本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及asprosin用于制備治療缺血性心臟病藥物的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

asprosin是2016年首次報(bào)道的新型內(nèi)源性小分子蛋白質(zhì)(romere,c.,etal.asprosin,afasting-inducedglucogenicproteinhormone.cell,2016.165(3):p.566-79.)。asprosin是profibrillin的c端多肽片段。profibrillin經(jīng)過弗林蛋白酶(furin)在靠近c(diǎn)末端切割，形成fibrillin-1和asprosin兩種蛋白。即asprosin實(shí)際是由fbn1基因的第65和66個(gè)外顯子編碼，第65個(gè)外顯子編碼11個(gè)氨基酸殘基，第66個(gè)外顯子編碼129個(gè)氨基酸殘基，共計(jì)140個(gè)氨基酸殘基，實(shí)際分子量為約30kda(可能具有糖基化等翻譯后修飾)。主要是由白色脂肪組織分泌，其循環(huán)濃度在納摩爾水平。在禁食時(shí)，可以靶向肝臟，通過激活g蛋白-camp-pka信號通路來增加肝細(xì)胞中葡萄糖的釋放。

缺血性心臟病是嚴(yán)重危害人類健康的心血管疾病之一，具有很高的發(fā)病率和致死率。缺血性心臟病的治療核心在于恢復(fù)心肌的血液供應(yīng)，即再灌注。但是，在心臟經(jīng)歷缺血再灌注后，會(huì)發(fā)生分子不良適應(yīng)、細(xì)胞功能紊亂、基質(zhì)重組、體積增大和心室壁畸形等一系列病理學(xué)轉(zhuǎn)變，繼而發(fā)生更加嚴(yán)重的心肌損傷，即缺血再灌注損傷，出現(xiàn)心肌舒縮功能降低、再灌注心律失常、心肌能量代謝障礙、超微結(jié)構(gòu)變化及無血流等現(xiàn)象，易導(dǎo)致死亡。尋找治療心肌缺血再灌注損傷的藥物成為治療缺血性心臟病亟待解決的手段之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的問題是提出asprosin作為保護(hù)缺血心臟方面的應(yīng)用，尤其是其在治療心肌缺血再灌注損傷，減少心肌細(xì)胞的凋亡，改善心臟功能方面的應(yīng)用。

發(fā)明人表達(dá)純化得到asprosin蛋白，建立小鼠心肌缺血再灌注模型，通過腹腔注射給予asprosin蛋白。心臟伊文氏藍(lán)/ttc染色證明，給予asprosin可以明顯減小缺血再灌注損傷導(dǎo)致的心肌梗死面積；tunel染色證明，給予asprosin可以明顯減少缺血再灌注損傷導(dǎo)致的心肌凋亡；小動(dòng)物心臟超聲證實(shí)，給予asprosin可以明顯改善缺血再灌注損傷導(dǎo)致的心臟功能下降。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，asprosin蛋白具有抑制心肌缺血再灌注損傷，心肌保護(hù)作用。因此，asprosin對于缺血心臟的保護(hù)作用可以用于抗心肌缺血損傷治療藥物的制備。

附圖說明

圖1為重組asprosin的純化與鑒定；a重組asprosin大小及純度鑒定；b采用anti-histag進(jìn)行westernblot鑒定重組蛋白。

圖2為重組asprosin對心肌細(xì)胞凋亡的影響；atunel染色代表圖，細(xì)胞核染色呈藍(lán)色，凋亡染色呈綠色；b細(xì)胞凋亡比例；*p<0.05，與mi/r組相比。

圖3為外源給予重組asprosin能夠減小心肌梗死面積；*p<0.05，與mi/r組相比。

圖4為重組asprosin對心臟左室功能的影響；a超聲心動(dòng)圖代表圖，b左室射血分?jǐn)?shù)，*p<0.05與sham組相比,#p<0.05與mi/r組相比。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述。實(shí)施例是對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明而不是限定。

實(shí)施例1:asprosin的表達(dá)、純化及鑒定

截取fbn1(genbankaccessionnm_000138)c末端141個(gè)氨基酸殘基即為asprosin。根據(jù)e.coli密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化，避免產(chǎn)生hindiii和ecori兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)，然后全基因合成(序列為：atgtctaccaacgaaaccgacgcttctaacatcgaagaccagtctgaaaccgaagctaacgtttctctggcttcttgggacgttgaaaaaaccgctatcttcgctttcaacatctctcacgtttctaacaaagttcgtatcctggaactgctgccggctctgaccaccctgaccaaccacaaccgttacctgatcgaatctggtaacgaagacggtttcttcaaaatcaaccagaaagaaggtatctcttacctgcacttcaccaaaaaaaaaccggttgctggtacctactctctgcagatcagttctaccccgctgtacaaaaaaaaagaactgaaccagctggaagacaaatacgacaaagactacctgtctggtgaactgggtgacaacctgaaaatgaaaatccaggttctgctgcactaa)，得到423bp的asprosin編碼dna片段。將dna片段連接到表達(dá)載體pet-30a的ecori和hindiii之間，形成表達(dá)質(zhì)粒pet30a-asp，轉(zhuǎn)化bl21(de3)菌株以后，形成asprosin表達(dá)菌株。

對轉(zhuǎn)化了pet30a-asp的bl21(de3)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，過夜培養(yǎng)后，按照1％進(jìn)行轉(zhuǎn)接至lb培養(yǎng)基，37℃，200rpm培養(yǎng)4-6小時(shí)至od6000.9。

加入誘導(dǎo)劑iptg使得終濃度達(dá)到0.2mm，降低溫度至16℃，誘導(dǎo)表達(dá)24小時(shí)。8000rpm離心，棄去上清，保留沉淀部分。菌體采用結(jié)合緩沖液(咪唑20mm，nacl500mm，磷酸鹽20mm,ph7.4)進(jìn)行重新懸浮并加入終濃度為0.5mm的pmsf，置于冰浴超聲破碎。破碎條件：工作3sec，停止5sec，功率300w，總共20min。12000rpm離心20min，棄去沉淀，保留上清進(jìn)行純化。

asprosin純化采用鎳柱親和純化。采用結(jié)合緩沖液進(jìn)行親和吸附，清洗緩沖液(咪唑100mm，nacl500mm，磷酸鹽20mm,ph7.4)洗脫雜蛋白，洗脫緩沖液(咪唑500mm，nacl500mm，磷酸鹽20mm,ph7.4)洗脫asprosin蛋白。通過過夜透析，將緩沖液置換為pbs緩沖液。采用pierce離心式內(nèi)毒素去除柱按照說明書步驟，進(jìn)行毒素去除。采用截留分子量為3kda的amicoultra-15超濾管進(jìn)行超濾濃縮，得到asprosin蛋白。

sds-page后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，純度鑒定顯示，目的蛋白純度大于95％(圖1a)，采用標(biāo)簽特異性抗體anti-his進(jìn)行免疫印跡分析，顯示只有唯一條帶，且大小與考馬斯亮藍(lán)染色位置一致(圖1b)，說明純化得到的是asprosin蛋白。最終，所得蛋白純度大于95％，內(nèi)毒素含量小于<0.1eu/μg蛋白，產(chǎn)量約400μg/l菌液，蛋白濃度0.3μg/ml。

實(shí)施例2：asprosin對心肌細(xì)胞凋亡的影響

用6-0絲線在小鼠冠脈左前降支距根部2-3毫米處打一活結(jié)造成心肌缺血，30分鐘后，將活結(jié)打開再灌注。再灌注4小時(shí)后取心肌組織進(jìn)行凋亡相關(guān)檢測。sham組在相同位置穿過絲線，但不進(jìn)行結(jié)扎；給藥治療組在結(jié)扎后，立即給予腹腔注射20μg前述純化的asprosin蛋白。

在麻醉狀態(tài)下，將小鼠固定，剪開小鼠胸廓，暴露小鼠心臟，將左心耳剪破，夾住主動(dòng)脈。從心肌灌入含有肝素的pbs，待左心耳流出的液體澄清透明后，再灌入4％多聚甲醛，心肌組織僵直變硬，剪下后浸沒于4％多聚甲醛。固定24小時(shí)后，進(jìn)行石蠟包埋和切片。保留切片的位置為結(jié)扎線結(jié)與心肌之間靠近線結(jié)1/4處。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，經(jīng)過切片脫蠟，tnuel染色，dapi復(fù)染及甘油封片后，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光。隨機(jī)挑取5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。

如圖2所示，進(jìn)行mi/r手術(shù)后，小鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，約有27％的心肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，而外源給予重組asprosin后，心肌細(xì)胞的凋亡比例下降顯著，降低至18％。給予重組asprosin后，心肌細(xì)胞凋亡與mi/r組相比差異顯著，說明重組asprosin可以抑制mi/r損傷，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

實(shí)施例3:給予重組asprosin能夠減小心肌梗死面積

如實(shí)施例2部分所述，建立小鼠心肌缺血再灌注模型。再灌注24小時(shí)以后，取心臟伊文氏藍(lán)/ttc染色檢測心梗面積。在體小鼠心肌局部ir過程完成后，將左冠狀動(dòng)脈原位重新結(jié)扎，通過主動(dòng)脈根部注射伊文式藍(lán)溶液，非缺血區(qū)心肌染成藍(lán)色。取下整個(gè)心臟，磷酸緩沖液沖洗后置于-20℃冷卻10min后，剪去心房，心室部分放入專門切片機(jī)，垂直于長軸橫切成4-6塊1-2mm厚的心肌片，心肌片置于1％氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride,ttc)溶液中，37℃孵育15min，有活性的心肌組織被染成磚紅色。非缺血區(qū)已由evans氏液染成藍(lán)色，缺血危險(xiǎn)區(qū)(areaatrisk,aar)內(nèi)包括磚紅色的存活心肌及未被染色的灰白梗死組織。即得出整個(gè)心臟的心肌梗死區(qū)(infarctsize,is)、缺血危險(xiǎn)區(qū)(aar)以及梗死區(qū)與缺血危險(xiǎn)區(qū)之比(is/aar)。

結(jié)果顯示，進(jìn)行mi/r手術(shù)后，小鼠心肌產(chǎn)生損傷，梗死面積約占48％，而給予重組asprosin之后，心肌梗死面積約32％，與mi/r組相比差異顯著(圖3)，說明重組asprosin可以顯著減小mi/r后心肌梗死面積，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

實(shí)施例4:重組asprosin對心臟左室功能的影響

如實(shí)施例2部分所述，建立小鼠心肌缺血再灌注模型。再灌注24小時(shí)以后，將小鼠放入小動(dòng)物氣體麻醉機(jī)，給予含有2％異氟烷的氧氣進(jìn)行吸入麻醉，使用脫毛膏進(jìn)行胸前區(qū)脫毛。脫毛后，采用vevo高分辨率小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)檢測小鼠心臟功能。使用儀器自帶軟件通過測量收縮及舒張期時(shí)，心肌厚度計(jì)算小鼠心臟左室射血分?jǐn)?shù)lvef％。

結(jié)果顯示，單純?nèi)毖俟嘧⒔M(mi/r)心功能明顯下降(圖4a)，在外源給予純化的重組asprosin后，與mi/r組相比有心功能有明顯的改善(圖4a)，左室射血分?jǐn)?shù)lvef％明顯上升(圖4b)，說明重組asprosin具有抑制心功能損傷，改善心功能的作用。

核苷酸序列表電子文件

<110>中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)

<120>asprosin用于制備治療缺血性心臟病藥物的應(yīng)用

<141>

<160>

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>全基因合成序列

<220>

<223>

<400>1

atgtctaccaacgaaaccgacgcttctaacatcgaagaccagtctgaaaccgaagctaacgtttctctggcttcttgggacgttgaaaaaaccgctatcttcgctttcaacatctctcacgtttctaacaaagttcgtatcctggaactgctgccggctctgaccaccctgaccaaccacaaccgttacctgatcgaatctggtaacgaagacggtttcttcaaaatcaaccagaaagaaggtatctcttacctgcacttcaccaaaaaaaaaccggttgctggtacctactctctgcagatcagttctaccccgctgtacaaaaaaaaagaactgaaccagctggaagacaaatacgacaaagactacctgtctggtgaactgggtgacaacctgaaaatgaaaatccaggttctgctgcactaa