/或第二群體的合成納米載體上的免疫抑制劑和/或抗原的負(fù)載是在0.1％與10％之間(重量/重量)。

在另一個(gè)實(shí)施例中，該第一群體和/或第二群體的合成納米載體包括脂質(zhì)納米顆粒、聚合物納米顆粒、金屬納米顆粒、基于表面活性劑的乳液、樹(shù)枝狀化合物、巴基球(buckyball)、納米線、病毒樣顆粒或肽或蛋白質(zhì)顆粒。在另一個(gè)實(shí)施例中，該第一群體和/或第二群體的合成納米載體包括脂質(zhì)納米顆粒。在另一個(gè)實(shí)施例中，該第一群體和/或第二群體的合成納米載體包括脂質(zhì)體。在另一個(gè)實(shí)施例中，該第一群體和/或第二群體的合成納米載體包括金屬納米顆粒。在另一個(gè)實(shí)施例中，這些金屬納米顆粒包括金納米顆粒。在另一個(gè)實(shí)施例中，該第一群體和/或第二群體的合成納米載體包括聚合物納米顆粒。在另一個(gè)實(shí)施例中，該聚合物納米顆粒包含聚合物，該聚合物是一種非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。在另一個(gè)實(shí)施例中，這些聚合物納米顆粒包含聚酯、與一種聚醚偶聯(lián)的聚酯、聚氨基酸、聚碳酸酯、聚縮醛、聚縮酮、多糖、聚乙基噁唑啉、或聚乙烯亞胺。在另一個(gè)實(shí)施例中，聚酯包括聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物或聚己酸內(nèi)酯。在另一個(gè)實(shí)施例中，這些聚合物納米顆粒包含聚酯和與聚醚偶聯(lián)的聚酯。在另一個(gè)實(shí)施例中，該聚醚包括聚乙二醇或聚丙二醇。

在另一個(gè)實(shí)施例中，使用對(duì)該第一和/或第二群體的合成納米載體進(jìn)行的動(dòng)態(tài)光散射而獲得的粒度分布的平均值是大于100nm的直徑。在另一個(gè)實(shí)施例中，該直徑大于150nm。在另一個(gè)實(shí)施例中，該直徑大于200nm。在另一個(gè)實(shí)施例中，該直徑大于250nm。在另一個(gè)實(shí)施例中，該直徑大于300nm。在另一個(gè)實(shí)施例中，該第一群體和/或第二群體的合成納米載體的長(zhǎng)寬比大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7或1∶10。

在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括制造一種劑型，該劑型包含收集的這些抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括制造可供受試者給予的這些收集的抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞或劑型。

在另一個(gè)實(shí)施例中，這些第二群體的合成納米載體還與包含mhci限制性表位的抗原偶聯(lián)。

在另一方面，提供了一種組合物，該組合物包含根據(jù)在此提供的任何方法產(chǎn)生的分離的抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞。

在另一個(gè)實(shí)施例中，該組合物進(jìn)一步包含一種藥學(xué)上可接受的賦形劑。

在另一方面，提供了一種包含在此提供的任何這些組合物的劑型。

在另一方面，提供了一種組合物，該組合物包含供在治療或預(yù)防中使用的分離的抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞，所述分離的抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞通過(guò)一種工藝可獲得，該工藝包括以下步驟：(a)通過(guò)給予一種組合物而在受試者中產(chǎn)生抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞，該組合物包含(i)第一群體的合成納米載體和(ii)第二群體的合成納米載體，這些第一種群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，這些第二群體的合成納米載體與一種抗原的b細(xì)胞表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)；并且(b)收集所產(chǎn)生的這些抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，該組合物是在此提供的或所提供的任何這些方法中使用的任何組合物。

在另一方面，提供了一種供在治療或預(yù)防中使用的組合物，該組合物包含：(i)第一群體的合成納米載體和(ii)第二群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，這些第二群體的合成納米載體與一種抗原的b細(xì)胞表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施例中，該組合物是在此提供的或所提供的任何方法中使用的任何組合物。

在另一方面，所提供的任何組合物都可以供在治療或預(yù)防中使用。

在另一方面，所提供的任何組合物可以用于在受試者中促進(jìn)一種致耐受性免疫應(yīng)答或產(chǎn)生抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞中使用。

在另一方面，提供了一種所提供的任何組合物或劑型用于制造一種藥劑的用途，該藥劑用于在受試者中促進(jìn)一種致耐受性免疫應(yīng)答或產(chǎn)生抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞中使用。

在另一個(gè)實(shí)施例中，該組合物進(jìn)一步包含一種可移植的移植物或治療性蛋白。

在另一方面，提供了一種包含所提供的任何組合物的劑型。

在另一方面，提供了一種方法，該方法包括：(i)產(chǎn)生第一群體的合成納米載體和(ii)產(chǎn)生第二群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，這些第二群體的合成納米載體與一種抗原的b細(xì)胞表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施例中，該組合物處于在受試者中有效產(chǎn)生抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的量。在另一個(gè)實(shí)施例中，該第一群體和第二群體是相同的群體。在另一個(gè)實(shí)施例中，該第一群體和第二群體是不同的群體。

在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括制造一種包含該第一群體和第二群體的合成納米載體的劑型。

在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括制造一種包含該第一群體和第二群體的合成納米載體的組合物、或可供受試者給予的劑型。

在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括對(duì)使用一種包含該第一群體和第二群體的合成納米載體的組合物的抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的產(chǎn)生進(jìn)行評(píng)定。

在另一個(gè)實(shí)施例中，產(chǎn)生的該第一群體和第二群體的合成納米載體是如在此提供的任何這些組合物和方法中所定義的。

在另一方面，提供了一種用于生產(chǎn)組合物或劑型的工藝，該工藝包括以下步驟：(i)將第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，并且(ii)將第二群體的合成納米載體與一種抗原的b細(xì)胞表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施例中，該組合物或劑型處于在受試者中有效產(chǎn)生調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的量。在一個(gè)實(shí)施例中，這些步驟如在此提供的任何方法中所定義。

在另一方面，提供了一種通過(guò)在此提供的任何這些方法或工藝可獲得的組合物或劑型。

在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括使一種可移植的移植物或治療性蛋白包括有這些收集的抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞或劑型。

在另一個(gè)實(shí)施例中，所提供的任何這些組合物或方法的該第一和/或第二群體的合成納米載體還與mhci類限制性表位偶聯(lián)。在此提供的任何這些組合物和方法的一個(gè)實(shí)施例中，這些抗原基本上不包含mhci類限制性表位。

在此提供的任何這些組合物和方法的一個(gè)實(shí)施例中，作為包含以上提到的這些表位的蛋白質(zhì)的抗原可以與這些合成納米載體偶聯(lián)。在另一個(gè)實(shí)施例中，包含以上提到的這些表位、但包含位于這一個(gè)或多個(gè)表位的一端或兩端側(cè)面的另外氨基酸的多肽或肽可以與這些合成納米載體偶聯(lián)。在另一個(gè)實(shí)施例中，這些表位本身與這些合成納米載體偶聯(lián)。

附圖說(shuō)明

圖1提供了treg細(xì)胞的流式細(xì)胞檢測(cè)分析的一個(gè)代表性實(shí)例。

圖2證明了本發(fā)明的合成納米載體產(chǎn)生更高比例的抗原特異性bregs。

圖3顯示了使用本發(fā)明的合成納米載體使得ige產(chǎn)生減少。

具體實(shí)施方式

在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不局限于具體舉例說(shuō)明的材料或工藝參數(shù)，因?yàn)檫@些當(dāng)然可以變化。還應(yīng)當(dāng)理解在此使用的術(shù)語(yǔ)只是為了描述本發(fā)明的具體實(shí)施例的目的，并不旨在限制使用可替代的術(shù)語(yǔ)來(lái)描述本發(fā)明。

無(wú)論在前或在后，在此引用的所有公開(kāi)物、專利以及專利申請(qǐng)，出于所有目的特此通過(guò)引用以其全文結(jié)合在此。

如在本說(shuō)明書和所附權(quán)利要求中所使用，單數(shù)形式“一個(gè)(種)(a，an)”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)指代物，除非內(nèi)容另外明確表明。例如，提及的“一種聚合物”包括兩種或更多種此類分子的混合物或不同分子量的單個(gè)聚合物種類的混合物；提及的“一種合成納米載體”包括兩種或更多種此類合成載體的混合物或多個(gè)此類合成納米載體；提及的“一種dna分子”包括兩種或更多種此類dna分子的混合物或多個(gè)此類dna分子；提及的“一種免疫抑制劑”包括兩種或更多種此類物質(zhì)的混合物或多個(gè)免疫抑制劑分子；諸如此類。

如在此所使用，術(shù)語(yǔ)“包括(comprise)”或其變體，如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”意在表明包括任何列舉的整體(例如，一個(gè)特點(diǎn)、要素、特征、特性、方法/工藝步驟或限制)或整體的組(例如，多個(gè)特點(diǎn)、多個(gè)要素、多個(gè)特征、多個(gè)特性、多種方法/多個(gè)工藝步驟或多個(gè)限制)，但是不排除任何其他整體或整體的組。因此，如在此所使用，術(shù)語(yǔ)“包括”是包含性的但是不排除另外的、未列舉的整體或方法/工藝步驟。

在此處提供的任何這些組合物和方法的多個(gè)實(shí)施例中，“包括”可用“基本上由......組成(consistingessentiallyof)”或“由......組成(consistingof)”來(lái)替代。短語(yǔ)“基本上由......組成”在此用來(lái)要求限定的一個(gè)或多個(gè)整體或步驟以及不實(shí)質(zhì)上影響所要求的發(fā)明的特征或功能的那些。如在此所使用，術(shù)語(yǔ)“組成(consisting)”用來(lái)表明僅存在所列舉的整體(例如，一個(gè)特點(diǎn)、要素、特征、特性、方法/工藝步驟或限制)或整體的組(例如，多個(gè)特點(diǎn)、多個(gè)要素、多個(gè)特征、多個(gè)特性、多種方法/多個(gè)工藝步驟或多個(gè)限制)。

a.前言

經(jīng)由包含b細(xì)胞表位和/或mhcii類限制性表位的合成納米載體組合物將免疫抑制劑和抗原更直接地遞送在感興趣的細(xì)胞(特別是apc)中的作用位點(diǎn)處可以刺激調(diào)節(jié)性b細(xì)胞并且產(chǎn)生對(duì)這些抗原特異的有益的致耐受性免疫應(yīng)答。如實(shí)例中所示，已發(fā)現(xiàn)合成納米載體組合物有效產(chǎn)生cd24+b細(xì)胞，這些b細(xì)胞產(chǎn)生il-10和tgf-β并且還識(shí)別提及該應(yīng)答的抗原特異性的抗原。另外，已發(fā)現(xiàn)相同的合成納米載體組合物減少ige產(chǎn)生，這提示是調(diào)節(jié)性b細(xì)胞產(chǎn)生的一種下游結(jié)果。不受任何具體理論束縛，所提供的組合物可以提供直接由表位的識(shí)別所造成的致耐受性免疫效應(yīng)，這可以導(dǎo)致調(diào)節(jié)性細(xì)胞的產(chǎn)生、b細(xì)胞向調(diào)節(jié)性表型轉(zhuǎn)換等等。致耐受性免疫應(yīng)答還可以是細(xì)胞因子的產(chǎn)生和/或由此類細(xì)胞因子刺激的其他調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞的產(chǎn)生的結(jié)果。調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的產(chǎn)生還可以導(dǎo)致下游致耐受性效應(yīng)。例如，調(diào)節(jié)性b細(xì)胞可以降低效應(yīng)t細(xì)胞(如cd4+t細(xì)胞)的增殖能力、和/或增加foxp3和ctla-4在調(diào)節(jié)性t細(xì)胞中的表達(dá)。調(diào)節(jié)性b細(xì)胞還可以產(chǎn)生調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子il-10。在多個(gè)實(shí)施例中，在此提供的抗原特異性itdc可以例如對(duì)受試者具有這些效應(yīng)。

此類調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的產(chǎn)生證明了本發(fā)明的組合物產(chǎn)生抗原特異性致耐受性免疫應(yīng)答的能力，這些抗原特異性致耐受性免疫應(yīng)答可以在多種疾病、紊亂或病癥的治療或預(yù)防中具有效用。因此，本發(fā)明對(duì)例如促進(jìn)具有或正處于具有過(guò)敏癥、自身免疫性疾病、炎性疾病、器官或組織排斥、或移植物抗宿主病的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者中的致耐受性免疫應(yīng)答是有用的。本發(fā)明還對(duì)促進(jìn)已經(jīng)經(jīng)歷或?qū)⒁?jīng)歷移植的受試者中的致耐受性免疫應(yīng)答是有用的。本發(fā)明還對(duì)促進(jìn)以下受試者中的致耐受性免疫應(yīng)答是有用的，這些受試者已經(jīng)接受、正在接受或?qū)⒁邮芤环N治療性蛋白，針對(duì)該治療性蛋白，會(huì)產(chǎn)生或預(yù)期會(huì)產(chǎn)生所不希望的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明防止或抑制了所不希望的免疫應(yīng)答，這些所不希望的免疫應(yīng)答可以中和某些治療性處理的有益作用。

本發(fā)明的諸位發(fā)明人已經(jīng)意外地并且令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)實(shí)踐在此披露的本發(fā)明，可以克服以上指出的問(wèn)題和限制。具體地說(shuō)，諸位發(fā)明人已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)，提供通過(guò)增加調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的數(shù)目和/或活性來(lái)誘導(dǎo)一種致耐受性免疫應(yīng)答的合成納米載體組合物和有關(guān)方法是有可能的。在此描述的方法包括向受試者給予一種組合物，該組合物包含：(i)第一群體的合成納米載體和(ii)第二群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，這些第二群體的合成納米載體與一種抗原的b細(xì)胞表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)。優(yōu)選地，該組合物處于在受試者中有效實(shí)現(xiàn)抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞增殖和/或活性的量。在另一方面，提供了一種包括通過(guò)給予一種組合物而在受試者中產(chǎn)生抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的方法，該組合物包含：(i)第一群體的合成納米載體和(ii)第二群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，這些第二群體的合成納米載體與一種抗原的b細(xì)胞表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)。在另一方面，提供了一種包括根據(jù)一種治療方案向受試者給予一種組合物的方法，該治療方案先前已經(jīng)顯示在一個(gè)或多個(gè)測(cè)試受試者中產(chǎn)生抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞，其中該組合物包含：(i)第一群體的合成納米載體和(ii)第二群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，這些第二群體的合成納米載體與一種抗原的b細(xì)胞表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)。

還可以向在此所提供的這些受試者給予可移植的移植物、治療性蛋白等等?？梢栽诮o予這些第一和第二群體的合成納米載體之前、與此同時(shí)或在此之后向受試者給予此類組合物。這類另外的藥劑可以與或可以不與這些第一或第二群體的合成納米載體或另一群體的合成納米載體偶聯(lián)。在多個(gè)實(shí)施例中，提供的這些組合物還可以作為一個(gè)或多個(gè)維持劑量向受試者給予。在此類實(shí)施例中，給予所提供的這些組合物，使得維持所希望的免疫應(yīng)答的產(chǎn)生或降低所不希望的免疫應(yīng)答的產(chǎn)生持續(xù)一定長(zhǎng)度的時(shí)間。在此在其他地方提供了此類長(zhǎng)度的時(shí)間的例子。

在另一方面，提供了一種組合物，該組合物包含根據(jù)所提供的任何方法產(chǎn)生的分離的抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞。在又另一個(gè)方面，還提供了包含這些第一群體和第二群體的合成納米載體的這些組合物。在多個(gè)實(shí)施例中，這些組合物進(jìn)一步包含一種可移植的移植物或一種治療性蛋白，這些可移植的移植物或治療性蛋白可以與或可以不與這些第一或第二群體的合成納米載體或另一群體的合成納米載體偶聯(lián)。

在另一方面，提供了在此的任何這些組合物的多種劑型?？梢詫⒋祟悇┬徒o予受試者，例如對(duì)抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞產(chǎn)生有需要的受試者。

在又另一方面，提供了一種方法，該方法包括：(i)產(chǎn)生第一群體的合成納米載體并且(ii)產(chǎn)生第二群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，這些第二群體的合成納米載體與一種抗原的b細(xì)胞表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括生產(chǎn)一種包含這些第一和第二群體的合成納米載體的劑型。在另一個(gè)實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括確保該第二群體的合成納米載體包含一種抗原的b細(xì)胞表位和/或mhcii類限制性表位。在一個(gè)實(shí)施例中，b細(xì)胞表位和/或mhcii類限制性表位的存在是通過(guò)此類表位刺激免疫應(yīng)答的能力來(lái)證實(shí)，這些免疫應(yīng)答如抗體產(chǎn)生或針對(duì)b細(xì)胞表位的b細(xì)胞增殖和/或活性以及針對(duì)mhcii類限制性表位的cd4+t細(xì)胞免疫應(yīng)答。用于測(cè)定這些活性的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的或在此其他地方提供。在再另一個(gè)實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括對(duì)使用一種組合物或劑型的調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的產(chǎn)生進(jìn)行評(píng)定，該組合物或劑型包含這些第一群體和第二群體的合成納米載體。在一個(gè)實(shí)施例中，這個(gè)評(píng)定是在體外進(jìn)行的。在另一個(gè)實(shí)施例中，這個(gè)評(píng)定是在體內(nèi)進(jìn)行的，如用從受試者獲得的樣品。在又另一個(gè)實(shí)施例中，該方法進(jìn)一步包括制造一種包含這些第一群體和第二群體的合成納米載體的組合物、或可供受試者給予的劑型。

在另一方面，還提供了通過(guò)在此提供的任何方法產(chǎn)生的這些組合物或劑型。

現(xiàn)在，在以下將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。

b.定義

“給予(administering)”或“給予(administration)”意指以藥理學(xué)上有用的方式向受試者提供一種物質(zhì)。

“過(guò)敏原”是能夠在受試者中引起所不希望的(例如，1型超敏性的)免疫應(yīng)答(即，一個(gè)過(guò)敏性應(yīng)答或反應(yīng))的任何物質(zhì)。過(guò)敏原包括但不限于：植物過(guò)敏原(例如，花粉、豚草過(guò)敏原)、昆蟲(chóng)過(guò)敏原、昆蟲(chóng)叮咬過(guò)敏原(例如，蜜蜂叮咬過(guò)敏原)、動(dòng)物過(guò)敏原(例如，寵物過(guò)敏原，如動(dòng)物皮屑或貓feld1抗原)、乳膠過(guò)敏原、霉菌過(guò)敏原、真菌過(guò)敏原、化妝品過(guò)敏原、藥物過(guò)敏原、食物過(guò)敏原、灰塵、昆蟲(chóng)毒液、病毒、細(xì)菌，等等。食物過(guò)敏原包括，但不限于：牛奶過(guò)敏原、雞蛋過(guò)敏原、堅(jiān)果過(guò)敏原(例如，花生或樹(shù)堅(jiān)果過(guò)敏原，等等(例如，胡桃、腰果，等等))、魚(yú)過(guò)敏原、貝類過(guò)敏原、大豆過(guò)敏原、豆類過(guò)敏原、種子過(guò)敏原、以及小麥過(guò)敏原。昆蟲(chóng)叮咬過(guò)敏原包括作為或與蜜蜂叮咬、胡蜂叮咬、馬蜂叮咬、黃蜂叮咬等等相關(guān)聯(lián)的過(guò)敏原。昆蟲(chóng)過(guò)敏原還包括屋塵螨過(guò)敏原(例如，derp1過(guò)敏原)以及蟑螂過(guò)敏原。藥物過(guò)敏原包括作為或與抗生素、nsaid、麻醉劑等等相關(guān)聯(lián)的抗原?；ǚ圻^(guò)敏原包括草過(guò)敏原、樹(shù)過(guò)敏原、雜草過(guò)敏原、花過(guò)敏原，等等?？梢杂迷诖颂峁┑娜魏芜@些組合物和方法對(duì)發(fā)展或正處于發(fā)展針對(duì)在此提供的任何這些過(guò)敏原的一種所不希望的免疫應(yīng)答的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者進(jìn)行治療?？梢杂锰峁┑娜魏芜@些組合物和方法治療的受試者還包括已經(jīng)對(duì)或正處于對(duì)提供的任何這些過(guò)敏原過(guò)敏的風(fēng)險(xiǎn)中的那些受試者。

在此又稱為“過(guò)敏性病癥”的“過(guò)敏癥”是其中對(duì)一種物質(zhì)存在所不希望的(例如，1型超敏性)免疫應(yīng)答(即，過(guò)敏性應(yīng)答或反應(yīng))的任何病癥。此類物質(zhì)在此被稱為過(guò)敏原。過(guò)敏癥或過(guò)敏性病癥包括但不限于：過(guò)敏性哮喘、花粉癥、蕁麻疹、濕疹、植物過(guò)敏、蜜蜂叮咬過(guò)敏、寵物過(guò)敏、乳膠過(guò)敏、霉菌過(guò)敏、化妝品過(guò)敏、食物過(guò)敏、過(guò)敏性鼻炎或鼻傷風(fēng)、局部過(guò)敏性反應(yīng)、過(guò)敏癥、特應(yīng)性皮炎、超敏反應(yīng)、以及其他過(guò)敏性病癥。該過(guò)敏性反應(yīng)可以是針對(duì)任何過(guò)敏原的一種免疫反應(yīng)的結(jié)果。在一些實(shí)施例中，該過(guò)敏是一種食物過(guò)敏。食物過(guò)敏包括但不限于：牛奶過(guò)敏、雞蛋過(guò)敏、堅(jiān)果過(guò)敏、魚(yú)過(guò)敏、貝類過(guò)敏、大豆過(guò)敏或小麥過(guò)敏。

在用于向受試者給予的一種組合物或劑型的背景下的“有效的量”是指在該受試者中產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)所希望的免疫應(yīng)答(例如，產(chǎn)生調(diào)節(jié)性b細(xì)胞)的該組合物或劑型的量。因此，在一些實(shí)施例中，有效的量是產(chǎn)生這一所希望的免疫應(yīng)答的在此提供的一種組合物的任何量。這個(gè)量可以出于體外或體內(nèi)目的。對(duì)于體內(nèi)目的而言，該量可以是臨床醫(yī)師將認(rèn)為對(duì)有抗原特異性耐受需要的受試者可以具有臨床益處的量。此類受試者包括具有或正處于具有一種炎性疾病、一種自身免疫性疾病、一種過(guò)敏癥、器官或組織排斥、或移植物抗宿主病的風(fēng)險(xiǎn)中的那些受試者。此類受試者還包括已經(jīng)經(jīng)歷或?qū)⒁?jīng)歷移植的那些受試者。此類受試者進(jìn)一步包括已經(jīng)經(jīng)歷、正在經(jīng)歷或預(yù)期會(huì)經(jīng)歷針對(duì)一種治療性蛋白的所不希望的免疫應(yīng)答的那些受試者。其他受試者包括在此其他地方描述的那些受試者。

有效的量可以僅涉及降低所不希望的免疫應(yīng)答的水平，雖然在一些實(shí)施例中，它涉及完全防止所不希望的免疫應(yīng)答。有效的量還可以涉及延遲所不希望的免疫應(yīng)答的發(fā)生。有效的量還可以涉及產(chǎn)生一種所希望的免疫應(yīng)答。有效的量還可以是產(chǎn)生所希望的治療終點(diǎn)或所希望的治療結(jié)果的在此提供的一種組合物的量。有效的量?jī)?yōu)選在受試者中導(dǎo)致針對(duì)抗原的致耐受性免疫應(yīng)答。有效的量?jī)?yōu)選導(dǎo)致調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的增加的增殖和/或活性。可以通過(guò)常規(guī)方法來(lái)監(jiān)測(cè)任何上述內(nèi)容的實(shí)現(xiàn)。

在提供的任何這些組合物和方法的一些實(shí)施例中，該有效的量是其中使所希望的免疫應(yīng)答在該受試者中持續(xù)至少1周、至少2周、至少1個(gè)月、至少2個(gè)月、至少3個(gè)月、至少4個(gè)月、至少5個(gè)月、至少6個(gè)月、至少9個(gè)月、至少1年、至少2年、至少5年、或更長(zhǎng)時(shí)間的量。在提供的任何這些組合物和方法的其他實(shí)施例中，該有效的量是產(chǎn)生一種可測(cè)量的所希望的免疫應(yīng)答(例如，可測(cè)量的免疫應(yīng)答(例如，針對(duì)一種特異性抗原)降低)持續(xù)至少1周、至少2周、至少1個(gè)月、至少2個(gè)月、至少3個(gè)月、至少4個(gè)月、至少5個(gè)月、至少6個(gè)月、至少9個(gè)月、至少1年、至少2年、至少5年、或更長(zhǎng)時(shí)間的量。

當(dāng)然，有效的量將取決于正被治療的具體受試者；病癥、疾病或紊亂的嚴(yán)重性；個(gè)體患者的參數(shù)，包括年齡、身體狀況、體型以及體重；治療持續(xù)時(shí)間；同步療法(如果有)的性質(zhì)；特定的給藥途徑、以及健康執(zhí)業(yè)醫(yī)師的知識(shí)和專業(yè)技能內(nèi)的類似因素。這些因素為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知，并且可以僅用常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法解決。通常優(yōu)選的是使用最大劑量，即根據(jù)正確醫(yī)學(xué)判斷的最高安全劑量。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，出于醫(yī)學(xué)原因、心理原因或幾乎任何其他原因，患者可以堅(jiān)持較低劑量或耐受劑量。

通常，本發(fā)明的組合物中的這些免疫抑制劑和/或抗原的劑量可以在從約10μg/kg至約100,000μg/kg的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施例中，這些劑量可以在從約0.1mg/kg至約100mg/kg的范圍內(nèi)。在再其他的實(shí)施例中，這些劑量可以在從約0.1mg/kg至約25mg/kg、約25mg/kg至約50mg/kg、約50mg/kg至約75mg/kg、或約75mg/kg至約100mg/kg的范圍內(nèi)。可替代地，可以基于提供希望的量的免疫抑制劑和/或抗原的合成納米載體的數(shù)目給予該劑量。例如，有用的劑量包括每劑量大于10⁶個(gè)、10⁷個(gè)、10⁸個(gè)、10⁹個(gè)或10¹⁰個(gè)合成納米載體。有用的劑量的其他例子包括每劑量從約1×10⁶至約1×10¹⁰個(gè)、約1×10⁷至約1×10⁹個(gè)、或約1×10⁸至約1×10⁹個(gè)合成納米載體。

“抗原”意指b細(xì)胞抗原或t細(xì)胞抗原。“抗原的一種或多種類型”意指共享相同的、或基本上相同的抗原特性的分子。在一些實(shí)施例中，抗原可以是蛋白質(zhì)類、多肽類、肽類、脂蛋白類、糖脂類、多核苷酸類、多糖類，或被包含或表達(dá)在細(xì)胞中。在一些實(shí)施例中，例如當(dāng)沒(méi)有很好定義或表征這些抗原時(shí)，這些抗原可以被包含在細(xì)胞或組織制品、細(xì)胞碎片、細(xì)胞外來(lái)體、條件培養(yǎng)基等等之內(nèi)?？梢耘c受試者暴露于引起所不希望的免疫應(yīng)答者相同的形式將一種抗原與這些合成納米載體組合，但該抗原還可以是其片段或衍生物。然而，當(dāng)為一個(gè)片段或衍生物時(shí)，針對(duì)由這樣的受試者遇到的形式的所希望的免疫應(yīng)答是使用所提供的這些組合物和方法的優(yōu)選結(jié)果。優(yōu)選地，這些抗原包含表位，使得調(diào)節(jié)性b細(xì)胞通過(guò)在此提供的組合物而產(chǎn)生、募集或激活。不管這是否發(fā)生，都可以通過(guò)使用常規(guī)技術(shù)測(cè)量細(xì)胞因子產(chǎn)生(例如，il-10)和/或調(diào)節(jié)性b細(xì)胞增殖來(lái)建立。

“抗原特異性”是指由該抗原或其部分的存在引起的、或產(chǎn)生特異性地識(shí)別或結(jié)合該抗原的多種分子的任何免疫應(yīng)答。例如，在該免疫應(yīng)答是抗原特異性抗體產(chǎn)生的情況下，產(chǎn)生了特異性地結(jié)合該抗原的多個(gè)抗體。作為另一個(gè)例子，在該免疫應(yīng)答是抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞增殖和/或活性的情況下，該增殖和/或活性由b細(xì)胞對(duì)單獨(dú)的或與mhc分子復(fù)合的該抗原或其部分的識(shí)別等等引起。

與在此提供的一種疾病、紊亂或病癥“相關(guān)聯(lián)的抗原”是可以針對(duì)該疾病、紊亂或病癥、作為其結(jié)果、或與其結(jié)合而產(chǎn)生所不希望的免疫應(yīng)答的抗原；作為該疾病、紊亂或病癥(或其癥狀或影響)的病因的抗原；和/或可以產(chǎn)生作為該疾病、紊亂或病癥的癥狀、結(jié)果或影響的所不希望的免疫應(yīng)答的抗原。優(yōu)選地，在一些實(shí)施例中，于在此提供的這些組合物和方法中使用一種與疾病、紊亂或病癥等相關(guān)聯(lián)的抗原將會(huì)導(dǎo)致針對(duì)該抗原和/或細(xì)胞(該抗原由這些細(xì)胞表達(dá)、在這些細(xì)胞之上或之中表達(dá))的致耐受性免疫應(yīng)答。這些抗原可以處于與具有該疾病、紊亂或病癥的受試者中所表達(dá)的相同的形式，但也可以是其片段或衍生物。然而，當(dāng)為一個(gè)片段或衍生物時(shí)，針對(duì)在這一受試者中所表達(dá)的形式的一種所希望的免疫應(yīng)答是使用所提供的這些組合物和方法的優(yōu)選結(jié)果。

在一個(gè)實(shí)施例中，該抗原是與一種炎性疾病、自身免疫性疾病、器官或組織排斥、或移植物抗宿主病相關(guān)聯(lián)的抗原。此類抗原包括：自身抗原，如髓磷脂堿性蛋白、膠原(例如，11型膠原)、人軟骨gp39、嗜鉻粒蛋白a、gp130-raps、蛋白脂質(zhì)蛋白、纖維蛋白、核蛋白、核仁蛋白(例如，小核仁蛋白)、甲狀腺刺激因子受體、組蛋白、糖蛋白gp70、核糖體蛋白、丙酮酸脫氫酶、脫氫硫辛酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶、毛囊抗原、人原肌球蛋白同工型5、線粒體蛋白、胰腺β-細(xì)胞蛋白、髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白、胰島素、谷氨酸脫羧酶(gad)、谷蛋白、以及其片段或衍生物。以下在表1中提供了其他的自身抗原。

抗原還包括與器官或組織排斥相關(guān)聯(lián)的那些抗原。此類抗原的實(shí)例包括，但不限于：來(lái)自同種異體細(xì)胞的抗原，例如來(lái)自一種同種異體細(xì)胞提取物的抗原；和來(lái)自其他細(xì)胞的抗原，如內(nèi)皮細(xì)胞抗原。

抗原還包括與一種過(guò)敏相關(guān)聯(lián)的那些抗原。此類抗原包括在此其他地方描述的過(guò)敏原。

抗原還包括與一種可移植的移植物相關(guān)聯(lián)的那些抗原。此類抗原與一種可移植的移植物、或在具有一種可移植的移植物的接受者中的一種所不希望的免疫應(yīng)答相關(guān)聯(lián)，該所不希望的免疫應(yīng)答由于將該可移植的移植物引入到該接受者中而產(chǎn)生，該可移植的移植物可以被呈遞以供免疫系統(tǒng)的細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別并且該可移植的移植物可以產(chǎn)生一種所不希望的免疫應(yīng)答。移植抗原包括與器官或組織排斥或移植物抗宿主病相關(guān)聯(lián)的那些抗原?？梢詮囊环N生物材料的細(xì)胞中或從與一種可移植的移植物相關(guān)的信息中獲得或衍生出移植抗原。移植抗原通常包括蛋白質(zhì)類、多肽類、肽類、脂蛋白類、糖脂類、多核苷酸類、或被包含或表達(dá)在細(xì)胞中。與一種可移植的移植物相關(guān)的信息是關(guān)于可以用來(lái)獲得或衍生出移植抗原的一種可移植的移植物的任何信息。此類信息包括關(guān)于將預(yù)期會(huì)呈遞在一種可移植的移植物的細(xì)胞之中或之上的抗原的信息，例如像序列信息；抗原和/或它們的mhci類、mhcii類或b細(xì)胞呈遞限制的類型或種類。此類信息還可以包括關(guān)于以下各項(xiàng)的信息：可移植的移植物的類型(例如，自身移植物、同種異體移植物、異種移植物)、該移植物的分子組成和細(xì)胞組成、該移植物源自其中或該移植物有待被移植至其上的身體位置(例如，全部或部分的器官、皮膚、骨骼、神經(jīng)、腱、神經(jīng)元、血管、脂肪、角膜等等)。

抗原還包括與一種治療性蛋白相關(guān)聯(lián)的抗原，這些抗原可以被呈遞以供免疫系統(tǒng)的細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別并且這些抗原可以產(chǎn)生針對(duì)該治療性蛋白的一種所不希望的免疫應(yīng)答。治療性蛋白抗原通常包括蛋白質(zhì)類、多肽類、肽類、脂蛋白類，或被包含在或表達(dá)在細(xì)胞之中、之上或由細(xì)胞表達(dá)。

抗原可以是完全定義或表征的抗原。然而，在一些實(shí)施例中，抗原不是完全定義或表征的。因此，抗原還包括被包含在細(xì)胞或組織制品、細(xì)胞碎片、細(xì)胞外來(lái)體或條件培養(yǎng)基內(nèi)的那些抗原，并且在一些實(shí)施例中可以此種形式遞送。

“評(píng)定一種免疫應(yīng)答”是指在體外或體內(nèi)對(duì)一種免疫應(yīng)答的水平、存在或不存在、降低、增加等等進(jìn)行的任何測(cè)量或測(cè)定?？梢栽趶氖茉囌咧蝎@得的一個(gè)或多個(gè)樣品上進(jìn)行此類測(cè)量或測(cè)定?？梢杂迷诖颂峁┑娜魏畏椒ɑ虮绢I(lǐng)域中已知的其他方法來(lái)進(jìn)行此類評(píng)定。

“處于風(fēng)險(xiǎn)中”的受試者是健康執(zhí)業(yè)醫(yī)師認(rèn)為其具有患上在此所提供的疾病、紊亂或病癥的機(jī)會(huì)的受試者、或健康執(zhí)業(yè)醫(yī)師認(rèn)為其具有經(jīng)歷在此所提供的所不希望的免疫應(yīng)答的機(jī)會(huì)的受試者。

“自身免疫性疾病”是其中免疫系統(tǒng)針對(duì)自身(例如，一個(gè)或多個(gè)自身抗原)發(fā)動(dòng)一種所不希望的免疫應(yīng)答的任何疾病。在一些實(shí)施例中，自身免疫性疾病包含作為自身靶向免疫應(yīng)答的一部分的對(duì)身體細(xì)胞的異常破壞。在一些實(shí)施例中，自身破壞表現(xiàn)為一個(gè)器官(例如，結(jié)腸或胰腺)的功能失常。在此其他地方描述了自身免疫性疾病的實(shí)例。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知另外的自身免疫性疾病，并且本發(fā)明在此方面不受限制。

如在此所使用的“平均值”是指算術(shù)平均值，除非另外指出。

“b細(xì)胞抗原”意指觸發(fā)b細(xì)胞中的免疫應(yīng)答的任何抗原(例如，由b細(xì)胞或其上的受體特異性地識(shí)別的抗原)。在一些實(shí)施例中，作為一種t細(xì)胞抗原的抗原也是一種b細(xì)胞抗原。在其他實(shí)施例中，該t細(xì)胞抗原并不也是一種b細(xì)胞抗原。b細(xì)胞抗原包括但不限于：蛋白質(zhì)、肽、小分子、以及碳水化合物。在一些實(shí)施例中，該b細(xì)胞抗原包括非蛋白抗原(即不是一種蛋白質(zhì)或肽抗原)。在一些實(shí)施例中，該b細(xì)胞抗原包括一種自身抗原。在其他實(shí)施例中，該b細(xì)胞抗原是從一種過(guò)敏原、自身抗原、治療性蛋白、或可移植的移植物中獲得或衍生出。

“同時(shí)”意指以時(shí)間相關(guān)的、優(yōu)選地時(shí)間充分相關(guān)的方式向受試者給予兩種或更多種物質(zhì)，以便提供對(duì)免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)。在多個(gè)實(shí)施例中，可以通過(guò)以相同劑型給予兩種或更多種物質(zhì)而發(fā)生同時(shí)給予。在其他實(shí)施例中，同時(shí)給予可以涵蓋以不同劑型、但在指定時(shí)間段內(nèi)、優(yōu)選在1個(gè)月內(nèi)、更優(yōu)選在1周內(nèi)、再更優(yōu)選在1天內(nèi)并且甚至更優(yōu)選在1小時(shí)內(nèi)給予兩種或更多種物質(zhì)。

“偶聯(lián)(couple)”或“偶聯(lián)(coupled)”或“偶聯(lián)(couples)”(諸如此類)意指使一個(gè)實(shí)體(例如一個(gè)部分)與另一個(gè)實(shí)體在化學(xué)上結(jié)合。在一些實(shí)施例中，偶聯(lián)是共價(jià)的，這意味著該偶聯(lián)是在兩個(gè)實(shí)體之間存在共價(jià)鍵的背景下發(fā)生的。在非共價(jià)的實(shí)施例中，通過(guò)非共價(jià)相互作用介導(dǎo)非共價(jià)偶聯(lián)，這些非共價(jià)相互作用包括但不限于：電荷相互作用、親和相互作用、金屬配位、物理吸附、主-客體相互作用、疏水相互作用、tt堆積相互作用、氫鍵相互作用、范德華相互作用、磁相互作用、靜電相互作用、偶極-偶極相互作用、和/或其組合。在多個(gè)實(shí)施例中，封裝是偶聯(lián)的一種形式。

“衍生的”意指由一種材料或與一種材料相關(guān)的信息制備的，而不是從該材料“獲得的”。此類材料可以是直接取自一種生物材料的材料的實(shí)質(zhì)性地改變或加工的形式。此類材料還包括從與一種生物材料相關(guān)的信息所產(chǎn)生的材料。

“劑型”意指在一種適用于向受試者給予的介質(zhì)、載體、媒介物或裝置中的藥理學(xué)和/或免疫學(xué)活性材料。

“封裝”意指將物質(zhì)的至少一個(gè)部分封閉在合成納米載體內(nèi)。在一些實(shí)施例中，一種物質(zhì)被完全封閉在合成納米載體內(nèi)。在其他實(shí)施例中，被封裝的物質(zhì)的大部分或全部不暴露于該合成納米載體外的局部環(huán)境。在其他實(shí)施例中，不超過(guò)50％、40％、30％、20％、10％或5％(重量/重量)暴露于該局部環(huán)境。封裝不同于吸附，吸附是將物質(zhì)的大部分或全部置于合成納米載體的表面上，并且使得該物質(zhì)暴露于該合成納米載體外的局部環(huán)境。

“表位”，又稱為抗原決定簇，是由免疫系統(tǒng)，確切地由例如抗體、b細(xì)胞、或t細(xì)胞識(shí)別的抗原部分。如在此所使用，“mhci類限制性表位”是通過(guò)在有核細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的mhci類分子呈遞給免疫細(xì)胞的表位?！癿hcii類限制性表位”是通過(guò)在抗原呈遞細(xì)胞(apc)上(例如，在專職性抗原呈遞免疫細(xì)胞上，如在巨噬細(xì)胞、b細(xì)胞以及樹(shù)突狀細(xì)胞上，或在非造血細(xì)胞如肝細(xì)胞上)發(fā)現(xiàn)的mhcii類分子呈遞給免疫細(xì)胞的表位?！癰細(xì)胞表位”是由抗體或b細(xì)胞識(shí)別的分子結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施例中，表位本身是一種抗原。

許多表位是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，并且根據(jù)本發(fā)明的一些方面適合的示例性表位包括但不限于列在免疫表位數(shù)據(jù)庫(kù)(www.immuneepitope.org，維塔·r(vitar)、札瑞布斯基·l(zarebskil)、格林鮑姆·ja(greenbaumja)、埃馬米·h(emamih)、霍夫·i(hoofi)、薩利姆·n(salimin)、達(dá)美樂(lè)·r(damler)、賽特·a(settea)、彼得斯·b(petersb)，免疫表位數(shù)據(jù)庫(kù)2.0(theimmuneepitopedatabase2.0)，核酸研究(nucleicacidsres)，2010年1月；38(數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)行號(hào))：d854-62；該免疫表位數(shù)據(jù)庫(kù)的全部?jī)?nèi)容以及2011年8月的iedb2.4版本的所有數(shù)據(jù)庫(kù)條目，并且具體地說(shuō)在其中披露的所有表位通過(guò)引用結(jié)合在此)中的那些。還可以使用公開(kāi)可獲得的算法來(lái)鑒定表位，這些算法例如在以下文獻(xiàn)中描述的算法：王平(wangp)、西德尼·j(sidneyj)、金姆·y(kimy)、賽特·a(settea)、倫德·o(lundo)、尼耳森·m(nielsenm)、彼得斯·b(petersb)，2010，用于hladr、dp以及dq分子的肽結(jié)合預(yù)測(cè)(peptidebindingpredictionsforhladr，dpanddqmolecules)，bmc生物信息學(xué)(bmcbioinformatics)2010，11：568；王平(wangp)、西德尼·j(sidneyj)、道·c(dowc)、莫斯·b(mothéb)、賽特·a(settea)、彼得斯·b(petersb)，2008，mhcii類肽結(jié)合預(yù)測(cè)的系統(tǒng)性評(píng)定和一致方法的評(píng)估(asystematicassessmentofmhcclassiipeptidebindingpredictionsandevaluationofaconsensusapproach)，plos計(jì)算生物學(xué)(ploscomputbiol.)4(4)：e1000048；尼耳森·m(nielsenm)、倫德·o(lundo)，2009，nn-比對(duì)，用于mhcii類肽結(jié)合預(yù)測(cè)的基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的比對(duì)算法(nn-align.anartificialneuralnetwork-basedalignmentalgorithmformhcclassiipeptidebindingprediction)，bmc生物信息學(xué)(bmcbioinformatics)，10：296；尼耳森·m(nielsenm)、倫德高·c(lundegaardc)、倫德·o(lundo)，2007，使用新穎的穩(wěn)定化矩陣比對(duì)方法smm-比對(duì)預(yù)測(cè)mhcii類結(jié)合親和性(predictionofmhcclassiibindingaffinityusingsmm-align，anovelstabilizationmatrixalignmentmethod)，bmc生物信息學(xué)(bmcbioinformatics)，8：238；裴·hh(buihh)、西德尼·j(sidneyj)、彼得斯·b(petersb)、薩塞默塞·m(sathiamurthym)、真一·a(sinichia)、潘頓·ka(purtonka)、莫斯·br(mothébr)、奇薩利·fv(chisarifv)、沃特金斯·di(watkinsdi)、賽特·a(settea)，2005，免疫遺傳學(xué)(immunogenetics)，57：304-314；斯圖爾尼奧洛·t(sturniolot)、博諾·e(bohoe)、丁·j(dingj)、拉德里查尼·l(raddrizzanil)、圖雷西·o(tuerecio)、薩因·u(sahinu)、布雷桑勒·m(braxenthalerm)、加利亞西·f(gallazzif)、普羅狄·mp(prottimp)、西尼加利亞·f(sinigagliaf)、漢姆莫·j(hammerj)，1999，使用dna微陣列和虛擬的hlaii類矩陣產(chǎn)生組織特異性的和混雜的hla配體數(shù)據(jù)庫(kù)(generationoftissue-specificandpromiscuoushlaliganddatabasesusingdnamicroarraysandvirtualhlaclassiimatriees).自然生物技術(shù)(natbiotechnol)，17(6)：555-561；尼耳森·m(nielsenm)、倫德高·c(lundegaardc)、沃林·p(worningp)、拉爾莫勒·sl(lauemollersl)、拉姆博特·k(lamberthk)、布斯·s(buuss)、布魯納克·s(brunaks)、倫德·o(lundo)，2003，使用具有新穎序列表示的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可靠預(yù)測(cè)t細(xì)胞表位(reliablepredictionoft-cellepitopesusingneuralnetworkswithnovelsequencerepresentations)，蛋白質(zhì)科學(xué)(proteinsci)12：1007-1017；裴·hh(buihh)、西德尼·j(sidneyj)、彼得斯·b(petersb)、薩塞默塞·m(sathiamurthym)、真一·a(sinichia)、潘頓·ka(purtonka)、莫斯·br(mothebr)、奇薩利·fv(chisarifv)、沃特金斯·di(watkinsdi)、賽特·a(settea)，2005，特異性mhc結(jié)合預(yù)測(cè)工具的自動(dòng)產(chǎn)生和評(píng)估：arb矩陣應(yīng)用(automatedgenerationandevaluationofspecificmhcbindingpredictivetools：arbmatrixapplications)，免疫遺傳學(xué)(immunogenetics)57：304-314；彼得斯·b(petersb)、賽特·a(settea)，2005，使用穩(wěn)定化的矩陣方法產(chǎn)生描述生物過(guò)程的序列特異性的定量模型(generatingquantitativemodelsdescribingthesequencespecificityofbiologicalprocesseswiththestabilizedmatrixmethod)，bmc生物信息學(xué)(bmcbioinformatics)6：132；周·py(choupy)、法斯曼·gd(fasmangd)，1978，由氨基酸序列預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)(predictionofthesecondarystruetureofproteinsfromtheiraminoacidsequence)，酶學(xué)相關(guān)領(lǐng)域分子生物學(xué)進(jìn)展(advenzymolrelatareasmolbiol)47：45-148；伊米妮·ea(eminiea)、休斯·jv(hughesjv)、珀洛·ds(perlowds)、博格·j(bogerj)，1985，由病毒特異性合成肽誘導(dǎo)中和甲型肝炎病毒的抗體(inductionofhepatitisavirus-neutralizingantibodybyavirus-specificsyntheticpeptide)，病毒學(xué)期刊(jvirol)55：836-839；卡普拉斯·pa(karpluspa)、舒爾茲·ge(schulzge)，1985，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)中的鏈柔性(predictionofchainflexibilityinproteins)，自然科學(xué)(naturwissenschaften)72：212-213；科拉斯卡·as(kolaskaras)、頓考恩卡·pc(tongaonkarpc)，1990，用于預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)抗原上的抗原決定簇的半經(jīng)驗(yàn)方法(asemi-empiricalmethodforpredictionofantigenicdeterminantsonproteinantigens)，febs快報(bào)(febslett)276：172-174；帕克·jm(parkerjm)、郭·d(guod)、霍奇斯·rs(hodgesrs)，1986，來(lái)源于高效液相色譜法肽保留數(shù)據(jù)的新型親水性標(biāo)度：預(yù)測(cè)的表面殘基與抗原性和源自x射線的可接近位點(diǎn)的相關(guān)性(newhydrophilicityscalederivedfromhigh-performanceliquidchromatographypeptideretentiondata：correlationofpredictedsurfaceresidueswithantigenicityandx-ray-derivedaccessiblesites)，生物化學(xué)(biochemistry)25：5425-5432；拉森·je(larsenje)、倫德·o(lundo)、尼耳森·m(nielsenm)，2006，用于預(yù)測(cè)線性b細(xì)胞表位的改進(jìn)方法(improvedmethodforpredictinglinearb-cellepitopes)，免疫研究(immunomeres)2：2；波諾馬連科·jv(ponomarenkojv)、伯恩·pe(bournepe)，2007，抗體-蛋白質(zhì)相互作用：基準(zhǔn)數(shù)據(jù)集和預(yù)測(cè)工具評(píng)估(antibody-proteininteractions：benchmarkdatasetsandpredictiontoolsevaluation)，bmc結(jié)構(gòu)生物學(xué)(bmcstructbiol)7：64；哈斯特安德森·p(hasteandersenp)、尼耳森·m(nielsenm)、倫德·o(lundo)，2006，使用蛋白質(zhì)3d結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)不連續(xù)b細(xì)胞表位中的殘基(predictionofresiduesindiscontinuousb-cellepitopesusingprotein3dstructures)，蛋白質(zhì)科學(xué)(proteinsci)15：2558-2567；波諾馬連科·jv(ponomarenkojv)、裴·h(buih)、李·w(liw)、福斯德·n(fussedern)、伯恩·pe(bournepe)、賽特settea、彼得斯·b(petersb)，2008，ellipro：用于預(yù)測(cè)抗體表位的新型基于結(jié)構(gòu)的工具(ellipro：anewstructure-basedtoolforthepredictionofantibodyepitopes)，bmc生物信息學(xué)(bmcbioinformatics)9：514；尼耳森·m(nielsenm)、倫德高·c(lundegaardc)、布里加·t(blichert)、彼得斯·b(petersb)、賽特·a(settea)、賈斯特遜·s(justesens)、布斯·s(buuss)以及倫德·o(lundo)，2008，plos計(jì)算生物學(xué)(ploscomputbiol.)4(7)e1000107，肽結(jié)合具有已知序列的任何hla-dr分子的定量預(yù)測(cè)：netmhciipan(quantitativepredictionsofpeptidebindingtoanyhla-drmoleculeofknownsequence：netmhciipan)；這些文獻(xiàn)各自的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用結(jié)合在此以用于披露用于鑒定表位的方法和算法。

表位的其他實(shí)例包括如seqidno：1-943所提供的mhci類限制性表位、mhcii類限制性表位以及b細(xì)胞表位中的任何一種。不希望受任何具體理論束縛，mhci類限制性表位包括在seqidno：1-186中列出的那些，mhcii類限制性表位包括在seqidno：187-537中列出的那些，并且b細(xì)胞表位包括在seqidno：538-943中列出的那些。這些表位包括mhci類限制性自身抗原、過(guò)敏原的mhcii類限制性表位以及自身抗原和過(guò)敏原的b細(xì)胞表位。

“產(chǎn)生”意指本身直接地或間接地(如但不限于，通過(guò)依賴某人的語(yǔ)言或行為采取行動(dòng)的不相關(guān)的第三方)引起一種行為(如一種免疫應(yīng)答(例如，致耐受性免疫應(yīng)答))發(fā)生。

“鑒定”是允許臨床醫(yī)師將受試者識(shí)別為可能從在此提供的這些方法和組合物中獲益者的任何行為或一系列行為。優(yōu)選地，鑒定的受試者是對(duì)如在此所提供的致耐受性免疫應(yīng)答有需要者。該行為或一系列行為可以是本身直接地或間接地，如但不限于，通過(guò)依賴某人的語(yǔ)言或行為采取行動(dòng)的不相關(guān)的第三方。

“免疫抑制劑”意指引起apc具有免疫抑制(例如，致耐受性作用)的一種化合物。免疫抑制作用通常是指由降低、抑制或防止所不希望的免疫應(yīng)答的apc產(chǎn)生或表達(dá)細(xì)胞因子或其他因子，但還可以包括由增加、刺激或促進(jìn)所希望的免疫應(yīng)答的apc產(chǎn)生或表達(dá)細(xì)胞因子或其他因子。當(dāng)該apc對(duì)識(shí)別由該apc呈遞的抗原的免疫細(xì)胞產(chǎn)生一種免疫抑制作用時(shí)，該免疫抑制作用被稱為是對(duì)呈遞的抗原特異的。此種作用在此還稱為致耐受性作用。不受任何具體理論束縛，認(rèn)為該免疫抑制或致耐受作用是該免疫抑制劑被遞送至該apc上的結(jié)果，優(yōu)選在一種抗原(例如，一種給予的抗原或已經(jīng)存在于體內(nèi)的抗原)存在的情況下。因此，該免疫抑制劑包括提供針對(duì)一種抗原的致耐受性免疫應(yīng)答的化合物，這些化合物可以被或可以不被提供在相同的組合物或不同的組合物中。在一個(gè)實(shí)施例中，該免疫抑制劑是引起apc促進(jìn)一個(gè)或多個(gè)免疫效應(yīng)細(xì)胞中的調(diào)節(jié)表型的免疫抑制劑。例如，該調(diào)節(jié)表型的特征可以在于產(chǎn)生、誘導(dǎo)、刺激或募集trcg細(xì)胞，等等。這可以是b細(xì)胞轉(zhuǎn)化為調(diào)節(jié)表型的結(jié)果。這還可以是調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的刺激、募集等等的結(jié)果。這還可以是在其他免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞和inkt細(xì)胞)中誘導(dǎo)foxp3的結(jié)果。在一個(gè)實(shí)施例中，該免疫抑制劑是在apc加工抗原之后影響該apc的應(yīng)答的免疫抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施例中，該免疫抑制劑不是干擾抗原加工的免疫抑制劑。在一個(gè)另外的實(shí)施例中，該免疫抑制劑不是一種細(xì)胞凋亡信號(hào)分子。在另一個(gè)實(shí)施例中，該免疫抑制劑不是一種磷脂。

免疫抑制劑包括但不限于：抑制素；mtor抑制劑，如雷帕霉素或一種雷帕霉素類似物；tgf-β信號(hào)劑；tgf-β受體激動(dòng)劑；組蛋白去乙?；敢种苿?，如曲古抑菌素a(trichostatina)；皮質(zhì)類固醇類；線粒體功能抑制劑，如魚(yú)藤酮(rotenone)；p38抑制劑；nf-κβ抑制劑，如6bio、地塞米松、tcpa-1、ikkvii；腺苷受體激動(dòng)劑；前列腺素e2激動(dòng)劑(pge2)，如米索前列醇(misoprostol)；磷酸二酯酶抑制劑，如磷酸二酯酶4抑制劑(pde4)，如咯利普蘭(rolipram)；蛋白酶體抑制劑；激酶抑制劑；g-蛋白偶聯(lián)受體激動(dòng)劑；g-蛋白偶聯(lián)受體拮抗劑；糖皮質(zhì)激素類；類視黃醇類；細(xì)胞因子抑制劑；細(xì)胞因子受體抑制劑；細(xì)胞因子受體激活劑；過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體拮抗劑；過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體激動(dòng)劑；組蛋白去乙酰化酶抑制劑；鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin)抑制劑；磷酸酶抑制劑；pi3kb抑制劑，如tgx-221；自噬(autophagy)抑制劑，如3-甲基腺嘌呤；芳香烴受體抑制劑；蛋白酶體抑制劑i(psi)；以及氧化的atp，如p2x受體阻斷劑。免疫抑制劑還包括ido、維生素d3、環(huán)孢霉素類(如環(huán)孢霉素a)、芳香烴受體抑制劑、白藜蘆醇、硫唑嘌呤(aza)、6-巰基嘌呤(6-mp)、6-硫鳥(niǎo)嘌呤(6-tg)、fk506、薩菲菌素a(sanglifehrina)、沙美特羅(salmeterol)、嗎替麥考酚酯(mycophenolatemofetil)(mmf)、阿司匹林以及其他cox抑制劑、尼氟酸、雌三醇以及雷公藤甲素(triptolide)。在多個(gè)實(shí)施例中，免疫抑制劑可以包含在此提供的任何藥劑(agent)。

免疫抑制劑可以是對(duì)apc直接提供免疫抑制(例如，致耐受性)作用的一種化合物，或該免疫抑制劑可以是間接(即，在給予之后以某種方式被加工之后)提供免疫抑制(例如，致耐受性)作用的一種化合物。因此，免疫抑制劑包括在此提供的任何化合物的前藥形式。

免疫抑制劑還可以包括編碼在此提供的產(chǎn)生免疫抑制(例如，致耐受性)免疫應(yīng)答的肽、多肽或蛋白質(zhì)的核酸。因此，在多個(gè)實(shí)施例中，免疫抑制劑是編碼一種產(chǎn)生免疫抑制(例如，致耐受性)免疫應(yīng)答的肽、多肽或蛋白質(zhì)的核酸，并且該免疫抑制劑是與合成納米載體偶聯(lián)的核酸。

該核酸可以是dna或rna，如mrna。在多個(gè)實(shí)施例中，這些發(fā)明的組合物包含一種互補(bǔ)物，如一種全長(zhǎng)互補(bǔ)物，或在此提供的任何這些核酸的一種簡(jiǎn)并物(由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性)。在多個(gè)實(shí)施例中，核酸是一種表達(dá)載體，當(dāng)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞系中時(shí)，該表達(dá)載體可以被轉(zhuǎn)錄。在多個(gè)實(shí)施例中，該表達(dá)載體可以包括除其他之外的質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、或腺病毒?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法來(lái)分離或合成核酸，例如通過(guò)使用聚合酶鏈反應(yīng)來(lái)產(chǎn)生核酸片段，然后對(duì)該核酸片段進(jìn)行純化并且克隆至表達(dá)載體中。對(duì)本發(fā)明的實(shí)踐有用的另外技術(shù)可以在2007年約翰威立國(guó)際出版公司(johnwileyandsons，inc.)的現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方案(currentprotocolsinmolecularbiology)；分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第三版)薩姆布魯克(molecularcloning：alaboratorymanual(thirdedition)josephsambrook)，彼得麥卡勒姆癌癥研究所(petermaccallumcancerinstitute)，墨爾本(melbourne)，澳大利亞(australia)；大衛(wèi)羅素(davidrussell)，德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心(universityoftexassouthwesternmedicalcenter)，達(dá)拉斯(dallas)，冷泉港(coldspringharbor)中找到。

在多個(gè)實(shí)施例中，在此提供的這些免疫抑制劑與合成納米載體偶聯(lián)。在多個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，免疫抑制劑是除了構(gòu)成該合成納米載體的結(jié)構(gòu)的材料之外的一種成分。例如，在一個(gè)實(shí)施例中，在合成納米載體由一種或多種聚合物構(gòu)成的情況下，該免疫抑制劑是除了這一種或多種聚合物之外的并且與其偶聯(lián)的一種化合物。作為另一個(gè)實(shí)例，在一個(gè)實(shí)施例中，在該合成納米載體由一種或多種脂質(zhì)構(gòu)成的情況下，該免疫抑制劑又是除了這一種或多種脂質(zhì)之外的并且與其偶聯(lián)的。在多個(gè)實(shí)施例中，例如在該合成納米載體的材料也產(chǎn)生一種免疫抑制(例如，致耐受性)作用的情況下，該免疫抑制劑是產(chǎn)生一種免疫抑制(例如，致耐受性)作用的、除了該合成納米載體材料之外而存在的一種成分。

其他示例性的免疫抑制劑包括但不限于：小分子藥物、天然產(chǎn)物、抗體(例如，對(duì)抗cd20、cd3、cd4的抗體)、基于生物制劑的藥物、基于碳水化合物的藥物、納米顆粒、脂質(zhì)體、rnai、反義核酸、適體、氨甲蝶呤、nsaid；芬戈莫德(fingolimod)；那他珠單抗(natalizumab)；阿侖單抗(alemtuzumab)；抗cd3；他克莫司(tacrolimus)(fk506)等等。另外的免疫抑制劑對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的，并且本發(fā)明在此方面不受限制。

“炎性疾病”意指其中發(fā)生所不希望的炎癥的任何疾病、紊亂或病癥。

免疫抑制劑或抗原的“負(fù)載”是基于整個(gè)合成納米載體中的材料的總重量，與合成納米載體偶聯(lián)的該免疫抑制劑或抗原的量(重量/重量)。通常，該負(fù)載被計(jì)算為在一個(gè)群體的合成納米載體上的平均值。在一個(gè)實(shí)施例中，平均在該第一群體的合成納米載體上的該免疫抑制劑的負(fù)載是在0.0001％與50％之間。在另一個(gè)實(shí)施例中，平均在該第一和/或第二群體的合成納米載體上的該抗原的負(fù)載是在0.0001％與50％之間。在又另一個(gè)實(shí)施例中，該免疫抑制劑和/或抗原的負(fù)載是在0.01％與20％之間。在一個(gè)另外的實(shí)施例中，該免疫抑制劑和/或抗原的負(fù)載是在0.1％與10％之間。在再一個(gè)另外的實(shí)施例中，該免疫抑制劑和/或抗原的負(fù)載是在1％與10％之間。在又另一個(gè)實(shí)施例中，平均在一個(gè)群體的合成納米載體上的該免疫抑制劑和/或該抗原的負(fù)載是至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、或至少20％。在又一個(gè)另外的實(shí)施例中，平均在一個(gè)群體的合成納米載體上的該免疫抑制劑和/或該抗原的負(fù)載是0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、或20％。在以上這些實(shí)施例中的一些實(shí)施例中，平均在一個(gè)群體的合成納米載體上的該免疫抑制劑和/或該抗原的負(fù)載是不大于25％。在多個(gè)實(shí)施例中，如實(shí)例中所描述對(duì)該負(fù)載進(jìn)行計(jì)算。

在提供的任何這些組合物和方法的多個(gè)實(shí)施例中，可以如下計(jì)算該負(fù)載：收集近似3mg的合成納米載體，并且離心以使上清液與合成納米載體沉淀物分離。向該沉淀物添加乙腈，并且對(duì)樣品進(jìn)行超聲處理并離心以去除任何不溶的材料。在rp-hplc上注射該上清液和沉淀物，并且在278nm處讀取吸光度。該沉淀物中的μg用來(lái)計(jì)算％包載(負(fù)載)，在上清液和沉淀物中的μg用來(lái)計(jì)算回收的總μg。

“維持劑量”是指在初始劑量已經(jīng)在受試者中產(chǎn)生免疫抑制(例如，致耐受性)應(yīng)答之后，為了維持所希望的免疫抑制(例如，致耐受性)應(yīng)答而向受試者給予的劑量。維持劑量例如可以是維持在該初始劑量之后所實(shí)現(xiàn)的致耐受作用、防止該受試者中的所不希望的免疫應(yīng)答、或防止該受試者變?yōu)樘幱诮?jīng)歷所不希望的免疫應(yīng)答(包括所不希望的水平的免疫應(yīng)答)風(fēng)險(xiǎn)的受試者的劑量。在一些實(shí)施例中，該維持劑量是足以維持適當(dāng)水平的所希望的免疫應(yīng)答的劑量。在一些實(shí)施例中，該維持劑量是足以持續(xù)調(diào)節(jié)性b細(xì)胞數(shù)目和/或活性的適當(dāng)抗體滴度或水平(該滴度或水平是維持致耐受性免疫應(yīng)答所必需的)或抵抗導(dǎo)致所不希望的免疫應(yīng)答的一種物質(zhì)的激發(fā)的劑量。

“合成納米載體的最大尺寸”意指沿著該合成納米載體的任何軸線測(cè)量的納米載體的最大尺寸?！昂铣杉{米載體的最小尺寸”意指沿著該合成納米載體的任何軸線測(cè)量的合成納米載體的最小尺寸。例如，對(duì)于球形合成納米載體而言，合成納米載體的最大和最小尺寸將是基本上相同的，并且將是該合成納米載體的直徑的大小。類似地，針對(duì)立方形合成納米載體，合成納米載體的最小尺寸將是它的高度、寬度或長(zhǎng)度中最小的，而合成納米載體的最大尺寸將是它的高度、寬度或長(zhǎng)度中最大的。在一個(gè)實(shí)施例中，基于樣品中的合成納米載體的總數(shù)，樣品中至少75％、優(yōu)選地至少80％、更優(yōu)選地至少90％的這些合成納米載體的最小尺寸等于或大于100nm。在一個(gè)實(shí)施例中，基于樣品中的合成納米載體的總數(shù)，樣品中至少75％、優(yōu)選地至少80％、更優(yōu)選地至少90％的這些合成納米載體的最小尺寸等于或小于5μm。優(yōu)選地，基于樣品中的合成納米載體的總數(shù)，樣品中至少75％、優(yōu)選地至少80％、更優(yōu)選地至少90％的這些合成納米載體的最小尺寸大于110nm、更優(yōu)選地大于120nm、更優(yōu)選地大于130nm、并且還更優(yōu)選地大于150nm。發(fā)明的合成納米載體的最大尺寸與最小尺寸的長(zhǎng)寬比可以取決于實(shí)施例而變化。例如，這些合成納米載體的最大尺寸與最小尺寸的長(zhǎng)寬比可以從1∶1至1,000,000∶1、優(yōu)選地從1∶1至100,000∶1、更優(yōu)選地從1∶1至10,000∶1、更優(yōu)選地從1∶1至1000∶1、再更優(yōu)選地從1∶1至100∶1、并且又更優(yōu)選地從1∶1至10∶1變化。優(yōu)選地，基于樣品中的合成納米載體的總數(shù)，樣品中至少75％、優(yōu)選地至少80％、更優(yōu)選地至少90％的這些合成納米載體的最大尺寸等于或小于3μm、更優(yōu)選地等于或小于2μm、更優(yōu)選地等于或小于1μm、更優(yōu)選地等于或小于800nm、更優(yōu)選地等于或小于600nm、并且還更優(yōu)選地等于或小于500nm。在多個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，基于樣品中的合成納米載體的總數(shù)，樣品中至少75％、優(yōu)選地至少80％、更優(yōu)選地至少90％的這些合成納米載體的最小尺寸等于或大于100nm、更優(yōu)選地等于或大于120nm、更優(yōu)選地等于或大于130nm、更優(yōu)選地等于或大于140nm、并且還更優(yōu)選地等于或大于150nm。通過(guò)將這些合成納米載體懸浮在一種液體(通常是水性)介質(zhì)中，并且使用動(dòng)態(tài)光散射(dls)(例如使用一臺(tái)brookhavenzetapals儀器)，獲得合成納米載體尺寸(例如，直徑)的測(cè)量值。例如，可以將具有合成納米載體的懸浮液從水性緩沖劑中稀釋到純化水中以達(dá)到近似0.01至0.1mg/ml的最終的合成納米載體懸浮液濃度。可以在一個(gè)適合的比色皿中直接制備稀釋的懸浮液，或轉(zhuǎn)移至該比色皿中以用于dls分析。然后可以將該比色皿置于dls中，允許其平衡至受控的溫度，并且然后掃描充分的時(shí)間以在介質(zhì)的粘度和樣品的折射率的適當(dāng)輸入的基礎(chǔ)上獲得穩(wěn)定且可再現(xiàn)的分布。然后報(bào)告有效直徑，或該分布的平均值。合成納米載體的“尺寸”或“大小”或“直徑”意指使用動(dòng)態(tài)光散射獲得的粒度分布的平均值。

“mhc”是指主要組織相容性復(fù)合體，即在大多數(shù)脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的編碼mhc分子的一個(gè)大的基因組區(qū)或基因家族，這些mhc分子將被加工的蛋白質(zhì)的片段或表位展示在細(xì)胞表面上。細(xì)胞表面上的mhc：肽的呈遞允許通過(guò)免疫細(xì)胞(通常是t細(xì)胞)來(lái)監(jiān)視。存在兩大類mhc分子：i類和ii類。通常，i類mhc分子被發(fā)現(xiàn)在有核細(xì)胞上并且將肽呈遞給細(xì)胞毒性t細(xì)胞。ii類mhc分子被發(fā)現(xiàn)在某些免疫細(xì)胞(主要是巨噬細(xì)胞、b細(xì)胞以及樹(shù)突狀細(xì)胞)上，這些免疫細(xì)胞共同稱為專職性apc。mhc區(qū)中最有名的基因是編碼細(xì)胞表面上的抗原呈遞蛋白的亞型。在人類中，這些基因被稱為人白細(xì)胞抗原(hla)基因。

“非甲氧基封端的聚合物”意指具有以除了甲氧基之外的部分結(jié)束的至少一個(gè)末端的聚合物。在一些實(shí)施例中，該聚合物具有以除了甲氧基之外的部分結(jié)束的至少兩個(gè)末端。在其他實(shí)施例中，該聚合物不具有以甲氧基結(jié)束的末端?！胺羌籽趸舛说钠绽誓峥司酆衔铩币庵赋嗽趦蓚€(gè)末端處具有甲氧基的線性普朗尼克聚合物之外的一種聚合物。如在此所提供的聚合物納米顆粒可以包含非甲氧基封端的聚合物或非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。

“獲得”意指直接從一種材料中取得并且基本上不用改變和/或加工而使用。

“藥學(xué)上可接受的賦形劑”意指與列舉的這些合成納米載體一起使用以配制本發(fā)明的組合物的藥理學(xué)上非活性的材料。藥物學(xué)上可接受的賦形劑包含本領(lǐng)域中已知的各種材料，包括但不限于糖類(如葡萄糖、乳糖，等等)、防腐劑(如抗微生物劑)、復(fù)原助劑、著色劑、鹽水(如磷酸鹽緩沖鹽水)、以及緩沖劑。

“治療方案(protocol)”是指針對(duì)受試者的一種或多種物質(zhì)的任何給藥方案。給藥方案可以包括給藥的量、頻率和/或方式。在一些實(shí)施例中，此種治療方案可以用來(lái)向一個(gè)或多個(gè)測(cè)試受試者給予本發(fā)明的一種或多種組合物。然后可以對(duì)這些測(cè)試受試者中的免疫應(yīng)答進(jìn)行評(píng)定，以便確定該治療方案是否對(duì)降低所不希望的免疫應(yīng)答或產(chǎn)生所希望的免疫應(yīng)答(例如，促進(jìn)致耐受性作用)有效。還可以代替或除了前面提到的這些免疫應(yīng)答之外，對(duì)任何其他治療性和/或預(yù)防性作用進(jìn)行評(píng)定?？梢允褂迷诖颂峁┑娜魏畏椒ɑ虮绢I(lǐng)域中已知的其他方法確定一個(gè)治療方案是否具有所希望的作用。例如，可以從已經(jīng)根據(jù)一個(gè)具體的治療方案而被給予了在此提供的一種組合物的受試者中獲得一群細(xì)胞，以便確定特異性免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、抗體等等是否被減少、產(chǎn)生、激活等等。用于檢測(cè)免疫細(xì)胞的存在和/或數(shù)目的有用方法包括但不限于流式細(xì)胞檢測(cè)方法(例如，facs)和免疫組織化學(xué)方法。用于免疫細(xì)胞標(biāo)記的特異性染色的抗體和其他結(jié)合劑是商業(yè)上可獲得的。此類試劑盒典型地包括用于多種抗原的染色試劑，這些染色試劑允許來(lái)自異質(zhì)細(xì)胞群體的所希望的細(xì)胞群的基于facs的檢測(cè)、分離和/或定量。

“提供受試者”是引起臨床醫(yī)師與受試者接觸并且向其給予在此提供的一種組合物或在其上進(jìn)行在此提供的一種方法的任何行為或一系列行為。優(yōu)選地，該受試者是對(duì)如在此所提供的一種致耐受性免疫應(yīng)答有需要者。該行為或一系列行為可以是本身直接地或間接地，如但不限于，通過(guò)依賴某人的語(yǔ)言或行為采取行動(dòng)的不相關(guān)的第三方。

“調(diào)節(jié)性b細(xì)胞”是本領(lǐng)域所公認(rèn)的并且是指一種類型的致耐受性b細(xì)胞或具有抑制性調(diào)節(jié)功能。調(diào)節(jié)性b細(xì)胞所特有的表面標(biāo)記和趨化因子概況以及調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的子集(例如，產(chǎn)生il-10的breg)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的(例如，在迪利洛(dilillo)等人的在炎癥、自身免疫性以及癌癥中的b10細(xì)胞和調(diào)節(jié)性b細(xì)胞平衡免疫應(yīng)答(b10cellsandregulatorybcellsbalanceimmuneresponseduringinflammation，autoimmunity，andcancer)，紐約科學(xué)院年報(bào)(annn.y.acad.sci.)，1183(2010)38-57，issn0077-8923中所述；該文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用結(jié)合在此)。調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的存在可以通過(guò)使用流式細(xì)胞檢測(cè)就il-10進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色來(lái)確定。例如，在處理之后，可就細(xì)胞標(biāo)記對(duì)b細(xì)胞進(jìn)行染色，接著固定并且透化且就細(xì)胞內(nèi)il-10進(jìn)行染色，并且通過(guò)流式細(xì)胞檢測(cè)來(lái)分析。

“受試者”意指動(dòng)物，包括溫血哺乳動(dòng)物，如人類和靈長(zhǎng)類；鳥(niǎo)類；家庭飼養(yǎng)動(dòng)物或農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，如貓、狗、綿羊、山羊、牛、馬以及豬；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如小鼠、大鼠以及豚鼠；魚(yú)類；爬行動(dòng)物；動(dòng)物園和野生動(dòng)物；等等。

“基本上無(wú)mhci類限制性表位”是指不存在處于在抗原的背景下自身、與一種載體結(jié)合或與一種發(fā)明組合物結(jié)合刺激對(duì)i類背景下存在的表位特異的免疫應(yīng)答的基本上激活的量的mhci類限制性表位。在多個(gè)實(shí)施例中，基本上無(wú)mhci限制性表位的一種組合物不含可測(cè)量的量的抗原的mhci類限制性表位。在其他實(shí)施例中，此種組合物可以包含可測(cè)量的量的抗原的mhci類限制性表位，但所述量并不有效于產(chǎn)生一種可測(cè)量的細(xì)胞毒性t細(xì)胞免疫應(yīng)答(在抗原的背景下是其本身、與一種載體結(jié)合、或與一種發(fā)明組合物結(jié)合)或并不有效于產(chǎn)生一種顯著可測(cè)量的細(xì)胞毒性t細(xì)胞免疫應(yīng)答(在抗原的背景下是其本身、與一種載體結(jié)合、或與一種發(fā)明組合物結(jié)合)。在一些實(shí)施例中，一種顯著可測(cè)量的細(xì)胞毒性t細(xì)胞免疫應(yīng)答是在受試者中產(chǎn)生或?qū)㈩A(yù)期會(huì)產(chǎn)生不利的臨床結(jié)果的細(xì)胞毒性t細(xì)胞免疫應(yīng)答。在其他實(shí)施例中，一種顯著可測(cè)量的細(xì)胞毒性t細(xì)胞免疫應(yīng)答是大于由對(duì)照抗原(例如，已知不包含mhci類限制性表位或不刺激細(xì)胞毒性t細(xì)胞免疫應(yīng)答的抗原)產(chǎn)生的相同類型免疫應(yīng)答的水平的細(xì)胞毒性t細(xì)胞免疫應(yīng)答。

在多個(gè)實(shí)施例中，這些組合物不包含mhci類限制性表位(在抗原的背景下是其本身、與一種載體結(jié)合、或與一種發(fā)明組合物結(jié)合)，這些mhci類限制性表位產(chǎn)生抗原特異性的細(xì)胞毒性t細(xì)胞免疫應(yīng)答或其所不希望的水平。在一些實(shí)施例中，為了確保組合物不包含此類表位，對(duì)抗原進(jìn)行選擇，使得這些抗原不包含用于與在此提供的合成納米載體偶聯(lián)的mhci類限制性表位。在其他實(shí)施例中，為了確保組合物不包含此類表位，產(chǎn)生與抗原偶聯(lián)的合成納米載體并且就細(xì)胞毒性t細(xì)胞免疫應(yīng)答對(duì)其進(jìn)行測(cè)試。然后可以選擇適當(dāng)?shù)暮铣杉{米載體。

“一種或多種合成納米載體”意指在自然中未發(fā)現(xiàn)的、并且在大小上具有小于或等于5微米的至少一個(gè)尺寸的離散物體。白蛋白納米顆粒通常被包括為合成納米載體，然而在某些實(shí)施例中，這些合成納米載體并不包括白蛋白納米顆粒。在多個(gè)實(shí)施例中，發(fā)明的合成納米載體不包含殼聚糖。在其他實(shí)施例中，發(fā)明的合成納米載體不是基于脂質(zhì)的納米顆粒。在另外多個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明的合成納米載體不包含磷脂。

一種合成納米載體可以是但不限于以下各項(xiàng)中的一種或多種：基于脂質(zhì)的納米顆粒(在此又稱為脂質(zhì)納米顆粒，即構(gòu)成它們結(jié)構(gòu)的大多數(shù)材料是脂質(zhì)的納米顆粒)、聚合物納米顆粒、金屬納米顆粒、基于表面活性劑的乳液、樹(shù)枝狀化合物、巴基球、納米線、病毒樣顆粒(即，主要由病毒結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成、但不是感染性的或具有低感染性的顆粒)、基于肽或蛋白質(zhì)的顆粒(在此又稱為蛋白質(zhì)顆粒，即構(gòu)成它們結(jié)構(gòu)的大多數(shù)材料是肽或蛋白質(zhì)的顆粒)(如白蛋白納米顆粒)、和/或使用納米材料的組合而發(fā)展的納米顆粒(如脂質(zhì)-聚合物納米顆粒)。合成納米載體可以具有各種不同的形狀，包括但不局限于：球形、立方形、錐形、長(zhǎng)方形、圓柱形、螺旋管形，等等。根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體包含一個(gè)或多個(gè)表面?？梢赃m合用于實(shí)踐本發(fā)明的示例性的合成納米載體包括：(1)披露在格列夫(gref)等人的美國(guó)專利5,543,158中的可生物降解的納米顆粒、(2)薩爾茲曼(saltzman)等人的公開(kāi)美國(guó)專利申請(qǐng)20060002852的聚合物納米顆粒、(3)戴斯蒙(desimone)等人的公開(kāi)美國(guó)專利申請(qǐng)20090028910的光刻構(gòu)建(lithographicallyconstructed)的納米顆粒、(4)馮·艾德里安(vonandrian)等人的wo2009/051837的披露內(nèi)容、或(5)披露在佩納德斯(penades)等人的公開(kāi)美國(guó)專利申請(qǐng)2008/0145441中的納米顆粒、(6)披露在德洛斯里奧斯(delosrios)等人的公開(kāi)美國(guó)專利申請(qǐng)20090226525中的蛋白質(zhì)納米顆粒、(7)披露在西貝爾(sebbel)等人的公開(kāi)美國(guó)專利申請(qǐng)20060222652中的病毒樣顆粒、(8)披露在巴赫曼(bachmann)等人的公開(kāi)美國(guó)專利申請(qǐng)20060251677中的與核酸偶聯(lián)的病毒樣顆粒、(9)披露在wo2010047839a1或wo2009106999a2中的病毒樣顆粒、(10)披露在p·保利賽利(p.paolicelli)等人的“可以高效結(jié)合并遞送病毒樣顆粒的表面修飾的基于plga的納米顆粒(surface-modifiedplga-basednanoparticlesthatcanefficientlyassociateanddelivervirus-likeparticles)”納米醫(yī)學(xué)(nanomedicine)，5(6)：843-853(2010)中的納米沉淀的納米顆粒、或(11)披露在美國(guó)公開(kāi)號(hào)2002/0086049中的凋亡細(xì)胞、凋亡小體、或合成或半合成的模擬物。在多個(gè)實(shí)施例中，合成納米載體可以具有大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7、或大于1∶10的長(zhǎng)寬比。

具有等于或小于約100nm、優(yōu)選地等于或小于100nm的最小尺寸的根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體不包含具有使補(bǔ)體活化的羥基的表面，或可替代地包含主要由不是使補(bǔ)體活化的羥基的部分組成的表面。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，具有等于或小于約100nm、優(yōu)選地等于或小于100nm的最小尺寸的根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體不包含基本上使補(bǔ)體活化的表面，或可替代地包含主要由不是基本上使活化補(bǔ)體的部分組成的表面。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施例中，具有等于或小于約100nm、優(yōu)選地等于或小于100nm的最小尺寸的根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體不包含使補(bǔ)體活化的表面，或可替代地包含主要由不使補(bǔ)體活化的部分組成的表面。在多個(gè)實(shí)施例中，合成納米載體排除病毒樣顆粒。在多個(gè)實(shí)施例中，合成納米載體可以具有大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7、或大于1∶10的長(zhǎng)寬比。

“t細(xì)胞抗原”意指cd4+t細(xì)胞抗原或cd8+細(xì)胞抗原?！癱d4+t細(xì)胞抗原”意指由cd4+t細(xì)胞識(shí)別并且觸發(fā)cd4+t細(xì)胞中的免疫應(yīng)答的任何抗原，例如經(jīng)由結(jié)合到ii類主要組織相容性復(fù)合體分子(mhc)上的抗原或其一部分的呈遞而被cd4+t細(xì)胞上的t細(xì)胞受體特異性地識(shí)別的抗原?！癱d8+t細(xì)胞抗原”意指由cd8+t細(xì)胞識(shí)別并且觸發(fā)cd8+t細(xì)胞中的免疫應(yīng)答的任何抗原，例如經(jīng)由結(jié)合到i類主要組織相容性復(fù)合體分子(mhc)上的抗原或其一部分的呈遞而被cd8+t細(xì)胞上的t細(xì)胞受體特異性地識(shí)別的抗原。在一些實(shí)施例中，作為t細(xì)胞抗原的抗原也是一種b細(xì)胞抗原。在其他實(shí)施例中，該t細(xì)胞抗原并不也是一種b細(xì)胞抗原。t細(xì)胞抗原通常是蛋白類或肽類。

“治療性蛋白”是指可以向受試者給予并且具有一種治療性作用的任何蛋白質(zhì)或基于蛋白質(zhì)的療法。此類療法包括蛋白質(zhì)替代和蛋白質(zhì)補(bǔ)充療法。此類療法還包括給予外源或外來(lái)的蛋白質(zhì)、抗體療法、以及細(xì)胞或基于細(xì)胞的療法。治療性蛋白包括酶、酶輔助因子、激素、凝血因子、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、單克隆抗體、以及多克隆抗體。在此在其他地方提供了其他治療性蛋白的實(shí)例。可以在細(xì)胞之中、之上或由細(xì)胞產(chǎn)生治療性蛋白，并且可以從此類細(xì)胞中獲得治療性蛋白、或以此類細(xì)胞的形式給予這些治療性蛋白。在多個(gè)實(shí)施例中，在以下細(xì)胞之中、之上或由以下細(xì)胞產(chǎn)生該治療性蛋白：哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、酵母細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、植物細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞等等。可以在此類細(xì)胞中重組地產(chǎn)生該治療性蛋白?？梢栽诓《巨D(zhuǎn)化的細(xì)胞之中、之上或由病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生該治療性蛋白。還可以在自體細(xì)胞之中、之上或由自體細(xì)胞產(chǎn)生該治療性蛋白，這些自體細(xì)胞已經(jīng)被轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或以另外的方式操縱以表達(dá)該治療性蛋白?？商娲?，可以作為一種核酸或通過(guò)將一種核酸引入到病毒、vlp、脂質(zhì)體等等中來(lái)給予該治療性蛋白?？商娲?，可以從此類形式中獲得該治療性蛋白并且作為該治療性蛋白本身而給予。因此，受試者包括已經(jīng)接受、正接受或?qū)⒁邮苌鲜鋈魏挝镔|(zhì)的任何受試者。此類受試者包括已經(jīng)接受、正接受或?qū)⒁邮芤韵赂黜?xiàng)的受試者：基因治療；已經(jīng)被轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或以另外的方式操縱以表達(dá)一種治療性蛋白、多肽或肽的自體細(xì)胞；或表達(dá)一種治療性蛋白、多肽或肽的細(xì)胞。

“治療性蛋白抗原”意指與一種治療性蛋白相關(guān)聯(lián)的抗原，該治療性蛋白可以是、或該治療性蛋白的一部分可以是被呈遞以供免疫系統(tǒng)的細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別并且可以產(chǎn)生針對(duì)該治療性蛋白的一種所不希望的免疫應(yīng)答(例如，產(chǎn)生治療性蛋白特異性的抗體)。治療性蛋白抗原通常包括蛋白質(zhì)類、多肽類、肽類、脂蛋白類，或被包含在或表達(dá)在細(xì)胞之中、之上或由細(xì)胞表達(dá)。

“致耐受免疫應(yīng)答”意指可以導(dǎo)致對(duì)一種抗原或表達(dá)此種抗原的一種細(xì)胞、組織、器官等等特異的免疫抑制的任何免疫應(yīng)答。此類免疫應(yīng)答包括對(duì)該抗原或表達(dá)此抗原的細(xì)胞、組織、器官等等特異的所不希望的免疫應(yīng)答的任何降低、延遲或抑制。此類免疫應(yīng)答還包括對(duì)該抗原或表達(dá)此抗原的細(xì)胞、組織、器官等等特異的所希望的免疫應(yīng)答的任何刺激、產(chǎn)生、誘導(dǎo)、促進(jìn)或募集。因此，致耐受性免疫應(yīng)答包括不存在或降低針對(duì)抗原的所不希望的免疫應(yīng)答，這可以通過(guò)抗原反應(yīng)性細(xì)胞以及存在或促進(jìn)抑制性細(xì)胞來(lái)介導(dǎo)。在此所提供的致耐受性免疫應(yīng)答包括免疫耐受性?！爱a(chǎn)生致耐受性免疫應(yīng)答”意指產(chǎn)生對(duì)一種抗原或表達(dá)此抗原的細(xì)胞、組織、器官等等特異的任何上述免疫應(yīng)答。該致耐受性免疫應(yīng)答可以是mhci類限制性呈遞和/或mhcii類限制性呈遞和/或b細(xì)胞呈遞和/或由cd1d進(jìn)行的呈遞等等的結(jié)果。在多個(gè)實(shí)施例中，為了確保組合物包含所希望的表位，對(duì)抗原進(jìn)行選擇，使得這些抗原包含用于與如在此所提供的合成納米載體偶聯(lián)的此類表位。在其他實(shí)施例中，為了確保組合物包含此類表位，產(chǎn)生與抗原偶聯(lián)的合成納米載體并且就調(diào)節(jié)性b細(xì)胞免疫應(yīng)答如激活或產(chǎn)生對(duì)其進(jìn)行測(cè)試。然后可以選擇適當(dāng)?shù)暮铣杉{米載體。

致耐受性免疫應(yīng)答包括cd4+t細(xì)胞、cd8+t細(xì)胞或b細(xì)胞增殖和/或活性的任何降低、延遲或抑制。致耐受性免疫應(yīng)答還包括抗原特異性抗體產(chǎn)生的降低。致耐受性免疫應(yīng)答還可以包括導(dǎo)致調(diào)節(jié)性細(xì)胞的刺激、誘導(dǎo)、產(chǎn)生或募集的任何應(yīng)答，這些調(diào)節(jié)性細(xì)胞如cd4+treg細(xì)胞、cd8+treg細(xì)胞、breg細(xì)胞等等。在一些實(shí)施例中，該致耐受性免疫應(yīng)答是導(dǎo)致轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N調(diào)節(jié)性表型的致耐受性免疫應(yīng)答，該調(diào)節(jié)性表型的特征在于產(chǎn)生、誘導(dǎo)、刺激或募集調(diào)節(jié)性細(xì)胞。

致耐受性免疫應(yīng)答還包括導(dǎo)致cd4+treg細(xì)胞和/或cd8+treg細(xì)胞的刺激、產(chǎn)生或募集的任何應(yīng)答。cd4+treg細(xì)胞可以表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子foxp3并且抑制炎癥應(yīng)答和自身免疫性炎性疾病(自身免疫性疾病中的人調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(humanregulatorytcellsinautoimmunediseases)，科夫塔諾維奇·gl(cvetanovichgl)、哈弗·da(haflerda)，免疫學(xué)當(dāng)前觀點(diǎn)(curropinimmunol.)2010年12月；22(6)：753-60，調(diào)節(jié)性t細(xì)胞和自身免疫性(regulatorytcellsandautoimmunity)，維拉·j(vilaj)、艾薩克·jd(isaacsjd)、安德森·ae(andersonae)，血液學(xué)當(dāng)前觀點(diǎn)(curropinhematol.)2009年7月；16(4)：274-9)。此類細(xì)胞還抑制t細(xì)胞對(duì)b細(xì)胞的幫助并且誘導(dǎo)對(duì)自身和外來(lái)抗原的耐受性(基于foxp3+調(diào)節(jié)性t細(xì)胞活化和擴(kuò)增的過(guò)敏和自身免疫性的治療性方法(therapeuticapproachestoallergyandautoimmunitybasedonfoxp3+regulatoryt-cellactivationandexpansion)，宮良·m(miyaram)、水·k(wingk)、板口·(sakaguchis)，過(guò)敏臨床免疫學(xué)期刊(jallergyclinimmunol)，2009年4月；123(4)：749-55)。當(dāng)抗原由apc上的ii類蛋白質(zhì)呈遞時(shí)，cd4+treg細(xì)胞識(shí)別這種抗原。識(shí)別由i類(和qa-1)呈遞的抗原的cd8+treg細(xì)胞還可以抑制t細(xì)胞對(duì)b細(xì)胞的幫助，并且導(dǎo)致誘導(dǎo)對(duì)自身和外來(lái)抗原二者的耐受性的抗原特異性抑制的活化。已經(jīng)顯示，qa-1與cd8+treg細(xì)胞的相互作用的破壞可使免疫應(yīng)答失調(diào)，并且導(dǎo)致自身抗體形成和自身免疫性致命性系統(tǒng)性紅斑狼瘡的產(chǎn)生(金(kim)等人，自然(nature)，2010年9月16日，467(7313)：328-32)。還已經(jīng)顯示，cd8+treg細(xì)胞可抑制包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和結(jié)腸炎的自身免疫性炎性疾病的模型(自身免疫性關(guān)節(jié)炎中的cd4+cd25+調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(cd4+cd25+regulatorytcellsinautoimmunearthritis)，歐·s(ohs)、蘭金·al(rankinal)、卡頓·aj(catonaj)，免疫性評(píng)論(immunolrev)，2010年1月；233(1)：97-111，炎性腸病中的調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(regulatorytcellsininflammatoryboweldisease)，博登·ek(bodenek)、斯奈普·sb(snappersb)，腸胃病學(xué)當(dāng)前觀點(diǎn)(curropingastroenterol)，2008年11月；24(6)：733-41)。在一些實(shí)施例中，提供的這些組合物可以有效地產(chǎn)生兩種類型的應(yīng)答(cd4+treg和cd8+treg)。在其他實(shí)施例中，可以在其他免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、inkt細(xì)胞等等)中誘導(dǎo)foxp3，并且在此提供的這些組合物同樣可以產(chǎn)生這些應(yīng)答中的一種或多種。

致耐受性免疫應(yīng)答還包括但不限于：誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，如treg細(xì)胞因子；誘導(dǎo)抑制性細(xì)胞因子；抑制炎性細(xì)胞因子(例如，il-4、il-1b、il-5、tnf-α、il-6、gm-csf、ifn-γ、il-2、il-9、il-12、il-17、il-18、il-21、il-22、il-23、m-csf、c反應(yīng)性蛋白、急性期蛋白、趨化因子(例如，mcp-1、rantes、mip-1α、mip-1β、mig、itac或ip-10)；產(chǎn)生抗炎性細(xì)胞因子(例如，il-4、il-13、il-10等等)、趨化因子(例如，ccl-2、cxcl8)、蛋白酶(例如，mmp-3、mmp-9)、白三烯(例如，cyslt-1、cyslt-2)、前列腺素(例如，pge2)或組胺；抑制向th17、th1或th2免疫應(yīng)答的極化；抑制效應(yīng)細(xì)胞特異性細(xì)胞因子：th17(例如，il-17、il-25)、th1(ifn-γ)、th2(例如，il-4、il-13)；抑制th1特異性、th2特異性或th17特異性的轉(zhuǎn)錄因子；抑制效應(yīng)t細(xì)胞的增殖；誘導(dǎo)效應(yīng)t細(xì)胞的凋亡；誘導(dǎo)致耐受性的樹(shù)突狀細(xì)胞特異性的基因；誘導(dǎo)foxp3表達(dá)；抑制ige誘導(dǎo)或ige介導(dǎo)的免疫應(yīng)答；抑制抗體應(yīng)答(例如，抗原特異性抗體的產(chǎn)生)；抑制t輔助細(xì)胞應(yīng)答；產(chǎn)生tgf-β和/或il-10；抑制自身抗體的效應(yīng)子功能(例如，細(xì)胞耗盡、細(xì)胞或組織損傷、或補(bǔ)體活化的抑制)；等等。

任何上述的免疫應(yīng)答可以在一個(gè)或多個(gè)動(dòng)物模型中體內(nèi)測(cè)量或可以在體外測(cè)量。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉此類體內(nèi)或體外測(cè)量。所不希望的免疫應(yīng)答或致耐受性免疫應(yīng)答可以使用例如評(píng)定免疫細(xì)胞數(shù)目和/或功能的方法、四聚物分析、elispot、基于流式細(xì)胞檢測(cè)的細(xì)胞因子表達(dá)、細(xì)胞因子分泌的分析、細(xì)胞因子表達(dá)譜繪制、基因表達(dá)譜繪制、蛋白質(zhì)表達(dá)譜繪制、細(xì)胞表面標(biāo)記分析、基于pcr的免疫細(xì)胞受體基因用法的檢測(cè)(參見(jiàn)t·克雷(t.clay)等人，“用于監(jiān)測(cè)針對(duì)癌癥的主動(dòng)免疫治療的細(xì)胞免疫應(yīng)答的測(cè)定(assaysformonitoringcellularimmuneresponsetoactiveimmunotherapyofcancer)”臨床癌癥研究(clinicalcancerresearch)7：1127-1135(2001))等等來(lái)監(jiān)測(cè)。所不希望的免疫應(yīng)答或致耐受性免疫應(yīng)答還可以使用例如評(píng)定血漿或血清中的蛋白質(zhì)水平的方法、免疫細(xì)胞增殖和/或功能測(cè)定等等來(lái)監(jiān)測(cè)。在一些實(shí)施例中，致耐受性免疫應(yīng)答可以通過(guò)評(píng)定foxp3的誘導(dǎo)來(lái)監(jiān)測(cè)。另外，在實(shí)例中更詳細(xì)地描述了具體方法。

優(yōu)選地，致耐受性免疫應(yīng)答導(dǎo)致對(duì)在此描述的疾病、紊亂或病癥的發(fā)展、進(jìn)展或病理的抑制?？梢杂镁哂写祟惣膊　⑽蓙y或病癥的動(dòng)物模型來(lái)測(cè)量這些發(fā)明的組合物是否可以導(dǎo)致對(duì)在此描述的疾病、紊亂或病癥的發(fā)展、進(jìn)展或病理的抑制。在一些實(shí)施例中，可以通過(guò)確定臨床終點(diǎn)、臨床功效、臨床癥狀、疾病生物標(biāo)記和/或臨床得分來(lái)評(píng)定所不希望的免疫應(yīng)答的降低或致耐受性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。還可以用診斷試驗(yàn)評(píng)定所不希望的免疫應(yīng)答或致耐受性免疫應(yīng)答，以便評(píng)定在此所提供的疾病、紊亂或病癥的存在或不存在。可以進(jìn)一步通過(guò)測(cè)量受試者中的治療性蛋白水平和/或功能的方法來(lái)評(píng)定所不希望的或所希望的免疫應(yīng)答。在多個(gè)實(shí)施例中，用于監(jiān)測(cè)或評(píng)定所不希望的過(guò)敏性應(yīng)答的方法包括通過(guò)皮膚反應(yīng)性和/或過(guò)敏原特異性的抗體產(chǎn)生評(píng)定受試者中的一種過(guò)敏性應(yīng)答。

在一些實(shí)施例中，可以在給予在此提供的合成納米載體的一種組合物之前和/或在給予一種可移植的移植物或治療性蛋白或暴露于一種過(guò)敏原之前監(jiān)測(cè)或評(píng)定受試者中的一種所不希望的免疫應(yīng)答或一種致耐受性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。在其他實(shí)施例中，可以在給予在此提供的合成納米載體的一種組合物之后和/或在給予一種可移植的移植物或治療性蛋白或暴露于一種過(guò)敏原之后評(píng)定一種所不希望的免疫應(yīng)答或致耐受性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。在一些實(shí)施例中，在給予合成納米載體的該組合物之后、但在給予一種可移植的移植物或治療性蛋白或暴露于一種過(guò)敏原之前完成該評(píng)定。在其他實(shí)施例中，在給予一種可移植的移植物或治療性蛋白或暴露于一種過(guò)敏原之后、但在給予該組合物之前完成該評(píng)定。在再其他的實(shí)施例中，在給予這些合成納米載體和給予一種可移植的移植物或治療性蛋白或暴露于一種過(guò)敏原二者之前進(jìn)行該評(píng)定，而在又其他的實(shí)施例中，在給予合成納米載體和給予一種可移植的移植物或治療性蛋白或暴露于一種過(guò)敏原二者之后進(jìn)行該評(píng)定。在另外的多個(gè)實(shí)施例中，在給予這些合成納米載體和/或給予一種可移植的移植物或治療性蛋白或暴露于一種過(guò)敏原之前和之后都進(jìn)行該評(píng)定。在再其他的實(shí)施例中，在受試者上進(jìn)行多于一次的該評(píng)定，以便確定令人希望的免疫狀態(tài)被維持在該受試者中，該受試者如患上或正處于患上一種炎性疾病、一種自身免疫疾病、一種過(guò)敏癥、器官或組織排斥或移植物抗宿主病的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者。其他受試者包括已經(jīng)經(jīng)歷或?qū)⒁?jīng)歷移植的那些受試者以及已經(jīng)接受、正在接受或?qū)⒁邮芤环N治療性蛋白的那些受試者，針對(duì)該治療性蛋白，這些受試者已經(jīng)經(jīng)歷、正在經(jīng)歷或預(yù)期會(huì)經(jīng)歷一種所不希望的免疫應(yīng)答。

可以通過(guò)測(cè)定一個(gè)或多個(gè)抗體滴度來(lái)評(píng)定抗體應(yīng)答?！翱贵w滴度”意指抗體產(chǎn)生的可測(cè)量水平。用于測(cè)量抗體滴度的方法是本領(lǐng)域中已知的并且包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)。在多個(gè)實(shí)施例中，該抗體應(yīng)答可以被定量為例如抗體的數(shù)目、抗體的濃度、或滴度。這些值可以是絕對(duì)的或它們可以是相對(duì)的。用于定量抗體應(yīng)答的測(cè)定包括抗體捕獲測(cè)定、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)、抑制液相吸附測(cè)定(inhibitionliquidphaseabsorptionassay，ilpaa)、火箭免疫電泳(rocketimmunoelectrophoresis，rie)測(cè)定、以及線狀免疫電泳(lineimmunoelectrophoresis，lie)測(cè)定。當(dāng)比較一種抗體應(yīng)答與另一種抗體應(yīng)答時(shí)，優(yōu)選地使用相同類型的定量值(例如，滴度)和測(cè)量方法(例如，elisa)進(jìn)行該比較。

用于測(cè)量抗體滴度的elisa方法(例如，一種典型的夾心elisa)可以由以下步驟組成：(i)制備一種elisa-板包被材料，使得感興趣的抗體靶標(biāo)與一種底物聚合物或其他適合的材料偶聯(lián)；(ii)在一種水溶液(如pbs)中制備該包被材料，并且將該包被材料溶液遞送至一個(gè)多孔板的孔中用于使該包被層過(guò)夜沉積在該多孔板上；(iii)用洗滌緩沖液(如含0.05％吐溫-20的pbs)徹底洗滌該多孔板以去除過(guò)量的包被材料；(iv)通過(guò)施加一種稀釋劑溶液(如含10％胎牛血清的pbs)來(lái)封閉該板的非特異性結(jié)合；(v)用洗滌緩沖液將該封閉/稀釋劑溶液從該板上洗滌下來(lái)；(vi)根據(jù)需要用稀釋劑對(duì)含有抗體和適當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品(陽(yáng)性對(duì)照)的一種或多種血清樣品進(jìn)行稀釋，以獲得適當(dāng)?shù)厥筫lisa應(yīng)答飽和的濃度；(vii)在該多孔板上對(duì)這些血漿樣品進(jìn)行連續(xù)稀釋，這樣以涵蓋適用于產(chǎn)生elisa應(yīng)答曲線的濃度范圍；(viii)孵育該板以提供抗體-靶標(biāo)結(jié)合；(ix)用洗滌緩沖液洗滌該板以去除未結(jié)合抗原的抗體；(x)添加適當(dāng)濃度的處于相同稀釋劑中的一種第二檢測(cè)抗體，如能夠結(jié)合第一抗體的一種偶聯(lián)生物素的檢測(cè)抗體；(xi)用所施加的該檢測(cè)抗體孵育該板，隨后用洗滌緩沖液進(jìn)行洗滌；(xii)添加將與生物素化的抗體上發(fā)現(xiàn)的生物素結(jié)合的酶(如鏈霉親和素-hrp(辣根過(guò)氧化物酶))并且進(jìn)行孵育；(xiii)洗滌該多孔板；(xiv)將一種或多種底物(如tmb溶液)添加至該板上；(xv)當(dāng)顯色完全時(shí)施加一種終止溶液(如2n硫酸)；(xvi)在針對(duì)該底物的特定波長(zhǎng)下讀取這些板孔的光密度(450nm減去570nm處的讀數(shù))；(xvi)對(duì)數(shù)據(jù)應(yīng)用一個(gè)適合的多參數(shù)曲線擬合，并且將半最大有效濃度(ec50)定義為達(dá)到這些板標(biāo)準(zhǔn)品的半最大值od值時(shí)的曲線上的濃度。

“可移植的移植物”是指可以給予一位受試者的生物材料，如細(xì)胞、組織以及器官(全部或部分地)?？梢浦驳囊浦参锟梢允抢缫环N生物材料(如器官、組織、皮膚、骨骼、神經(jīng)、腱、神經(jīng)元、血管、脂肪、角膜、多能細(xì)胞、分化細(xì)胞(在體內(nèi)或體外獲得或衍生的)等的自身移植物、同種異體移植物、或異種移植物。在一些實(shí)施例中，可移植的移植物例如由軟骨、骨骼、細(xì)胞外基質(zhì)、或膠原基質(zhì)形成?？梢浦驳囊浦参镞€可以是單細(xì)胞、細(xì)胞懸浮液以及可以被移植的組織和器官中的細(xì)胞?？梢浦驳募?xì)胞典型地具有一種治療功能，例如在受體受試者中缺乏或減退的功能?？梢浦驳募?xì)胞的一些非限制性實(shí)例是β細(xì)胞、肝細(xì)胞、造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、或成髓鞘細(xì)胞?？梢浦驳募?xì)胞可以是未修飾的細(xì)胞，例如從供體受試者獲得的并且可用于移植而沒(méi)有任何遺傳或表觀遺傳修飾的細(xì)胞。在其他實(shí)施例中，可移植的細(xì)胞可以是被修飾的細(xì)胞，例如獲得自具有遺傳缺陷、其中該遺傳缺陷已得到糾正的受試者的細(xì)胞；或來(lái)源于重新編程的細(xì)胞的細(xì)胞，例如來(lái)源于獲得自受試者的細(xì)胞的分化細(xì)胞。

“移植”是指將一個(gè)可移植的移植物(例如，從供體受試者、從體外來(lái)源(例如分化的自體或異體原生的或誘導(dǎo)的多能細(xì)胞))轉(zhuǎn)移(移動(dòng))到一個(gè)受體受試者中和/或在同一受試者中從一個(gè)身體部位轉(zhuǎn)移(移動(dòng))到另一個(gè)身體部位的過(guò)程。

“所不希望的免疫應(yīng)答”是指由暴露于抗原而引起的、促進(jìn)或加劇在此提供的疾病、紊亂或病癥(或其癥狀)的、或是在此提供的疾病、紊亂或病癥的癥狀的任何所不希望的免疫應(yīng)答。此類免疫應(yīng)答通常對(duì)受試者的健康具有負(fù)面影響或表明對(duì)受試者的健康的負(fù)面影響。

c.發(fā)明組合物

在此提供了用于產(chǎn)生調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的方法和組合物。據(jù)信調(diào)節(jié)性b細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，例如，是在于從調(diào)節(jié)性b細(xì)胞釋放的il-10對(duì)大多數(shù)造血細(xì)胞發(fā)揮抗炎性和免疫抑制性作用。il-10還抑制由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞造成的促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生和抗原特異性的cd4+t細(xì)胞的增殖。不希望受任何具體理論束縛，人們認(rèn)為在此提供的組合物可以通過(guò)例如與初始b細(xì)胞或調(diào)節(jié)性b細(xì)胞前體相互作用從而造成調(diào)節(jié)性b細(xì)胞成熟的誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)性b細(xì)胞增殖和/或活性的增加而在體外和/或體內(nèi)影響調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的數(shù)目和/或活性。對(duì)調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的數(shù)目和/或活性的影響還可以是產(chǎn)生其他調(diào)節(jié)性細(xì)胞或致耐受性免疫應(yīng)答(如通過(guò)調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的產(chǎn)生和/或活化)的結(jié)果。

在此提供了多種致耐受性方法和相關(guān)組合物，這些方法包括給予合成納米載體組合物，這些合成納米載體組合物包含免疫抑制劑和一種抗原的b細(xì)胞表位和/或mhcii類限制性表位。此類方法和組合物對(duì)于產(chǎn)生、刺激或募集調(diào)節(jié)性b細(xì)胞和促進(jìn)致耐受性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生是有用的。提供的這些方法還可以包括給予多種治療性蛋白和/或可移植的移植物。因此，提供的這些組合物還可以包括這些治療性蛋白和/或可移植的移植物?？梢韵蛳Ｍ兄履褪苄悦庖邞?yīng)答的受試者給予這些組合物。此類受試者包括已經(jīng)患上或正處于患上一種炎性疾病、一種自身免疫性疾病、一種過(guò)敏癥、器官或組織排斥、或移植物抗宿主病的風(fēng)險(xiǎn)中的那些受試者。此類受試者還包括已經(jīng)被、正在被或?qū)⒁唤o予一種治療性蛋白的那些受試者，針對(duì)該治療性蛋白，該受試者已經(jīng)經(jīng)歷或預(yù)期會(huì)經(jīng)歷一種不所希望的免疫應(yīng)答。此類受試者還包括已經(jīng)經(jīng)歷或?qū)⒁?jīng)歷移植的那些受試者。

優(yōu)選地，發(fā)明組合物造成調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的產(chǎn)生、募集或活化。調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)志是產(chǎn)生和分泌il-10的能力。一些調(diào)節(jié)性b細(xì)胞是cd1d+或cd1d高。一些調(diào)節(jié)性b細(xì)胞是cd5+和/或cd19+。例如，一些調(diào)節(jié)性b細(xì)胞是cd1d高cd5+cd19+。一些調(diào)節(jié)性b細(xì)胞是cd24+或cd24高；和/或cd38+或cd38高。例如，一些調(diào)節(jié)性b細(xì)胞是cd19+cd24高cd38高。一些調(diào)節(jié)性b細(xì)胞產(chǎn)生并分泌il-10?？梢杂糜阼b定調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的另外的表面標(biāo)記和趨化因子分泌譜是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。基于對(duì)各種調(diào)節(jié)性b細(xì)胞群體的鑒定有用的表面標(biāo)記的了解，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠鑒定并枚舉一個(gè)異質(zhì)細(xì)胞群體中(例如在處于培養(yǎng)中的一群細(xì)胞中或在獲得自受試者的一群細(xì)胞中)的調(diào)節(jié)性b細(xì)胞。

如上所提及，合成納米載體被設(shè)計(jì)為包含b細(xì)胞表位和/或mhcii類限制性表位和/或免疫抑制劑。根據(jù)本發(fā)明，可以使用各種各樣的合成納米載體。在一些實(shí)施例中，合成納米載體是球體或球狀體。在一些實(shí)施例中，合成納米載體是扁平的或盤狀的。在一些實(shí)施例中，合成納米載體是立方體或立方形的。在一些實(shí)施例中，合成納米載體是卵形或橢圓形的。在一些實(shí)施例中，合成納米載體是圓柱體、錐體、或錐形。

在一些實(shí)施例中，希望使用在大小、形狀、和/或構(gòu)成方面較一致的一個(gè)群體的合成納米載體，使得每一合成納米載體具有相似特性。例如，基于合成納米載體的總數(shù)，至少80％、至少90％、或至少95％的這些合成納米載體可以具有歸屬在這些合成納米載體的平均直徑或平均尺寸的5％、10％或20％之內(nèi)的最小尺寸或最大尺寸。在一些實(shí)施例中，一個(gè)群體的合成納米載體可以在大小、形狀、和/或構(gòu)成方面是不均勻的。

合成納米載體可以是實(shí)心的或空心的，并且可以包含一個(gè)或多個(gè)層。在一些實(shí)施例中，每一層相對(duì)于其他一層或多層具有獨(dú)特的構(gòu)成和獨(dú)特的特性。為了作為一個(gè)實(shí)例給出，合成納米載體可以具有一個(gè)核/殼結(jié)構(gòu)，其中該核是一個(gè)層(例如一個(gè)聚合物核)并且該殼是一個(gè)第二層(例如一個(gè)脂質(zhì)雙層或單層)。合成納米載體可以包括多個(gè)不同的層。

在一些實(shí)施例中，合成納米載體可以任選地包含一種或多種脂質(zhì)。在一些實(shí)施例中，合成納米載體可以包括一種脂質(zhì)體。在一些實(shí)施例中，合成納米載體可以包含一個(gè)脂質(zhì)雙層。在一些實(shí)施例中，合成納米載體可以包含一個(gè)脂質(zhì)單層。在一些實(shí)施例中，合成納米載體可以包含一種微膠粒。在一些實(shí)施例中，合成納米載體可以包含一個(gè)核，該核包含被一個(gè)脂質(zhì)層(例如，脂質(zhì)雙層、脂質(zhì)單層等等)圍繞的一種聚合物基質(zhì)。在一些實(shí)施例中，合成納米載體可以包含被一個(gè)脂質(zhì)層(例如，脂質(zhì)雙層、脂質(zhì)單層等等)圍繞的一個(gè)非聚合物核(例如，金屬顆粒、量子點(diǎn)、陶瓷顆粒、骨顆粒、病毒顆粒、蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物等等)。

在其他實(shí)施例中，合成納米載體可以包含金屬顆粒、量子點(diǎn)、陶瓷顆粒等等。在一些實(shí)施例中，非聚合物合成納米載體是非聚合組分的一個(gè)聚集體，如金屬原子(例如金原子)的一個(gè)聚集體。

在一些實(shí)施例中，合成納米載體可以任選地包含一種或多種兩親實(shí)體。在一些實(shí)施例中，兩親實(shí)體可以促進(jìn)具有增加的穩(wěn)定性、改進(jìn)的均勻性、或增加的粘度的合成納米載體的產(chǎn)生。在一些實(shí)施例中，兩親實(shí)體可以與一個(gè)脂質(zhì)膜(例如，脂質(zhì)雙層、脂質(zhì)單層等等)的內(nèi)表面結(jié)合。在本領(lǐng)域中已知的許多兩親實(shí)體可以適用于制造根據(jù)本發(fā)明的合成納米載體。此類兩親實(shí)體包括但不限于：磷酸甘油酯類；磷脂酰膽堿類；二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dppc)；二油烯基磷脂?；掖及?dope)；二油烯基氧丙基三乙基銨(dotma)；二油酰基磷脂酰膽堿；膽固醇；膽固醇酯；二?；视停欢；视顽晁狨?；二磷脂酰基甘油(dppg)；十六烷醇；脂肪醇類，如聚乙二醇(peg)；聚氧乙烯-9-月桂基醚；一種表面活性脂肪酸，如棕櫚酸或油酸；脂肪酸類；脂肪酸甘油單酯類；脂肪酸甘油二酯類；脂肪酸酰胺類；脫水山梨糖醇三油酸酯甘氨膽酸酯；脫水山梨糖醇單月桂酸酯聚山梨醇酯20聚山梨醇酯60聚山梨醇酯65聚山梨醇酯80聚山梨醇酯85聚氧乙烯單硬脂酸酯；表面活性素；泊洛沙姆；一種脫水山梨糖醇脂肪酸酯，如脫水山梨糖醇三油酸酯；卵磷脂；溶血卵磷脂；磷脂酰絲氨酸；磷脂酰肌醇；鞘磷脂；磷脂酰乙醇胺(腦磷脂)；心磷脂；磷脂酸；腦苷脂；雙十六烷基磷酸酯；二棕櫚酰磷脂酰甘油；硬脂酰胺；十二烷胺；十六烷胺；乙?；貦八狨ィ槐吐橛退岣视王?；十八酸十六烷基酯；肉豆蔻酸異丙酯；四丁酚醛(tyloxapol)；聚(乙二醇)5000-磷脂酰乙醇胺；聚(乙二醇)400-單硬脂酸酯；磷脂；具有高表面活性劑特性的合成的和/或天然的洗滌劑；脫氧膽酸酯；環(huán)糊精；離液序列高的鹽；離子對(duì)試劑；以及它們的組合。兩親實(shí)體組分可以是不同兩親實(shí)體的混合物。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，這是具有表面活性劑活性的物質(zhì)的示例性的、而不是全面的清單。任何兩親實(shí)體可以用于有待根據(jù)本發(fā)明使用的合成納米載體的生產(chǎn)中。

在一些實(shí)施例中，合成納米載體可以任選地包含一種或多種碳水化合物。碳水化合物可以是天然的或合成的。碳水化合物可以是衍生的天然碳水化合物。在某些實(shí)施例中，碳水化合物包含單糖或二糖，包括但不限于：葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖、纖維二糖(cellbiose)、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺、以及神經(jīng)氨酸。在某些實(shí)施例中，碳水化合物是一種多糖，包括但不限于：支鏈淀粉、纖維素、微晶纖維素、羥丙基甲基纖維素(hpmc)、羥基纖維素(hc)、甲基纖維素(mc)、葡聚糖、環(huán)葡聚糖、糖原、羥乙基淀粉、卡拉膠、多聚糖(glycon)、直鏈淀粉、殼聚糖、n，o-羧甲基殼聚糖、藻膠和海藻酸、淀粉、甲殼質(zhì)、菊糖、魔芋、葡萄甘露聚糖(glucommannan)、石耳素、肝素、透明質(zhì)酸、凝膠多糖、以及黃原膠。在實(shí)施例中，這些發(fā)明的合成納米載體并不包含(或特別排除)碳水化合物，如多糖。在某些實(shí)施例中，該碳水化合物可以包含一種碳水化合物衍生物，如一種糖醇，包括但不限于：甘露醇、山梨醇、木糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、以及乳糖醇。

在一些實(shí)施例中，合成納米載體可以包含一種或多種聚合物。在一些實(shí)施例中，這些合成納米載體包含一種或多種聚合物，該聚合物是非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。在一些實(shí)施例中，構(gòu)成這些合成納米載體的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、或99％(重量/重量)的這些聚合物是非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。在一些實(shí)施例中，構(gòu)成這些合成納米載體的所有這些聚合物是非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。在一些實(shí)施例中，這些合成納米載體可以包含一種或多種聚合物，該聚合物是非甲氧基封端的聚合物。在一些實(shí)施例中，構(gòu)成這些合成納米載體的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、或99％(重量/重量)的這些聚合物是非甲氧基封端的聚合物。在一些實(shí)施例中，構(gòu)成這些合成納米載體的所有這些聚合物是非甲氧基封端的聚合物。在一些實(shí)施例中，這些合成納米載體包含一種或多種聚合物，這些聚合物不包含普朗尼克聚合物。在一些實(shí)施例中，構(gòu)成這些合成納米載體的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、或99％(重量/重量)的這些聚合物不包含普朗尼克聚合物。在一些實(shí)施例中，構(gòu)成這些合成納米載體的所有這些聚合物不包含普朗尼克聚合物。在一些實(shí)施例中，可以由包被層(例如脂質(zhì)體、脂質(zhì)單層、微膠粒等)環(huán)繞這樣一種聚合物。在一些實(shí)施例中，合成納米載體的不同成分可以與該聚合物偶聯(lián)。

可以通過(guò)多種方法中的任一種使這些免疫抑制劑和/或抗原與這些合成納米載體偶聯(lián)。通常，該偶聯(lián)可以是這些免疫抑制劑和/或抗原與這些合成納米載體之間鍵合的結(jié)果。這種鍵合可以導(dǎo)致這些免疫抑制劑和/或抗原附著至合成納米載體的表面上和/或被包含(封裝)在合成納米載體之內(nèi)。然而，在一些實(shí)施例中，這些免疫抑制劑和/或抗原由于這些合成納米載體的結(jié)構(gòu)而被合成納米載體封裝，而不是鍵合至合成納米載體上。在多個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，合成納米載體包含如在此所提供的一種聚合物，并且這些免疫抑制劑和/或抗原與聚合物偶聯(lián)。

當(dāng)由于這些免疫抑制劑和/或抗原與合成納米載體之間的鍵合而發(fā)生偶聯(lián)時(shí)，該偶聯(lián)可以經(jīng)由一個(gè)偶聯(lián)部分而發(fā)生。一個(gè)偶聯(lián)部分可以是通過(guò)其使免疫抑制劑和/或抗原鍵合至合成納米載體上的任何部分。此類部分包括共價(jià)鍵(如一個(gè)酰胺鍵或酯鍵)、以及使免疫抑制劑和/或抗原鍵合(共價(jià)地或非共價(jià)地)至該合成納米載體上的單獨(dú)的分子。此類分子包括連接物或聚合物或其單元。例如，該偶聯(lián)部分可以包含免疫抑制劑和/或抗原靜電結(jié)合至其上的一種帶電荷的聚合物。作為另一個(gè)實(shí)例，該偶聯(lián)部分可以包含它共價(jià)結(jié)合至其上的一種聚合物或其單元。

在多個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，這些合成納米載體包含如在此所提供的一種聚合物。這些合成納米載體可以是完全聚合的或它們可以是聚合物與其他材料的混合物。

在一些實(shí)施例中，具有合成納米載體的這些聚合物結(jié)合以形成一種聚合物基質(zhì)。在這些實(shí)施例中的一些中，一種組分(如一種免疫抑制劑或抗原)可以與該聚合物基質(zhì)中的一種或多種聚合物共價(jià)結(jié)合。在一些實(shí)施例中，共價(jià)結(jié)合是由一個(gè)連接物介導(dǎo)的。在一些實(shí)施例中，一種組分可以與該聚合物基質(zhì)中的一種或多種聚合物非共價(jià)結(jié)合。例如，在一些實(shí)施例中，一種組分可以被封裝在一種聚合物基質(zhì)之內(nèi)、被聚合物基質(zhì)圍繞、和/或分散在整個(gè)聚合物基質(zhì)中?？商娲鼗蛄硗獾?，一種組分可以通過(guò)疏水相互作用、電荷相互作用、范德華力等等與一種聚合物基質(zhì)中的一種或多種聚合物結(jié)合。用于從其形成聚合物基質(zhì)的各種各樣的聚合物和方法是常規(guī)已知的。

聚合物可以是天然的或非天然的(合成的)聚合物。聚合物可以是均聚物或包含兩種或更多種單體的共聚物。在序列方面，共聚物可以是隨機(jī)的、嵌段的，或包含隨機(jī)序列與嵌段序列的組合。典型地，根據(jù)本發(fā)明的聚合物是有機(jī)聚合物。

在一些實(shí)施例中，聚合物包括一種聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、或聚醚、或其單元。在其他實(shí)施例中，聚合物包括聚(乙二醇)(peg)、聚丙二醇、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物、或一種聚己酸內(nèi)酯、或其單元。在一些實(shí)施例中，優(yōu)選的是該聚合物是可生物降解的。因此，在這些實(shí)施例中，優(yōu)選的是如果該聚合物包含一種聚醚(如聚(乙二醇)或聚丙二醇或其單元)，則該聚合物包含一種聚醚和一種可生物降解的聚合物的嵌段共聚物，使得該聚合物是可生物降解的。在其他實(shí)施例中，該聚合物不僅僅包含一種聚醚或其單元，如聚(乙二醇)或聚丙二醇或其單元。

適合用于本發(fā)明的聚合物的其他實(shí)例包括但不限于：聚乙烯、聚碳酸酯(例如聚(1，3-二噁烷-2酮))、聚酐(例如聚(癸二酸酐))、聚丙基延胡索酸酯(polypropylfumerate)、聚酰胺(例如聚己內(nèi)酰胺)、聚縮醛、聚醚、聚酯(例如聚丙交酯、聚乙交酯、丙交酯-乙交酯共聚物、聚己酸內(nèi)酯、多羥基酸(例如聚(β-羥基烷酸酯)、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、以及聚胺、聚賴氨酸、聚賴氨酸-peg共聚物、以及聚(乙烯亞胺)、聚(乙烯亞胺)-peg共聚物。

在一些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的聚合物包括在21c.f.r.§177.2600下已經(jīng)由美國(guó)食品與藥品管理局(fda)批準(zhǔn)用于人的聚合物，包括但并不局限于聚酯(例如聚乳酸、聚(乳酸乙醇酸共聚物)、聚己內(nèi)酯、聚戊內(nèi)酯、聚(1，3-二噁烷-2酮))；聚酐(例如聚(癸二酸酐))；聚醚(例如聚乙二醇)；聚氨酯；聚甲基丙烯酸酯；聚丙烯酸酯；以及聚氰基丙烯酸酯。

在一些實(shí)施例中，聚合物可以是親水性的。例如，聚合物可以包含陰離子基團(tuán)(例如磷酸根、硫酸根、羧酸根)；陽(yáng)離子基團(tuán)(例如，季胺基團(tuán))；或極性基團(tuán)(例如，羥基基團(tuán)、硫醇基團(tuán)、胺基團(tuán))。在一些實(shí)施例中，包含一種親水性聚合物基質(zhì)的合成納米載體在該合成納米載體內(nèi)產(chǎn)生親水環(huán)境。在一些實(shí)施例中，聚合物可以是疏水性的。在一些實(shí)施例中，包含疏水性聚合物基質(zhì)的合成納米載體在該合成納米載體內(nèi)產(chǎn)生疏水環(huán)境。聚合物親水性或疏水性的選擇可以影響被結(jié)合(例如偶聯(lián))在合成納米載體之內(nèi)的材料的性質(zhì)。

在一些實(shí)施例中，聚合物可以用一個(gè)或多個(gè)部分和/或官能團(tuán)修飾。根據(jù)本發(fā)明，可以使用各種各樣的部分或官能團(tuán)。在一些實(shí)施例中，可以用聚乙二醇(peg)、用碳水化合物、和/或用衍生自多糖類的非環(huán)狀聚縮醛來(lái)修飾聚合物(papisov(巴比索夫)，2001，acssymposiumseries，786：301)?？梢允褂胓ref(格里夫)等人的美國(guó)專利號(hào)5543158、或vonandrian(馮安德里安)等人的wo公開(kāi)wo2009/051837中的全部傳授內(nèi)容進(jìn)行某些實(shí)施例。

在一些實(shí)施例中，可以用脂質(zhì)或脂肪酸基團(tuán)修飾聚合物。在一些實(shí)施例中，脂肪酸基團(tuán)可以是丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、山崳酸、或廿四烷酸中的一種或多種。在一些實(shí)施例中，脂肪酸基團(tuán)可以是棕櫚烯酸、油酸、異油酸、亞麻酸、α-亞麻酸、γ-亞麻酸、花生四烯酸、二十碳烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、或芥酸中的一種或多種。

在一些實(shí)施例中，聚合物可以是聚酯，包括共聚物，這些共聚物包括乳酸和乙醇酸單元(例如聚(乳酸乙醇酸共聚物)和聚(丙交酯乙交酯共聚物))，在此統(tǒng)稱為“plga”；以及包括乙醇酸單元的均聚物，在此稱為“pga”，以及乳酸單元(例如聚-l-乳酸、聚-d-乳酸、聚-d，l-乳酸、聚-l-丙交酯、聚-d-丙交酯、以及聚-d，l-丙交酯)，在此統(tǒng)稱為“pla”。在一些實(shí)施例中，示例性的聚酯包括，例如多羥基酸；peg共聚物和丙交酯與乙交酯的共聚物(例如pla-peg共聚物、pga-peg共聚物、plga-peg共聚物)，以及它們的衍生物)。在一些實(shí)施例中，聚酯包括例如聚(己內(nèi)酯)、聚(己內(nèi)酯)-peg共聚物、聚(l-丙交酯-l-賴氨酸共聚物)、聚(絲氨酸酯)、聚(4-羥基-l-脯氨酸酯)、聚[α-(4-氨基丁基)-l-乙醇酸]、以及它們的衍生物。

在一些實(shí)施例中，聚合物可以是plga。plga是一種生物相容的并且生物可降解的乳酸和乙醇酸的共聚物，并且多種形式的plga特征在于乳酸∶乙醇酸的比率。乳酸可以是l-乳酸、d-乳酸、或d，l-乳酸?？梢酝ㄟ^(guò)改變?nèi)樗帷靡掖妓岬谋嚷收{(diào)整plga的降解速率。在一些實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的將使用的plga特征在于大約85∶15、大約75∶25、大約60∶40、大約50∶50、大約40∶60、大約25∶75、或者大約15∶85的乳酸∶乙醇酸比率。

在一些實(shí)施例中，聚合物可以是一種或多種丙烯酸聚合物。在某些實(shí)施例中，丙烯酸聚合物包括，例如丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰基乙基酯、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、甲基丙烯酸烷基酰胺共聚物、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸酸酐)、甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)共聚物、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、甲基丙烯酸縮水甘油酯共聚物、聚腈基丙烯酸酯、以及包括一種或多種以上聚合物的組合。該丙烯酸聚合物可以包含具有低含量的季銨基團(tuán)的丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的完全聚合的共聚物。

在一些實(shí)施例中，聚合物可以是陽(yáng)離子型聚合物。通常，陽(yáng)離子型聚合物能夠縮合和/或保護(hù)核酸(例如dna、或它的衍生物)的帶負(fù)電的鏈。含有胺的聚合物(例如聚(賴氨酸)(zauner(澤納)等人，1998，先進(jìn)藥物遞送綜述，30：97；以及kabanov(卡巴諾夫)等人，1995，生物共軛化學(xué)，6：7)、聚(亞乙基亞胺)(pei；boussif(波希夫)等人，1995，美國(guó)科學(xué)院院刊，1995，92：7297)、以及聚(酰胺胺)樹(shù)枝狀聚合物(kukowska(庫(kù)科斯卡)-latallo(拉塔羅)等人，1996，美國(guó)科學(xué)院院刊，93：4897；tang(唐)等人，1996，生物共軛化學(xué)，7：703；以及haensler(亨斯勒)等人，1993，生物共軛化學(xué)，4：372)在生理ph下是帶正電的，在多種細(xì)胞系中與核酸形成離子對(duì)，并且介導(dǎo)轉(zhuǎn)染。在多個(gè)實(shí)施例中，這些發(fā)明的合成納米載體可以不包含(或可以排除)陽(yáng)離子型聚合物。

在一些實(shí)施例中，聚合物可以是帶有陽(yáng)離子側(cè)鏈的可降解聚酯(putnam(普特南)等人，1999，大分子，32：3658；barrera(巴雷拉)等人，1993，美國(guó)化學(xué)會(huì)志，115：11010；kwon(權(quán))等人，1989，大分子，22：3250；lim(林)等人，1999，美國(guó)化學(xué)會(huì)志，121：5633；以及zhou(周)等人，1990，大分子，23：3399)。這些聚酯的實(shí)例包括聚(l-丙交酯l-賴氨酸共聚物)(barrera(巴雷拉)等人，1993，美國(guó)化學(xué)會(huì)志，115：11010)、聚(絲氨酸酯)(zhou(周)等人，1990，大分子，23：3399)、聚(4-羥基-l-脯氨酸酯)(putnam(普特南)等人，1999，大分子，32：3658；以及l(fā)im(林)等人，1999，美國(guó)化學(xué)會(huì)志，121：5633)、以及聚(4-羥基-l-脯氨酸酯)(putnam(普特南)等人，1999，大分子，32：3658；以及l(fā)im(林)等人，1999，美國(guó)化學(xué)會(huì)志，121：5633)。

這些和其他聚合物的特性以及用于制備它們的方法在本領(lǐng)域中是熟知的(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利6,123,727；5,804,178；5,770,417；5,736,372；5,716,404；6,095,148；5,837,752；5,902,599；5,696,175；5,514,378；5,512,600；5,399,665；5,019,379；5,010,167；4,806,621；4,638,045；以及4,946,929；wang(王)等人，2001，美國(guó)化學(xué)會(huì)志，123：9480；lim(林)等人，2001，美國(guó)化學(xué)會(huì)志，123：2460；langer(朗格爾)，2000，化學(xué)研究評(píng)述，33：94；langer(朗格爾)，1999，控釋雜志，62：7；以及uhrich(烏利希)等人，1999，化學(xué)評(píng)論，99：3181)。更一般地，在conciseencyclopediaofpolymerscienceandpolymericaminesandammoniumsalts，goethals(戈薩爾斯)編輯，培格曼出版社，1980中；在principlesofpolymerizationbyodian，約翰·威利父子出版公司，第四版，2004中；在allcock(阿爾庫(kù)克)等人的contemporarypolymerchemistry，prentice-hall，1981中；在deming(德明)等人，1997，自然，390：386中；以及在美國(guó)專利6,506,577、6,632,922、6,686,446、以及6,818,732中說(shuō)明了用于合成某些適合的聚合物的多種方法。

在一些實(shí)施例中，聚合物可以是線型聚合物或分支聚合物。在一些實(shí)施例中，聚合物可以是樹(shù)枝狀化合物。在一些實(shí)施例中，聚合物可以是基本上彼此交聯(lián)的。在一些實(shí)施例中，聚合物可以基本上不交聯(lián)。在一些實(shí)施例中，聚合物可以根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行使用而不經(jīng)歷交聯(lián)步驟。進(jìn)一步理解的是，本發(fā)明的合成納米載體可以包含嵌段共聚物、接枝共聚物、共混物、混合物、和/或任何上述及其他聚合物的加合物。本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，在此列出的這些聚合物代表根據(jù)本發(fā)明可以使用的聚合物的示例性的、而不是全面的清單。

根據(jù)本發(fā)明的多種組合物包含與藥學(xué)上可接受的賦形劑(如防腐劑、緩沖劑、鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水)組合的合成納米載體?？梢允褂贸Ｒ?guī)藥物制造和配制技術(shù)制造這些組合物，以實(shí)現(xiàn)有用的劑型。在一個(gè)實(shí)施例中，將發(fā)明的合成納米載體與防腐劑一起懸浮在注射用無(wú)菌鹽水溶液中。

在多個(gè)實(shí)施例中，當(dāng)制備合成納米載體作為載體時(shí)，用于將組分與合成納米載體偶聯(lián)的方法可以是有用的。如果該組分是小分子，那么在組裝這些合成納米載體之前將該組分附接至聚合物上可能是有利的。在多個(gè)實(shí)施例中，制備具有用于將該組分與合成納米載體偶聯(lián)的表面基團(tuán)的合成納米載體也可能是有利的，該偶聯(lián)是通過(guò)使用這些表面基團(tuán)而不是將該組分附接至聚合物上且隨后在合成納米載體的構(gòu)建中使用這種聚合物共軛物來(lái)進(jìn)行。

在某些實(shí)施例中，該偶聯(lián)可以是共價(jià)連接物。在多個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的多肽可以經(jīng)由1，2，3-三唑連接物共價(jià)偶聯(lián)至外表面上，該連接物通過(guò)納米載體表面上的疊氮基團(tuán)與含有炔基的抗原或免疫抑制劑進(jìn)行1，3-偶極環(huán)加成反應(yīng)、或通過(guò)納米載體表面上的炔與含有疊氮基團(tuán)的組分進(jìn)行1，3-偶極環(huán)加成反應(yīng)而形成。此類環(huán)加成反應(yīng)優(yōu)選地是在銅(i)催化劑以及適合的cu(i)-配體和將cu(ii)化合物還原成催化活性的cu(i)化合物的還原劑存在下進(jìn)行的。此類cu(i)催化的疊氮-炔環(huán)加成反應(yīng)(cuaac)也可以稱為點(diǎn)擊反應(yīng)。

另外，共價(jià)偶聯(lián)可以包含共價(jià)連接物，該共價(jià)連接物包含酰胺連接物、二硫化物連接物、硫醚連接物、腙連接物、酰肼連接物、亞胺或肟連接物、脲或硫脲連接物、脒連接物、胺連接物、以及磺酰胺連接物。

酰胺連接物經(jīng)由一種組分上的胺與第二組分(如納米載體)的羧酸基團(tuán)之間的酰胺鍵形成。該連接物中的酰胺鍵可以用被適當(dāng)保護(hù)的氨基酸或組分與被活化的羧酸(如被n-羥基丁二酰亞胺活化的酯)、使用任何常規(guī)酰胺鍵形成反應(yīng)制成。

二硫化物連接物經(jīng)由在例如r1-s-s-r2的形式的兩個(gè)硫原子之間形成二硫(s-s)鍵制成。二硫鍵可以通過(guò)含有硫醇基/巰基(-sh)的組分與聚合物或納米載體上另一個(gè)被活化的硫醇基或含有硫醇基/巰基的納米載體與含有被活化的硫醇基的組分進(jìn)行硫醇交換形成。

三唑連接物(特別是其中r1和r2可以是任何化學(xué)實(shí)體的形式的1，2，3-三唑)是通過(guò)附接至第一組分(如納米載體)上的疊氮基與附接至第二組分(如免疫抑制劑或抗原)上的末端炔的1，3-偶極環(huán)加成反應(yīng)制成。該1，3-偶極環(huán)加成反應(yīng)在有或無(wú)催化劑的情況下、優(yōu)選地在有經(jīng)由1，2，3-三唑官能團(tuán)連接兩個(gè)組分的cu(i)催化劑的情況下進(jìn)行。夏普里斯(sharpless)等人，在德國(guó)應(yīng)用化學(xué)(angew.chem.int.ed.)，4l(14)，2596，(2002)中以及梅爾達(dá)爾(meldal)等人，在化學(xué)評(píng)述(chem.rev.)，2008，108(8)，2952-3015中詳細(xì)描述了此化學(xué)作用，并且該化學(xué)作用常常被稱為“點(diǎn)擊”反應(yīng)或cuaac。

在多個(gè)實(shí)施例中，制備了一種在聚合物鏈末端含有一個(gè)疊氮基或炔基的聚合物。然后使用此聚合物來(lái)制備合成納米載體，以此方式使得多個(gè)炔或疊氮基放置在該納米載體的表面上?？商娲?，可以通過(guò)另一種途徑制備該合成納米載體，并且隨后用炔或疊氮基功能化。該組分是在或者炔(如果該聚合物含有疊氮基)或者疊氮基(如果該聚合物含有炔)存在下制備。然后在具有或不具有催化劑的情況下允許該組分與該納米載體經(jīng)由1，3-偶極環(huán)加成反應(yīng)進(jìn)行反應(yīng)，該催化劑將該組分經(jīng)由1，4-二取代的1，2，3-三唑連接物共價(jià)偶聯(lián)至顆粒上。

硫醚連接物通過(guò)以例如r1-s-r2的形式形成硫-碳(硫醚)鍵制成。硫醚可以通過(guò)用第二組分(如納米載體)上的烷基化基團(tuán)(如鹵基或環(huán)氧基)烷基化一種組分(如該組分)上的硫醇基/巰基(-sh)制成。硫醚連接物還可以通過(guò)將一種組分上的硫醇基/巰基與作為邁克爾受體的第二組分(如一種含有馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)或乙烯砜基團(tuán)的聚合物)上的缺電子烯基進(jìn)行邁克爾加成來(lái)形成。以另一種方式，硫醚連接物可以通過(guò)一種組分上的硫醇基/巰基與第二組分(如一種聚合物或納米載體)上的烯基進(jìn)行自由基硫醇-烯反應(yīng)來(lái)制備。

腙連接物通過(guò)一種組分上的酰肼基與第二組分(如納米載體)上的醛基/酮基進(jìn)行反應(yīng)制成。

酰肼連接物通過(guò)一種組分上的肼基與第二組分(如納米載體)上的羧酸基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)來(lái)形成。此類反應(yīng)通常使用類似于形成酰胺鍵的化學(xué)方法(其中羧酸用活化試劑活化)來(lái)進(jìn)行。

亞胺或肟連接物通過(guò)一種組分上的胺或n-烷氧基胺基(或氨氧基)與第二組分(如納米載體)上的醛或酮基進(jìn)行反應(yīng)來(lái)形成。

脲或硫脲連接物通過(guò)一種組分上的胺基與第二組分(如納米載體)上的異氰酸酯或異硫氰酸酯基進(jìn)行反應(yīng)來(lái)制備。

脒連接物通過(guò)一種組分上的胺基與第二組分(如納米載體)上的亞氨酸酯基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)來(lái)制備。

胺連接物通過(guò)一種組分上的胺基與第二組分(如納米載體)上的烷基化基團(tuán)(如鹵基、環(huán)氧基、或磺酸酯基)進(jìn)行烷基化反應(yīng)制成?？商娲兀愤B接物還可以用適合的還原試劑(如氰基硼氫化鈉或三乙酰氧基硼氫化鈉)、通過(guò)一種組分上的胺基與第二組分(如納米載體)上的醛基或酮基進(jìn)行還原胺化反應(yīng)制成。

磺酰胺連接物通過(guò)一種組分上的胺基與第二組分(如納米載體)上的磺?；u化物(如磺酰氯)基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)制成。

砜連接物通過(guò)親核試劑與乙烯砜進(jìn)行邁克爾加成制成?；蛘咴撘蚁╉炕蛘咴撚H核試劑可以位于納米載體的表面上或附接至一種組分上。

該組分還可以經(jīng)由非共價(jià)共軛方法與納米載體共軛。例如，帶負(fù)電荷的抗原或免疫抑制劑可以通過(guò)靜電吸附與帶正電荷的納米載體共軛。含有金屬配體的組分還可以經(jīng)由金屬-配體絡(luò)合物與含有金屬絡(luò)合物的納米載體其軛。

在多個(gè)實(shí)施例中，該組分可以在組裝該合成納米載體之前附接至聚合物(例如聚乳酸-嵌段-聚乙二醇)上，或可以形成該合成納米載體而使得反應(yīng)性或可活化基團(tuán)在它的表面上。在后一種情況下，可以制備該組分以使其具有與由這些合成納米載體的表面呈現(xiàn)的附接化學(xué)性質(zhì)相容的基團(tuán)。在其他實(shí)施例中，可以使用一種適合的連接物將肽組分附接至vlp或脂質(zhì)體上。連接物是能夠?qū)蓚€(gè)分子連接在一起的化合物或試劑。在一個(gè)實(shí)施例中，該連接物可以是在赫曼森(hermanson)2008中所描述的同雙功能或異雙功能試劑。例如，可以在edc存在下用同雙功能連接物(己二酸二酰肼(adh))處理表面上含有羧基的vlp或脂質(zhì)體合成納米載體，以形成具有adh連接物的相應(yīng)合成納米載體。然后使所得被adh連接的合成納米載體經(jīng)由nc上的該adh連接物的另一端與含有酸基團(tuán)的肽組分共軛，以產(chǎn)生相應(yīng)的vlp或脂質(zhì)體肽共軛物。

針對(duì)可獲得的共軛方法的詳細(xì)描述，參見(jiàn)2008年由學(xué)術(shù)出版公司(academicpress，inc.)出版的第2版，赫曼森·gt(hermansongt)“生物共軛技術(shù)(bioconjugatetechniques)”。除了共價(jià)附接之外，該組分可以通過(guò)吸附至預(yù)先形成的合成納米載體上來(lái)偶聯(lián)、或它可以通過(guò)在該合成納米載體形成過(guò)程中進(jìn)行封裝來(lái)偶聯(lián)。

在此所提供的任何免疫抑制劑可以與該合成納米載體偶聯(lián)。免疫抑制劑包括但不限于：抑制素；mtor抑制劑，如雷帕霉素或一種雷帕霉素類似物；tgf-β信號(hào)劑；tgf-β受體激動(dòng)劑；組蛋白去乙?；?hdac)抑制劑；皮質(zhì)類固醇類；線粒體功能抑制劑，如魚(yú)藤酮；p38抑制劑；nf-κβ抑制劑；腺苷受體激動(dòng)劑；前列腺素e2激動(dòng)劑；磷酸二酯酶抑制劑，如磷酸二酯酶4抑制劑；蛋白酶體抑制劑；激酶抑制劑；g-蛋白偶聯(lián)受體激動(dòng)劑；g-蛋白偶聯(lián)受體拮抗劑；糖皮質(zhì)激素類；類視黃醇類；細(xì)胞因子抑制劑；細(xì)胞因子受體抑制劑；細(xì)胞因子受體活化劑；過(guò)氧化酶體增殖物活化受體拮抗劑；過(guò)氧化酶體增殖物活化受體激動(dòng)劑；組蛋白去乙?；敢种苿?；鈣調(diào)磷酸酶抑制劑；磷酸酶抑制劑，以及氧化的atp。免疫抑制劑還包括ido、維生素d3、環(huán)孢霉素a、芳香烴受體抑制劑、白藜蘆醇、硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤、阿司匹林、尼氟酸、雌三醇、雷公藤甲素、白細(xì)胞介素(例如，il-1、il-10)、環(huán)孢霉素a、sirna靶向細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體等。

抑制素的實(shí)例包括：阿托伐他汀(atorvastatin)西立伐他汀(cerivastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)(xl)、洛伐他汀(lovastatin)美伐他汀(mevastatin)匹伐他汀(pitavastatin)羅蘇伐他汀(rosuvastatin)羅蘇伐他汀以及辛伐他汀(simvastatin)

mtor抑制劑的實(shí)例包括：雷帕霉素和其類似物(例如，ccl-779、rad001、ap23573、c20-甲代烯丙基雷帕霉素(c20-marap)、c16-(s)-丁基磺酰氨基雷帕霉素(c16-bsrap)、c16-(s)-3-甲基吲哚雷帕霉素(c16-irap)(貝爾(bayle)等人，化學(xué)與生物學(xué)(chemistry&biology)2006，13：99-107))、azd8055、bez235(nvp-bez235)、大黃根酸(大黃酚)、德福羅莫司(deforolimus)(mk-8669)、依維莫司(everolimus)(rad0001)、ku-0063794、pi-103、pp242、替西羅莫司(temsirolimus)以及wye-354(可獲自賽立克公司(selleck)，休斯頓(houston)，德克薩斯州(tx)，美國(guó)(usa))。

tgf-β信號(hào)劑的實(shí)例包括：tgf-β配體(例如，活化素a、gdf1、gdf11、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、nodal、tgf-β)和它們的受體(例如，acvr1b、acvr1c、acvr2a、acvr2b、bmpr2、bmpr1a、bmpr1b、tgfβri、tgfβrii)、r-smads/co-smads(例如，smad1、smad2、smad3、smad4、smad5、smad8)、以及配體抑制劑(例如，卵泡抑素、頭蛋白、腱蛋白、dan、lefty、ltbp1、thbs1、核心蛋白聚糖)。

線粒體功能抑制劑的實(shí)例包括：蒼術(shù)苷(二鉀鹽)、米酵菌酸(三銨鹽)、羰基氰化間氯苯腙、羧基蒼術(shù)苷(例如，來(lái)自蒼術(shù)屬植物(atractylisgummifera))、cgp-37157、(-)-魚(yú)藤素(例如，來(lái)自栓皮豆(munduleasericea))、f16、己糖激酶iivdac結(jié)合域肽、寡霉素、魚(yú)藤酮、ru360、sfk1、以及纈氨霉素(例如，來(lái)自極暗黃鏈霉菌(streptomycesfulvissimus))(emd4生物科學(xué)(emd4biosciences)，美國(guó)(usa))。

p38抑制劑的實(shí)例包括：sb-203580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亞硫?；交?-5-(4-吡啶基)1h-咪唑)、sb-239063(反式-1-(4-羥基環(huán)己基)-4-(氟苯基)-5-(2-甲氧基-嘧啶-4-基)咪唑)、sb-220025(5-(2-氨基-4-嘧啶基)-4-(4-氟苯基)-1-(4-哌啶基)咪唑))、以及arry-797。

nf(例如，nk-κβ)抑制劑的實(shí)例包括：ifrd1、2-(1，8-萘啶-2-基)-苯酚、5-氨基水楊酸、bay11-7082、bay11-7085、cape(咖啡酸苯乙酯)、馬來(lái)酸二乙酯、ikk-2抑制劑iv、imd0354、乳胞素(lactacystin)、mg-132[z-leu-leu-leu-cho]、nfκb活化抑制劑iii、nf-κb活化抑制劑ii、jsh-23、小白菊內(nèi)酯(parthenolide)、氧化苯胂(pao)、ppm-18、吡咯烷二硫代氨基甲酸銨鹽、qnz、ro106-9920、楝酰胺(rocaglamide)、楝酰胺al、楝酰胺c、楝酰胺i、楝酰胺j、洛克米蘭醇(rocaglaol)、(r)-mg-132、水楊酸鈉、雷公藤甲素(pg490)、蟛蜞菊內(nèi)酯(wedelolactone)。

腺苷受體激動(dòng)劑的實(shí)例包括cgs-21680和atl-146e。

前列腺素e2激動(dòng)劑的實(shí)例包括e-前列腺素類激素2(e-prostanoid2)和e-前列腺素類激素4。

磷酸二酯酶抑制劑(非選擇性和選擇性抑制劑)的實(shí)例包括：咖啡因、氨茶堿、ibmx(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)、副黃嘌呤、己酮可可堿、可可堿、茶堿、甲基化的黃嘌呤類、長(zhǎng)春西汀(vinpocetine)、ehna(赤-9-(2-羥基-3-壬基)腺嘌呤)、阿那格雷(anagrelide)、伊諾昔酮(enoximone)(perfantm)、米利酮(milrinone)、左昔孟坦(levosimendon)、松葉菊堿(mesembrine)、異丁司特(ibudilast)、吡拉米司特(piclamilast)、木犀草素(luteolin)、屈他維林(drotaverine)、羅氟司特(roflumilast)(daxas^tm、daliresp^tm)、西地那非(sildenafil)他達(dá)拉非(tadalafil)伐地那非(vardenafil)烏地那非(udenafil)、阿伐那非(avanafil)、淫羊藿苷(icariin)、4-甲基哌嗪、以及吡唑并嘧啶-7-1。

蛋白酶體抑制劑的實(shí)例包括硼替佐米(bortezomib)、雙硫侖(disulfiram)、表兒茶素-3-沒(méi)食子酸鹽、以及鹽孢菌酰胺a(salinosporamidea)。

激酶抑制劑的實(shí)例包括：貝伐單抗(bevacizumab)、bibw2992、西妥昔單抗(cetuximab)伊馬替尼(imatinib)曲妥單抗(trastuzumab)吉非替尼(gefitinib)蘭尼單抗(ranibizumab)哌加他尼(pegaptanib)、索拉非尼(sorafenib)、達(dá)沙替尼(dasatinib)、舒尼替尼(sunitinib)、埃羅替尼(erlotinib)、尼羅替尼(nilotinib)、拉帕替尼(lapatinib)、帕尼單抗(panitumumab)、凡德他尼(vandetanib)、e7080、帕唑帕尼(pazopanib)、木利替尼(mubritinib)。

糖皮質(zhì)激素類的實(shí)例包括：氫化可的松(皮質(zhì)醇)、醋酸可的松、強(qiáng)的松(prednisone)、潑尼松龍(prednisolone)、甲潑尼龍(methylprednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、倍他米松(betamethasone)、曲安西龍(triamcinolone)、倍氯米松(beclometasone)、醋酸氟氫可的松、醋酸脫氧皮質(zhì)酮(doca)、以及醛固酮。

類視黃醇類的實(shí)例包括：視黃醇、視黃醛、維甲酸(視黃酸，)、異維甲酸阿利維甲酸(alitretinoin)依曲替酯(etretinate)(tegison^tm)和它的代謝物阿維a(acitretin)他扎羅汀(tazarotene)貝沙羅汀(bexarotene)以及阿達(dá)帕林(adapalene)

細(xì)胞因子抑制劑的實(shí)例包括il1ra、il1受體拮抗劑、igfbp、tnf-bf、尿調(diào)節(jié)素(uromodulin)、α-2-巨球蛋白、環(huán)孢霉素a、戊烷脒、以及己酮可可堿

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體拮抗劑的實(shí)例包括gw9662、pparγ拮抗劑iii、g335、t0070907(emd4生物科學(xué)(emd4biosciences)，美國(guó)(usa))。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體激動(dòng)劑的實(shí)例包括：吡格列酮(pioglitazone)、環(huán)格列酮(ciglitazone)、氯貝特(clofibrate)、gw1929、gw7647、l-165，041、ly171883、pparγ活化劑、fmoc-leu、曲格列酮(troglitazone)、以及wy-14643(emd4生物科學(xué)(emd4biosciences)，美國(guó)(usa))。

組蛋白去乙?；敢种苿┑膶?shí)例包括：異氫肟酸類(或異氫肟酸酯類)，如曲古抑菌素a(trichostatina)；環(huán)狀四肽類(如曲破辛b(trapoxinb))和縮肽類；苯甲酰胺類；親電酮類；脂肪族酸化合物，如苯基丁酸酯和丙戊酸；異羥肟酸類，如伏立諾他(vorinostat)(saha)、貝林司他(belinostat)(pxd101)、laq824、以及帕比司他(panobinostat)(lbh589)；苯甲酰胺類，如恩替諾特(entinostat)(ms-275)、ci994、以及莫替司他(mocetinostat)(mgcd0103)、煙酰胺；nad的衍生物、二氫香豆素、萘并吡喃酮(naphthopyranone)、以及2-羥基萘醛類。

鈣調(diào)磷酸酶抑制劑的實(shí)例包括環(huán)孢霉素、吡美莫司(pimecrolimus)、伏環(huán)孢素(voclosporin)、以及他克莫司(tacrolimus)。

磷酸酶抑制劑的實(shí)例包括：bn82002鹽酸鹽、cp-91149、花萼海綿誘癌素a(calyculina)、斑蝥酸(cantharidicacid)、斑蝥素(cantharidin)、氯氰菊酯(cypermethrin)、乙基-3，4-迪磷他汀(ethyl-3，4-dephostatin)、福司曲星(fostriecin)鈉鹽、maz51、甲基-3，4-迪磷他汀(methyl-3，4-dephostatin)、nsc95397、去甲斑蝥素(norcantharidin)、來(lái)自凹形原甲藻(proroeentrumconcavum)的岡田酸銨鹽、岡田酸、岡田酸鉀鹽、岡田酸鈉鹽、氧化苯胂、各種磷酸酶抑制劑混合、蛋白磷酸酶1c、蛋白磷酸酶2a抑制蛋白、蛋白磷酸酶2a1、蛋白磷酸酶2a2、原釩酸鈉。

在一些實(shí)施例中，在此所描述的抗原也與合成納米載體偶聯(lián)。在一些實(shí)施例中，這些抗原與這些免疫抑制劑偶聯(lián)至其上的相同或不同的合成納米載體偶聯(lián)。在其他實(shí)施例中，這些抗原不與任何合成納米載體偶聯(lián)。這些抗原包括在此提供的任何抗原，或其片段或衍生物，此類抗原與炎性、自身免疫性疾病、過(guò)敏癥、器官或組織排斥、移植物抗宿主病相關(guān)；移植抗原以及治療性蛋白抗原?？梢詮乃峁┑幕虮绢I(lǐng)域中另外已知的任何抗原中獲得或衍生出多個(gè)表位、或包含這些表位的蛋白質(zhì)、多肽或肽。

治療性蛋白包括但不限于：可輸注的治療性蛋白、酶、酶輔助因子、激素、凝血因子、細(xì)胞因子和干擾素、生長(zhǎng)因子、單克隆抗體、及多克隆抗體(例如，作為替代療法向受試者給予的多克隆抗體)、以及與龐貝氏病相關(guān)的蛋白質(zhì)(例如，阿葡糖苷酶α、rhgaa(例如，myozyme和lumizyme(健贊公司(genzyme)))。治療性蛋白還包括涉及在凝血級(jí)聯(lián)系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)。治療性蛋白包括但不限于：因子viii、因子vii、因子ix、因子v、血管性血友病因子、vonheldebrant因子、組織型纖溶酶原激活物、胰島素、生長(zhǎng)激素、α促紅細(xì)胞生成素、vegf、促血小板生成素、溶菌酶、抗凝血酶等等。治療性蛋白還包括脂肪因子類，如瘦素和脂聯(lián)素。如下和在此其他地方描述了治療性蛋白的其他實(shí)例。還包括作為抗原而提供的任何治療性蛋白的片段或衍生物。

在具有溶酶體貯積癥的受試者的酶替代療法中使用的治療性蛋白的實(shí)例包括但不限于：用于治療高雪病的伊米苷酶(例如，cerezymetm)、用于治療法布里病的a-半乳糖苷酶a(a-gala)(例如，阿加糖酶β、fabryzyme^tm)、用于治療龐貝氏病的酸性a-葡糖苷酶(gaa)(例如，阿葡糖苷酶α、lumizyme^tm、myozyme^tm)、用于治療粘多糖病的芳基硫酸酯酶b(例如，拉羅尼酶(laronidase)、aldurazyme^tm、艾度硫酸酯酶、elaprase^tm、芳基硫酸酯酶b、naglazyme^tm)。

酶的實(shí)例包括氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶、以及連接酶。

激素的實(shí)例包括：褪黑素(n-乙?；?5-甲氧基色胺)、血清素、甲狀腺素(或四碘甲狀腺原氨酸)(一種甲狀腺激素)、三碘甲狀腺原氨酸(一種甲狀腺激素)、腎上腺素(epinephrine)(或腎上腺素(adrenaline))、去甲腎上腺素(norepinephrine)(或去甲腎上腺素(noradrenaline))、多巴胺(或催乳素抑制激素)、抗苗勒氏管激素(或苗勒氏管抑制因子或激素)、脂聯(lián)素、促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropichormone)(或促腎上腺皮質(zhì)激素(corticotropin))、血管緊張素原和血管緊張素、抗利尿激素(antidiuretichormone)(或加壓素(vasopressin)、精氨酸加壓素(argininevasopressin))、心房利鈉肽(或心房肽)、降鈣素、縮膽囊素(cholecystokinin)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素、紅細(xì)胞生成素、促卵泡激素、胃泌素、胃饑餓素(ghrelin)、胰高血糖素(glucagon)、胰高血糖素樣肽(glp-1)、gip、促性腺激素釋放激素、生長(zhǎng)激素釋放激素、人絨毛膜促性腺激素、人胎盤催乳素、生長(zhǎng)激素、抑制素(inhibin)、胰島素、胰島素樣生長(zhǎng)因子(或生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素)、瘦素、促黃體激素、促黑素細(xì)胞激素、阿立新(orexin)、催產(chǎn)素、甲狀旁腺激素、催乳素、松弛素、分泌素、促生長(zhǎng)素抑制素、促血小板生成素、促甲狀腺激素(或促甲狀腺素)、促甲狀腺素釋放激素、皮質(zhì)醇、醛固酮、睪酮、脫氫表雄酮、雄烯二酮、二氫睪酮、雌二醇、雌酮、雌三醇、黃體酮、骨化三醇(1，25-二羥基維生素d3)、骨化二醇(25-羥基維生素d3)、前列腺素類、白三烯類、前列腺環(huán)素、凝血噁烷、催乳素釋放激素、促脂解素、腦利鈉肽、神經(jīng)肽y、組胺、內(nèi)皮素、胰多肽、腎素、以及腦啡肽。

血液和凝血因子的實(shí)例包括：因子i(纖維蛋白原)、因子ii(凝血酶原)、組織因子、因子v(促凝血球蛋白原、易變因子)、因子vii(穩(wěn)定因子、前轉(zhuǎn)變素)、因子viii(抗血友病球蛋白)、因子ix(克雷司馬斯因子(christmasfactor)或血漿促凝血酶原激酶組分)、因子x(斯圖亞特因子(stuart-prowerfactor))、因子xa、因子xi、因子xii(哈格曼因子(hagemanfactor))、因子xiii(纖維蛋白穩(wěn)定因子)、血管性血友病因子、前激肽釋放酶(費(fèi)萊徹因子(fletcherfactor))、高分子量激肽原(hmwk)(菲茨杰拉德因子)、纖連蛋白、纖維蛋白、凝血酶、抗凝血酶iii、肝素輔助因子ii、蛋白c、蛋白s、蛋白z、蛋白z相關(guān)蛋白酶抑制劑(zpi)、纖溶酶原、α2-抗纖維蛋白溶酶、組織型纖溶酶原激活物(tpa)、尿激酶、纖溶酶原激活物抑制劑-1(pai1)、纖溶酶原激活物抑制劑-2(pai2)、癌性促凝物質(zhì)、以及阿法依伯汀(益比奧(epogen)、普羅克里特(procrit))。

細(xì)胞因子的實(shí)例包括：淋巴因子、白細(xì)胞介素、及趨化因子、1型細(xì)胞因子(如ifn-γ、tgf-β)、以及2型細(xì)胞因子(如il-4、il-10、以及il-13)。

生長(zhǎng)因子的實(shí)例包括：腎上腺髓質(zhì)素(am)、血管生成素(ang)、自分泌運(yùn)動(dòng)因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bmp)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(bdnf)、表皮生長(zhǎng)因子(egf)、紅細(xì)胞生成素(epo)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fgf)、膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(gdnf)、粒細(xì)胞集落刺激因子(g-csf)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)、生長(zhǎng)分化因子-9(gdf9)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hgf)、肝細(xì)胞瘤源性生長(zhǎng)因子(hdgf)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(igf)、促移行因子、肌生長(zhǎng)抑制素(gdf-8)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(ngf)和其他神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白、血小板源性生長(zhǎng)因子(pdgf)、促血小板生成素(tpo)、α-轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(tgf-α)、β-轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(tgf-β)、α-腫瘤壞死因子(tnf-α)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)、wnt信號(hào)通路、胎盤生長(zhǎng)因子(plgf)、[(胎牛生長(zhǎng)激素)](fbs)、il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、以及il-7。

單克隆抗體的實(shí)例包括：阿巴伏單抗(abagovomab)、阿昔單抗(abciximab)、阿達(dá)木單抗(adalimumab)、阿德木單抗(adecatumumab)、阿非莫單抗(afelimomab)、阿夫土珠(afutuzumab)、培化阿珠單抗(alacizumabpegol)、ald、阿侖單抗(alemtuzumab)、噴替酸阿妥莫單抗(altumomabpentetate)、麻安莫單抗(anatumomabmafenatox)、安蘆珠單抗(anrukinzumab)、抗胸腺細(xì)胞球蛋白、阿泊珠單抗(apolizumab)、阿西莫單抗(arcitumomab)、阿塞珠單抗(aselizumab)、那他珠單抗(atlizumab)(托珠單抗(tocilizumab))、阿托木單抗(atorolimumab)、巴品珠單抗(bapineuzumab)、巴利昔單抗(basiliximab)、巴維昔單抗(bavituximab)、貝妥莫單抗(bectumomab)、貝利木單抗(belimumab)、貝那利珠單抗(benralizumab)、柏替木單抗(bertilimumab)、貝索單抗(besilesomab)、貝伐單抗(bevacizumab)、比西單抗(biciromab)、比伐珠單抗-美登素(bivatuzumabmertansine)、蘭妥莫單抗(blinatumomab)、貝倫妥單抗-維多汀(brentuximabvedotin)、布雷奴單抗(briakinumab)、卡那單抗(canakinumab)、莫坎妥珠單抗(cantuzumabmertansine)、卡羅單抗噴地肽(capromabpendetide)、卡妥索單抗(catumaxomab)、西利珠單抗(cedelizumab)、賽妥珠單抗(certolizumabpegoi)、西妥昔單抗(cetuximab)、泊西他珠單抗(citatuzumabbogatox)、西妥木單抗(cixutumumab)、克立昔單抗(clenoliximab)、克伐珠單抗(clivatuzumabtetraxetan)、可那木單抗(conatumumab)、達(dá)西珠單抗(dacetuzumab)、達(dá)利珠單抗(daclizumab)、達(dá)雷木單抗(daratumumab)、地諾單抗(denosumab)、地莫單抗(detumomab)、阿托度單抗(dorlimomabaritox)、達(dá)利珠單抗(dorlixizumab)、依美昔單抗(ecromeximab)、依庫(kù)珠單抗(eculizumab)、埃巴單抗(edobacomab)、依決洛單抗(edrecolomab)、依法利珠單抗(efalizumab)、依芬古單抗(efungumab)、依洛珠單抗(elotuzumab)、艾西莫單抗(elsilimomab)、培化恩莫單抗(enlimomabpegol)、西艾匹莫單抗(epitumomabcituxetan)、依帕珠單抗(epratuzumab)、厄利珠單抗(erlizumab)、厄妥索單抗(ertumaxomab)、埃達(dá)珠單抗(etaracizumab)、艾維單抗(exbivirumab)、法索單抗(fanolesomab)、法拉莫單抗(faralimomab)、法利珠單抗(farletuzumab)、泛維珠單抗(felvizumab)、非扎奴單抗(fezakinumab)、芬妥木單抗(figitumumab)、芳妥珠單抗(fontolizumab)、福拉韋單抗(foravirumab)、夫蘇木單抗(fresolimumab)、加利昔單抗(galiximab)、羅氏單抗(gantenerumab)、加維莫單抗(gavilimomab)、吉妥珠單抗-奧唑米星(gemtuzumabozogamicin)、gc1008、吉瑞昔單抗(girentuximab)、格雷帕珠單抗-維德汀(glembatumumabvedotin)、戈利木單抗(golimumab)、戈利昔單抗(gomiliximab)、伊巴珠單抗(ibalizumab)、替伊莫單抗(ibritumomabtiuxetan)、伊戈伏單抗(igovomab)、英西單抗(imciromab)、英夫利昔單抗(infliximab)、英妥木單抗(intetumumab)、伊諾莫單抗(inolimomab)、伊珠單抗-奧加米星(inotuzumabozogamicin)、伊匹單抗(ipilimumab)、伊妥木單抗(iratumumab)、凱利昔單抗(keliximab)、拉貝珠單抗(labetuzumab)、來(lái)金珠單抗(lebrikizumab)、來(lái)馬索單抗(lemalesomab)、樂(lè)德木單抗(lerdelimumab)、來(lái)沙木單抗(lexatumumab)、利韋單抗(libivirumab)、林妥珠單抗(lintuzumab)、羅佛珠單抗-美登素(lorvotuzumabmertansine)、魯卡木單抗(lucatumumab)、魯昔單抗(lumiliximab)、馬帕木單抗(mapatumumab)、馬司莫單抗(maslimomab)、馬妥珠單抗(matuzumab)、美泊利單抗(mepolizumab)、美替木單抗(metelimumab)、米拉珠單抗(milatuzumab)、明瑞莫單抗(minretumomab)、米妥莫單抗(mitumomab)、莫羅木單抗(morolimumab)、莫維珠單抗(motavizumab)、莫羅單抗-cd3(muromonab-cd3)、他那可洛單抗(nacolomabtafenatox)、他那莫單抗(naptumomabestafenatox)、那他珠單抗(natalizumab)、奈巴庫(kù)單抗(nebacumab)、奈昔木單抗(necitumumab)、奈瑞莫單抗(nerelimomab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、莫諾非莫單抗(nofetumomabmerpentan)、奧瑞珠單抗(ocrelizumab)、奧度莫單抗(odulimomab)、奧法木單抗(ofatumumab)、奧拉雷單抗(olaratumab)、奧馬珠單抗(omalizumab)、莫奧珠單抗(oportuzumabmonatox)、奧戈伏單抗(oregovomab)、奧昔珠單抗(otelixizumab)、帕吉昔單抗(pagibaximab)、帕利珠單抗(palivizumab)、帕尼單抗(panitumumab)、帕諾庫(kù)單抗(panobacumab)、帕考珠單抗(pascolizumab)、帕尼單抗(pemtumomab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、培克珠單抗(pexelizumab)、平妥單抗(pintumomab)、普立昔單抗(priliximab)、普托木單抗(pritumumab)、瑞非韋魯(rafivirumab)、禮來(lái)單抗(ramucirumab)、來(lái)尼珠單抗(ranibizumab)、瑞希巴庫(kù)(raxibacumab)、瑞加韋單抗(regavirumab)、瑞利珠單抗(reslizumab)、利妥木單抗(rilotumumab)、利妥珠單抗(rituximab)、羅妥木單抗(robatumumab)、羅利珠單抗(rontalizumab)、羅韋來(lái)單抗(rovelizumab)、蘆利珠單抗(ruplizumab)、噴地肽沙妥莫單抗(satumomabpendetide)、司韋單抗(sevirumab)、西羅珠單抗(sibrotuzumab)、西法木單抗(sifalimumab)、司妥昔單抗(siltuximab)、希普利珠單抗(siplizumab)、蘇蘭珠單抗(solanezumab)、索尼普單抗(sonepcizumab)、索土珠單抗(sontuzumab)、司他蘆單抗(stamulumab)、硫索單抗(sulesomab)、他珠單抗(tacatuzumabtetraxetan)、他度珠單抗(tadocizumab)、他利珠單抗(talizumab)、他尼珠單抗(tanezumab)、帕他莫單抗(taplitumomabpaptox)、特非珠單抗(tefibazumab)、阿替莫單抗(telimomabaritox)、替妥莫單抗(tenatumomab)、替奈昔單抗(teneliximab)、替利珠單抗(teplizumab)、替西莫單抗(ticilimumab)(替西木單抗(tremelimumab))、替加珠單抗(tigatuzumab)、托珠單抗(tocilizumab)(阿替珠單抗(atlizumab))、托利珠單抗(toralizumab)、托西莫單抗(tositumomab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、曲美木單抗(tremelimumab)、西莫白細(xì)胞介素單抗(tucotuzumabcelmoleukin)、妥韋單抗(tuvirumab)、烏珠單抗(urtoxazumab)、優(yōu)特克單抗(ustekinumab)、伐利昔單抗(vapaliximab)、維多珠單抗(vedolizumab)、維妥珠單抗(veltuzumab)、維帕莫單抗(vepalimomab)、維西珠單抗(visilizumab)、伏洛昔單抗(volociximab)、伏妥莫單抗(votumumab)、扎魯木單抗(zalutumumab)、扎木單抗(zanolimumab)、齊拉木單抗(ziralimumab)、以及阿佐莫單抗(zolimomabaritox)。

輸注療法或可注射的治療性蛋白的實(shí)例包括：例如，塔西單抗(tocilizumab)(羅氏公司(roche))、α-1抗胰蛋白酶(卡美達(dá)公司(kamada)/aat)、(affymax和takeda，合成肽)、白蛋白干擾素α-2b(諾華公司(novartis)/zalbin^tm)、(嫁接集團(tuán)(pharminggroup)，c1抑制劑替代療法)、替莫瑞林(tesamorelin)(治療技術(shù)公司(theratechnologies)/egrifta，合成生長(zhǎng)激素釋放因子)、奧瑞珠單抗(ocrelizumab)(遺傳技術(shù)公司(genentech)、羅氏公司(roche)以及生物遺傳公司(biogen))、杯利單抗(belimumab)(葛蘭素史克公司(glaxosmithkline))、聚乙二醇重組尿酸酶(savient制藥公司/krystexxa^tm)、α-他利苷酶(protalix公司/uplyso)、阿加糖酶α(夏爾公司(shire))、葡糖腦苷脂酶α(夏爾公司(shire))。

對(duì)根據(jù)本發(fā)明的方面有用的另外的治療性蛋白對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言將是顯而易見(jiàn)的，并且本發(fā)明在此方面是不受限的。

在一些實(shí)施例中，可以對(duì)一種組分(如抗原或免疫抑制劑)進(jìn)行分離。分離是指該成分與它的天然環(huán)境分離并且以容許對(duì)它進(jìn)行鑒定或使用的足夠量存在。這意味著，例如，該成分可以(i)通過(guò)表達(dá)克隆選擇性地產(chǎn)生或(ii)如通過(guò)色譜法或電泳進(jìn)行純化。分離的成分可以是基本上純的，但是不需要如此。由于在藥物制劑中分離的成分可以與藥學(xué)上可接受的賦形劑相混合，按該制劑的重量計(jì)該成分可以僅包含小的百分比。雖然如此，該成分是分離的原因在于，它已經(jīng)從在活系統(tǒng)中可能與其結(jié)合的物質(zhì)中分離出來(lái)，即從其他脂質(zhì)或蛋白質(zhì)中分離出來(lái)。在此提供的任何成分可以以分離的形式被包含在這些組合物中。

d.制造和使用本發(fā)明的組合物和有關(guān)方法的方法

可以使用本領(lǐng)域中已知的各種各樣的方法制備合成納米載體。例如，可以通過(guò)如納米沉淀、使用流體通道的流動(dòng)聚焦、噴霧干燥、單和雙乳液溶劑蒸發(fā)、溶劑萃取、相分離、研磨、微乳液步驟、微制造、納米制造、犧牲層、簡(jiǎn)單和復(fù)雜凝聚法的方法、以及本領(lǐng)域的那些普通技術(shù)人員熟知的其他方法形成合成納米載體?？商娲鼗蛄硗獾?，已經(jīng)說(shuō)明了用于單分散半導(dǎo)體，傳導(dǎo)性的、磁性的、有機(jī)的、以及其他納米材料的水性和有機(jī)溶劑合成(pellegrino(佩萊格里諾)等人，2005，小物質(zhì)，1：48；murray(莫雷)等人，2000，材料科學(xué)年度評(píng)論，30：545；以及trindade(特林達(dá)德)等人，2001，材料化學(xué)，13：3843)。在文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了另外的方法(參見(jiàn)，例如，多布羅夫(doubrow)編著，“醫(yī)藥中的微膠囊和納米顆粒(microcapsulesandnanoparticlesinmedicineandpharmacy)”，crc出版社，博卡拉頓(bocaraton)，1992；馬西威茲(mathiowitz)等人，1987，控釋期刊(j.control.release)，5：13；馬西威茲(mathiowitz)等人，1987，反應(yīng)性聚合物(reactivepolymers)，6：275；以及馬西威茲(mathiowitz)等人，1988，應(yīng)用聚合物科學(xué)期刊(j.appl.polymersci.)，35：755；美國(guó)專利5578325和6007845；p·保利賽利(p.paolicelli)等人，“可以有效結(jié)合并遞送病毒樣顆粒的表面修飾的基于plga的納米顆粒(surface-modifiedplga-basednanoparticlesthatcanefficientlyassociateanddelivervirus-likeparticles)”，納米醫(yī)學(xué)(nanomedicine)，5(6)：843-853(2010))。

可以使用各種方法將各種材料封裝在所令人希望的合成納米載體中，這些方法包括但不限于：c·阿斯泰特(c.astete)等人，“plga納米顆粒的合成和表征(synthesisandcharacterizationofplgananoparticles)”生物材料科學(xué)期刊(j.biomater.sci.)聚合物版，第17卷，第3期，第247-289頁(yè)(2006)；k·阿芙古斯塔基斯(k.avgoustakis)“peg化的聚(丙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)納米顆粒：制備、特性以及在藥物遞送中的可能應(yīng)用(pegylatedpoly(lactide)andpoly(lactide-co-glycolide)nanoparticles：preparation，propertiesandpossibleapplicationsindrugdelivery)”當(dāng)前藥物遞送(currentdrugdelivery)1：321-333(2004)；里斯·c(c.reis)等人，“納米封裝i.用于制備載藥聚合物納米顆粒的方法(nanoencapsulationi.methodsforpreparationofdrug-loadedpolymericnanoparticles)”納米醫(yī)學(xué)(nanomedicine)2：8-21(2006)；p·保利賽利(p.paolicelli)等人，“可以有效結(jié)合和遞送病毒樣顆粒的表面修飾的基于plga的納米顆粒(surface-modifiedplga-basednanoparticlesthatcanefficientlyassociateanddelivervirus-likeparticles)”納米醫(yī)學(xué)(nanomedicine)，5(6)：843-853(2010)?？梢允褂闷渌m合于將材料封裝至合成納米載體中的方法，這些方法包括但不限于披露在昂格爾(unger)的美國(guó)專利6,632,671(2003年10月14日)中的方法。

在某些實(shí)施例中，通過(guò)納米沉淀工藝或噴霧干燥來(lái)制備合成納米載體?？梢愿淖?cè)谥苽浜铣杉{米載體中使用的條件以產(chǎn)生具有所希望的大小和特性(例如，疏水性、親水性、外部形態(tài)學(xué)、“粘性”、形狀等等)的顆粒。制備這些合成納米載體的方法和使用的條件(例如，溶劑、溫度、濃度、空氣流速等等)可以取決于有待偶聯(lián)至這些合成納米載體上的材料和/或該聚合物基質(zhì)的組成。

如果通過(guò)任何以上方法制備的顆粒具有在希望的范圍外的大小范圍，那么可以按大小分類這些顆粒，例如使用一個(gè)篩。

本發(fā)明的合成納米載體的成分(即，組分)(如構(gòu)成一個(gè)免疫特征表面的部分、靶向部分、聚合物基質(zhì)、抗原、免疫抑制劑等)可以例如通過(guò)一個(gè)或多個(gè)共價(jià)鍵偶聯(lián)至整體的合成納米載體上或可以借助一個(gè)或多個(gè)連接物來(lái)偶聯(lián)。使合成納米載體功能化的另外方法可以由以下文獻(xiàn)改編而來(lái)：薩爾茨曼(saltzman)等人的公布的美國(guó)專利申請(qǐng)2006/0002852、戴斯蒙(desimone)等人的公布的美國(guó)專利申請(qǐng)2009/0028910、或默西(murthy)等人的公布的國(guó)際專利申請(qǐng)wo/2008/127532a1。

可替代地或另外地，可以經(jīng)由非共價(jià)相互作用使合成納米載體直接地或間接地偶聯(lián)至組分上。在非共價(jià)的實(shí)施例中，通過(guò)非共價(jià)相互作用介導(dǎo)非共價(jià)偶聯(lián)，這些非共價(jià)相互作用包括但不限于：電荷相互作用、親和相互作用、金屬配位、物理吸附、主-客體相互作用、疏水相互作用、tt堆積相互作用、氫鍵相互作用、范德華相互作用、磁相互作用、靜電相互作用、偶極-偶極相互作用、和/或其組合。此類偶聯(lián)可以安排在本發(fā)明合成納米載體的一個(gè)外表面或一個(gè)內(nèi)表面上。在多個(gè)實(shí)施例中，封裝和/或吸附是偶聯(lián)的形式。在多個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的這些合成納米載體可以通過(guò)在相同媒介物或遞送系統(tǒng)中混合而與抗原相組合。

可以使用傳統(tǒng)的藥物混合方法組合多個(gè)群體的合成納米載體以形成根據(jù)本發(fā)明的藥物劑型。這些方法包括液體-液體混合，其中兩種或更多種各自含有一個(gè)或多個(gè)納米載體子集的懸浮液被直接組合或經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)含有稀釋劑的容器被集合在一起。因?yàn)楹铣杉{米載體還可以以粉末形式生產(chǎn)或貯存，所以可以進(jìn)行干燥的粉末-粉末混合，因?yàn)榭梢詫煞N或更多種粉末再懸浮于共同的介質(zhì)中。取決于納米載體的特性和它們的相互作用潛力，一種或另一種混合途徑可能也有優(yōu)勢(shì)。

包含合成納米載體的典型的發(fā)明組合物可以包含無(wú)機(jī)或有機(jī)緩沖劑(例如，磷酸、碳酸、乙酸、或檸檬酸的鈉鹽或鉀鹽)和ph調(diào)節(jié)劑(例如，鹽酸、氫氧化鈉或氫氧化鉀、檸檬酸或乙酸的鹽、氨基酸和它們的鹽)、抗氧化劑(例如，抗壞血酸、α-生育酚)、表面活性劑(例如，聚山梨酯20、聚山梨酯80、聚氧乙烯9-10壬基酚、去氧膽酸鈉)、溶液和/或低溫/凍干穩(wěn)定劑(例如，蔗糖、乳糖、甘露醇、海藻糖)、滲透調(diào)節(jié)劑(例如，鹽類或糖類)、抗細(xì)菌劑(例如，苯甲酸、苯酚、慶大霉素)、消泡劑(例如，聚二甲基硅酮(polydimethylsilozone))、防腐劑(例如，硫柳汞、2-苯氧乙醇、edta)、聚合物穩(wěn)定劑和粘度調(diào)節(jié)劑(例如，聚乙烯吡咯酮、泊洛沙姆488、羧甲基纖維素)、以及共溶劑(例如，甘油、聚乙二醇、乙醇)。

根據(jù)本發(fā)明的組合物包含與藥學(xué)上可接受的賦形劑組合的本發(fā)明的合成納米載體?？梢允褂贸Ｒ?guī)藥物制造和配制技術(shù)制造這些組合物，以實(shí)現(xiàn)有用的劑型。適合用于實(shí)踐本發(fā)明的技術(shù)可以在以下文獻(xiàn)中找到：愛(ài)德華·l保羅(edwardl.paul)，維克多·a.atiemo-obeng(victora.atiemo-obeng)以及蘇珊娜·m.kresta(suzannem.kresta)編著的工業(yè)混合手冊(cè)：科學(xué)與實(shí)踐(handbookofindustrialmixing：scienceandpractice)，2004約翰成利國(guó)際出版公司(johnwiley&sons，inc.)；和奧斯丁·m.e.(m.e.auten)編著的制藥學(xué)：劑型設(shè)計(jì)科學(xué)(pharmaceutics：thescienceofdosageformdesign)，第2版，2001，丘吉爾利文斯通出版社(churchilllivingstone)。在一個(gè)實(shí)施例中，將本發(fā)明的合成納米載體與防腐劑一起懸浮在注射用無(wú)菌鹽水溶液中。

應(yīng)當(dāng)理解可以按任何適合的方式制造本發(fā)明的這些組合物，并且本發(fā)明絕不局限于可以使用在此描述的方法所產(chǎn)生的組合物。適當(dāng)方法的選擇可能需要注意被結(jié)合的特定部分的特性。

在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的合成納米載體是在無(wú)菌條件下制造或最后進(jìn)行滅菌。這可以確保所得的組合物是無(wú)菌的并且是非感染性的，因此當(dāng)與非無(wú)菌的組合物相比時(shí)提高了安全性。這提供了有價(jià)值的安全措施，尤其是當(dāng)接受合成納米載體的受試者具有免疫缺陷、正在遭受感染、和/或易受感染時(shí)。在一些實(shí)施例中，取決于配制策略，可以將本發(fā)明的合成納米載體凍干并且儲(chǔ)存在懸浮液中或呈凍干粉末形式，持續(xù)延長(zhǎng)的時(shí)間而無(wú)活性損失。

可以通過(guò)各種途徑給予本發(fā)明的這些組合物，這些途徑包括但不限于皮下、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、透粘膜、透粘膜、舌下、直腸、眼睛、肺部、皮膚內(nèi)、經(jīng)皮膚、經(jīng)皮或真皮內(nèi)或這些途徑的組合。給予途徑還包括通過(guò)吸入或肺氣溶膠來(lái)進(jìn)行的給予。用于制備氣溶膠遞送系統(tǒng)的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(參見(jiàn)，例如夏拉(sciarra)和庫(kù)替(cutie)，“氣溶膠(aerosols)，”雷明頓的藥物科學(xué)(remington’spharmaceuticalsciences)，第18版，1990，第1694-1712頁(yè)；該文獻(xiàn)通過(guò)引用的方式結(jié)合在此)。

本發(fā)明的作為基于細(xì)胞的治療而提供的可移植的移植物或治療性蛋白可以通過(guò)腸胃外、動(dòng)脈內(nèi)注射、鼻內(nèi)或靜脈內(nèi)給予或通過(guò)注射至淋巴結(jié)或眼前房或通過(guò)局部給予至感興趣的器官或組織而進(jìn)行給予?？梢酝ㄟ^(guò)皮下、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、冠狀動(dòng)脈內(nèi)、胰腺內(nèi)、肝內(nèi)或支氣管注射來(lái)進(jìn)行給予。

本發(fā)明的這些組合物可以按有效的量給予，如在此其他地方描述的有效的量。根據(jù)本發(fā)明，劑型的劑量含有不同量的多個(gè)群體的合成納米載體和/或不同量的免疫抑制劑和/或抗原。本發(fā)明的劑型中存在的合成納米載體和/或免疫抑制劑和/或抗原的量可以根據(jù)這些抗原的性質(zhì)、有待完成的治療益處、以及其他此類參數(shù)而改變。在多個(gè)實(shí)施例中，可以進(jìn)行劑量范圍研究，以建立有待存在于該劑型中的合成納米載體群體的最佳治療量以及免疫抑制劑和/或抗原的量。在多個(gè)實(shí)施例中，這些合成納米載體和/或這些免疫抑制劑和/或抗原是以一定的量存在于該劑型中，當(dāng)向受試者給予時(shí)，該量是有效于產(chǎn)生針對(duì)這些抗原的致耐受性免疫應(yīng)答。在受試者中使用常規(guī)劑量范圍研究和技術(shù)，也許有可能確定對(duì)產(chǎn)生致耐受性免疫應(yīng)答有效的免疫抑制劑和/或抗原的量?？梢栽诙喾N頻率下給予本發(fā)明的劑型。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，至少一次給予該劑型足以產(chǎn)生藥理學(xué)上相關(guān)的應(yīng)答。在多個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施例中，利用至少兩次給予、至少三次給予、或至少四次給予該劑型來(lái)確保藥理學(xué)上相關(guān)的應(yīng)答。

可以在疾病、紊亂或病癥發(fā)作之前啟動(dòng)這些發(fā)明組合物的預(yù)防性給予，或可以在紊亂、紊亂或病癥建立之后啟動(dòng)治療性給予。

在一些實(shí)施例中，例如在給予一種治療性蛋白或可移植的移植物或暴露于一種過(guò)敏原之前進(jìn)行合成納米載體的給予。在多個(gè)示例性的實(shí)施例中，在給予一種治療性蛋白或可移植的移植物或暴露于一種過(guò)敏原之前包括但不限于30天、25天、20天、15天、14天、13天、12天、11天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、1天、或0天給予合成納米載體一次或多次。另外或可替代地，可以在給予治療性蛋白或可移植的移植物或暴露于一種過(guò)敏原之后向受試者給予合成納米載體。在多個(gè)示例性的實(shí)施例中，在給予一種治療性蛋白或可移植的移植物或暴露于一種過(guò)敏原之后包括但不限于1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、20天、25天、30天等等給予合成納米載體一次或多次。

在一些實(shí)施例中，在初始給予已經(jīng)在受試者中產(chǎn)生一種致耐受性應(yīng)答之后向該受試者給予維持劑量(例如，在此提供的合成納米載體組合物的維持劑量)，例如以便維持在初始劑量之后所達(dá)到的致耐受性作用、以便防止該受試者中的不希望的免疫應(yīng)答、或以便防止該受試者變?yōu)樘幱诮?jīng)歷所不希望的免疫應(yīng)答或所不希望的水平的免疫應(yīng)答風(fēng)險(xiǎn)中的受試者。在一些實(shí)施例中，該維持劑量是與該受試者接受的初始劑量相同的劑量。在一些實(shí)施例中，該維持劑量是比初始劑量更低的劑量。例如，在一些實(shí)施例中，該維持劑量是約3/4、約2/3、約1/2、約1/3、約1/4、約1/8、約1/10、約1/20、約1/25、約1/50、約1/100、約1/1,000、約1/10,000、約1/100,000、或約1/1,000,000(重量/重量)的初始劑量。

出于免疫抑制的目的，在此描述的這些組合物和方法可以用來(lái)誘導(dǎo)或增強(qiáng)一種致耐受性的免疫應(yīng)答和/或抑制、調(diào)節(jié)、引導(dǎo)或重定向所不希望的免疫應(yīng)答。在此描述的這些組合物和方法可以用于診斷、預(yù)防和/或治療其中免疫抑制(例如，致耐受性性免疫應(yīng)答)將會(huì)賦予治療益處的疾病、紊亂或病癥。這類疾病、紊亂或病癥包括炎性疾病、自身免疫性疾病、過(guò)敏、器官或組織排斥以及移植物抗宿主病。在此描述的這些組合物和方法還可以用于已經(jīng)經(jīng)歷或?qū)⒁?jīng)歷移植的受試者。在此描述的這些組合物和方法還可以用于已經(jīng)接受、正在接受或?qū)⒁邮芤环N治療性蛋白的受試者，針對(duì)該治療性蛋白，該受試者已經(jīng)產(chǎn)生或預(yù)期會(huì)產(chǎn)生一種所不希望的免疫應(yīng)答。

自身免疫性疾病包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、免疫介導(dǎo)的或i型糖尿病、炎性腸病(例如，克羅恩病或潰瘍性結(jié)腸炎)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、硬皮病、自身免疫性甲狀腺疾病、斑禿、格雷夫病、格林-巴利綜合征、乳糜瀉、干燥綜合征、風(fēng)濕熱、胃炎、自身免疫性萎縮性胃炎、自身免疫性肝炎、胰島炎、卵巢炎、睪丸炎、葡萄膜炎、晶狀體源性葡萄膜炎、重癥肌無(wú)力、原發(fā)性粘液性水腫、惡性貧血、自身免疫性溶血性貧血、阿狄森病、硬皮病、古德帕斯徹氏綜合征、腎炎(例如，腎小球腎炎)、銀屑病、尋常性天皰瘡、類天皰瘡、交感性眼炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜、特發(fā)性白細(xì)胞減少癥(feucopenia)、韋格納肉芽腫病以及多肌炎/皮肌炎。

一些另外的示例性的自身免疫性疾病、相關(guān)聯(lián)的自身抗原、以及自身抗體(它們預(yù)期會(huì)在本發(fā)明中使用)在以下表1中描述：

炎性疾病包括但不限于：阿爾茨海默病、強(qiáng)直性脊柱炎、關(guān)節(jié)炎、哮喘、動(dòng)脈粥樣硬化、白塞病、慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)根神經(jīng)病、克羅恩病、結(jié)腸炎、囊性纖維化、皮炎、憩室炎、肝炎、腸易激綜合征(ibs)、紅斑狼瘡、肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、腎炎、帕金森病、帶狀皰疹以及潰瘍性結(jié)腸炎。炎性疾病還包括，例如，心血管疾病、慢性阻塞性肺病(copd)、支氣管擴(kuò)張、慢性膽囊炎、結(jié)核病、橋本氏甲狀腺炎、敗血病、結(jié)節(jié)病、矽肺及其他塵肺、以及傷口中的植入異體、但都不局限于此。如在此所使用，術(shù)語(yǔ)“敗血癥”是指一種公認(rèn)的與針對(duì)微生物侵襲的宿主系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)相關(guān)聯(lián)的臨床綜合征。在此所使用的術(shù)語(yǔ)“敗血癥”是指典型地信號(hào)為發(fā)熱或低體溫、心動(dòng)過(guò)速以及呼吸急促的一種病癥，并且在嚴(yán)重的情況下可進(jìn)展為低血壓、器官功能障礙，及甚至死亡。

在一些實(shí)施例中，炎性疾病是非自身免疫性炎性腸病、手術(shù)后粘連、冠狀動(dòng)脈疾病、肝纖維化、急性呼吸窘迫綜合征、急性炎性胰腺炎、內(nèi)窺鏡逆行膽管胰造影術(shù)引起的胰腺炎、燒傷、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、腦和外周動(dòng)脈、闌尾炎、膽囊炎、憩室炎、內(nèi)臟纖維化病癥、傷口愈合、皮膚瘢痕形成病癥(瘢痕瘤、化膿性汗腺炎)、肉芽腫性病癥(結(jié)節(jié)病、原發(fā)性膽汁性肝硬變)、哮喘、壞疽性膿皮病、sweet氏綜合征、白塞病、原發(fā)性硬化性膽管炎或膿腫。在一些優(yōu)選實(shí)施例中，炎性疾病是炎性腸病(例如，克羅恩病或潰瘍性結(jié)腸炎)。

在其他實(shí)施例中，炎性疾病是一種自身免疫性疾病。在一些實(shí)施例中，自身免疫性疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕熱、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、自身免疫性炎性腸病、胰島素依賴型糖尿病、糖尿病、青少年糖尿病、自發(fā)性自身免疫性糖尿病、胃炎、自身免疫性萎縮性胃炎、自身免疫性肝炎、甲狀腺炎、橋本氏甲狀腺炎、胰島炎、卵巢炎、睪丸炎、葡萄膜炎、晶狀體源性葡萄膜炎、多發(fā)性硬化、重癥肌無(wú)力、原發(fā)性粘液性水腫、甲狀腺功能亢進(jìn)、惡性貧血、自身免疫性溶血性貧血、阿狄森病、強(qiáng)直性脊柱炎、結(jié)節(jié)病、硬皮病、古德帕斯徹氏綜合征、格林-巴利綜合征、格雷夫病、腎小球腎炎、銀屑病、尋常性天皰瘡、類天皰瘡、濕疹、大皰性類天皰瘡、交感性眼炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜、特發(fā)性白細(xì)胞減少癥(feucopenia)、干燥綜合征、系統(tǒng)性硬化、韋格納肉芽腫、多肌炎/皮肌炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、原發(fā)性硬化性膽管炎、紅斑狼瘡或系統(tǒng)性紅斑狼瘡。

移植物抗宿主病(gvhd)是多能細(xì)胞(例如，干細(xì)胞)或骨髓移植之后可以發(fā)生的并發(fā)癥，在移植中新移植的材料對(duì)移植受體身體產(chǎn)生攻擊。在一些實(shí)例中，gvhd在輸血后發(fā)生。移植物抗宿主病可以分為急性和慢性形式。急性或暴發(fā)形式的疾病(agvhd)通常在移植后前100天觀察到，并且由于相關(guān)聯(lián)的發(fā)病率和死亡率而對(duì)移植是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。慢性形式的移植物抗宿主病(cgvhd)通常發(fā)生在100天之后。cgvhd的中度至重度情況的出現(xiàn)不利地影響長(zhǎng)期生存。

實(shí)例

實(shí)例1：具有或不具有卵白蛋白肽(323-339)的帶有偶聯(lián)的雷帕霉素的合成納米載體的免疫應(yīng)答

材料

從巴亨美洲公司(bachemamericasinc.，柏市街(kashiwastreet)3132號(hào)，托倫斯(torrance)加利福尼亞州(ca)90505；區(qū)號(hào)#4065609)購(gòu)買卵白蛋白肽323-339，即一種已知為卵白蛋白的t和b細(xì)胞表位的17氨基酸肽。從tsz化學(xué)品公司(tszchem，威爾遜街(wilsonstreet)185號(hào)，弗雷明漢(framingham)，馬薩諸塞州(ma)01702；產(chǎn)品目錄#r1017)購(gòu)買雷帕霉素。從surmodics制藥公司(surmodicspharmaceuticals，湯姆馬丁路(tommartindrive)756號(hào)，伯明翰(birmingham)，亞拉巴馬州(al)35211；產(chǎn)品代碼7525dlg7a)購(gòu)買丙交酯∶乙交酯比為3∶1并且特性粘度為0.75dl/g的plga。從emd化學(xué)品公司(emdchemicals，產(chǎn)品編號(hào)1.41350.1001)購(gòu)買聚乙烯醇(85％-89％水解的)。

溶液1：在稀釋的鹽酸水溶液中的20mg/ml的卵白蛋白肽323-339@20mg/ml。通過(guò)在室溫下將卵白蛋白肽溶解在0.13m鹽酸溶液中而制備該溶液。

溶液2：在二氯甲烷中的雷帕霉素@50mg/ml。通過(guò)將雷帕霉素溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液。

溶液3：在二氯甲烷中的plga@100mg/ml。通過(guò)將plga溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液。

溶液4：在100mm的ph8的磷酸鹽緩沖液中的聚乙烯醇@50mg/ml。

用于制備含有雷帕霉素和卵白蛋白(323-339)的合成納米載體的方法

首先制備第一油包水乳液。通過(guò)將溶液1(0.2ml)、溶液2(0.2ml)、以及溶液3(1.0ml)合并在一個(gè)小的壓力管中并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀(bransondigitalsonifier)250在50％振幅下進(jìn)行聲處理40秒來(lái)制備w1/o1。然后通過(guò)將溶液4(3.0ml)與第一w1/o1乳液合并、渦旋10秒、并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在30％振幅下進(jìn)行聲處理60秒來(lái)制備第二乳液(w1/o1/w2)。

將該w1/o1/w2乳液添加到含有70mm的ph8磷酸鹽緩沖溶液(30ml)的燒杯中并且在室溫下攪拌2小時(shí)以允許二氯甲烷蒸發(fā)并且允許合成納米載體形成。通過(guò)以下方式來(lái)洗滌一部分合成納米載體：將合成納米載體懸浮液轉(zhuǎn)移至一個(gè)離心管中，并且在21,000×g和4℃下離心一小時(shí)、去除上清液、并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中。重復(fù)該洗滌程序，并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中以用于約10mg/ml的最終的合成納米載體分散液。

通過(guò)hplc分析來(lái)確定在合成納米載體中的肽和雷帕霉素的量。通過(guò)重量法來(lái)確定每ml懸浮液的總的干燥合成納米載體質(zhì)量。

用于含有雷帕霉素的合成納米載體的方法

首先制備第一油包水乳液。通過(guò)將0.13m鹽酸溶液(0.2ml)、溶液2(0.2ml)、以及溶液3(1.0ml)合并在一個(gè)小的壓力管中并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在50％振幅下進(jìn)行聲處理40秒來(lái)制備w1/o1。然后通過(guò)將溶液4(3.0ml)與第一w1/o1乳液合并、渦旋10秒、并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在30％振幅下進(jìn)行聲處理60秒來(lái)制備第二乳液(w1/o1/w2)。

將該w1/o1/w2乳液添加到含有70mm的ph8磷酸鹽緩沖溶液(30ml)的燒杯中并且在室溫下攪拌2小時(shí)以允許二氯甲烷蒸發(fā)并且允許合成納米載體形成。通過(guò)以下方式來(lái)洗滌一部分合成納米載體：將合成納米載體懸浮液轉(zhuǎn)移至一個(gè)離心管中，并且在21,000×g和4℃下離心一小時(shí)、去除上清液、并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中。重復(fù)該洗滌程序，并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中以用于約10mg/ml的最終的合成納米載體分散液。

通過(guò)hplc分析來(lái)確定在合成納米載體中的雷帕霉素的量。通過(guò)重量法來(lái)確定每ml懸浮液的總的干燥合成納米載體質(zhì)量。

用于測(cè)量雷帕霉素負(fù)載量的方法

收集近似3mg的合成納米載體，并且離心以使上清液與合成納米載體沉淀分離。向該沉淀添加乙腈，并且對(duì)樣品進(jìn)行聲處理并且離心以去除任何不溶的材料。將該上清液和沉淀注射在rp-hplc上，并且在278nm處讀取吸光度。該沉淀中發(fā)現(xiàn)的μg用來(lái)計(jì)算％包載(負(fù)載)，在上清液和沉淀中的μg用來(lái)計(jì)算回收的總μg。

用于測(cè)量卵白蛋白(323-339)負(fù)載量的方法

收集近似3mg的合成納米載體，并且離心以使上清液與合成納米載體沉淀分離。向該沉淀添加三氟乙醇并且對(duì)樣品進(jìn)行聲處理以溶解該聚合物，添加0.2％三氟乙酸并且對(duì)樣品進(jìn)行聲處理并且然后離心以去除任何不溶的材料。將該上清液和沉淀注射在rp-hplc上，并且在215nm處讀取吸光度。該沉淀中發(fā)現(xiàn)的μg用來(lái)計(jì)算％包載(負(fù)載)，在上清液和沉淀中的μg用來(lái)計(jì)算回收的總μg。

在treg細(xì)胞發(fā)育上的抗原特異性致耐受性樹(shù)突狀細(xì)胞(tdc)活性

該測(cè)定包括使用具有對(duì)免疫顯性卵白蛋白(323-339)特異的轉(zhuǎn)基因t細(xì)胞受體的otii小鼠。為了產(chǎn)生抗原特異性tdc，將cd11c+脾臟細(xì)胞分離，并且在1μg/ml或無(wú)抗原下在體外添加卵白蛋白(323-339)肽。然后將可溶的或納米載體封裝的雷帕霉素添加到dc中保持2小時(shí)，然后將這些dc充分洗滌以從培養(yǎng)物中去除游離雷帕霉素。將純化的應(yīng)答cd4+cd25-細(xì)胞從otii小鼠分離并且以10∶1的t與dc比添加到tdc中。然后將tdc與otiit-細(xì)胞的混合物培養(yǎng)4-5天，并且通過(guò)如圖1所示的流式細(xì)胞檢測(cè)來(lái)分析treg細(xì)胞(cd4+cd25highfoxp3+)的頻率?；谕N型對(duì)照選擇區(qū)域。

實(shí)例2：具有偶聯(lián)的布洛芬的介孔二氧化硅納米顆粒(預(yù)示的)

介孔sio2納米顆粒核心通過(guò)溶膠-凝膠法產(chǎn)生。將十六烷基三甲基溴化銨(ctab)(0.5g)溶解在去離子水(500ml)中，并且然后將2m的naoh水溶液(3.5ml)添加到ctab溶液中。將該溶液攪拌30分鐘，并且然后向該溶液中添加四乙氧基硅烷(teos)(2.5ml)。在80℃的溫度下將生成的凝膠攪拌3小時(shí)。通過(guò)過(guò)濾捕獲形成的白色沉淀，隨后用去離子水洗滌并且在室溫下干燥。然后通過(guò)懸浮于hcl的乙醇溶液中過(guò)夜而從顆粒中提取出殘留的表面活性劑。將這些顆粒用乙醇洗滌、離心、并且在超聲處理下再分散。這個(gè)洗滌程序另外再重復(fù)兩次。

然后使用(3-氨基丙基)-三乙氧基硅烷(aptms)用氨基對(duì)sio2納米顆粒進(jìn)行功能化。為此，將顆粒懸浮在乙醇(30ml)中，并且將aptms(50μl)添加到懸浮液中。允許該懸浮液在室溫下靜置2小時(shí)，并且然后煮沸4小時(shí)，通過(guò)周期性地添加乙醇使體積保持恒定。殘留的反應(yīng)物通過(guò)五個(gè)離心洗滌和再分散于純乙醇中的循環(huán)來(lái)去除。

在一個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)中，產(chǎn)生1-4nm直徑的金種子。在此反應(yīng)中使用的所有的水首先被去離子并且然后從玻璃蒸餾。將水(45.5ml)添加到100ml圓底燒瓶中。在攪拌下，添加0.2m水性naoh(1.5ml)，隨后添加氯化四(羥甲基)鏻(thpc)的1％水溶液(1.0ml)。在添加thpc溶液之后兩分鐘，添加已經(jīng)老化至少15分鐘的氯金酸的10mg/ml水溶液(2ml)。通過(guò)用水透析來(lái)純化這些金種子。

為了形成核-殼納米載體，將以上形成的氨基功能化的sio2納米顆粒首先在室溫下與這些金種子混合2小時(shí)。將金修飾的sio2顆粒通過(guò)離心來(lái)收集，并且與氯金酸和碳酸氫鉀的水溶液混合來(lái)形成金外殼。然后將這些顆粒離心洗滌、并且再分散于水中。通過(guò)將這些顆粒懸浮于布洛芬鈉的溶液(1mg/l)中72小時(shí)來(lái)負(fù)載布洛芬。然后將游離的布洛芬通過(guò)離心從顆粒中洗滌出并且再分散于水中。

實(shí)例3：含有環(huán)孢霉素a的脂質(zhì)體(預(yù)示的)

這些脂質(zhì)體使用薄膜水合來(lái)形成。將1，2-二棕櫚酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(dppc)(32μmol)、膽固醇(32μmol)、以及環(huán)孢霉素a(6.4μmol)溶解在純氯仿(3ml)中。將此脂質(zhì)溶液添加到50ml的圓底燒瓶中，并且在60℃的溫度下在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上蒸發(fā)溶劑。燒瓶然后用氮?dú)鉀_洗以去除殘留溶劑。將磷酸鹽緩沖鹽水(2ml)和五個(gè)玻璃珠添加到燒瓶中，并且通過(guò)在60℃下?lián)u晃1小時(shí)來(lái)使脂質(zhì)膜水合以形成懸浮液。將該懸浮液轉(zhuǎn)移到一個(gè)小的壓力管中并且在60℃下進(jìn)行聲處理，持續(xù)四個(gè)30秒脈沖循環(huán)，其中在每個(gè)脈沖之間有30秒的延遲。然后使懸浮液在室溫下靜置2小時(shí)，以允許完全水合。離心洗滌脂質(zhì)體，隨后再懸浮于新鮮磷酸鹽緩沖鹽水中。

實(shí)例4：含有聚合物-雷帕霉素共軛物的聚合納米載體(預(yù)示的)

plga-雷帕霉素共軛物的制備：

將具有酸端基的plga聚合物(7525dlg1a，酸值0.46mmol/g，lakeshore生物材料公司(lakeshorebiomaterials)；5g，2.3mmol，1.0當(dāng)量)溶解在30ml的二氯甲烷(dcm)中。添加n，n-二環(huán)己基碳二亞胺(1.2當(dāng)量，2.8mmol，0.57g)，隨后添加雷帕霉素(1.0當(dāng)量，2.3mmol，2.1g)和4-二甲氨基吡啶(dmap)(2.0當(dāng)量，4.6mmol，0.56g)。將混合物在室溫下攪拌2天。然后過(guò)濾混合物以去除不溶的二環(huán)己脲。將濾液濃縮至體積大約為10ml并且添加到100ml的異丙醇(ipa)中以沉淀出plga-雷帕霉素共軛物。將ipa層去除并且聚合物然后用50ml的ipa和50ml的甲基叔丁醚(mtbe)洗滌。然后將聚合物在35℃下真空干燥2天，給出呈白色固體的plga-雷帕霉素(大約6.5g)。

含有plga-雷帕霉素共軛物和卵白蛋白肽(323-339)的納米載體的制備：

根據(jù)實(shí)例1中所述的程序如下制備含有plga-雷帕霉素的納米載體：

如下制備用于納米載體形成的溶液：

溶液1：在稀釋的鹽酸水溶液中的卵白蛋白肽323-339@20mg/ml。通過(guò)在室溫下將卵白蛋白肽溶解在0.13m鹽酸溶液中而制備該溶液。溶液2：在二氯甲烷中的plga-雷帕霉素@100mg/ml。通過(guò)將plga-雷帕霉素溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液。溶液3：在二氯甲烷中的pla-peg@100mg/ml。通過(guò)將pla-peg溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液。溶液4：在100mm的ph8的磷酸鹽緩沖液中的聚乙烯醇@50mg/ml。

首先制備第一油包水乳液。通過(guò)將溶液1(0.2ml)、溶液2(0.75ml)、以及溶液3(0.25ml)合并在一個(gè)小的壓力管中并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在50％振幅下進(jìn)行聲處理40秒來(lái)制備w1/o1。然后通過(guò)將溶液4(3.0ml)與第一w1/o1乳液合并、渦旋10秒、并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在30％振幅下進(jìn)行聲處理60秒來(lái)制備第二乳液(w1/o1/w2)。將該w1/o1/w2乳液添加到含有70mm的ph8磷酸鹽緩沖溶液(30ml)的燒杯中并且在室溫下攪拌2小時(shí)以允許二氯甲烷蒸發(fā)并且允許納米載體形成。通過(guò)以下方式來(lái)洗滌一部分納米載體：將納米載體懸浮液轉(zhuǎn)移至一個(gè)離心管中，并且在75,600×g和4℃下離心35分鐘、去除上清液、并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中。重復(fù)該洗滌程序，并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中以用于約10mg/ml的最終的納米載體分散液。

實(shí)例5：含有雷帕霉素的金納米載體(auncs)的制備(預(yù)示的)

hs-peg-雷帕霉素的制備：

將peg酸二硫化物(1.0當(dāng)量)、雷帕霉素(2.0-2.5當(dāng)量)、dcc(2.5當(dāng)量)以及dmap(3.0當(dāng)量)在無(wú)水dmf中的溶液在室溫下攪拌過(guò)夜。通過(guò)過(guò)濾去除不溶的二環(huán)己脲并且將濾液添加到異丙醇(ipa)中以沉淀出peg-二硫化物-二-雷帕霉素酯并用ipa洗滌并干燥。聚合物然后用在dmf中的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽處理，以便將peg二硫化物還原成硫醇基peg雷帕霉素酯(hs-peg-雷帕霉素)。通過(guò)沉淀從ipa回收生成的聚合物并且如先前所述進(jìn)行干燥并且通過(guò)hnmr和gpc來(lái)分析。

金ncs(auncs)的形成：

在一個(gè)裝備有冷凝器的1l圓底燒瓶中，在劇烈攪拌下加熱回流500ml的1mmhaucl4的水溶液10分鐘。然后向攪拌的溶液迅速添加50ml的40mm的檸檬酸三鈉溶液。將生成的深酒紅色溶液保持回流25-30分鐘，然后停止加熱，并且冷卻該溶液至室溫。然后通過(guò)一個(gè)0.8μm薄膜過(guò)濾器過(guò)濾該溶液，以給出auncs溶液。使用可見(jiàn)光譜學(xué)和透射電子顯微術(shù)表征auncs。這些auncs直徑大約20nm，被檸檬酸鹽包裹，并且吸收峰在520nm處。

具有hs-peg-雷帕霉素的auncs共軛物：

將150μl的hs-peg-雷帕霉素的溶液(在10mmph9.0碳酸鹽緩沖液中，10μm)添加到1ml的20nm直徑的檸檬酸鹽包裹的金納米載體(1.16nm)中，以產(chǎn)生2500∶1的硫醇基與金的摩爾比。在室溫在氬下攪拌混合物1小時(shí)以允許金納米載體上的硫醇與檸檬酸鹽完全交換。然后通過(guò)在12,000g下離心30分鐘將表面上的具有peg-雷帕霉素的auncs純化。將上清液傾析出來(lái)并且然后將含有aunc-s-peg-雷帕霉素的沉淀用1xpbs緩沖液沉淀洗滌。然后將純化的金-peg-雷帕霉素納米載體再懸浮于合適的緩沖液中以便進(jìn)行進(jìn)一步分析和生物測(cè)定。

實(shí)例6：含有卵白蛋白的介孔二氧化硅-金核-殼納米載體(預(yù)示的)

介孔sio2納米顆粒核心通過(guò)溶膠-凝膠法來(lái)產(chǎn)生。將十六烷基三甲基溴化銨(ctab)(0.5g)溶解在去離子水(500ml)中，并且然后將2m的naoh水溶液(3.5ml)添加到ctab溶液中。將該溶液攪拌30分鐘，并且然后向該溶液中添加四乙氧基硅烷(teos)(2.5ml)。在80℃的溫度下將生成的凝膠攪拌3小時(shí)。通過(guò)過(guò)濾捕獲形成的白色沉淀，隨后用去離子水洗滌并且在室溫下干燥。然后通過(guò)懸浮于hcl的乙醇溶液中過(guò)夜而從顆粒中提取出殘留的表面活性劑。將這些顆粒用乙醇洗滌、離心、并且在超聲處理下再分散。這個(gè)洗滌程序另外再重復(fù)兩次。

然后使用(3-氨基丙基)-三乙氧基硅烷(aptms)用氨基對(duì)sio2納米顆粒進(jìn)行功能化。為此，將顆粒懸浮在乙醇(30ml)中，并且將aptms(50μl)添加到懸浮液中。允許該懸浮液在室溫下靜置2小時(shí)，并且然后煮沸4小時(shí)，通過(guò)周期性地添加乙醇使體積保持恒定。殘留的反應(yīng)物通過(guò)五個(gè)離心洗滌和再分散于純乙醇中的循環(huán)來(lái)去除。

在一個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)中，產(chǎn)生1-4nm直徑的金種子。在此反應(yīng)中使用的所有的水首先被去離子并且然后從玻璃蒸餾。將水(45.5ml)添加到100ml圓底燒瓶中。在攪拌下，添加0.2m水性naoh(1.5ml)，隨后添加氯化四(羥甲基)鏻(thpc)的1％水溶液(1.0ml)。在添加thpc溶液之后兩分鐘，添加已經(jīng)老化至少15分鐘的氯金酸的10mg/ml水溶液(2ml)。通過(guò)用水透析來(lái)純化這些金種子。

為了形成核-殼納米載體，將以上形成的氨基功能化的sio2納米顆粒首先在室溫下與這些金種子混合2小時(shí)。將金修飾的sio2顆粒通過(guò)離心來(lái)收集，并且與氯金酸和碳酸氫鉀的水溶液混合來(lái)形成金外殼。然后將這些顆粒離心洗滌、并且再分散于水中。通過(guò)將這些顆粒懸浮于硫醇化的卵白蛋白溶液(1mg/l)中72小時(shí)來(lái)負(fù)載硫醇化的卵白蛋白(通過(guò)用2-亞氨基硫烷鹽酸鹽處理卵白蛋白而制成)。顆粒然后用1xpbs(ph7.4)沉淀洗滌以去除游離蛋白。然后將生成的含有卵白蛋白的二氧化硅-金核-殼納米載體再懸浮于1xpbs中以便進(jìn)行進(jìn)一步分析和測(cè)定。

實(shí)例7：含有雷帕霉素和卵白蛋白的脂質(zhì)體(預(yù)示的)

這些脂質(zhì)體通過(guò)薄膜水合來(lái)形成。將1，2-二棕櫚酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(dppc)(32μmol)、膽固醇(32μmol)、以及雷帕霉素(6.4μmol)溶解在純氯仿(3ml)中。將此脂質(zhì)溶液添加到10ml玻璃管中，并且在氮?dú)饬飨氯コ軇┎⑶艺婵崭稍?小時(shí)。通過(guò)用2.0ml的25mmmops緩沖液ph8.5使該膜水合來(lái)獲得多層囊泡，其含有過(guò)量的卵白蛋白。使管渦旋，直到脂質(zhì)膜從管表面上剝落。為了將多層囊泡打破成單層的，應(yīng)用十個(gè)冷凍(液氮)和融化(30℃水浴)循環(huán)。然后將樣品在25mmmops緩沖液ph8.5中稀釋到1ml。通過(guò)使樣品10倍穿過(guò)200nm孔聚碳酸酯過(guò)濾器而擠出而將生成的脂質(zhì)體的大小均勻化。然后使用生成的脂質(zhì)體用于進(jìn)一步分析和生物測(cè)定。

實(shí)例8：由具有表面共軛的卵白蛋白的修飾聚氨基酸組成的聚合納米載體(預(yù)示的)

步驟1.用l-苯丙氨酸乙酯(l-pae)修飾的聚(γ-谷氨酸)(γ-pga)的制備：將4.7單位毫摩爾的γ-pga(mn＝300kd)溶解在0.3n-nahco3水溶液(50ml)中。將l-pae(4.7mmol)和edc.hcl(4.7mmol)添加到該溶液中并且在4℃下攪拌30分鐘。然后在攪拌下將該溶液保持在室溫24小時(shí)。使用具有mwco50kd的透析薄膜通過(guò)滲析去除低分子量化學(xué)物質(zhì)。通過(guò)凍干獲得生成的γ-pga-接枝-l-pae。

步驟2.由γ-pga-接枝-l-pae聚合物制備納米顆粒：通過(guò)沉淀和透析方法來(lái)制備由γ-pga-接枝-l-pae組成的納米顆粒。將γ-pga-接枝-l-pae(20mg)溶解在2ml的dmso中，隨后添加2ml的水以形成半透明溶液。然后在室溫下用蒸餾水使用纖維素薄膜配管(50,000mwco)透析該溶液72小時(shí)，以形成納米顆粒并且去除有機(jī)溶劑。蒸餾水以12小時(shí)的間隔進(jìn)行更換。然后使用生成的納米顆粒溶液(在水中的10mg/ml)以用于抗原共軛。

步驟3.卵白蛋白與γ-pga納米顆粒的共軛：γ-pga納米顆粒(10mg/ml)的表面羧酸基團(tuán)首先在環(huán)境溫度下通過(guò)edc和nhs(各自在磷酸鹽緩沖液中的10mg/ml，ph5.8)活化2小時(shí)。在沉淀洗滌以去除過(guò)量的edc/nhs之后，將活化的納米顆粒與1ml的卵白蛋白(10mg/ml)混合在磷酸鹽緩沖鹽水(pbs，ph7.4)中，并且將混合物在4℃-8℃下孵育24小時(shí)。將生成的卵白蛋白共軛的γ-pga納米顆粒用pbs洗滌兩次并且以5mg/ml再懸浮于pbs中以便進(jìn)行進(jìn)一步分析和生物測(cè)定。

實(shí)例9：紅細(xì)胞生成素(epo)封裝的γ-pga納米顆粒(預(yù)示的)

為了制備epo封裝的γ-pga納米顆粒，將0.25-4mg的epo溶解在1ml的pbs(ph7.4)中，并且將1ml的γ-pga-接枝-l-pae(dmso中的10mg/ml)添加到epo溶液中。將生成的溶液在14,000xg下離心15分鐘并且用pbs重復(fù)清洗。然后將生成的epo封裝的γ-pga納米顆粒再懸浮于pbs(5mg/ml)中以便進(jìn)行進(jìn)一步分析和生物測(cè)定。

實(shí)例10：含有卵白蛋白的金納米載體(auncs)的制備(預(yù)示的)

步驟1.金ncs(auncs)的形成：在一個(gè)裝備有冷凝器的1l圓底燒瓶中，在劇烈攪拌下加熱回流500ml的1mmhaucl4的水溶液10分鐘。然后向攪拌的溶液迅速添加50ml的40mm的檸檬酸三鈉溶液。將生成的深酒紅色溶液保持回流25-30分鐘，然后停止加熱，并且冷卻該溶液至室溫。然后通過(guò)一個(gè)0.8μm薄膜過(guò)濾器過(guò)濾該溶液，以給出auncs溶液。使用可見(jiàn)光譜學(xué)和透射電子顯微術(shù)表征auncs。這些auncs直徑大約20nm，被檸檬酸鹽包裹，并且吸收峰在520nm處。

步驟2.卵白蛋白與auncs的共軛：將150μl的硫醇化的卵白蛋白溶液(在10mmph9.0碳酸鹽緩沖液中的10μm)添加到1ml的20nm直徑的檸檬酸鹽包裹的金納米載體(1.16nm)中，以產(chǎn)生2500∶1的硫醇基與金的摩爾比。在室溫在氬氣下攪拌混合物1小時(shí)以允許金納米載體上的硫醇與檸檬酸鹽完全交換。然后通過(guò)在12,000g下離心30分鐘將表面上的具有卵白蛋白的auncs純化。將上清液傾析出來(lái)并且然后將含有aunc-卵白蛋白的沉淀用1xpbs緩沖液沉淀洗滌。然后將純化的金-卵白蛋白納米載體再懸浮于合適的緩沖液中以便進(jìn)行進(jìn)一步分析和生物測(cè)定。

實(shí)例11：體內(nèi)評(píng)估針對(duì)抗原的致耐受性免疫應(yīng)答(預(yù)示的)

balb/c小鼠用不完全弗氏佐劑中的抗原免疫，并且評(píng)定調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的增殖水平。隨后，以劑量依賴性方式給予發(fā)明組合物。然后將相同小鼠再次暴露于抗原，并且再次評(píng)定調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的增殖水平。然后監(jiān)測(cè)調(diào)節(jié)性b細(xì)胞增殖的變化，其中在隨后用抗原激發(fā)時(shí)調(diào)節(jié)性b細(xì)胞增殖增加，表明了致耐受性免疫應(yīng)答。

實(shí)例12：評(píng)估調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的體外誘導(dǎo)(預(yù)示的)

使包含調(diào)節(jié)性b細(xì)胞或調(diào)節(jié)性b細(xì)胞前體的一個(gè)細(xì)胞群體在體外與一種在此提供的組合物接觸。在足以使該組合物與該細(xì)胞群體中的這些調(diào)節(jié)性b細(xì)胞或調(diào)節(jié)性b細(xì)胞前體相互作用的一段時(shí)間后，預(yù)期調(diào)節(jié)性b細(xì)胞數(shù)目的增加。在一些實(shí)施例中，足以使該細(xì)胞群體中的調(diào)節(jié)性b細(xì)胞數(shù)目增加的一段時(shí)間是約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約1周、約2周、約3周、或約4周。在一些實(shí)施例中，在那段時(shí)間之后，調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的數(shù)目增加至與該群體中的調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的原始總數(shù)目或相對(duì)數(shù)目相比例如至少約5倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約50倍、至少約100倍、至少約1.000倍、至少約10.000倍、至少約100.000倍、或至少約1.000.000倍。在一些實(shí)施例中，在那段時(shí)間之后，調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的數(shù)目增加至該群體中的總細(xì)胞的或該細(xì)胞群體中的淋巴細(xì)胞的例如約1％、約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約40％、約50％、約75％、約90％、或約95％。在一些實(shí)施例中，調(diào)節(jié)性b細(xì)胞在接觸之前在該細(xì)胞群體中不存在，但在接觸之后則存在。

在一些實(shí)施例中，在使該細(xì)胞群體與在此提供的一種組合物接觸之前測(cè)定該群體中調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的總數(shù)目和/或相對(duì)數(shù)目，以便建立該群體中調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的一個(gè)基線數(shù)目。在一些實(shí)施例中，使該細(xì)胞群體與在此提供的一種組合物接觸一次。在一些實(shí)施例中，使該細(xì)胞群體與在此提供的一種組合物重復(fù)接觸。

還在接觸之后測(cè)定該細(xì)胞群體中調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的數(shù)目和/或存在。在一些實(shí)施例中，監(jiān)測(cè)一段時(shí)間內(nèi)調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的數(shù)目和/或存在，例如通過(guò)執(zhí)行多個(gè)隨后的調(diào)節(jié)性b細(xì)胞檢測(cè)測(cè)定。在一些實(shí)施例中，通過(guò)取得代表該細(xì)胞群體的來(lái)自該細(xì)胞群體的一個(gè)樣品、用特異性地檢測(cè)調(diào)節(jié)性b細(xì)胞標(biāo)記的抗體或染色劑對(duì)該樣品中所含的細(xì)胞染色、并且例如通過(guò)facs或通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)表達(dá)該樣品中調(diào)節(jié)性b細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞，來(lái)測(cè)定該細(xì)胞群體中調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的數(shù)目和/或存在。在一些實(shí)施例中，將調(diào)節(jié)性b細(xì)胞定量。在一些實(shí)施例中，將接觸之后測(cè)定的調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的量與接觸之前的調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的量相比較，例如與調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的基線數(shù)目相比較，其中，如果該細(xì)胞群體中調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的數(shù)目在接觸后比基線數(shù)目更高，則確定已經(jīng)發(fā)生了針對(duì)該組合物的一種致耐受性應(yīng)答。

實(shí)例13：評(píng)估調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的體內(nèi)誘導(dǎo)(預(yù)示的)

使包含調(diào)節(jié)性b細(xì)胞或調(diào)節(jié)性b細(xì)胞前體的一個(gè)細(xì)胞群體在體內(nèi)與一種在此提供的組合物接觸。在一些實(shí)施例中，將該組合物給予擁有包含調(diào)節(jié)性b細(xì)胞或調(diào)節(jié)性b細(xì)胞前體的細(xì)胞群的受試者。在足以使該組合物與該受試者中的這些調(diào)節(jié)性b細(xì)胞或調(diào)節(jié)性b細(xì)胞前體相互作用的一段時(shí)間后，預(yù)期調(diào)節(jié)性b細(xì)胞數(shù)目的增加。在一些實(shí)施例中，足以使該群體中的調(diào)節(jié)性b細(xì)胞數(shù)目增加的一段時(shí)間是約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約1周、約2周、約3周、或約4周。在一些實(shí)施例中，足以實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)性b細(xì)胞數(shù)目增加的該時(shí)間段長(zhǎng)于4周。在一些實(shí)施例中，在那段時(shí)間之后，調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的數(shù)目增加至與該受試者中的調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的原始總數(shù)目或相對(duì)數(shù)目相比至少約5倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約50倍、至少約100倍、至少約1.000倍、至少約10.000倍、至少約100.000倍、或至少約1.000.000倍。在一些實(shí)施例中，在那段時(shí)間之后，調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的數(shù)目增加至該受試者中的總細(xì)胞的或該受試者中的淋巴細(xì)胞的例如約1％、約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約40％、約50％、約75％、約90％、或約95％。在一些實(shí)施例中，調(diào)節(jié)性b細(xì)胞在給予之前該受試者中不存在，但在給予之后則存在。

在一些實(shí)施例中，在對(duì)該受試者給予在此提供的一種組合物之前測(cè)定該受試者中調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的總數(shù)目和/或相對(duì)數(shù)目，以便建立該受試者中調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的一個(gè)基線數(shù)目。在一些實(shí)施例中，在此提供的組合物被給予受試者一次。在一些實(shí)施例中，在此提供的一種組合物被給予受試者多次，例如，直到在該受試者中觀察到調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的所希望的增加或豐度。

在給予之后測(cè)定該受試者中調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的數(shù)目和/或存在。在一些實(shí)施例中，監(jiān)測(cè)一段時(shí)間內(nèi)調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的數(shù)目和/或存在，例如通過(guò)執(zhí)行多個(gè)隨后的調(diào)節(jié)性b細(xì)胞檢測(cè)測(cè)定。在一些實(shí)施例中，通過(guò)從該受試者取得代表該受試者中的一個(gè)淋巴細(xì)胞群體的一個(gè)樣品(例如外周血樣品或淋巴樣品)、用特異性地檢測(cè)調(diào)節(jié)性b細(xì)胞標(biāo)記的抗體或染色劑對(duì)該樣品中所含的細(xì)胞染色、并且例如通過(guò)facs或通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)表達(dá)該樣品中調(diào)節(jié)性b細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞，來(lái)測(cè)定該受試者中調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的數(shù)目和/或存在。在一些實(shí)施例中，將調(diào)節(jié)性b細(xì)胞定量。在一些實(shí)施例中，將給予之后測(cè)定的調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的量與給予之前的調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的量相比較，例如與調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的基線數(shù)目相比較，其中，如果該受試者中調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的數(shù)目在給予后比基線數(shù)目更高，則確定已經(jīng)發(fā)生了針對(duì)該組合物的一種致耐受性應(yīng)答。

實(shí)例14：體內(nèi)誘導(dǎo)針對(duì)可移植的骨髓細(xì)胞的所希望的免疫應(yīng)答(預(yù)示的)

在受試者接受骨髓移植前四周，向該受試者皮下給予一個(gè)群體的至少10⁶個(gè)合成納米載體，這些合成納米載體包含免疫抑制劑和從骨髓細(xì)胞中獲得或衍生出的多種抗原。在該受試者接受該移植之后，在接受該移植后的第一周內(nèi)每日一次、并且然后在接下來(lái)的三周內(nèi)每周一次、并且然后在接下來(lái)的11周內(nèi)每月一次地對(duì)該受試者中的所希望的免疫應(yīng)答的產(chǎn)生進(jìn)行評(píng)定。作為評(píng)定的一部分，取得調(diào)節(jié)性b細(xì)胞計(jì)數(shù)，并且與向該受試者給予骨髓移植或這些合成納米載體之前取得的調(diào)節(jié)性b細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行比較。在第一年期間，向該受試者雙月地給予維持劑量的這些合成納米載體。該受試者預(yù)期會(huì)展現(xiàn)出更高或所希望的水平的對(duì)該骨髓移植特異的調(diào)節(jié)性b細(xì)胞。

實(shí)例15：評(píng)定具有抗原和免疫抑制劑的納米載體的作用

納米載體

從巴亨美洲公司(柏市街3132號(hào)，托倫斯，加利福尼亞州90505；區(qū)號(hào)#4065609)購(gòu)買卵白蛋白肽323-339，即一種已知為卵白蛋白的t和b細(xì)胞表位的17氨基酸肽。從surmodics制藥公司(湯姆馬丁路756號(hào)，伯明翰，亞拉巴馬州35211；產(chǎn)品代碼7525dlg7a)購(gòu)買丙交酯∶乙交酯比為3∶1并且特性粘度為0.75dl/g的plga。合成了peg嵌段大約為5,000da并且pla嵌段大約為20,000da的pla-peg嵌段共聚物。從emd化學(xué)品公司(產(chǎn)品編號(hào)1.41350.1001)購(gòu)買聚乙烯醇(85％-89％水解的)。

如下制備溶液：溶液1：在稀釋的鹽酸水溶液中的卵白蛋白肽323-339@20mg/ml。通過(guò)在室溫下將卵白蛋白肽溶解在0.13m鹽酸溶液中而制備該溶液。溶液2：在二氯甲烷中的plga@100mg/ml。通過(guò)將plga溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液。溶液3：在二氯甲烷中的pla-peg@100mg/ml通過(guò)將pla-peg溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液。溶液4：在100mm的ph8的磷酸鹽緩沖液中的聚乙烯醇@50mg/ml。首先制備第一油包水乳液。通過(guò)將溶液1(0.2ml)、溶液2(0.75ml)、以及溶液3(0.25ml)合并在一個(gè)小的壓力管中并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在50％振幅下進(jìn)行聲處理40秒來(lái)制備w1/o1。然后通過(guò)將溶液4(3.0ml)與第一w1/o1乳液合并、渦旋10秒、并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在30％振幅下進(jìn)行聲處理60秒來(lái)制備第二乳液(w1/o1/w2)。

將該w1/o1/w2乳液添加到含有70mm的ph8磷酸鹽緩沖溶液(30ml)的燒杯中并且在室溫下攪拌2小時(shí)以允許二氯甲烷蒸發(fā)并且允許納米載體形成。通過(guò)以下方式來(lái)洗滌一部分納米載體：將納米載體懸浮液轉(zhuǎn)移至一個(gè)離心管中，并且以75,600×g和4℃離心45分鐘、去除上清液、并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中。重復(fù)該洗滌程序，并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中以用于約10mg/ml的最終的納米載體分散液。

通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射來(lái)確定納米載體大小。通過(guò)hplc分析來(lái)確定在納米載體中的肽的量。通過(guò)重量法來(lái)確定每ml懸浮液的總的干燥納米載體質(zhì)量。

從巴亨美洲公司(柏市街3132號(hào)，托倫斯，加利福尼亞州90505；區(qū)號(hào)#4065609)購(gòu)買卵白蛋白肽323-339，即一種已知為卵白蛋白的t和b細(xì)胞表位的17氨基酸肽。從tsz化學(xué)品公司(威爾遜街185號(hào)，弗雷明漢，馬薩諸塞州01702；產(chǎn)品目錄#r1017)購(gòu)買雷帕霉素。從surmodics制藥公司(湯姆馬丁路756號(hào)，伯明翰，亞拉巴馬州35211；產(chǎn)品代碼7525dlg7a)購(gòu)買丙交酯∶乙交酯比為3∶1并且特性粘度為0.75dl/g的plga。合成了peg嵌段大約為5,000da并且pla嵌段大約為20,000da的pla-peg嵌段共聚物。從emd化學(xué)品公司(產(chǎn)品編號(hào)1.41350.1001)購(gòu)買聚乙烯醇(85％-89％水解的)。

如下制備溶液：溶液1：在稀釋的鹽酸水溶液中的卵白蛋白肽323-339@20mg/ml。通過(guò)在室溫下將卵白蛋白肽溶解在0.13m鹽酸溶液中而制備該溶液。溶液2：在二氯甲烷中的雷帕霉素@50mg/ml。通過(guò)將雷帕霉素溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液。溶液3：在二氯甲烷中的plga@100mg/ml。通過(guò)將plga溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液。溶液4：在二氯甲烷中的pla-peg@100mg/ml。通過(guò)將pla-peg溶解在純二氯甲烷中而制備該溶液。溶液5：在100mm的ph8的磷酸鹽緩沖液中的聚乙烯醇@50mg/ml。

首先制備第一油包水乳液。通過(guò)將溶液1(0.2ml)、溶液2(0.2ml)、溶液3(0.75ml)、以及溶液4(0.25ml)合并在一個(gè)小的壓力管中并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在50％振幅下進(jìn)行聲處理40秒來(lái)制備w1/o1。然后通過(guò)將溶液5(3.0ml)與第一w1/o1乳液合并、渦旋10秒、并且使用布蘭森數(shù)字超聲波儀250在30％振幅下進(jìn)行聲處理60秒來(lái)制備第二乳液(w1/o1/w2)。

將該w1/o1/w2乳液添加到含有70mm的ph8磷酸鹽緩沖溶液(30ml)的燒杯中并且在室溫下攪拌2小時(shí)以允許二氯甲烷蒸發(fā)并且允許納米載體形成。通過(guò)以下方式來(lái)洗滌一部分納米載體：將納米載體懸浮液轉(zhuǎn)移至一個(gè)離心管中，并且以21,000×g和4℃離心45分鐘、去除上清液、并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中。重復(fù)該洗滌程序，并且將沉淀再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水中以用于約10mg/ml的最終的納米載體分散液。

通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射來(lái)確定納米載體大小。通過(guò)hplc分析來(lái)確定在納米載體中的肽和雷帕霉素的量。通過(guò)重量法來(lái)確定每ml懸浮液的總的干燥納米載體質(zhì)量。

通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射(dls)獲得合成納米載體尺寸的測(cè)量值。將合成納米載體的懸浮液用純化水稀釋到以達(dá)到近似0.01至0.1mg/ml的最終的合成納米載體懸浮液濃度。在一個(gè)適合的比色皿中直接制備稀釋的懸浮液以用于dls分析。然后將該比色皿置于布魯克海文儀器公司(brookhaveninstrumentscorp.)zetapals中，允許其平衡至25℃，并且然后掃描充分的時(shí)間以在介質(zhì)的粘度和樣品的折射率的適當(dāng)輸入的基礎(chǔ)上獲得穩(wěn)定且可再現(xiàn)的分布。然后報(bào)告有效直徑，或該分布的平均值。

免疫

將納米載體融化并平衡。初始稀釋液構(gòu)成一個(gè)10x儲(chǔ)備溶液，并且進(jìn)一步在ova323-339中稀釋到100μg/ml的濃度或1x溶液。將這個(gè)1x溶液用于以每靜脈內(nèi)注射按200μl進(jìn)行注射。將動(dòng)物用ova蛋白(ova)免疫并且用ova323-339肽處理。免疫途徑如下：10μg的ova+4mg明礬(alum)，腹膜內(nèi)，每只balb/c初次接受免疫的雌性小鼠400μl。實(shí)驗(yàn)組各自由5只動(dòng)物組成。脾細(xì)胞用抗原使用cfse或cto重新刺激，以便測(cè)定抗原特異性增殖的量。

測(cè)量調(diào)節(jié)性b細(xì)胞

借助流式細(xì)胞檢測(cè)計(jì)算分泌卵白蛋白反應(yīng)性il-10的b細(xì)胞的頻率。將來(lái)自實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的脾細(xì)胞用一種適用于長(zhǎng)期細(xì)胞標(biāo)記的硫醇反應(yīng)性熒光探針cfse染色，并且在完全培養(yǎng)基中在37c、5％co2下用卵白蛋白培養(yǎng)3天。在第3天，使用標(biāo)準(zhǔn)的方法和試劑盒、通過(guò)細(xì)胞內(nèi)染色測(cè)定這些細(xì)胞分泌不同的細(xì)胞因子的潛力。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將細(xì)胞用乙酸肉豆蔻佛波醇(pma)和離子霉素重新刺激2小時(shí)，并且阻斷蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)另外4小時(shí)。用抗cd16/32抗體阻斷非特異性的抗體結(jié)合，并且然后用特異性識(shí)別b細(xì)胞(cd45r(b220)和cd19)的共軛抗體對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。在用多聚甲醛固定之后，將細(xì)胞透化以允許單克隆抗體進(jìn)入這些細(xì)胞并且標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)表位(細(xì)胞因子)。通過(guò)比較差異性cfse染色來(lái)評(píng)定b220+cd19+的那些脾細(xì)胞的增殖并且測(cè)定分泌il-10的細(xì)胞的比例。

ige抗體的測(cè)量

根據(jù)制造廠商的說(shuō)明書使用由md生物制品公司(mdbioproducts)(cat#m036005)提供的小鼠ova-igeelisa試劑盒測(cè)量ige抗體。

結(jié)果

圖2證明了這些納米載體在灌洗樣品中產(chǎn)生調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的有效性，這些灌洗樣品來(lái)自用包含ova323-339和免疫抑制劑的合成納米載體處理的動(dòng)物受試者。該圖證明了本發(fā)明的合成納米載體導(dǎo)致由抗原特異性cd24+b細(xì)胞產(chǎn)生il-10和tgf-β。圖3顯示了使用本發(fā)明的合成納米載體使得ige產(chǎn)生減少。

實(shí)例16：在給予本發(fā)明的合成納米載體之后從受試者中分離調(diào)節(jié)性b細(xì)胞(bregs)細(xì)胞(預(yù)示的)

在受試者給予了在此所描述的合成納米載體組合物之后，從該受試者中獲得的生物樣品(例如外周血)中分離出bregs。典型地，該生物樣品是在足以使被給予的itdcs誘導(dǎo)bregs的時(shí)間段之后從該受試者中獲得的。通過(guò)陰性和/或陽(yáng)性選擇，從生物樣品中(例如，從全血中)分離出bregs。例如，通過(guò)離心獲得全血的細(xì)胞部分，并且使用紅細(xì)胞裂解緩沖液來(lái)裂解紅細(xì)胞。在細(xì)胞裂解之后，外周血單核細(xì)胞被耗盡了cd4+細(xì)胞和cd8+t細(xì)胞。隨后，通過(guò)陽(yáng)性選擇針對(duì)在此其他地方提供的或本領(lǐng)域另外已知的標(biāo)記來(lái)富集bregs。在一些實(shí)施例中，使用用于識(shí)別一種或多種這些標(biāo)記的生物素化的抗體和抗生物素磁珠的混合物來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的分離。

本申請(qǐng)還涉及以下實(shí)施方案：

1.一種方法，包括：

向受試者給予一種組合物，該組合物包含：

(i)第一群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，和

(ii)第二群體的合成納米載體，這些第二群體的合成納米載體被偶聯(lián)以包含一種抗原的b細(xì)胞表位和/或mhcii類限制性表位，

其中該組合物處于在受試者中有效產(chǎn)生抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的量。

2.一種方法，包括：

通過(guò)給予一種組合物而在受試者中產(chǎn)生抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞，該組合物包含：

(i)第一群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，和

(ii)第二群體的合成納米載體，這些第二群體的合成納米載體與一種抗原的b細(xì)胞表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)。

3.一種方法，包括：

根據(jù)一種治療方案向受試者給予一種組合物，該治療方案先前已經(jīng)顯示在一個(gè)或多個(gè)測(cè)試受試者中產(chǎn)生抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞；

其中，該組合物包含：

(i)第一群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，和

(ii)第二群體的合成納米載體，這些第二群體的合成納米載體與一種抗原的b細(xì)胞表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)。

4.如實(shí)施方案2或3所述的方法，其中該組合物處于在受試者中有效產(chǎn)生抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的量

5.如實(shí)施方案1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中該第一群體和該第二群體是相同的群體。

6.如實(shí)施方案1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中該方法進(jìn)一步包括提供或鑒定該受試者。

7.如實(shí)施方案1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中該抗原是一種治療性蛋白、一種自身抗原或一種過(guò)敏原，或與一種炎性疾病、一種自身免疫性疾病、器官或組織排斥、或移植物抗宿主病相關(guān)聯(lián)。

8.如實(shí)施方案1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中該方法進(jìn)一步包括在給予該組合物之前和/或之后評(píng)定該受試者中的抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的產(chǎn)生。

9.如實(shí)施方案1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中該受試者具有或正處于具有一種炎性疾病、一種自身免疫性疾病、一種過(guò)敏癥、器官或組織排斥、或移植物抗宿主病的風(fēng)險(xiǎn)中。

10.如實(shí)施方案1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中該受試者已經(jīng)經(jīng)歷或?qū)⒁?jīng)歷移植。

11.如實(shí)施方案1-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中該受試者具有或正處于具有針對(duì)一種治療性蛋白的一種所不希望的免疫應(yīng)答的風(fēng)險(xiǎn)中，該治療性蛋白是正被給予或?qū)⒁唤o予該受試者的。

12.如實(shí)施方案1-11中任一項(xiàng)所述的方法，其中向該受試者給予一個(gè)或多個(gè)維持劑量的包含這些第一群體和第二群體的合成納米載體的組合物。

13.如實(shí)施方案1-12中任一項(xiàng)所述的方法，其中該給予是通過(guò)靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、透粘膜、經(jīng)口、皮下、肺部、鼻內(nèi)、皮內(nèi)或肌肉內(nèi)給予進(jìn)行的。

14.如實(shí)施方案1-12中任一項(xiàng)所述的方法，其中該給予是通過(guò)吸入或靜脈內(nèi)、皮下或透粘膜給予進(jìn)行的。

15.如實(shí)施方案1-14中任一項(xiàng)所述的方法，其中該方法進(jìn)一步包括收集所產(chǎn)生的這些抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞。

16.如實(shí)施方案1-15中任一項(xiàng)所述的方法，其中這些免疫抑制劑包括一種抑制素、一種mtor抑制劑、一種tgf-β信號(hào)劑、一種皮質(zhì)類固醇、一種線粒體功能抑制劑、一種p38抑制劑、一種nf-κβ抑制劑、一種腺苷受體激動(dòng)劑、一種前列腺素e2激動(dòng)劑、一種磷酸二酯酶4抑制劑、一種hdac抑制劑、或一種蛋白酶體抑制劑。

17.如實(shí)施方案16所述的方法，其中該mtor抑制劑是雷帕霉素。

18.如實(shí)施方案1-17中任一項(xiàng)所述的方法，其中平均在這些第一和/或第二群體的合成納米載體上的這些免疫抑制劑和/或表位的負(fù)載是在0.0001％與50％之間(重量/重量)。

19.如實(shí)施方案18所述的方法，其中平均在這些第一和/或第二群體的合成納米載體上的這些免疫抑制劑和/或表位的負(fù)載是在0.1％與10％之間(重量/重量)。

20.如實(shí)施方案1-19中任一項(xiàng)所述的方法，其中該第一群體和/或第二群體的這些合成納米載體包括脂質(zhì)納米顆粒、聚合物納米顆粒、金屬納米顆粒、基于表面活性劑的乳液、樹(shù)枝狀化合物、巴基球、納米線、病毒樣顆粒、或肽或蛋白質(zhì)顆粒。

21.如實(shí)施方案20所述的方法，其中該第一群體和/或第二群體的這些合成納米載體包括脂質(zhì)納米顆粒。

22.如實(shí)施方案21所述的方法，其中該第一群體和/或第二群體的這些合成納米載體包括脂質(zhì)體。

23.如實(shí)施方案20所述的方法，其中該第一群體和/或第二群體的這些合成納米載體包括金屬納米顆粒。

24.如實(shí)施方案23所述的方法，其中這些金屬納米顆粒包括金納米顆粒。

25.如實(shí)施方案20所述的方法，其中該第一群體和/或第二群體的這些合成納米載體包括聚合物納米顆粒。

26.如實(shí)施方案25所述的方法，其中該聚合物納米顆粒包括聚合物，該聚合物是一種非甲氧基封端的普朗尼克聚合物。

27.如實(shí)施方案25或26所述的方法，其中這些聚合物納米顆粒包括聚酯、與聚醚偶聯(lián)的聚酯、聚氨基酸、聚碳酸酯、聚縮醛、聚縮酮、多糖、聚乙基噁唑啉或聚乙烯亞胺。

28.如實(shí)施方案27所述的方法，其中該聚酯包括一種聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物、或聚己酸內(nèi)酯。

29.如實(shí)施方案27或28所述的方法，其中這些聚合物納米顆粒包括聚酯以及與聚醚偶聯(lián)的聚酯。

30.如實(shí)施方案27-29中任一項(xiàng)所述的方法，其中該聚醚包括聚乙二醇或聚丙二醇。

31.如實(shí)施方案1-30中任一項(xiàng)所述的方法，其中使用對(duì)該第一和/或第二群體的這些合成納米載體進(jìn)行的動(dòng)態(tài)光散射而獲得的粒度分布的平均值是大于100nm的直徑。

32.如實(shí)施方案31所述的方法，其中該直徑大于150nm。

33.如實(shí)施方案32所述的方法，其中該直徑大于200nm。

34.如實(shí)施方案33所述的方法，其中該直徑大于250nm。

35.如實(shí)施方案34所述的方法，其中該直徑大于300nm。

36.如實(shí)施方案1-35中任一項(xiàng)所述的方法，其中該第一群體和/或第二群體的這些合成納米載體的長(zhǎng)寬比大于1∶1、1∶1.2、1∶1.5、1∶2、1∶3、1∶5、1∶7或1∶10。

37.如實(shí)施方案15-36中任一項(xiàng)所述的方法，其中該方法進(jìn)一步包括制造一種包含所收集的這些抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的劑型。

38.如實(shí)施方案15-37中任一項(xiàng)所述的方法，其中該方法進(jìn)一步包括制造可供使用的這些收集的抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞或可供受試者給予的劑型。

39.如實(shí)施方案1-38中任一項(xiàng)所述的方法，其中這些第二群體的合成納米載體還與mhci類限制性表位偶聯(lián)。

40.一種包含根據(jù)實(shí)施方案1-39中任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的分離的抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的組合物。

41.一種組合物，包含根據(jù)實(shí)施方案1-39中任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的組合物。

42.如實(shí)施方案40或41所述的組合物，其中該組合物進(jìn)一步包含一種藥學(xué)上可接受的賦形劑。

43.一種包含如實(shí)施方案40-42中任一項(xiàng)所述的組合物的劑型。

44.一種供在治療或預(yù)防中使用的包含分離的抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的組合物，所述分離的抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞通過(guò)一種工藝可獲得，該工藝包括以下步驟：(a)通過(guò)給予一種組合物而在受試者中產(chǎn)生抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞，該組合物包含：(i)第一群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，和(ii)第二群體的合成納米載體，這些第二群體的合成納米載體與一種抗原的b細(xì)胞表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)；并且(b)收集所產(chǎn)生的這些抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞。

45.如實(shí)施方案44所述的組合物，該組合物是如在實(shí)施方案40-42中任一項(xiàng)所定義的。

46.一種供在治療或預(yù)防中使用的組合物，包含：(i)第一群體的合成納米載體和(ii)第二群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，這些第二群體的合成納米載體與一種抗原的b細(xì)胞表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)。

47.如實(shí)施方案46所述的組合物，其中該組合物是如在實(shí)施方案1-39中任一項(xiàng)所定義的。

48.如實(shí)施方案40-42中任一項(xiàng)所述或如在實(shí)施方案1-39或44中任一項(xiàng)所定義的組合物或如實(shí)施方案43所述的劑型，供在治療或預(yù)防中使用。

49.如實(shí)施方案40-42中任一項(xiàng)所述或如在實(shí)施方案1-39或44中任一項(xiàng)所定義的組合物、或如實(shí)施方案43所述的劑型用于在受試者中促進(jìn)一種致耐受性免疫應(yīng)答或產(chǎn)生抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞中使用。

50.如實(shí)施方案40-42中任一項(xiàng)所述或如在實(shí)施方案1-39或44中任一項(xiàng)所定義的組合物、或如實(shí)施方案43所述的劑型用于制造一種藥劑的用途，該藥劑用于在受試者中促進(jìn)一種致耐受性免疫應(yīng)答或產(chǎn)生抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞中使用。

51.一種包含如實(shí)施方案44-49中任一項(xiàng)所述的組合物的劑型。

52.一種方法，包括：

(i)產(chǎn)生第一群體的合成納米載體，這些第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，并且

(ii)產(chǎn)生第二群體的合成納米載體，這些第二群體的合成納米載體與一種抗原的b細(xì)胞表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)，其中該組合物處于在受試者中有效產(chǎn)生抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的量。

53.如實(shí)施方案52所述的方法，其中該第一群體和第二群體是相同的群體。

54.如實(shí)施方案52或53所述的方法，其中該方法進(jìn)一步包括制造一種包含這些第一群體和第二群體的合成納米載體的劑型。

55.如實(shí)施方案52-54中任一項(xiàng)所述的方法，其中該方法進(jìn)一步包括制造一種包含這些第一群體和第二群體的合成納米載體的組合物、或可供受試者給予的劑型。

56.如實(shí)施方案52-55中任一項(xiàng)所述的方法，其中該方法進(jìn)一步包括評(píng)定使用一種包含這些第一群體和第二群體的合成納米載體的組合物的抗原特異性調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的產(chǎn)生。

57.如實(shí)施方案52-56中任一項(xiàng)所述的方法，其中產(chǎn)生的這些第一群體和第二群體的合成納米載體是如在實(shí)施方案1-39中任一項(xiàng)所定義的。

58.一種用于生產(chǎn)一種組合物或劑型的工藝，該工藝包括以下步驟：

(i)將第一群體的合成納米載體與免疫抑制劑偶聯(lián)，并且

(ii)將第二群體的合成納米載體與一種抗原的b細(xì)胞表位和/或mhcii類限制性表位偶聯(lián)，其中該組合物或劑型處于在受試者中有效產(chǎn)生調(diào)節(jié)性b細(xì)胞的量。

59.如實(shí)施方案58所述的工藝，該工藝包括如在實(shí)施方案52-57中任一項(xiàng)所述的方法中所定義的步驟。

60.一種通過(guò)如實(shí)施方案52-59中任一項(xiàng)所述的方法或工藝可獲得的組合物或劑型。