專利名稱：治療缺血性心臟病的川芎內酯及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及由植物類中藥飲片提取的藥物，特別是一種治療缺血性心臟病的川芎內酯及其制備方法。
背景技術：
川芎(Ligusticum chuanxiong Hort.的根莖)味辛性溫，既能活血化瘀又可行氣止痛，以川芎為主藥的“冠心II號”，“速效救心丸”等，都是臨床上治療缺血性心臟病的有效成藥。缺血性心臟病的基本病機是“虛氣留滯，毒損心絡”，而川芎具有辛香透絡，活血化瘀之功，可以條達氣血，俾氣血條暢，毒邪無所依附而消散，則心絡舒展自如?？梢?，川芎是通過祛邪以扶正，同時，又具有止痛之效。因此，為治療心血瘀阻，毒損心絡胸痹之良藥。
但是，目前對川芎的臨床應用主要依靠飲片煎煮制取，由于飲片質量不易控制，作用不穩(wěn)定，用量大而作用小。因此，近年來中藥界已開始研究川芎對心血管系統(tǒng)的藥理作用，以提高其藥效。川芎對心血管系統(tǒng)的藥理作用研究，在陰健主編的《中藥現(xiàn)代研究與臨床應用I》pp108-118的綜述中表明，川芎具有擴張冠脈，增加冠脈血流量，降低心肌氧耗，并對心肌缺血性損傷有保護作用，但其有效成分的研究幾乎全集中于川芎嗪(四甲基吡嗪)，許多文獻甚至以合成四甲基吡嗪的作用來闡明川芎藥理活性。我們的研究表明，川芎中四甲基吡嗪含量甚微，有些產地的川芎生藥中甚至未能檢出四甲基吡嗪，因此，川芎對心血管系統(tǒng)的藥理作用物質基礎是否歸于四甲基吡嗪，值得商榷。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于從中藥川芎中分離精制內酯類化合物，用于治療缺血性心臟病。其創(chuàng)新點在于川芎內酯為結構確定的化合物，比川芎飲片易于質量控制而作用穩(wěn)定，而且用量小作用強，可開發(fā)成二類乃至一類新藥而具有較好的應用前景。
本發(fā)明治療缺血性心臟病的川芎內酯，是由川芎飲片提取的川芎總內酯包含的，其中川芎內酯A與川芎內酯B分別占總內酯成分重量的50％±10％和20％±5％，總內酯中還有少量二聚體，該二聚體共有3種，內酯A、B及二聚體的分子結構式如下 川芎內酯A 川芎內酯B
二聚體1 二聚體2 二聚體3利用1HNMR，13CNMR及EIMS法鑒定了川芎內酯的結構，其光譜數(shù)據如下川芎內酯A為化合物4，5-二氫-3-丁叉基苯肽(4，5-dihydro-3-butylidene-phthalide)，系淺黃色油狀物。EIMS m/z(％)190(M+，72)，161(100)，134(28)，133(26)，106(50)，105(60)，78(50)，77(50)，55(90).分子式C12H14O2。分子量190。1HNMR(CDCl3)δ0.91(3H，t，J＝7.5，H-11)，1.46(2H，Hexa，J＝7.5，H-10)，2.33(2H，q，J＝7.5，H-9)，2.44(2H，m，H-5)，2.57(2H，t，J＝7.2，H-4)，5.19(1H，t，J＝7.5，H-8)，5.97(1H，dt，J＝10.0，5.0，H-6)，6.23(1H，dt，J＝10.0，2.0，H-7)。13CNMR(CDCl3)δ13.7(q，C-11)，18.4(t，C-10)，22.3(t，C-9，5)，28.0(t，C-4)，112.8(d，C-8)，116.9(d，C-7)，123.9(s，C-7a)，129.9(d，C-6)，147.0(s，C-3a)，148.5(s，C-3)，167.5(s，C-1)；川芎內酯B為化合物4，5-二氫-3-丁基苯肽(4，5-dihydro-3-butyl-phthalide)，系淺黃色油狀物。EIMS m/z(％)192(M+，25)，163(5)，135(10)，107(100)，79(40)，77(35)，分子式C12H16O2，分子量192。1HNMR(CDCl3)δ0.87(3H，t，J＝7.5，H-11)，1.36(4H，m，H-9，10)，1.50(1H，m，H-8a)，1.85(1H，m，H-8b)，2.43(2H，m，H-4)，2.47(2H，m，H-5)，4.90(1H，dd，J＝8.0，3.5，H-3)，5.88(1H，dt，J＝9.5，4.5，H-6)，6.16(1H，dt，J＝9.5，2.5，H-7)。13CNMR(CDCl3)δ13.8(q，C-11)，20.7(t，C-10)，22.3(t，C-9)，22.4(t，C-8)，26.7(t，C-5)，31.9(t，C-4)，82.5(d，C-3)，116.8(d，C-7)，124.4(s，C-7a)，128.3(d，C-6)，161.4(s，C-3a)，171.2(s，C-1)。
由川芎總內酯分離出川芎內酯A、B，即該川芎內酯是指川芎內酯A或川芎內酯B。
以川芎內酯A、B為原料，可人工合成川芎內酯A、B二聚體，該二聚體為結晶性化合物，它具有與川芎內酯A、B相同的不飽和五元內酯環(huán)及環(huán)外丁(烯)基活性基團。
用于上述治療缺血性心臟病的川芎內酯的制備方法是取川芎飲片以乙醇滲漉，二者重量比為1∶4，滲漉液減壓回收乙醇至無乙醇味，加入與殘物等體積的水，充分攪拌后靜置分層，取上層油脂層以石油醚溶解，用含水甲醇萃取，甲醇萃取物行硅膠柱層析，以石油醚∶乙酸乙酯(20∶1)除油脂，再用石油醚∶乙酸乙酯(8∶1)洗出川芎總內酯。川芎總內酯再行硅膠及ODS層析分離得到川芎內酯A、B及其二聚體化合物。
藥理實驗研究結果表明
1、川芎內酯A，B可明顯降低缺血及再灌注時室性心律失常的發(fā)生率，持續(xù)時間縮短；顯著縮小心肌梗塞面積，血漿乳酸脫氫酶、磷酸肌酸激酶活性增高程度明顯降低。表明川芎內酯A，B對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護作用。
2、川芎內酯A、B明顯延長小白鼠在缺氧狀態(tài)下的存活時間，提示川芎內酯A，B可以提高小白鼠的耐缺氧能力。
3、川芎內酯A、B降低血小板聚集率，全血粘度及血漿粘度，表明川芎內酯A、B具有活血化瘀之功能。
4、川芎內酯A、B對正常開胸大鼠血壓、心率、左心室內壓、左室壓最大上升及下降速率和主動脈流量沒有影響，表明川芎內酯A、B對大鼠心臟功能沒有負性肌力作用。
以上結果為川芎內酯A，B治療缺血性心臟病提供了實驗依據。


圖1為川芎內酯A的1HNMR譜圖2為川芎內酯A的13CNMR譜圖3為川芎內酯B的1HNMR譜圖4為川芎內酯B的13CNMR譜圖5為二聚體1的1HNMR譜圖6為二聚體1的13CNMR譜圖7為二聚體2的1HNMR譜圖8為二聚體2的13CNMR譜圖9為二聚體3的1HNMR譜圖10為二聚體3的13CNMR譜具體實施方式
提取分離工藝及藥效學研究實施例實施例1 川芎總內酯的提取分離取川芎飲片粗粉10kg，以95％乙醇拌勻后，置滲漉筒內室溫悶潤24h，飲片與乙醇重量比為1∶4，開始用95％乙醇滲漉，滲漉速度1000ml/h，滲漉8h，靜置16h后再行滲漉，共收集滲漉液5萬ml(5000ml滲漏液/kg飲片)。滲漉液減壓回收乙醇至無醇味(殘物約1萬ml)后，加入1萬ml水，充分攪拌后靜置2h，分取上層油脂狀物，以石油醚含水甲醇系統(tǒng)萃取分離。取甲醇萃取液，減壓回收甲醇。甲醇萃取物(油狀物)置硅膠柱，以石油醚∶乙酸乙酯(20∶1)洗去油脂后，再以石油醚∶乙酸乙酯(8∶1)洗脫川芎總內酯。
實施例2 川芎內酯A、B的分離取總內酯置硅膠柱中，以石油醚∶乙酸乙酯(10∶1)進行層析分離。收集亮蘭色熒光部分，用作川芎內酯A的精制。取隨后之熒光吸收部分用作川芎內酯B的精制。
實施例3 川芎內酯A、B的精制取實施例2中收集的亮蘭色熒光部分(油狀物)進行ODS層析分離，以含水甲醇為洗脫劑，收集亮蘭色熒光部分，減壓回收甲醇，殘物加入無水乙醇反復脫水，得淺黃色油狀物川芎內酯A。
取實施例2中熒光吸收部分(油狀物)按上述方法層析分離，收集TLC單一熒光吸收斑點組分，回收甲醇，無水乙醇脫水，得淺黃色油狀物川芎內酯B。
實施例4 川芎內酯A、B的純度檢查方法HPLC法；儀器Waters 996型HPLC儀；固定相Kromasil 100 C185μm；檢測波長240nm；流速0.9ml/min；流動相∶甲醇-水(70∶30)；柱溫18-19℃。川芎內酯A純度為98.35％，川芎內酯B純度為99.05％。
實例5 川芎內酯A，B對麻醉大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用采用麻醉大鼠整體動物實驗模型，開胸后結扎冠狀動脈前降支，觀察了川芎內酯A，B1g.kg-12g.kg-1對麻醉大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響。結果表明川芎內酯A，B可明顯降低缺血及再灌注時室性心律失常的發(fā)生率，縮短其持續(xù)時間；顯著縮小心肌梗塞面積，血漿乳酸脫氫酶、磷酸肌酸激酶活性增高程度明顯降低。表明川芎內酯A，B對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護作用。
實例6 川芎內酯A、B對小鼠耐缺氧作用采用常規(guī)小鼠耐缺氧實驗方法，觀察川芎內酯A、B灌胃給藥對耐缺氧能力的影響。結果表明川芎內酯A、B明顯延長小白鼠在缺氧狀態(tài)下的存活時間，提示川芎內酯A，B可以提高小白鼠的耐缺氧能力。
實例7 川芎內酯A.B對大鼠血液流變學的影響Wistar大鼠，雄性，體重240-270g，戊巴比妥鈉麻醉(30mg.kg-1iv)后，腹主動脈采血，枸櫞酸鈉抗凝，測定血小板聚集率(比濁法)，全血粘度及血漿粘度。結果表明川芎內酯A、B降低血小板聚集率，全血粘度及血漿粘度，提示川芎內酯A、B具有活血化瘀之功能。
實例8 對麻醉大鼠心臟功能和血流動力學的影響采用麻醉大鼠整體動物實驗模型，觀察了川芎內酯A、B對正常大鼠心臟功能和血流動力學的影響。結果表明川芎內酯A、B對正常開胸大鼠血壓、心率、左心室內壓、左室壓最大上升及下降速率和主動脈流量沒有影響，提示川芎內酯A、B對大鼠心臟功能沒有負性肌力作用。
從3個二聚體的結構分析，二聚化后其結構中仍然保留著不飽和五元內酯環(huán)之結構部分，從構效學的觀點出發(fā)，預計二聚體應保持與聚合單元化合物相似的生物活性，而且二聚體均為結晶性化合物，其熔點分別為113~115℃，108~110℃，154~156℃，與聚合單元化合物相比要穩(wěn)定得多，而且由于其可結晶性質而易于分離純化，而且采用適當?shù)幕瘜W方法可從單元化合物聚合反應而成。

另外，具有如下結構類型的化合物同樣具有不飽和五元環(huán)內酯結構，也應具有與川芎內酯A、B相似的生理活性。
R1~R8可為氫，亦可為羥基及其它簡單取代基團由于川芎內酯A占總內酯成分的50％±，B占20％±，因此可以認定川芎總內酯也同樣對心血管系統(tǒng)有類似的生理活性。
同理，任何以川芎總內酯為主，配伍其它中藥的復方制劑，并以川芎內酯A，B或相關化合物為質控標準的藥物亦應有類似的藥效作用。
附 藥理研究實驗報告書一、川芎內酯A，B對麻醉大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用1.材料1.1 藥物及試劑 川芎。硝基藍四唑(N-BT)，軍事醫(yī)學科學院藥材供應站批號，971120。乳酸脫氫酶測定試劑盒(比色法)，北京化工廠，批號，020205。磷酸肌酸激酶(CPK)測定試劑盒，北京化工廠，批號，020104。川芎內酯A，B1.2 動物 雄性Wistar大鼠，體重300-400克，由中國醫(yī)學科學研究院實驗動物中心提供，合格證號醫(yī)動字第01-3008。
1.3 儀器DH-140B型動物人工呼吸機(浙江醫(yī)科大學實驗儀器廠)，BIOPAC多導生理記錄儀(美國)，ZS-3型半自動生化分析(北京中生生物工高科技公司)。
2.方法2.1 實驗模型實驗動物用戊巴比妥鈉麻醉(30mg·kg-1ip)。氣管切開，行人工呼吸。呼吸頻率45-50次/分。暴露左頸總動脈，插動脈套管以監(jiān)測血壓。于胸骨左源3-4肋間，打開胸腔及心包膜，暴露心臟；在肺動脈圓錐與左心耳下緣之間，經左冠狀動脈下淺層心肌穿一絲線，線的兩端穿過一條直徑2mm的聚乙烯塑料管，其末端用一小動脈夾固定。通過打開和夾緊動脈夾造成冠狀動脈的阻斷與再通。連續(xù)記錄冠狀動脈結扎前后及再通后Π導心電圖。觀察VT、VF的起始時間和持續(xù)時間。動脈血壓和心電圖均同步記錄于多導生理記錄儀。實驗結束后，腹主動脈取血，分離血漿測LDH、CPK活性。然后，迅速摘取心臟，左心室稱重后，將其切成1-2mm的心肌薄片，浸于N-BT溶液中染色30分鐘。非缺血區(qū)的心肌組織為深藍，缺血區(qū)心肌不染色。按稱重法計算心肌梗死面積。
2.2 實驗分組 大鼠48只。隨機隨機分為6組，每組8只。1)對照組等量生理鹽水；2)川芎內酯A2g.kg-1組；3)川芎內酯A1g.kg-1組；4) 川芎內酯B2g.kg-1組；5)川芎內酯B1g.kg-1組；上述各組于給藥40分鐘后，結扎左主冠狀動脈10分鐘，再灌注20分鐘。6)，假手術組左主冠狀動脈下穿線，不結扎。
2.3統(tǒng)計分析實驗數(shù)據均用均數(shù)±標準差表示；心律失常的發(fā)生率，用X2檢驗；其他數(shù)據分析用單因素方差分析方法。
3.實驗結果3.1對缺血再灌注所致心律失常的影響 川芎內酯A，B2g.kg-1可明顯降低缺血及再灌注時室性心律失常的發(fā)生率，并縮短其持續(xù)時間。與單純缺血再灌注組比較，有顯著性差異。結果見表1。
3.2對心肌梗塞面積和血漿乳酸脫氫酶、磷酸肌酸激酶的影響 川芎內酯A，B2g.kg-1均能顯著縮小心肌梗塞面積，血漿乳酸脫氫酶、磷酸肌酸激酶活性增高程度明顯降低，與單純缺血再灌注組相比，均有顯著性差異。結果見表2。
表1 對大鼠心肌缺血再灌注所致心律失常的影響(x±s) n＝8劑量 VT和VF發(fā)生率(％)持續(xù)時間(VT+VF)(s)組別(g·kg-1)缺血期 再灌期 缺血期 再灌期假手術組- - - - -單純I/R組 - 75 312.3±34.8 288.3±55.387.5川芎內酯A組 1 50 50 416.6±12.5 212.8±61.22 37.5* 37.5* 48.3±14.6**25.8±1.26**川芎內酯B組 1 75 75 360.4±12.8 229.43±85.92 37.5* 37.5* 43.7±21.5**47.3±19.4***P＜0.05； **P＜0.01，與單純I/R組相比。
表2 對大鼠心肌缺血再灌注所致梗塞面積和LDH、CPK活性的影響X±SD n＝8劑量 LDH CPK 梗塞面積組 別(g.kg-1) (U.mL-1)) (10-3IU.L-1) (％)假手術組- 112±34 234±87 -單純I/R組 - 211±16**613±114**29.18±4.09川芎內酯A組 1 216±22 568±13635.18±3.172 176±32* 286±64*15.38±4.16*川芎內酯B組 1 286±55 611±61 35.38±14.762 164±20* 268±46*17.25±6.83*
*P＜0.05；與單純I/R組相比；**P＜0.01；與假手術組相比。
二、川芎內酯A、B對小鼠耐常壓缺氧作用1.原理缺氧對機體是一種劣性刺激，影響機體各種代謝，特別是影響機體的氧化功能，最終會導致機體的心腦等重要器官缺氧供能不足而死亡。
2.材料2.1動物 小鼠，雄性，體重25-30g，由中國醫(yī)學科學研究院實驗動物中心提供，合格證號醫(yī)動字第01-3008。
2.2藥品 川芎內酯A，B鈉石灰3.方法3.1實驗分組及過程取32只小鼠，隨機分成4組；給藥組分別灌胃給予川芎內酯A，B1.1g.kg-1，2.2g.kg-1；對照組小鼠給等量生理鹽水；給藥后30分鐘，將小鼠放入盛有5g鈉石灰的廣口瓶內，用凡士林涂抹瓶口蓋嚴，防止漏氣，并立即計時；以呼吸停止為指標，觀察小鼠因缺氧死亡的時間。與對照組比較，測其顯著性。
3.2統(tǒng)計分析實驗數(shù)據均用均數(shù)±標準差表示；其他數(shù)據分析用單因素方差分析方法。
4.實驗結果川芎內酯A、B明顯延長小白鼠在缺氧狀態(tài)下的存活時間，與對照組相比，差別有顯著性意義。結果見表3。
表3 對小鼠耐常壓缺氧作用的影響X±SDn＝8組 別動物數(shù)(n)劑量(g.kg-1) 存活時間(min)對照組8- 12.39±1.07川芎內酯A組 81.1 12.76±4.57川芎內酯A組 82.2 13.91±5.66*川芎內酯B組 81.1 20.38±6.89川芎內酯B組 82.2 26.11±7.56**與對照組比較，P＜0.05三、川芎內酯A.B對大鼠血液流變學的影響1.材料1.1 動物Wistar大鼠，雄性，體重240-270g，由中國醫(yī)學科學研究院實驗動物中心提供，合格證號醫(yī)動字第01-3008。
1.2 器材DIC-PA 3210型血小板聚集儀(日本)LBY-NW1自動清洗毛細管式血漿粘度計(北京普利生)LBY-NA6自動清洗旋轉式粘度計(北京普利生)1.3藥品及試劑川芎內酯A、B二磷酸腺苷ADP(5.3mg/ml)
枸櫞酸鈉抗凝液(3.8％)2方法2.1 實驗分組及過程大鼠按體重隨機分成5組，每組8只；給藥組分別灌胃給予川芎內酯A，B1.0g.kg-1，2.0g.kg-1，對照組給等量生理鹽水；1小時后，用戊巴比妥鈉麻醉(30mg.kg-1)；固定后由腹主動脈采血，枸櫞酸鈉抗凝(1∶9)；部分血液1000rpm離心10分鐘，制備富血小板血漿(PRP)；3000rpm再次離心15分鐘，制備貧血小板血漿(PPP)。將PRP與PPP按一定比例調至所需濃度，用光密度法測定由ADP誘導的血小板聚集的百分率；部分血液3000rpm離心15分鐘，測定血漿粘度；部分血液測定全血粘度。
2.2 統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據均用均數(shù)±標準差表示；其他數(shù)據分析用單因素方差分析方法。
3.實驗結果川芎內酯A、B降低血小板聚集率，與對照組相比，差別有顯著性意義。結果見表4。
表4 川芎內酯A對血小板聚集功能的影響X±SD(n＝8)全血粘度 血漿粘度劑量 血小板聚集組別(mPa.s) (mPa.s)(g.kg-1) (％)100S-1200-1對照組- 48.0±4.954.77±0.92 4.22±0.70 1.44±0.03川芎內酯A組 1.041.0±12.98 3.80±0.25*3.37±0.16* 1.24±0.05*川芎內酯A組 2.028.9±5.67* 3.39±0.37*3.15±0.31* 1.22±0.08*川芎內酯B組 1.040.39±8.45 3.95±0.49*3.51±0.30* 1.35±0.07*川芎內酯B組 2.033.98±11.37* 3.92±0.40*3.57±0.23* 1.33±0.12**P＜0.05與對照組比較四、對麻醉大鼠心臟功能和血流動力學的影響1.材料1.1 藥物川芎1.2 動物雄性SD大鼠，體重300-400g，由中國醫(yī)學科學研究院實驗動物中心提供，合格證號醫(yī)動字第01-3008。
1.3 儀器DH-140B型動物人工呼吸機，MP-100多導生理記錄系統(tǒng)(美國)，CBI血流儀(美國)。
2.方法2.1 心功能的測定實驗動物用戊巴比妥鈉麻醉(30mg.kg-1iv)。氣管切開，行人工呼吸。呼吸頻率45-50次/分。暴露左頸總動脈，插動脈套管以監(jiān)測血壓(BP)。于胸骨左緣3-4肋間，打開胸腔及心包膜，暴露心臟；用內充肝素生理鹽水的聚乙烯塑料管從心尖部插入左室腔內，接壓力換能器，觀察左室內壓(LSVP)。分離升主動脈，嵌入直徑適當?shù)奶筋^，通過CBI血流儀測主動脈流量。左室壓最大上升及下降速率(±dp/dtmax)，用MP-100的專用程序通過對LVP的微分求得。BP、HR、LVP、主動脈流量和±dp/dtmax均同步記錄于MP-100多導生理記錄系統(tǒng)。術后穩(wěn)定30分鐘后，首先記錄上述指標的正常值；然后經十二指腸給藥，觀察給藥后5份、10分、15分、30分、60分上述指標的變化。
2.2 實驗分組大鼠40只，隨機分為5組，每組8只。1.正常對照組等量生理鹽水組；2.川芎內脂A2g.kg-1組；3.川芎內脂A1g.kg-1組；4.川芎內脂B2g.kg-1組；5.川芎內脂B 1g.kg-1組。
2.3統(tǒng)計分析用統(tǒng)計軟件SPSS10.0中重復測量方差分析方法進行數(shù)據處理，實驗數(shù)據以均數(shù)±SD表示。
3.實驗結果3.1 對血壓、心率和心電圖的影響十二指腸給予川芎內脂A、B1g.kg-1、2g.kg-1，在觀察時間內對動脈收縮壓和舒張壓、心率沒有影響。結果見表5、6。
3.2 對左室內壓、左室壓最大上升及下降速率和主動脈流量的影響十二指腸給予川芎內脂A、B1g.kg-1、2g.kg-1，在觀察時間內對左室內壓、左室壓最大上升及下降速率和主動脈流量沒有影響。結果見表7。
表5 川芎內脂A、B對麻醉大鼠血壓的影響 X±SD n＝8測定 川芎內酯A 川芎內酯B測定時間空白組指標2.0g/kg2.0g/kg102.20± 113.14±給藥前 100.97±20.2519.01 9.79100.40± 103.67±5分 96.70±15.7318.25 10.00收 102.41± 116.63±10分 96.75±15.43縮 10.30 20.71給壓 96.50±115.70±藥 15分 96.37±13.40(mmHg) 14.90 19.79后95.56±118.20±30分 91.35±16.3516.24 17.0897.48±106.57±60分 93.62±13.9512.47 20.6866.23±給藥前 61.65±16.73 68.23±14.5918.1665.46±5分 65.67±18.37 69.76±16.9610.52舒 60.38±10分 60.55±16.44 64.93±17.70張 14.91給壓 66.50±藥 15分 58.55±17.87 70.80±16.00(mmHg) 19.43后64.28±30分 57.65±18.52 65.12±17.2513.0959.49±60分 59.10±17.34 60.62±16.7319.97表6 川芎內脂A、B對麻醉大鼠心率(bpm)的影響(X±SD n＝8)川芎內酯A川芎內酯B測定時間 空白組2.0g/kg 2.0g/kg
203.19± 239.06±給藥前 236.85±7.8433.67 27.31190.27±241.97± 240.00±5分24.15 12.41 23.76192.48±219.81± 241.83±10分 24.74 23.73 24.55給15分 209.23±222.50± 215.97±藥15.68 16.97 23.23后216.19±220.15± 261.25±30分 20.04 20.29 18.6360分 207.14±221.55± 221.04±25.93 15.72 20.08表7 川芎內脂A、B對麻醉大鼠LVSP、LVP±dp/dtmax及CO的影響X±SD n＝8測定川芎內酯A 川芎內酯B測定時間 空白組指標2.0g/kg 2.0g/kg149.21± 160.10±給藥前 170.02±11.1119.83 11.73148.06± 162.03±5分164.17±5.968.68 18.9110 146.40± 147.78±171.81±7.02LVSP 分 16.03 16.79給(mmHg) 15 143.78± 145.17±藥 172.31±5.85分 14.37 19.31后30 137.48±136.20±5.47 171.09±15.63分 13.8760 138.31±136.20±8.14 159.53±23.16分 11.492551.9± 4138.8±給藥前 3903.3±194.2248.6 425.12604.3± 3952.8±5分 3940.7±281.7264.2 365.810 2621.3± 4100.9±LVP+dp/dtmax3784.9±271.5分 236.8 386.2給15 2572.4± 4018.2±(mmHg/s)藥 3715.3±309.9分 257.9 361.7后30 2365.2± 4135.6±3489.8±330.8分 213.8 349.860 2502.7± 3846.8±3303.7±243.0分 202.8 261.5LVP-dp/dtmax1477.9± 2469.5±給藥前 2847.4±429.8136.8 175.1
(mmHg/s) 1673.2±2330.6±5分 2522.4±330.6183.9292.8101603.3±2683.4±2605.2±385.9分159.2238.9給151673.2±2346.7±藥 2415.3±155.9分156.8377.8后301604.4±2536.5±2424.5±258.9分200.4250.8601464.0±2381.9±2349.7±327.7分187.8255.9135.50±給藥前 136.6±14.9 142.58±17.3914.63129.35±5分 141.9±15.4 159.81±19.0122.4810 134.23±147.8±14.6 153.57±26.32CO分 19.14給(ml/min) 15 131.67±藥156.0±19.4 159.42±26.81分 17.47后30 141.90±200.4±13.8 172.75±35.96分 18.7660 131.06±187.3±14.2 137.47±31.93分 16.85結論藥理實驗研究結果表明1.川芎內酯A，B可明顯降低缺血及再灌注時室性心律失常的發(fā)生率，持續(xù)時間縮短；顯著縮小心肌梗塞面積，血漿乳酸脫氫酶、磷酸肌酸激酶活性增高程度明顯降低。表明川芎內酯A，B對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護作用。
2.川芎內酯A、B明顯延長小白鼠在缺氧狀態(tài)下的存活時間，提示川芎內酯A，B可以提高小白鼠的耐缺氧能力。
3.川芎內酯A、B降低血小板聚集率，全血粘度及血漿粘度，表明川芎內酯A、B具有活血化瘀之功能。
4.川芎內酯A、B對正常開胸大鼠血壓、心率、左心室內壓、左室壓最大上升及下降速率和主動脈流量沒有影響，表明川芎內酯A、B對大鼠心臟功能沒有負性肌力作用。
以上結果為川芎內酯A，B治療缺血性心臟病提供了實驗依據。
權利要求
1.一種治療缺血性心臟病的川芎內酯，其特征在于該川芎內酯是由川芎飲片提取的川芎總內酯所包含的，其中川芎內酯A與川芎內酯B分別占總內酯成分重量的50％±10％和20％±5％，總內酯中還有少量二聚體，該二聚體共有3種，上述成分的分子結構式如下 川芎內酯A 川芎內酯B 二聚體1 二聚體2 二聚體3利用1HNMR，13CNMR及EIMS法鑒定了川芎內酯的結構，其光譜數(shù)據如下川芎內酯A為化合物4，5-二氫-3-丁叉基苯肽(4，5-dihydro-3-butylidene-phthalide)，系淺黃色油狀物。EIMS m/z(％)190(M+，72)，161(100)，134(28)，133(26)，106(50)，105(60)，78(50)，77(50)，55(90).分子式C12H14O2。分子量190。1HNMR(CDCl3)δ0.91(3H，t，J＝7.5，H-11)，1.46(2H，Hexa，J＝7.5，H-10)，2.33(2H，q，J＝7.5，H-9)，2.44(2H，m，H-5)，2.57(2H，t，J＝7.2，H-4)，5.19(1H，t，J＝7.5，H-8)，5.97(1H，dt，J＝10.0，5.0，H-6)，6.23(1H，dt，J＝10.0，2.0，H-7)。13CNMR(CDCl3)δ13.7(q，C-11)，18.4(t，C-10)，22.3(t，C-9，5)，28.0(t，C-4)，112.8(d，C-8)，116.9(d，C-7)，123.9(s，C-7a)，129.9(d，C-6)，147.0(s，C-3a)，148.5(s，C-3)，167.5(s，C-1)；川芎內酯B為化合物4，5-二氫-3-丁基苯肽(4，5-dihydro-3-butyl-phthalide)，系淺黃色油狀物。EIMS m/z(％)192(M+，25)，163(5)，135(10)，107(100)，79(40)，77(35)，分子式C12H16O2，分子量192。1HNMR(CDCl3)δ0.87(3H，t，J＝7.5，H-11)，1.36(4H，m，H-9，10)，1.50(1H，m，H-8a)，1.85(1H，m，H-8b)，2.43(2H，m，H-4)，2.47(2H，m，H-5)，4.90(1H，dd，J＝8.0，3.5，H-3)，5.88(1H，dt，J＝9.5，4.5，H-6)，6.16(1H，dt，J＝9.5，2.5，H-7)。13CNMR(CDCl3)δ13.8(q，C-11)，20.7(t，C-10)，22.3(t，C-9)，22.4(t，C-8)，26.7(t，C-5)，31.9(t，C-4)，82.5(d，C-3)，116.8(d，C-7)，124.4(s，C-7a)，128.3(d，C-6)，161.4(s，C-3a)，171.2(s，C-1)。
2.根據權利要求1所述的治療缺血性心臟病的川芎內酯，其特征在于該川芎內酯是指川芎內酯A。
3.根據權利要求1所述的治療缺血性心臟病的川芎內酯，其特征在于該川芎內酯是指川芎內酯B。
4.根據權利要求1或2所述的治療缺血性心臟病的川芎內酯，其特征在于該川芎內酯是由川芎內酯A、B合成的川芎內酯A、B二聚體，該二聚體為結晶性化合物，它具有與川芎內酯A、B相同的不飽和五元內酯環(huán)及環(huán)外丁(烯)基活性基團。
5.用于權利要求1所述的川芎內酯的制備方法，其特征在于取川芎飲片以乙醇滲漉，二者重量比為1∶4，滲漉液減壓回收乙醇至無乙醇味，加入與殘物等體積的水，充分攪拌后靜置分層，取上層油脂層以石油醚溶解，用含水甲醇萃取，甲醇萃取物行硅膠柱層析，以石油醚∶乙酸乙酯(20∶1)除油脂，再用石油醚∶乙酸乙酯(8∶1)洗出川芎總內酯。
6.用于權利要求5所述的川芎內酯的制備方法，其特征在于取總內酯置硅膠柱中，以石油醚∶乙酸乙酯(10∶1)進行層析分離。收集亮蘭色熒光部分，用作川芎內酯A的精制；取隨后之熒光吸收部分用作川芎內酯B的精制。
7.用于權利要求6所述的川芎內酯的制備方法，其特征在于取收集的亮蘭色熒光部分(油狀物)進行ODS層析分離，以含水甲醇為洗脫劑，收集亮蘭色熒光部分，減壓回收甲醇，殘物加入無水乙醇反復脫水，得淺黃色油狀物川芎內酯A；取熒光吸收部分(油狀物)按上述方法層析分離，收集TLC單一熒光吸收斑點組分，回收甲醇，無水乙醇脫水，得淺黃色油狀物川芎內酯B。
全文摘要
本發(fā)明是一種治療缺血性心臟病的川芎內酯及其制備方法，由中藥川芎飲片中提取出川芎總內酯，該總酯中川芎內酯A、B占70％，并有少量川芎內酯A、B二聚體。實驗藥理學證明川芎內酯A、B對麻醉大鼠心肌缺血再灌注損傷具有非常顯著的保護作用，并能顯著提高小鼠耐缺氧能力，該二化合物及其相關化合物結構明確，可研制成用于治療缺血性心臟病的二類或一類新藥。
文檔編號A61P9/10GK1569848SQ03146029
公開日2005年1月26日 申請日期2003年7月14日 優(yōu)先權日2003年7月14日
發(fā)明者肖永慶, 梁日欣, 李文, 李麗, 張村 申請人:中國中醫(yī)研究院中藥研究所