本申請是申請日為2012年7月6日、中國專利申請?zhí)枮?01280043194.2(國際申請?zhí)枮閜ct/us2012/045784)、發(fā)明名稱為“因子viii嵌合和雜合多肽及其使用方法”的發(fā)明專利申請的分案申請。

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發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明總體上涉及用于止血病癥的治療學的領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

血友病a為由因子viii(fviii)基因中的突變和/或缺失(從而導(dǎo)致fviii活性缺乏)引起的x染色體連鎖的出血病癥(peyvandi,f.等haemophilia12:82-89(2006)。所述疾病的特征在于自發(fā)性流血及創(chuàng)傷后過量出血。隨時間推移，肌肉和關(guān)節(jié)中的反復(fù)出血(其經(jīng)常始于兒童早期)引起血友病性關(guān)節(jié)病及不可逆的關(guān)節(jié)損傷。此損傷為進行性的且可能導(dǎo)致關(guān)節(jié)活動性嚴重受限、肌肉萎縮及慢性疼痛(rodriguez-merchan,e.c.,semin.thromb.hemost.29:87-96(2003)，其以引用的方式整體并入本文)。

a2結(jié)構(gòu)域為因子viii分子的促凝血活性所必需的。研究顯示，豬因子viii具有人類因子viii六倍高的促凝血活性(lollar,p.和e.t.parker,j.biol.chem.266:12481-12486(1991))，且人類與豬因子viii之間凝血活性的差異似乎是基于在氨基酸序列中人類與豬a2結(jié)構(gòu)域中一個或多個殘基之間的差異(lollar,p.等,j.biol.chem.267:23652-23657(1992))，以引用的方式整體并入本文。

血友病a的治療是通過目標在于使fviii活性恢復(fù)至正常程度的1至5％以預(yù)防自發(fā)性出血的替代療法(mannucci,p.m.等,n.engl.j.med.344:1773-1779(2001)，其以引用的方式整體并入本文)。存在可用于按需治療出血事件或通過預(yù)防性治療來防止出血事件發(fā)生的血漿來源的和重組的fviii產(chǎn)品。然而，基于這些產(chǎn)品的短半衰期(例如8-12小時)，治療方案需要頻繁施用靜脈內(nèi)注射。所述頻繁施用是令人疼痛且不方便的。

降低的死亡率、關(guān)節(jié)損傷的預(yù)防及生活質(zhì)量的提高因血漿來源的和重組的fviii的開發(fā)已經(jīng)是重要成果。出血保護延長將代表血友病a患者治療的另一個關(guān)鍵進展。然而，迄今為止，尚未開發(fā)出允許長期止血保護的產(chǎn)品。因此，仍對比現(xiàn)有療法更耐受、持續(xù)時間更長且更有效的治療因子viii缺乏所致的血友病的改進方法存在需要。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供施用因子viii的方法；施用包含因子viii的嵌合多肽及所述嵌合多肽的雜合體的方法；包含因子viii的嵌合多肽及所述嵌合多肽的雜合體；編碼所述嵌合和雜合多肽的多核苷酸；包含所述多核苷酸的細胞；以及使用所述細胞制造所述嵌合和雜合多肽的方法。

本發(fā)明提供向有需要的受試者施用因子viii的方法，其包括向所述受試者施用治療劑量的嵌合因子viii多肽，例如嵌合因子viii-fc多肽，給藥間隔為相等劑量的無非因子viii部分(例如無fc部分)的所述因子viii(由所述因子viii部分組成的多肽)所需要的給藥間隔的至少約一倍半長。

給藥間隔可為相等劑量的無非因子viii部分(例如fc部分)的所述因子viii(由所述因子viii部分組成的多肽)所需要的給藥間隔的至少約一倍半至六倍長、一倍半至五倍長、一倍半至四倍長、一倍半至三倍長或一倍半至兩倍長。給藥間隔可為相等劑量的無非因子viii部分(例如fc部分)的所述因子viii(由所述因子viii部分組成的多肽)所需要的給藥間隔的至少約一倍半、兩倍、兩倍半、三倍、三倍半、四倍、四倍半、五倍、五倍半或六倍長。給藥間隔可為約每五天、每六天、每七天、每八天、每九天、每十天、每十一天、每十二天、每十三天或每十四天或更長時間。

給藥間隔可為至少約一天半至5天、一天半、2天、3天、4天或5天或更長時間。

本發(fā)明還提供向有需要的受試者施用因子viii的方法，其包括向所述受試者施用治療劑量的嵌合因子viii多肽，例如嵌合因子viii-fc多肽，以獲得由相等劑量的無非因子viii部分(例如無fc部分)的所述因子viii(由所述因子viii部分組成的多肽)所獲得的血漿濃度對時間曲線下面積(auc)的至少約一又四分之一倍大的auc。

本發(fā)明還提供向有需要的受試者施用因子viii的方法，其包括向所述受試者施用治療劑量的包含因子viii及fc的多肽，給藥間隔為約每三天、每四天、每五天、每六天、每七天、每八天、每九天、每十天、每十一天、每十二天、每十三天或每十四天或更長時間。

本發(fā)明的方法可對需要預(yù)防性治療或按需治療的受試者實施。

按需治療包括治療出血事件、關(guān)節(jié)積血、肌肉出血、口腔出血、流血、肌肉內(nèi)流血、口腔流血、創(chuàng)傷、頭部創(chuàng)傷(traumacapitis)(頭部創(chuàng)傷(headtrauma))、胃腸出血、顱內(nèi)流血、腹內(nèi)流血、胸內(nèi)流血、骨折、中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血、咽后間隙出血、腹膜后間隙出血或髂腰肌鞘出血。受試者可能需要手術(shù)預(yù)防、圍手術(shù)期管理或用于手術(shù)的治療(treatmentforsurgery)。所述手術(shù)包括例如小手術(shù)、大手術(shù)、拔牙、扁桃體切除術(shù)、腹股溝疝氣切開術(shù)、滑膜切除術(shù)、全膝置換、開顱術(shù)、骨縫合術(shù)、創(chuàng)傷外科手術(shù)、顱內(nèi)手術(shù)、腹內(nèi)手術(shù)、胸內(nèi)手術(shù)或關(guān)節(jié)置換手術(shù)。

對于按需治療，所述嵌合多肽的給藥間隔為約每24-36小時、每24-48小時、每24-72小時、每24-96小時、每24-120小時、每24-144小時、每24-168小時、每24小時、每25小時、每26小時、每27小時、每28小時、每29小時、每30小時、每31小時、每32小時、每33小時、每34小時、每35小時、每36小時、每37小時、每38小時、每39小時、每40小時、每41小時、每42小時、每43小時、每44小時、每45小時、每46小時、每47小時、每48小時、每49小時、每50小時、每51小時、每52小時、每53小時、每54小時、每55小時、每56小時、每57小時、每58小時、每59小時、每60小時、每61小時、每62小時、每63小時、每64小時、每65小時、每66小時、每67小時、每68小時、每69小時、每70小時、每71小時或每72小時或更長時間一次。

可用于本發(fā)明方法中的治療劑量為約10至約100iu/kg，更具體地為約10-20iu/kg、20-30iu/kg、30-40iu/kg、40-50iu/kg、50-60iu/kg、60-70iu/kg、70-80iu/kg、80-90iu/kg或90-100iu/kg，且更具體地為約10iu/kg、15iu/kg、20iu/kg、25iu/kg、30iu/kg、35iu/kg、40iu/kg、45iu/kg、50iu/kg、55iu/kg、60iu/kg、65iu/kg、70iu/kg、75iu/kg、80iu/kg、85iu/kg、90iu/kg、95iu/kg或100iu/kg。

可用于本發(fā)明方法中的治療劑量為約10至約150iu/kg，更具體地為約100-110iu/kg、110-120iu/kg、120-130iu/kg、130-140iu/kg、140-150iu/kg，且更具體地為約110iu/kg、115iu/kg、120iu/kg、125iu/kg、130iu/kg、135iu/kg、140iu/kg、145iu/kg或150iu/kg。

本發(fā)明方法中的受試者為人類受試者。給藥間隔和auc的確定可在單一受試者中或在受試者群體中進行。

因子viii(或嵌合多肽的因子viii部分)為人類因子viii。因子viii(或嵌合多肽的因子viii部分)的b結(jié)構(gòu)域可完全或部分缺失。

因子viii(或嵌合多肽的因子viii部分)可與表2中所示無信號序列的因子viii氨基酸序列(seqidno:2的氨基酸20至1457或seqidno:6的氨基酸4至2351)至少90％或95％同一。因子viii(或嵌合多肽的因子viii部分)可與表2中所示無信號序列的因子viii氨基酸序列(seqidno:2的氨基酸20至1457或seqidno:6的氨基酸20至2351)同一。

因子viii(或嵌合多肽的因子viii部分)可與表2中所示有信號序列的因子viii氨基酸序列(seqidno:2的氨基酸1至1457或seqidno:6的氨基酸1至2351)至少90％或95％同一。因子viii(或嵌合多肽的因子viii部分)可與表2中所示有信號序列的因子viii氨基酸序列(seqidno:2的氨基酸1至1457或seqidno:6的氨基酸1至2351)同一。

fc部分(或嵌合多肽的fc部分)可與表2中所示的fc氨基酸序列(seqidno:2的氨基酸1458至1684或seqidno:6的氨基酸2352至2578)至少90％或95％同一。fc部分(或嵌合多肽的fc部分)可與表2中所示的fc氨基酸序列(seqidno:2的氨基酸1458至1684或seqidno:6的氨基酸2352至2578)同一。

嵌合多肽可包含與表2a(i)中所示無信號序列的因子viii及fc氨基酸序列(seqidno:2的氨基酸20至1684)至少90％或95％同一或與表2a(i)中所示有信號序列的因子viii及fc氨基酸序列(seqidno:2的氨基酸1至1684)至少90％或95％同一的序列。嵌合多肽可包含與表2a(i)中所示無信號序列的因子viii及fc氨基酸序列(seqidno:2的氨基酸20至1684)同一或與表2a(i)中所示有信號序列的因子viii及fc氨基酸序列(seqidno:2的氨基酸1至1684)同一的序列。

嵌合多肽可呈包含與所述嵌合多肽締合的第二多肽的雜合體形式，其中所述第二多肽包含fc或基本上由fc組成。

第二多肽可包含以下或基本上由以下組成：與表2a(ii)中所示無信號序列的氨基酸序列(seqidno:4的氨基酸21至247)至少90％或95％同一或與表2a(ii)中所示有信號序列的氨基酸序列(seqidno:4的氨基酸1至247)至少90％或95％同一的序列。第二多肽可包含以下或基本上由以下組成：與表2a(ii)中所示無信號序列的氨基酸序列(seqidno:4的氨基酸21至247)同一或與表2a(ii)中所示有信號序列的氨基酸序列(seqidno:4的氨基酸1至247)同一的序列。

嵌合多肽或雜合體可作為包含至少一種賦形劑的藥物組合物的一部分施用。

本發(fā)明還提供上述嵌合和雜合多肽本身、編碼其的多核苷酸、包含所述多核苷酸的培養(yǎng)的人類胚胎細胞及產(chǎn)生所述嵌合和雜合多肽的方法，及由所述方法產(chǎn)生的多肽。

本發(fā)明還提供包含因子viii部分及第二部分的具有因子viii活性的嵌合多肽，其中所述因子viii部分為包含兩條鏈的加工過的因子viii，第一鏈包含重鏈且第二鏈包含輕鏈，其中所述第一鏈與所述第二鏈由金屬鍵締合。舉例來說，嵌合多肽的因子viii部分的至少約50％、約60％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％或約99％為加工過的因子viii。

此外，本發(fā)明包括具有因子viii活性的嵌合多肽，其中所述因子viii部分為單鏈因子viii。一方面，單鏈因子viii可含有完整的細胞內(nèi)加工位點。在一個實施方案中，嵌合多肽的因子viii部分的至少約1％、約5％、約10％、約15％、約20％或約25％為單鏈因子viii。在另一實施方案中，嵌合多肽的因子viii部分的至少約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％或約99％為單鏈因子viii。另一方面，單鏈fviii不含細胞內(nèi)加工位點。舉例來說，scfviii包含對應(yīng)于精氨酸1645的氨基酸位置處的取代或突變、對應(yīng)于精氨酸1648的氨基酸位置處的取代或突變或?qū)?yīng)于全長因子viii中精氨酸1645和精氨酸1648的氨基酸位置處的取代或突變。在對應(yīng)于精氨酸1645的氨基酸位置處取代的氨基酸為與在對應(yīng)于精氨酸1648的氨基酸位置處取代的氨基酸不同的氨基酸。在某些實施方案中，取代或突變?yōu)槌彼嵋酝獾陌被?，例如丙氨酸?/p>

在一些實施方案中，當在體外通過顯色測定測量因子viii活性時，包含單鏈因子viii的嵌合多肽具有程度與由兩個fc部分及融合于所述兩個fc部分中的一個的加工過的因子viii組成的嵌合多肽相當?shù)囊蜃觱iii活性。在其它實施方案中，包含單鏈因子viii的嵌合多肽在體內(nèi)具有與由兩個fc部分及融合于所述兩個fc部分中的一個的加工過的因子viii組成的嵌合多肽相當?shù)囊蜃觱iii活性。在其它實施方案中，包含單鏈因子viii的嵌合多肽具有與由兩個fc部分及融合于所述兩個fc部分中的一個的加工過的因子viii組成的嵌合多肽相當?shù)囊蜃觴a產(chǎn)生速率。在某些實施方案中，嵌合多肽中的單鏈因子viii由活化的蛋白c滅活的程度與由兩個fc部分及加工過的因子viii組成的嵌合多肽中的加工過的因子viii相當。在其它實施方案中，嵌合多肽中的單鏈因子viii具有與由兩個fc部分及加工過的因子viii組成的嵌合多肽中的加工過的因子viii相當?shù)囊蜃觟xa相互作用速率。在其它實施方案中，嵌合多肽中的單鏈因子viii以與由兩個fc部分及加工過的因子viii組成的嵌合多肽中的加工過的因子viii相當?shù)某潭冉Y(jié)合馮·維勒布蘭德因子(vonwillebrandfactor)。

本發(fā)明進一步包括包含具有因子viii活性的嵌合多肽的組合物，其中所述多肽的至少約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％包含為單鏈因子viii的因子viii部分及第二部分，其中所述單鏈因子viii與表2中所示無信號序列的因子viii氨基酸序列(seqidno:2的氨基酸20至1457或seqidno:6的氨基酸20至2351)至少90％或95％同一。在一個實施方案中，第二部分可為fc。在另一實施方案中，多肽呈包含第二多肽的雜合體形式，其中所述第二多肽基本上由fc組成。在其它實施方案中，所述多肽具有由所述因子viii組成的多肽的至少一倍半至六倍長、一倍半至五倍長、一倍半至四倍長、一倍半至三倍長或一倍半至兩倍長的半衰期。

還提供治療出血病狀的方法，其包括施用治療有效量的組合物。所述治療可為預(yù)防性治療或按需治療或圍手術(shù)期治療。出血凝血病癥可為血友病。在一個實施方案中，所治療的受試者為小兒科受試者。

本發(fā)明還針對預(yù)防、減少或治療受試者的出血事件的方法，其包括向所述受試者施用有效量的長效因子viii(fviii)蛋白，其中所述受試者在血漿中表達高水平的馮·維勒布蘭德因子(vwf)。在一個實施方案中，受試者已鑒別為在血漿中表達高水平的vwf。本發(fā)明還針對預(yù)防、減少或治療受試者的出血事件的方法，其包括：(a)通過測量受試者血漿中vwf的水平來鑒別具有高vwf水平的所述受試者，其中至少約100iu/dl的vwf水平將所述受試者鑒別為具有高vwf水平；及(b)向所述受試者施用有效量的長效fviii蛋白。

在一個實施方案中，受試者為人類。在另一實施方案中，受試者為小兒科受試者。在另一實施方案中，受試者患有血友病a。

在一個實施方案中，vwf的高水平為至少約100iu/dl。在另一實施方案中，vwf的高水平在約100iu/dl與約200iu/dl之間。在另一實施方案中，vwf的高水平為約110iu/dl、約120iu/dl、約130iu/dl、約140iu/dl、約150iu/dl、約160iu/dl、約170iu/dl、約180iu/dl、約190iu/dl或約200iu/dl。

在一個實施方案中，受試者具有血液血清型a、b或ab。

在一個實施方案中，長效fviii蛋白在所述受試者體內(nèi)具有約20小時與約40小時之間的半衰期。在另一實施方案中，長效fviii蛋白具有約21小時、22小時、23小時、24小時、25小時、26小時、27小時、28小時、29小時、30小時、31小時、31小時、32小時、33小時、34小時、35小時、36小時、37小時、38小時、39小時或40小時的半衰期。在另一實施方案中，長效fviii蛋白具有約20小時與27小時之間的半衰期。在另一實施方案中，長效fviii蛋白具有為所述所述長效fviii蛋白施用于具有平均水平vwf的個體時的半衰期的至少約1.2倍大的半衰期。在另一實施方案中，長效fviii蛋白具有為所述所述長效fviii蛋白施用于具有平均水平vwf的個體時的半衰期的至少約約1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍或2.5倍大的半衰期。

在一個實施方案中，所施用的長效fviii蛋白的有效量為至少約20iu/kg、至少約25iu/kg、至少約30iu/kg、至少約35iu/kg、至少約40iu/kg、至少約45iu/kg、至少約50iu/kg、至少約55iu/kg、至少約60iu/kg、至少約65iu/kg、至少約70iu/kg、至少約75iu/kg、至少約80iu/kg、至少約85iu/kg或至少約90iu/kg。在另一實施方案中，有效量為至少約65iu/kg至至少約90iu/kg。在另一實施方案中，有效量為80iu/kg。

在一個實施方案中，長效fviii蛋白每72小時或更長時間施用一次。在另一實施方案中，長效fviii蛋白約一周或更長時間施用一次。在另一實施方案中，長效fviii蛋白約每10天施用一次、約每兩周施用一次、約每15天施用一次、約每20天施用一次、約每三周施用一次、約每25天施用一次、約每四周施用一次或約每一個月施用一次。

在一個實施方案中，長效fviii以80iu/kg的劑量每72小時施用一次。在另一實施方案中，長效fviii向小兒科受試者以80iu/kg的劑量每72小時施用一次。

在一個實施方案中，施用長效fviii蛋白消退多于5-20％、多于5-15％、多于5-10％、多于10-20％或多于10-15％的出血事件。在一個實施方案中，受試者體內(nèi)血漿因子viii:c的谷水平維持高于1-3iu/dl或3-5iu/dl。在一個實施方案中，所述施用預(yù)防受試者的出血事件。在另一實施方案中，出血事件為自發(fā)性的。在另一實施方案中，所述施用消退多于80-100％、多于80-90％、多于85-90％、多于90-100％、多于90-95％或多于95-100％的出血事件。

在一個實施方案中，所述施用在需要手術(shù)的受試者的群體中維持穩(wěn)態(tài)。在另一實施方案中，長效fviii蛋白在手術(shù)之前、期間或之后施用。在另一實施方案中，手術(shù)為小手術(shù)、大手術(shù)、拔牙、扁桃體切除術(shù)、腹股溝疝氣切開術(shù)、滑膜切除術(shù)、全膝置換、開顱術(shù)、骨縫合術(shù)、創(chuàng)傷外科手術(shù)、顱內(nèi)手術(shù)、腹內(nèi)手術(shù)、胸內(nèi)手術(shù)或關(guān)節(jié)置換手術(shù)。在另一實施方案中，手術(shù)為急救外科手術(shù)。

在一個實施方案中，長效fviii蛋白具有長于由fviii組成的多肽的半衰期。在另一實施方案中，長效fviii蛋白被聚乙二醇化、羥乙基淀粉化或聚唾液酸化。

在一個實施方案中，長效fviii蛋白為包含fviii部分及第二部分的嵌合蛋白。在另一實施方案中，第二部分為fc區(qū)、白蛋白、pas序列、轉(zhuǎn)鐵蛋白、ctp(具有4個o-聚糖的hcg的28個氨基酸的c端肽(ctp))、聚乙二醇(peg)、羥乙基淀粉(hes)、白蛋白結(jié)合多肽、白蛋白結(jié)合小分子或其兩個或更多個組合。在另一實施方案中，第二部分融合于fviii部分的氨基端或羧基端。在另一實施方案中，第二部分插入于fviii部分中的兩個氨基酸之間。在另一實施方案中，嵌合蛋白為fviiifc單體二聚體雜合體。在另一實施方案中，fviii部分為單鏈。在另一實施方案中，fviii部分包含重鏈和輕鏈。在另一實施方案中，fviii部分包含全長因子viii、成熟因子viii或b結(jié)構(gòu)域完全或部分缺失的因子viii。在另一實施方案中，fviii部分包含與seqidno:2的氨基酸1至1438或seqidno:6的氨基酸1至2332至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。在另一實施方案中，fviii部分包含seqidno:2的氨基酸1至1438或seqidno:6的氨基酸1至2332。在另一實施方案中，嵌合多肽包含與seqidno:2的氨基酸1439至1665或seqidno:6的氨基酸2333至2559至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的fc區(qū)。在另一實施方案中，第二部分包含seqidno:2的氨基酸1439至1665或seqidno:6的氨基酸2333至2559。在另一實施方案中，長效fviii多肽作為包含至少一種賦形劑的藥物組合物的一部分施用。

本發(fā)明還提供治療診斷患有出血病癥的受試者的方法，其包括測量所述受試者體內(nèi)fviii-fc的半衰期，其中為正常受試者體內(nèi)fviii-fc半衰期的至少約1.2倍大的半衰期指示所述受試者為長間隔給藥的候選者，及以有效量及至少3天的給藥間隔施用fviii-fc多肽。

本發(fā)明還提供治療診斷患有出血病癥的受試者的方法，其包括以有效量及至少3天的給藥間隔向受試者施用fviii-fc多肽，其中所述受試者體內(nèi)fviii-fc的半衰期為fviii-fc施用于具有平均水平vwf的受試者時的半衰期的至少約1.2倍大。

在一個實施方案中，所述受試者體內(nèi)fviii-fc的血漿半衰期為fviii-fc施用于具有平均水平vwf的受試者時的血漿半衰期的至少約1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍或2.5倍大。在另一實施方案中，fviii-fc血漿半衰期在20-40小時之間。在另一實施方案中，長效fviii蛋白具有約21小時、22小時、23小時、24小時、25小時、26小時、27小時、28小時、29小時、30小時、31小時、31小時、32小時、33小時、34小時、35小時、36小時、37小時、38小時、39小時或40小時的半衰期。在另一實施方案中，長效fviii蛋白具有約20小時與27小時之間的半衰期。

本發(fā)明還提供治療診斷患有出血病癥的受試者的方法，其包括測量施用于所述受試者的短效fviii的半衰期，其中為所述短效fviii在具有平均vwf水平的受試者體內(nèi)的半衰期的至少約1.2倍大的半衰期指示所述受試者為長間隔給藥的候選者，及以有效量及至少3天的給藥間隔施用長效fviii-fc多肽。在一個實施方案中，所述受試者體內(nèi)短效fviii的半衰期為短效fviii施用于具有平均水平vwf的受試者時的半衰期的至少約1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍或2.5倍大。

在一個實施方案中，受試者為人類。在另一實施方案中，受試者為小兒科受試者。在另一實施方案中，受試者患有血友病a。在另一實施方案中，受試者具有血液血清型a、b或ab。

在一個實施方案中，長效fviii-fc以以下有效量施用：至少約20iu/kg、至少約25iu/kg、至少約30iu/kg、至少約35iu/kg、至少約40iu/kg、至少約45iu/kg、至少約50iu/kg、至少約55iu/kg、至少約60iu/kg、至少約65iu/kg、至少約70iu/kg、至少約75iu/kg、至少約80iu/kg、至少約85iu/kg或至少約90iu/kg。在另一實施方案中，有效量為至少約65iu/kg至至少約90iu/kg。

在一個實施方案中，有效量的fviii-fc蛋白約每周施用一次、約每10天施用一次、約每兩周施用一次、約每15天施用一次、約每20天施用一次、約每三周施用一次、約每25天施用一次、約每四周施用一次或約每一個月施用一次。

在一個實施方案中，所述施用消退多于5-20％、多于5-15％、多于5-10％、多于10-20％或多于10-15％的出血事件。在一個實施方案中，受試者體內(nèi)血漿因子viii:c的谷水平維持高于1-3iu/dl或3-5iu/dl。

在一個實施方案中，所述施用預(yù)防受試者的出血事件。在一個實施方案中，出血事件為自發(fā)性的。在一個實施方案中，所述施用消退多于80-100％、多于80-90％、多于85-90％、多于90-100％、多于90-95％或多于95-100％的出血事件。在一個實施方案中，所述施用在需要手術(shù)的受試者的群體中維持穩(wěn)態(tài)。在一個實施方案中，fviii-fc蛋白在手術(shù)之前、期間或之后施用。在一個實施方案中，手術(shù)為小手術(shù)、大手術(shù)、拔牙、扁桃體切除術(shù)、腹股溝疝氣切開術(shù)、滑膜切除術(shù)、全膝置換、開顱術(shù)、骨縫合術(shù)、創(chuàng)傷外科手術(shù)、顱內(nèi)手術(shù)、腹內(nèi)手術(shù)、胸內(nèi)手術(shù)或關(guān)節(jié)置換手術(shù)。在一個實施方案中，手術(shù)為急救外科手術(shù)。

在一個實施方案中，fviii-fc蛋白具有長于由fviii組成的多肽的半衰期。在一個實施方案中，fviii-fc蛋白被聚乙二醇化、羥乙基淀粉化或聚唾液酸化。在一個實施方案中，fviii-fc蛋白為fviiifc單體二聚體雜合體。在一個實施方案中，fviii部分為單鏈。在一個實施方案中，fviii部分包含重鏈和輕鏈。在一個實施方案中，fviii部分包含全長因子viii、成熟因子viii或b結(jié)構(gòu)域完全或部分缺失的因子viii。在一個實施方案中，fviii部分包含與seqidno:2的氨基酸1至1438或seqidno:6的氨基酸1至2332至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。在一個實施方案中，fviii部分包含seqidno:2的氨基酸1至1438或seqidno:6的氨基酸1至2332。在一個實施方案中，嵌合多肽的第二部分包含與seqidno:2的氨基酸1439至1665或seqidno:6的氨基酸2333至2559至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的fc區(qū)。在一個實施方案中，第二部分包含seqidno:2的氨基酸1439至1665或seqidno:6的氨基酸2333至2559。

在一個實施方案中，fviii-fc多肽作為包含至少一種賦形劑的藥物組合物的一部分施用。

本發(fā)明還提供用于確定診斷患有出血病癥的受試者是否為用于長間隔給予長效fviii多肽的候選者的方法，其包括測量血漿vwf的表達水平，其中至少100iu/dl的vwf表達水平指示所述受試者為使用長效fviii多肽進行長間隔給藥的候選者。在一個實施方案中，vwf表達水平為至少約110iu/dl、約120iu/dl、約130iu/dl、約140iu/dl、約150iu/dl、約160iu/dl、約170iu/dl、約180iu/dl、約190iu/dl或約200iu/dl。

本發(fā)明還提供用于確定診斷患有出血病癥的受試者是否為用于長間隔給予長效fviii多肽的候選者的方法，其包括測量所述受試者體內(nèi)fviii-fc的半衰期，其中為fviii-fc施用于具有平均vwf水平的受試者時的半衰期的至少約1.2倍大的半衰期指示所述受試者為長間隔給藥的候選者。在一個實施方案中，fviii-fc的半衰期為fviii-fc施用于具有平均水平vwf的受試者時的半衰期的至少約1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍或2.5倍大。

本發(fā)明還提供用于確定診斷患有出血病癥的受試者是否為用于長間隔給予長效fviii多肽的候選者的方法，其包括測量所述受試者體內(nèi)短效fviii的半衰期，其中為短效fviii施用于具有平均vwf水平的受試者時的半衰期的至少約1.2倍大的半衰期指示所述受試者為長間隔給藥的候選者。在一個實施方案中，半衰期為fviii-fc施用于具有平均水平vwf的受試者時的半衰期的至少約1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍或2.5倍大。

附圖簡述

圖1：rfviiifc單體的示意圖。

圖2a-圖2e：a-b.rfviiifc(加工過的或單鏈)的非還原性及還原性sds-page分析。c.通過lc/uv和lc/ms分析的rfviiifc結(jié)構(gòu)。d.凝血酶裂解后rfviiifc的總離子流(tic)色譜圖(lc/ms圖)。指示主要消化產(chǎn)物。e.rfviiifc和rbddfviii的a2結(jié)構(gòu)域的去卷積質(zhì)譜。指示對應(yīng)于凝血酶裂解的a2結(jié)構(gòu)域(s373至r740)及兩個截短產(chǎn)物s373至y729及s373至e720的主要產(chǎn)物及其同源質(zhì)量。

圖3a-圖3c：rfviii-fc的生物化學表征：a.作為磷脂囊泡濃度的函數(shù)的因子x的活化；b.作為fx濃度的函數(shù)的因子x的活化。c.作為因子ixa濃度的函數(shù)的因子x的活化。

圖4：因子x由活化的蛋白c裂解后的活化。

圖5a-圖5d：根據(jù)劑量水平分選、根據(jù)化合物分組(單級測定，25iu/kg(a)或65iu/kg(b)；及顯色測定，25iu/kg(c)或65iu/kg(d))的相對于時間的觀測到的組平均fviii活性(±se)對時間曲線。

圖6a-圖6b：根據(jù)劑量水平和化合物分組(單級測定(a)或顯色測定(b))的相對于時間的觀測到的組平均fviii活性(±se)對時間曲線。

圖7(a)-圖7(c)：單鏈fviii:fc在hema小鼠尾靜脈橫斷模型中的體內(nèi)功效。(a)單鏈rfviii:fc劑量展示為方塊，且加工過的rfviii:fc劑量展示為圓形。(b)尾靜脈橫斷后4.6μg/kg、1.38μg/kg及0.46μg/kg的rfviiifc或scrfviiifc的存活百分比。(c)尾靜脈橫斷后4.6μg/kg(黑色圓形或倒三角形)、1.38μg/kg(三角形或菱形)及0.46μg/kg(方塊和灰色圓形)的rfviiifc或scrfviiifc分別的非出血者百分比。

圖8：研究設(shè)計。圖8描繪1/2a期研究的研究設(shè)計，所述研究為劑量遞增依序設(shè)計，以評估25iu/kg(低劑量組a)或65iu/kg(高劑量組b)的單次靜脈內(nèi)劑量后rfviiifc與的安全性和pk的比較。

圖9：單級(aptt)及顯色測定所測定的rfviii活性的相關(guān)性。注射(◆)和rfviiifc(□)后測量fviii活性(iu/ml)的單級凝血(aptt)與顯色測定結(jié)果之間的相關(guān)性。

圖10(a)-圖10(b)：低劑量組和高劑量組的組平均血漿fviii活性藥物代謝動力學概況。展示(a)25iu/kg(低劑量組，n＝6)；及(b)65iu/kg(高劑量組，n＝10n＝9[rfviiifc])的單次靜脈內(nèi)注射rfviiifc或后的血漿fviii活性(單級aptt測定)對時間曲線。所示結(jié)果為組平均值±平均值的標準誤差(sem)。

圖11(a)-圖11(b)：vwf抗原水平對注射或rfviiifc后fviii活性的cl和t1/2的影響。vwf抗原水平與(a)(r²＝0.5415且p＝0.0012)及rfviiifc(r²＝0.5492且p＝0.0016)的權(quán)重調(diào)整的cl；及(b)(r²＝0.7923且p<0.0001)及rfviiifc(r²＝0.6403且p＝0.0003)的t1/2之間的相關(guān)性。各點表示單個受試者。

圖12(a)-圖12(b)：單個受試者在注射或rfviiifc后的離體全血結(jié)果。在指定時間點在以(a)25iu/kg和rfviiifc；及(b)65iu/kg和rfviiifc的劑量治療之前及之后從受試者采集血液樣品。在儀器上通過以ca++起始的natem測定凝結(jié)時間。所示結(jié)果為來自各單個樣品的三重復(fù)通道讀數(shù)的平均值±平均值的標準誤差(sem)。

圖13(a)-圖13(b)：凝血酶產(chǎn)生測定(tga)中的活性比較。(a)scrfviiifc展示內(nèi)源性凝血酶潛能(etp)降低，及(b)與rfviiifc相比峰值凝血酶降低。

圖14(a)-圖14(c)：體外rotem數(shù)據(jù)。摻加于從未處理的hema小鼠獲得的匯集全血中的不同濃度的xyntha、advate<及rfviiifc的rotem(natem)結(jié)果(平均值±sd)。(a)平均凝結(jié)時間(ct)(圖14a)，(b)凝塊形成時間(cft)，及(c)α角。

圖15(a)-圖15(c)：離體rotem數(shù)據(jù)。在單次靜脈內(nèi)施用50iu/kg的xyntha、advate或rfviiifc后在給藥后5分鐘、24小時、48小時、72小時及96小時從hema小鼠獲得的rotem(natem)結(jié)果(平均值±sd)。(a)平均凝結(jié)時間(ct)，(b)凝塊形成時間(cft)，及(c)α角。

圖16(a)-圖16(e)：rfviiifc及單鏈(sc)rfviiifc與vwf的相互作用的實時評估，及凝血酶介導(dǎo)的rfviiifc及scrfviiifc從vwf釋放的實時評估。(a).rfviiifc及scrfviiifc對vwf的親和力的表面等離子體共振(spr)分析。描繪結(jié)合曲線及1:1擬合相互作用模型。x軸展示時間(秒)且y軸展示反應(yīng)(反應(yīng)單位(ru))。(b).在25℃(上圖)及37℃(下圖)下活化的rfviiifc、scrfviiifc及缺乏fc部分的b結(jié)構(gòu)域缺失的rfviii(rbddfviii)的凝血酶介導(dǎo)釋放的參考扣除傳感器圖。x軸展示時間(秒)且y軸展示反應(yīng)(反應(yīng)單位(ru))。單條線指示在不同α-凝血酶濃度下的反應(yīng)。最上方的線為在0u/mlα-凝血酶下的反應(yīng)，且后續(xù)各線依序針對0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.31、0.63、1.3、2.5、5、10及20u/ml的α-凝血酶濃度。(c).在25℃(上圖)及37℃(下圖)下rfviiifc、scrfviiifc及rbddfviii的凝血酶介導(dǎo)的釋放相的雙重參考扣除傳感器圖。x軸展示時間(秒)且y軸展示反應(yīng)(反應(yīng)單位(ru))。單條線指示在不同α-凝血酶濃度下的反應(yīng)。最上方的線為在0u/mlα-凝血酶下的反應(yīng)，且后續(xù)各線依序針對0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.31、0.63、1.3、2.5、5.0、10及20u/ml的α-凝血酶濃度。(d).在25℃(上圖)及37℃(下圖)下rfviiifc、scrfviiifc及rbddfviii的作為時間的函數(shù)的凝血酶介導(dǎo)的釋放速率。x軸展示時間(秒)且y軸展示反應(yīng)(反應(yīng)單位(ru))。單條線指示在不同α-凝血酶濃度下的反應(yīng)。最上方的線為在20u/mlα-凝血酶下的反應(yīng)，且后續(xù)各線依序針對10、5、2.5、1.3、0.63、0.31、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01及0.005u/ml的α-凝血酶濃度。(e).在25℃(上圖)及37℃(下圖)下rfviiifc、scrfviiifc及rbddfviii的作為凝血酶濃度的函數(shù)的峰值凝血酶介導(dǎo)的釋放速率。ec50為半最大有效濃度。x軸為α-凝血酶濃度(u/ml)且y軸為最大釋放速率(ru/秒)。

發(fā)明詳述

本發(fā)明提供利用因子viii(加工過的、單鏈或其組合)使用比用當前已知的因子viii產(chǎn)品所可能的更長的給藥間隔和/或更大的auc治療血友病a的方法。本發(fā)明還提供改進的因子viii嵌合多肽及制造方法。

治療血友病a是通過目標在于使fviii活性恢復(fù)至正常水平的1至5％以預(yù)防自發(fā)性出血的替代療法(mannucci,p.m.等,n.engl.j.med.344:1773-9(2001)，其以引用的方式整體并入本文)。存在可用于按需治療出血事件或通過預(yù)防性治療來防止出血事件發(fā)生的血漿來源的和重組的fviii產(chǎn)品?；谶@些產(chǎn)品的短半衰期(例如8-12小時)(whiteg.c.等,thromb.haemost.77:660-7(1997)；morfini,m.,haemophilia9(增刊1):94-99；discussion100(2003))，治療方案需要頻繁靜脈內(nèi)施用，通常對于預(yù)防來說為每周兩次至三次且對于按需治療來說為每日一次至三次(manco-johnson,m.j.等,n.engl.j.med.357:535-544(2007))，各自以引用的方式整體并入本文。所述頻繁施用是令人疼痛且不方便的。

本發(fā)明提供向有需要的人類受試者(例如人類患者)施用因子viii的方法，其包括向所述受試者施用治療劑量的嵌合因子viii多肽(例如嵌合因子viii-fc多肽)或所述多肽的雜合體，給藥間隔為相等劑量的無非因子viii部分(例如無fc部分)的所述因子viii(由所述因子viii部分組成的多肽)所需要的給藥間隔的至少約一倍半長。本發(fā)明還針對延長因子viii施用在有需要的人類受試者中的給藥間隔的方法，其包括施用嵌合因子viii多肽。

給藥間隔可為相等劑量的無非因子viii部分(例如無fc部分)的所述因子viii(由所述因子viii部分組成的多肽)所需要的給藥間隔的至少約一倍半至六倍長、一倍半至五倍長、一倍半至四倍長、一倍半至三倍長或一倍半至兩倍長。給藥間隔可為相等劑量的無非因子viii部分(例如無fc部分)的所述因子viii(由所述因子viii部分組成的多肽)所需要的給藥間隔的至少約一倍半、兩倍、兩倍半、三倍、三倍半、四倍、四倍半、五倍、五倍半或六倍長。給藥間隔可為約每三天、每四天、每五天、每六天、每七天、每八天、每九天、每十天、每十一天、每十二天、每十三天或每十四天或更長時間。

給藥間隔可為至少約一天半至5天、一天半、2天、3天、4天或5天或更長時間。

本發(fā)明還提供向有需要的人類受試者施用因子viii的方法，其包括向所述受試者施用治療劑量的嵌合因子viii多肽(例如嵌合因子viii-fc多肽)或所述多肽的雜合體，以獲得由相等劑量的無非因子viii部分(例如無fc部分)的所述因子viii(由所述因子viii部分組成的多肽)所獲得的血漿濃度對時間曲線下面積(auc)的至少約一又四分之一倍大的auc。本發(fā)明因此包括增加或延長因子viii活性在有需要的人類受試者中的auc的方法，其包括施用嵌合因子viii多肽。

本發(fā)明還提供向有需要的受試者施用因子viii的方法，其包括向所述受試者施用治療劑量的包含因子viii及fc的多肽或所述多肽的雜合體，給藥間隔為約每三天、每四天、每五天、每六天、每七天、每八天、每九天、每十天、每十一天、每十二天、每十三天或每十四天或更長時間。

本發(fā)明的方法可對需要預(yù)防性治療或按需治療的受試者實施。

如本文所用的“施用”意指經(jīng)由藥學上可接受的途徑向受試者給予本發(fā)明的藥學上可接受的因子viii多肽。施用途徑可為靜脈內(nèi)，例如靜脈內(nèi)注射及靜脈內(nèi)輸注。其它施用途徑包括例如皮下、肌肉內(nèi)、經(jīng)口、經(jīng)鼻及肺部施用。嵌合多肽和雜合蛋白可作為包含至少一種賦形劑的藥物組合物的一部分施用。

如本文所用的“血漿濃度對時間曲線下面積(auc)”與藥理學領(lǐng)域中的術(shù)語相同，并且是基于施用后因子viii吸收的速率及程度。auc是針對指定時期(如12小時、18小時、24小時、36小時、48小時或72小時)測定，或使用外推法基于曲線的斜率針對無窮大測定的。除非本文另外說明，否則auc是針對無窮大測定的。auc的測定可在單一受試者中進行，或在受試者群體中進行，其中針對所述受試者群體計算平均值。

如本文所用，因子viii的“b結(jié)構(gòu)域”與本領(lǐng)域中已知通過內(nèi)部氨基酸序列同一性及凝血酶蛋白水解裂解位點界定的b結(jié)構(gòu)域相同，例如全長人類因子viii的殘基ser741-arg1648。其它人類因子viii結(jié)構(gòu)域由以下氨基酸殘基界定：a1，殘基ala1-arg372；a2，殘基ser373-arg740；a3，殘基ser1690-ile2032；c1，殘基arg2033-asn2172；c2，殘基ser2173-tyr2332。a3-c1-c2序列包括殘基ser1690-tyr2332。其余序列(殘基glu1649-arg1689)通常稱為因子viii輕鏈活化肽。豬、小鼠及犬因子viii的所有結(jié)構(gòu)域(包括b結(jié)構(gòu)域)的邊界的位置在本領(lǐng)域中也已知。在一個實施方案中，因子viii的b結(jié)構(gòu)域缺失(“b結(jié)構(gòu)域缺失因子viii”或“bddfviii”)。bddfviii的一個實例為(重組bddfviii)，其具有與表2a(i)中序列的因子viii部分相同的序列(seqidno:2的氨基酸1至1457或20至1457)。在另一實施方案中，b結(jié)構(gòu)域缺失因子viii含有完整的細胞內(nèi)加工位點，其對應(yīng)于b結(jié)構(gòu)域缺失因子viii的殘基754處的精氨酸(其對應(yīng)于seqidno:2的精氨酸殘基773)或全長因子viii的殘基1648處的精氨酸(其對應(yīng)于seqidno:6的精氨酸殘基1667)。除非另外指示，否則未提及任何seqid編號時本文所用的序列殘基編號對應(yīng)于無信號肽序列(19個氨基酸)的因子viii序列。舉例來說，由于19個氨基酸的信號肽序列，全長因子viii的s743/q1638對應(yīng)于seqidno:6的s762/q1657。在其它實施方案中，b結(jié)構(gòu)域缺失的fviii包含對應(yīng)于精氨酸1645的氨基酸位置處的取代或突變、對應(yīng)于精氨酸1648的氨基酸位置處的取代或突變、或?qū)?yīng)于全長因子viii中精氨酸1645和精氨酸1648的氨基酸位置處的取代或突變。在一些實施方案中，在對應(yīng)于精氨酸1645的氨基酸位置處取代的氨基酸為與在對應(yīng)于精氨酸1648的氨基酸位置處取代的氨基酸不同的氨基酸。在某些實施方案中，取代或突變?yōu)槌彼嵋酝獾陌被幔绫彼帷?/p>

“b結(jié)構(gòu)域缺失的因子viii”可具有以下文獻中公開的完全或部分缺失：美國專利號6,316,226、6,346,513、7,041,635、5,789,203、6,060,447、5,595,886、6,228,620、5,972,885、6,048,720、5,543,502、5,610,278、5,171,844、5,112,950、4,868,112及6,458,563，所述文獻各自以引用的方式整體并入本文。在一些實施方案中，本發(fā)明的b結(jié)構(gòu)域缺失的因子viii序列包含美國專利號6,316,226(還在us6,346,513中)的第4列第4行至第5列第28行及實施例1-5所公開的任一缺失。在一些實施方案中，本發(fā)明的b結(jié)構(gòu)域缺失的因子viii具有美國專利號5,789,203(還為us6,060,447、us5,595,886及us6,228,620)的第2列第26-51行及實施例5-8所公開的缺失。在一些實施方案中，b結(jié)構(gòu)域缺失的因子viii具有以下中所述的缺失：美國專利號5,972,885的第1列第25行至第2列第40行；美國專利號6,048,720的第6列第1-22行及實施例1；美國專利號5,543,502的第2列第17-46行；美國專利號5,171,844的第4列第22行至第5列第36行；美國專利號5,112,950的第2列第55-68行、圖2及實施例1；美國專利號4,868,112的第2列第2行至第19列第21行及表2；美國專利號7,041,635的第2列第1行至第3列第19行、第3列第40行至第4列第67行、第7列第43行至第8列第26行及第11列第5行至第13列第39行；或美國專利號6,458,563的第4列第25-53行。在一些實施方案中，b結(jié)構(gòu)域缺失的因子viii已缺失大部分b結(jié)構(gòu)域，但仍含有b結(jié)構(gòu)域中為初級翻譯產(chǎn)物體內(nèi)蛋白水解加工成兩條多肽鏈所必需的氨基端序列(即細胞內(nèi)加工位點)，如wo91/09122中所公開，所述文獻以引用的方式整體并入本文。在一些實施方案中，b結(jié)構(gòu)域缺失的因子viii構(gòu)建成缺失氨基酸747-1638，即b結(jié)構(gòu)域幾乎完全缺失。hoebenr.c.等,j.biol.chem.265(13):7318-7323(1990)，以引用的方式整體并入本文。b結(jié)構(gòu)域缺失的因子viii還可含有因子viii的氨基酸771-1666或氨基酸868-1562的缺失。meulienp.等,proteineng.2(4):301-6(1988)，以引用的方式整體并入本文。作為本發(fā)明的一部分的其它b結(jié)構(gòu)域缺失包括例如缺失氨基酸982至1562或760至1639(toole等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.83:5939-5942(1986))、797至1562(eaton等,biochemistry25:8343-8347(1986))、741至1646(kaufman(pct公開申請?zhí)杦o87/04187))、747-1560(sarver等,dna6:553-564(1987))、741至1648(pasek(pct申請?zhí)?8/00831))、816至1598或741至1689(lagner(behringinst.mitt.(1988)no82:16-25,ep295597))，所述文獻各自以引用的方式整體并入本文。前述各缺失可在任何因子viii序列中進行。

在一個實施方案中，嵌合多肽中的b結(jié)構(gòu)域缺失的因子viii部分被加工成由金屬鍵連接(或締合)的兩條鏈，第一鏈包含重鏈(a1-a2-部分b)且第二鏈包含輕鏈(a3-c1-c2)。在另一實施方案中，b結(jié)構(gòu)域缺失的因子viii部分為單鏈因子viii。單鏈因子viii可包含細胞內(nèi)加工位點，其對應(yīng)于b結(jié)構(gòu)域缺失的因子viii的殘基754(seqidno:2的殘基773)或全長因子viii的殘基1648(seqidno:6的殘基1657)處的精氨酸。

重鏈與輕鏈之間的金屬鍵可為本領(lǐng)域中已知的任何金屬。舉例來說，適用于本發(fā)明的金屬可為二價金屬離子?？捎糜诰喓现劓溑c輕鏈的金屬包括(但不限于)ca²⁺、mn²⁺或cu²⁺。fatouros等,intern.j.pharm.155(1):121-131(1997)；wakabayashi等,jbc.279(13):12677-12684(2004)。

如本文所用的“嵌合多肽”意指其中包括來自不同來源的至少兩種多肽(或子序列或肽)的多肽。嵌合多肽可包括例如來自不同來源(如不同基因、不同cdna或不同動物或其它物種)的兩種、三種、四種、五種、六種、七種或更多種多肽。嵌合多肽可包括例如連接不同子序列的一個或多個接頭。因此，在單一嵌合多肽內(nèi)，子序列可直接連接或其可經(jīng)由接頭間接連接或兩者。嵌合多肽可包括例如其它肽，如信號序列及有助于蛋白質(zhì)純化或檢測的序列(如6his及flag)。此外，嵌合多肽可在n端和/或c端具有氨基酸或肽添加。

在一些實施方案中，嵌合多肽包含因子viii部分及非因子viii部分。示例性非因子viii部分包括例如fc、xten、白蛋白、pas序列、轉(zhuǎn)鐵蛋白、ctp(具有4個o-聚糖的人類絨毛膜促性腺激素(hcg)的28個氨基酸的c端肽(ctp))、聚乙二醇(peg)、羥乙基淀粉(hes)、白蛋白結(jié)合多肽及白蛋白結(jié)合小分子。本發(fā)明的示例性嵌合多肽包括例如嵌合因子viii-fc多肽、嵌合因子viii-xten多肽、嵌合因子viii-白蛋白多肽、嵌合因子viii-pas多肽、嵌合因子viii-轉(zhuǎn)鐵蛋白多肽、嵌合因子viii-ctp多肽、嵌合因子viii-peg多肽、嵌合因子viii-hes多肽、嵌合因子viii-白蛋白結(jié)合多肽多肽及嵌合因子viii-白蛋白結(jié)合小分子多肽。

示例性嵌合因子viii-fc多肽包括例如有或無信號序列的seqidno:2或6(表2)及seqidno:4的嵌合fc多肽(表2)。

嵌合多肽可包含與表2a(i)中所示無信號序列的因子viii及fc氨基酸序列(seqidno:2的氨基酸20至1684)至少90％或95％同一或與表2a(i)中所示有信號序列的因子viii及fc氨基酸序列(seqidno:2的氨基酸1至1684)至少90％或95％同一的序列，其中所述序列具有因子viii活性。因子viii活性可通過活化的部分促凝血酶原激酶時間(appt)測定、顯色測定或其它已知方法測量。嵌合多肽可包含與表2a(i)中所示無信號序列的因子viii及fc氨基酸序列(seqidno:2的氨基酸20至1684)同一或與表2a(i)中所示有信號序列的因子viii及fc氨基酸序列(seqidno:2的氨基酸1至1684)同一的序列。

如上文所論述，示例性嵌合多肽包括融合于一個或多個xten多肽的因子viii。schellenburger等,nat.biotech.27:1186-90(2009)，所述文獻以引用的方式整體并入本文。xten多肽可融合于fviii的n端或fviii的c端?？稍趚ten部分與因子viii部分之間包括蛋白酶位點以允許所述加工。xten多肽包括例如以下文獻中公開的那些：wo2009/023270、wo2010/091122、wo2007/103515、us2010/0189682及us2009/0092582，所述文獻各自以引用的方式整體并入本文。

如上文所論述，示例性嵌合多肽還包括融合于一個或多個白蛋白多肽、白蛋白結(jié)合多肽或白蛋白結(jié)合小分子的因子viii。在一個實施方案中，白蛋白為人類白蛋白。白蛋白或白蛋白結(jié)合蛋白可融合于fviii的n端或fviii的c端，或插入fviii中的兩個氨基酸之間。可用于本發(fā)明中的白蛋白(例如其片段)的實例為已知的。例如美國專利號7,592,010；美國專利號6,686,179；及schulte,thrombosisres.124增刊2:s6-s8(2009)，所述文獻各自以引用的方式整體并入本文。

白蛋白結(jié)合多肽可包含(但不限于)細菌白蛋白結(jié)合域、白蛋白結(jié)合肽或可結(jié)合白蛋白的白蛋白結(jié)合抗體片段。如由kraulis等,febslett.378:190-194(1996)及l(fā)inhult等,proteinsci.11:206-213(2002)所公開來自鏈球菌蛋白g的結(jié)構(gòu)域3為細菌白蛋白結(jié)合域的一個實例。白蛋白結(jié)合肽的實例包括具有核心序列diclprwgclw(seqidno:7)的一系列肽。參見例如dennis等,j.biol.chem.2002,277:35035-35043(2002)。白蛋白結(jié)合抗體片段的實例公開于以下文獻中：muller和kontermann,curr.opin.mol.ther.9:319-326(2007)；rooverset等,cancerimmunol.immunother.56:303-317(2007)；及holt等,prot.eng.designsci.,21:283-288(2008)，所述文獻以引用的方式整體并入本文。

在某些方面，本發(fā)明的重組fviii多肽包含至少一個用于非多肽小分子、變體或其可結(jié)合白蛋白的衍生物的連接位點。所述白蛋白結(jié)合部分的一個實例為2-(3-馬來酰亞胺基丙酰胺基)-6-(4-(4-碘苯基)丁酰胺基)己酸酯(“albu”標簽)，如由trusselet等,bioconjugatechem.20:2286-2292(2009)所公開。

如上文所論述，示例性嵌合多肽還包括融合于人類絨毛膜促性腺激素的c端肽(ctp)的至少一個β亞單位或其片段、變體或衍生物的因子viii。ctp可在fviii的n端或fviii的c端融合于因子viii，或插入fviii中的兩個氨基酸之間。融合于重組蛋白或插入重組蛋白中的一個或多個ctp肽已知增加所述蛋白質(zhì)的體內(nèi)半衰期。參見例如美國專利號5,712,122，以引用的方式整體并入本文。示例性ctp肽包括dprfqdsssskapppslpspsrlpgpsdtpil(seqidno:8)或sssskapppslpspsrlpgpsdtpilpq(seqidno:9)。參見例如美國專利申請公布號us2009/0087411a1，以引用的方式并入本文。

如上文所論述，示例性嵌合多肽還包括融合于至少一個pas序列或其片段、變體或衍生物的因子viii。pas序列可融合于fviii的n端或fviii的c端，或插入fviii中的兩個氨基酸之間。如本文所用的pas肽或pas序列意指主要包含丙氨酸及絲氨酸殘基或主要包含丙氨酸、絲氨酸和脯氨酸殘基的氨基酸序列，所述氨基酸序列在生理條件下形成無規(guī)卷曲構(gòu)象。因此，pas序列為包含丙氨酸、絲氨酸和脯氨酸、基本上由丙氨酸、絲氨酸和脯氨酸組成或由丙氨酸、絲氨酸和脯氨酸組成的構(gòu)建塊、氨基酸聚合物或序列盒，其可用作嵌合蛋白中異源部分的一部分。氨基酸聚合物還可在添加除丙氨酸、絲氨酸和脯氨酸以外的殘基作為pas序列中的次要成分時形成無規(guī)卷曲構(gòu)象?！按我煞帧币庵赋彼帷⒔z氨酸和脯氨酸以外的氨基酸可以以下某一程度添加于pas序列中：例如至多約12％，即pas序列的100個氨基酸中約12個，至多約10％、至多約9％、至多約8％、約6％、約5％、約4％、約3％，即約2％或約1％的氨基酸。不同于丙氨酸、絲氨酸和脯氨酸的氨基酸可選自由以下組成的組：arg、asn、asp、cys、gln、glu、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、thr、trp、tyr及val。在生理條件下，pas肽形成無規(guī)卷曲構(gòu)象且由此可介導(dǎo)本發(fā)明重組蛋白的增加的體內(nèi)和/或體外穩(wěn)定性，且具有促凝血活性。

pas肽的非限制性實例包括aspaapapaspaapapsapa(seqidno:10)、aapaspapaapsapapaaps(seqidno:11)、apsspspsapsspspaspss(seqidno:12)、apsspspsapsspspasps(seqidno:13)、sspsapspsspaspspsspa(seqidno:14)、aaspaapsappaaaspaapsappa(seqidno:15)、asaaapaaasaaasapsaaa(seqidno:16)或其任何變體、衍生物、片段或組合。pas序列的其它實例從例如美國專利公布號2010/0292130a1及pct申請公布號wo2008/155134a1、歐洲授權(quán)專利ep2173890知曉。

如上文所論述，示例性嵌合多肽還包括融合于至少一個轉(zhuǎn)鐵蛋白肽或其片段、變體或衍生物的因子viii。至少一個轉(zhuǎn)鐵蛋白肽可融合于fviii的n端或fviii的c端，或插入fviii中的兩個氨基酸之間。任何轉(zhuǎn)鐵蛋白都可融合于本發(fā)明的重組fviii蛋白或插入本發(fā)明的重組fviii蛋白中。作為一個實例，野生型人類tf(tf)為約75kda(未計算糖基化)的679個氨基酸的蛋白質(zhì)，具有兩個主要結(jié)構(gòu)域n(約330個氨基酸)和c(約340個氨基酸)，所述結(jié)構(gòu)域似乎來源于基因復(fù)制。參見基因庫登錄號nm001063、xm002793、m12530、xm039845、xm039847及s95936(www.ncbi.nlm.nih.gov)，全部以引用的方式整體并入本文。

轉(zhuǎn)鐵蛋白經(jīng)由轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(tfr)介導(dǎo)的內(nèi)吞作用來轉(zhuǎn)運鐵。在鐵釋放至內(nèi)體區(qū)室中且tf-tfr復(fù)合物再循環(huán)至細胞表面后，tf釋放回到細胞外間隙以進行下一個鐵轉(zhuǎn)運循環(huán)。tf具有超過14-17天的長半衰期(li等,trendspharmacol.sci.23:206-209(2002))。已針對半衰期延長、用于癌癥療法的靶向遞送、經(jīng)口遞送及胰島素原的持續(xù)活化對轉(zhuǎn)鐵蛋白融合蛋白進行了研究(brandsma等,biotechnol.adv.,29:230-238(2011)；bai等,proc.natl.acad.sci.usa102:7292-7296(2005)；kim等,j.pharmacol.exp.ther.,334:682-692(2010)；wang等,j.controlledrelease155:386-392(2011))。

如上文所論述，示例性嵌合多肽還包括融合于至少一個聚乙二醇(peg)部分的因子viii。

聚乙二醇化的fviii可指的是fviii與至少一個聚乙二醇(peg)分子之間形成的綴合物。peg可以多種分子量及平均分子量范圍購得。peg平均分子量范圍的典型實例包括但不限于約200道爾頓、約300道爾頓、約400道爾頓、約600道爾頓、約1000道爾頓、約1300-1600道爾頓、約1450道爾頓、約2000道爾頓、約3000道爾頓、約3000-3750道爾頓、約3350道爾頓、約3000-7000道爾頓、約3500-4500道爾頓、約5000-7000道爾頓、約7000-9000道爾頓、約8000道爾頓、約10000道爾頓、約8500-11500道爾頓、約16000-24000道爾頓、約35000道爾頓、約40000道爾頓、約60000道爾頓以及約80000道爾頓(dalton)。這些平均分子量僅作為實例提供且不意圖以任何方式具有限制性。

本發(fā)明的重組fviii蛋白可被聚乙二醇化以包括單個或多個(例如2-4個)peg部分。聚乙二醇化可通過本領(lǐng)域中已知的任何聚乙二醇化反應(yīng)進行。制備聚乙二醇化蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法通常包括(i)使多肽與聚乙二醇(如peg的反應(yīng)性酯或醛衍生物)在使得本發(fā)明的肽連接至一個或多個peg基團的條件下反應(yīng)；及(ii)獲得反應(yīng)產(chǎn)物。一般來說，用于所述反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件將基于已知參數(shù)及所要結(jié)果逐項確定。

存在許多本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的peg連接方法，例如malikf等,exp.hematol.20:1028-35(1992)；francis,focusongrowthfactors3(2):4-10(1992)；歐洲專利公布號ep0401384、ep0154316及ep0401384；及國際專利申請公布號wo92/16221及wo95/34326。作為一個非限制性實例，fviii變體可在fviii中的一個或多個插入位點中含有半胱氨酸取代，且所述半胱氨酸可進一步綴合于peg聚合物。參見mei等,blood116:270-279(2010)及美國專利號7,632,921，所述文獻以引用的方式整體并入本文。

如上文所論述，示例性嵌合多肽還包括融合于至少一個羥乙基淀粉(hes)聚合物的因子viii。hes為天然存在的支鏈淀粉的衍生物且在體內(nèi)由α-淀粉酶降解。hes展現(xiàn)有利的生物性質(zhì)且用作血容量替代劑且在臨床上用于血液稀釋療法中。參見例如sommermeyer等,krankenhauspharmazie8:271-278(1987)；及weidler等,arzneim.-forschung/drugres.41:494-498(1991)。

hes的主要特征在于分子量分布及取代度。hes具有1至300kd、2至200kd、3至100kd或4至70kd的平均分子量(分子量平均值)。羥乙基淀粉可進一步展現(xiàn)0.1至3、0.1至2、0.1至0.9或0.1至0.8的摩爾取代度，及關(guān)于羥乙基在2至20范圍內(nèi)的c2:c6取代比率。平均分子量為約130kd的hes為來自fresenius的為人工膠體，用于例如治療及預(yù)防低血容量癥的治療適應(yīng)癥中所用的容量替代。存在許多本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的hes連接方法，例如與上文所述的peg連接方法相同。

在一些實施方案中，包含因子viii部分的嵌合多肽具有相比于由相同因子viii部分組成而無非因子viii部分的多肽增加的半衰期(t1/2)。t1/2增加的嵌合因子viii多肽在本文中可稱為長效因子viii。長效嵌合因子viii多肽包括例如融合于fc的因子viii(包括例如呈雜合體形式的嵌合因子viii多肽，如fviiifc單體二聚體雜合體；參見實施例1、圖1及表2a；及美國專利號7,404,956及7,348,004)、融合于xten的因子viii及融合于白蛋白的因子viii。

如本文所用，“培養(yǎng)(culture/toculture/culturing)”意指在允許細胞生長或分裂或維持細胞呈活的狀態(tài)的體外條件下孵育細胞。如本文所用，“培養(yǎng)細胞”意指體外繁殖的細胞。

除非另外說明，否則如本文所用的“因子viii”意指在凝血中發(fā)揮正常作用的功能性因子viii多肽。因此，術(shù)語因子viii包括具有功能性的變體多肽。因子viii蛋白可為人類、豬、犬及鼠類因子viii蛋白。如背景技術(shù)部分中所描述，全長多肽及多核苷酸序列為已知的，許多功能性片段、突變體及修飾型式也是已知的。人類因子viii序列的實例展示為seqidno:2或6中的子序列(表2)。因子viii多肽包括例如全長因子viii、在n端減去met的全長因子viii、成熟因子viii(減去信號序列)、在n端具有附加met的成熟因子viii和/或b結(jié)構(gòu)域完全或部分缺失的因子viii。因子viii變體包括b結(jié)構(gòu)域缺失，無論為部分或完全缺失。

大量功能性因子viii變體為已知的，如上文及下文所論述。另外，已在血友病患者中鑒別出因子viii中的數(shù)百種非功能性突變，且已確定這些突變對因子viii功能的影響更多地由于其在因子viii的3維結(jié)構(gòu)中所處的位置而非取代的性質(zhì)(cutler等,hum.mutat.19:274-8(2002))，以引用的方式整體并入本文。另外，來自人類及其它物種的因子viii之間的比較已鑒別出可能為功能所需的保守殘基(cameron等,thromb.haemost.79:317-22(1998)；us6,251,632)，以引用的方式整體并入本文。

在哺乳動物細胞中分離并表達了人類因子viii基因(toole,j.j.等,nature312:342-347(1984)；gitschier,j.等,nature312:326-330(1984)；wood,w.i.等,nature312:330-337(1984)；vehar,g.a.等,nature312:337-342(1984)；wo87/04187；wo88/08035；wo88/03558；美國專利號4,757,006)，所述文獻各自以引用的方式整體并入本文，且由cdna推導(dǎo)出了氨基酸序列。以引用的方式整體并入本文的capon等的美國專利號4,965,199公開用于在哺乳動物宿主細胞中制造因子viii及純化人類因子viii的重組dna方法。已報道在cho(中國倉鼠卵巢)細胞及bhkc(幼倉鼠腎細胞)中的人類因子viii表達。已對人類因子viii進行修飾以缺失部分或全部b結(jié)構(gòu)域(美國專利號4,994,371及4,868,112，所述文獻各自以引用的方式整體并入本文)，并且已將人類因子viiib結(jié)構(gòu)域用人類因子vb結(jié)構(gòu)域置換(美國專利號5,004,803，以引用的方式整體并入本文)。編碼人類因子viii的cdna序列及預(yù)測的氨基酸序列分別展示于美國申請公布號2005/0100990(以引用的方式整體并入本文)的seqidno:1及2中。

以引用的方式整體并入本文的美國專利號5,859,204,lollar,j.s.報道免疫原性降低且免疫反應(yīng)性降低的因子viii的功能性突變體。以引用的方式整體并入本文的美國專利號6,376,463,lollar,j.s.也報道了免疫反應(yīng)性降低的因子viii的突變體。以引用的方式整體并入本文的美國申請公布號2005/0100990,saenko等報道因子viii的a2結(jié)構(gòu)域中的功能性突變。

許多功能性因子viii分子(包括b結(jié)構(gòu)域缺失)公開于以下專利中：us6,316,226及us6,346,513(均轉(zhuǎn)讓給baxter)；us7,041,635(轉(zhuǎn)讓給in2gen)；us5,789,203、us6,060,447、us5,595,886及us6,228,620(轉(zhuǎn)讓給chiron)；us5,972,885及us6,048,720(轉(zhuǎn)讓給biovitrum)、us5,543,502及us5,610,278(轉(zhuǎn)讓給novonordisk)；us5,171,844(轉(zhuǎn)讓給immunoag)；us5,112,950(轉(zhuǎn)讓給transgenes.a.)；us4,868,112(轉(zhuǎn)讓給geneticsinstitute)，所述專利各自以引用的方式整體并入本文。

豬因子viii序列已公布(toole,j.j.等,proc.natl.acad.sci.usa83:5939-5942(1986))，以引用的方式整體并入本文，且已報道由pcr擴增來自豬脾cdna文庫的因子viii序列獲得的完整的豬cdna序列(healey,j.f.等,blood88:4209-4214(1996)，以引用的方式整體并入本文)。所有結(jié)構(gòu)域、所有亞單位及具體氨基酸序列被取代的雜合人類/豬因子viii公開于lollar和runge的美國專利號5,364,771及wo93/20093中，所述文獻以引用的方式整體并入本文。最近，豬因子viii的a1及a2結(jié)構(gòu)域以及用豬a1和/或a2結(jié)構(gòu)域取代相應(yīng)人類結(jié)構(gòu)域的嵌合因子viii的核苷酸及相應(yīng)氨基酸序列報道于wo94/11503中，所述文獻以引用的方式整體并入本文。美國專利號5,859,204,lollar,j.s.也公開豬cdna及推導(dǎo)的氨基酸序列。以引用的方式整體并入本文的美國專利號6,458,563(轉(zhuǎn)讓給emory)公開b結(jié)構(gòu)域缺失的豬因子viii。

因子viii(或嵌合多肽的因子viii部分)可與表2中所示無信號序列的因子viii氨基酸序列(seqidno:2的氨基酸20至1457；及seqidno:6的氨基酸20至2351)至少90％或95％同一，其中所述因子viii部分具有因子viii活性。因子viii(或嵌合多肽的因子viii部分)可與表2中所示無信號序列的因子viii氨基酸序列(seqidno:2的氨基酸20至1457；及seqidno:6的氨基酸20至2351)同一。

因子viii(或嵌合多肽的因子viii部分)可與表2中所示有信號序列的因子viii氨基酸序列(seqidno:2的氨基酸1至1457；及seqidno:6的氨基酸1至2351)至少90％或95％同一，其中所述因子viii部分具有因子viii活性。因子viii(或嵌合多肽的因子viii部分)可與表2中所示有信號序列的因子viii氨基酸序列(seqidno:2的氨基酸1至1457及seqidno:6的氨基酸1至2351)同一。

如本文所用，“相等劑量”意指以國際單位表述的相同劑量的因子viii活性，其與所討論的多肽的分子量無關(guān)。一個國際單位(iu)的因子viii活性大致對應(yīng)于一毫升正常人類血漿中因子viii的量。若干種測定可用于測量因子viii活性，包括歐洲藥典(europeanpharmacopoeia)顯色底物測定及單級凝結(jié)測定。

除非另外說明，否則如本文所用的“fc”意指功能性新生兒fc受體(fcrn)結(jié)合配偶體。fcrn結(jié)合配偶體為可由fcrn受體特異性結(jié)合的任何分子且隨后由fcrn受體活性轉(zhuǎn)運所述fcrn結(jié)合配偶體。因此，術(shù)語fc包括iggfc的任何功能性變體。igg的fc部分中結(jié)合fcrn受體的區(qū)已基于x射線結(jié)晶學進行了描述(burmeister等,nature372:379(1994)，以引用的方式整體并入本文)。fc與fcrn的主要接觸區(qū)在ch2與ch3結(jié)構(gòu)域的接點附近。fc-fcrn接觸全部在單一ig重鏈內(nèi)。fcrn結(jié)合配偶體包括例如整個igg、igg的fc片段及包括完整fcrn結(jié)合區(qū)的其它igg片段。主要接觸位點包括ch2結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311及314以及ch3結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基385-387、428及433-436。提及免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或區(qū)的氨基酸編號均基于kabat等1991,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,u.s.departmentofpublichealth,bethesda；md，以引用的方式整體并入本文。(fcrn受體已從若干哺乳動物物種(包括人類)中分離。人類fcrn、大鼠fcrn及小鼠fcrn的序列為已知的(story等,j.exp.med.180:2377(1994)，以引用的方式整體并入本文)。fc可包含免疫球蛋白的ch2及ch3結(jié)構(gòu)域，有或無免疫球蛋白的鉸鏈區(qū)。示例性fc變體提供于wo2004/101740及wo2006/074199中，所述文獻以引用的方式整體并入本文。

fc(或嵌合多肽的fc部分)可含有一個或多個突變及突變的組合。

fc(或嵌合多肽的fc部分)可含有使半衰期增加的突變，如m252y、s254t、t256e及其組合，如oganesyan等,mol.immunol.46:1750(2009)中所公開，所述文獻以引用的方式整體并入本文；h433k、n434f及其組合，如vaccaro等,nat.biotechnol.23:1283(2005)中所公開，所述文獻以引用的方式整體并入本文；us2009/0264627a1的第1-2頁的段落[0012]及實施例9和10所公開的突變體，所述文獻以引用的方式整體并入本文；及us20090163699a1的第2頁的段落[0014]至[0021]所公開的突變體，所述文獻以引用的方式整體并入本文。

fc(或嵌合多肽的fc部分)還可包括例如以下突變：igg的fc區(qū)可根據(jù)如定點誘變及其類似工序的公認工序進行修飾以產(chǎn)生將由fcrn結(jié)合的修飾的igg或其fc片段或部分。所述修飾包括例如遠離fcrn接觸位點的修飾以及接觸位點內(nèi)保留或甚至增強與fcrn的結(jié)合的修飾。舉例來說，人類igg1fc(fcy1)中的以下單個氨基酸殘基可被取代而不顯著損失fc對fcrn的結(jié)合親和力：p238a、s239a、k246a、k248a、d249a、m252a、t256a、e258a、t260a、d265a、s267a、h268a、e269a、d270a、e272a、l274a、n276a、y278a、d280a、v282a、e283a、h285a、n286a、t289a、k290a、r292a、e293a、e294a、q295a、y296f、n297a、s298a、y300f、r301a、v303a、v305a、t307a、l309a、q311a、d312a、n315a、k317a、e318a、k320a、k322a、s324a、k326a、a327q、p329a、a330q、a330s、p331a、p331s、e333a、k334a、t335a、s337a、k338a、k340a、q342a、r344a、e345a、q347a、r355a、e356a、m358a、t359a、k360a、n361a、q362a、y373a、s375a、d376a、a378q、e380a、e382a、s383a、n384a、q386a、e388a、n389a、n390a、y391f、k392a、l398a、s400a、d401a、d413a、k414a、r416a、q418a、q419a、n421a、v422a、s424a、e430a、n434a、t437a、q438a、k439a、s440a、s444a以及k447a，其中例如p238a表示在位置編號238處野生型脯氨酸取代為丙氨酸。除丙氨酸外，其它氨基酸也可取代上文指定位置處的野生型氨基酸。突變可單獨引入fc中，從而產(chǎn)生一百種以上不同于天然fc的fcrn結(jié)合配偶體。另外，可一起引入兩個、三個或更多個這些單個突變的組合，從而產(chǎn)生數(shù)百種多的fcrn結(jié)合配偶體。某些所述突變可對fcrn結(jié)合配偶體賦予新功能性。舉例來說，一個實施方案并入n297a，從而除去高度保守的n糖基化位點。這個突變的作用是在于降低免疫原性，由此增強fcrn結(jié)合配偶體的循環(huán)半衰期，并且使fcrn結(jié)合配偶體不能結(jié)合fcyri、fcyriia、fcyriib及fcyriiia而不有損對fcrn的親和力(routledge等1995,transplantation60:847，其以引用的方式整體并入本文；friend等1999,transplantation68:1632，其以引用的方式整體并入本文；shields等1995,j.biol.chem.276:6591，其以引用的方式整體并入本文)。此外，至少三種人類fcγ受體似乎識別igg上的下鉸鏈區(qū)內(nèi)的結(jié)合位點，通常為氨基酸234-237。因此，新功能性及可能降低的免疫原性的另一實例可由這個區(qū)的突變，如例如通過將人類igg1的氨基酸233-236“ellg”置換為來自igg2的相應(yīng)序列“pva”(具有一個氨基酸缺失)來產(chǎn)生。已顯示介導(dǎo)各種效應(yīng)功能的fcyri、fcyrii及fcyriii在已引入所述突變時將不結(jié)合igg1(ward和ghetie,therapeuticimmunology2:77(1995)，其以引用的方式整體并入本文；及armour等,eur.j.immunol.29:2613(1999)，其以引用的方式整體并入本文)。作為由上述突變產(chǎn)生的新功能性的另一實例，在一些情況下，對fcrn的親和力可增加超過野生型的親和力。此增加的親和力可反映增加的“締合”速率、降低的“解離”速率或增加的“締合”速率與降低的“解離”速率兩者。據(jù)信使對fcrn的親和力增加的突變包括例如t256a、t307a、e380a及n434a(shields等,j.biol.chem.276:6591(2001)，其以引用的方式整體并入本文)。

fc(或嵌合多肽的fc部分)可與表2中所示的fc氨基酸序列(seqidno:2的氨基酸1458至1684或seqidno:6的氨基酸2352至2578)至少90％或95％同一。fc(或嵌合多肽的fc部分)可與表2中所示的fc氨基酸序列(seqidno:2的氨基酸1458至1684及seqidno:6的氨基酸2352至2578)同一。

如本文所用，“雜合”多肽及蛋白意指嵌合多肽與第二多肽的組合。雜合體中的嵌合多肽及第二多肽可經(jīng)由蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(如電荷-電荷相互作用或疏水性相互作用)彼此締合。雜合體中的嵌合多肽及第二多肽可經(jīng)由二硫鍵或其它共價鍵彼此締合。雜合體描述于wo2004/101740及wo2006/074199中，所述文獻各自以引用的方式整體并入本文。還參見美國專利號7,404,956及7,348,004，所述文獻各自以引用的方式整體并入本文。第二多肽可為相同嵌合多肽的第二拷貝或其可為不相同的嵌合多肽。參見例如圖1、實施例1及表2。在一個實施方案中，第二多肽為包含fc的多肽。在另一實施方案中，嵌合多肽為嵌合因子viii-fc多肽且第二多肽基本上由fc組成，例如實施例1的雜合多肽，其為由融合于人類igg1的二聚fc結(jié)構(gòu)域且無插入接頭序列的單一分子的重組b結(jié)構(gòu)域缺失的人類fviii(bdd-rfviii)組成的rfviiifc重組融合蛋白。此雜合多肽在本文中稱為fviiifc單體fc融合蛋白、fviiifc單體雜合體、單體fviiifc雜合體及fviiifc單體-二聚體。參見實施例1、圖1及表2a。所述實施例提供此雜合多肽的臨床前及臨床數(shù)據(jù)。

雜合體中的第二多肽可包含以下或基本上由以下組成：與表2a(ii)中所示無信號序列的氨基酸序列(seqidno:4的氨基酸21至247)至少90％或95％同一或與表2a(ii)中所示有信號序列的氨基酸序列(seqidno-:4的氨基酸1至247)至少90％或95％同一的序列。第二多肽可包含以下或基本上由以下組成：與表2a(ii)中所示無信號序列的氨基酸序列(seqidno:4的氨基酸21至247)同一或與表2a(ii)中所示有信號序列的氨基酸序列(seqidno:4的氨基酸1至247)同一的序列。

圖1為展示b結(jié)構(gòu)域缺失的因子viii-fc嵌合多肽及其與為fc多肽的第二多肽的締合的結(jié)構(gòu)的示意圖。為獲得此雜合體，使用fviii特異性引物通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(rt-pcr)從人類肝臟polyarna(clontech)獲得人類重組b結(jié)構(gòu)域缺失的fviii的編碼序列。fviii序列包括fviii的天然信號序列。b結(jié)構(gòu)域缺失為從絲氨酸743(s743；2287bp)至谷氨酰胺1638(q1638；4969bp)，總共缺失2682bp。接著，使用fc特異性引物通過rt-pcr從人類白細胞cdna文庫(clontech)獲得人類重組fc的編碼序列。引物設(shè)計成使得b結(jié)構(gòu)域缺失的fviii序列直接融合于fc序列的n端而無插入接頭。在cmv啟動子的控制下將fviiifcdna序列克隆至哺乳動物雙重表達載體pbudce4.1(invitrogen)中。通過rt-pcr獲得包括小鼠igk信號序列的第二相同fc序列且克隆于表達載體pbudce4.1中第二啟動子ef1α的下游。

使用脂轉(zhuǎn)染胺2000(lipofectamine2000)轉(zhuǎn)染試劑(invitrogen)將rfviiifc表達載體轉(zhuǎn)染至人類胚腎293細胞(hek293h；invitrogen)中。通過用博萊霉素(zeocin)(invitrogen)進行選擇來產(chǎn)生穩(wěn)定克隆的細胞系。一個克隆的細胞系3c4-22用于產(chǎn)生fviiifc以供在體內(nèi)表征。在biogenidec(cambridge,ma)產(chǎn)生重組fviiifc并進行純化(mccue等2009)。預(yù)期上述轉(zhuǎn)染策略產(chǎn)生三種產(chǎn)物，即單體rfviiifc雜合體、二聚rfviiifc雜合體及二聚fc。然而，在來自這些細胞的條件培養(yǎng)基中基本上未檢測到二聚rfviiifc。相反，條件培養(yǎng)基含有fc及單體rfviiifc。有可能二聚rfviiifc的尺寸過大且妨礙細胞有效分泌。這個結(jié)果為有益的，因為相比于所有三種蛋白質(zhì)均存在，其使得單體純化的復(fù)雜程度較低。這些研究中所用的材料具有約9000iu/mg的比活性。

在一個實施方案中，向表達高水平馮·維勒布蘭德因子(vwf)的患者施用本發(fā)明的多肽。如本文所用的“受試者”或“患者”意指人類受試者。受試者可為當前正患有出血病癥或預(yù)期需要所述治療的患者。“受試者”可包括成人或小兒科受試者。小兒科受試者可為年齡小于12歲的小兒科患者。如本文所用的術(shù)語“小兒科”為醫(yī)學上的分支，其處理嬰兒及兒童的護理及其疾病的治療。在一個實施方案中，受試者為已診斷出重度血友病a的小兒科患者。在某些實施方案中，小兒科受試者用本發(fā)明的長效因子viii多肽治療。

vwf為具有多聚體結(jié)構(gòu)的血漿蛋白，其中各種形式的分子量在各單體亞單位的約230kda與呈具有更大分子量的多聚體形式的高達超過2千萬da之間變化，由此形成最大的已知可溶性蛋白。其血漿濃度為約5-10μg/ml左右(siedlecki等,blood,第88卷:2939-2950(1996))且具有更小尺寸的血漿形式為對應(yīng)于二聚體者，大致尺寸為500kda。

vwf在初期止血中發(fā)揮必需的作用，負責使血小板粘附至受損的血管表面且因此形成血小板栓塞，在所述血小板栓塞上發(fā)展形成纖維蛋白凝結(jié)物的機制。已提出更高分子量的多聚體支持血小板以更高效率粘附于內(nèi)皮下層的機制，且已發(fā)現(xiàn)vwf濃縮物的臨床功效與這些更高分子量的多聚體的濃度有關(guān)(metzner等,haemophilia4:25-32(1998)。

因此，表達高水平vwf的受試者將需要與表達較低或正常水平的vwf的受試者相比頻率更低的fviii給藥。vwf在血漿中的平均范圍在約50iu/dl與約200iu/dl之間。在一個實施方案中，vwf在血漿中的平均水平為約50iu/dl。在另一實施方案中，血漿中至少約100iu/dl的vwf水平被視為高vwf水平。在另一實施方案中，vwf在血漿中的高水平在約100iu/dl與約200iu/dl之間。在另一實施方案中，vwf在血漿中的高水平為至少約110iu/dl、約120iu/dl、約130iu/dl、約140iu/dl、約150iu/dl、約160iu/dl、約170iu/dl、約180iu/dl、約190iu/dl或約200iu/dl。

因此，在一個實施方案中，對表達至少約100iu/dl的血漿vwf的受試者以長間隔給藥方案施用本發(fā)明的長效fviii多肽。在一個實施方案中，長效fviii多肽以至少約3天的給藥間隔施用。在另一實施方案中，長效fviii多肽以至少約每周一次、約每兩周一次、約每15天一次、約每20天一次、約每三周一次、約每25天一次、約每四周一次或約每個月一次的給藥間隔施用。

在一個實施方案中，受試者先前鑒別為具有高vwf水平。在某些實施方案中，具有除o以外的血液血清型(即a、b或ab)的受試者因為長效fviii在這些受試者中具有更長半衰期而需要較低頻率的長效fviii給藥。在這些受試者中，增加的半衰期是由于其升高vwf水平。

此外，藥物代謝動力學數(shù)據(jù)(定義為藥物吸收、分布、代謝及排出的時程的研究)可用作適于使用本發(fā)明長效fviii多肽時的更長或更短給藥間隔的受試者的指標。臨床藥物代謝動力學為藥物代謝動力學原理應(yīng)用于藥物在單個患者中的安全和有效的治療管理。臨床藥物代謝動力學的主要目標包括增強功效及降低患者藥物療法的毒性。藥物濃度與其藥理學反應(yīng)之間的強相關(guān)性的發(fā)展使得臨床醫(yī)師能夠根據(jù)實際患者情形來應(yīng)用藥物代謝動力學原理。

因此，在一個實施方案中，使用本發(fā)明fviii-fc多肽的半衰期來鑒別表達高水平vwf的患者。fviii-fc半衰期的范圍在約10小時與約40小時之間，至少部分取決于還存在的vwf的水平。然而，fviii-fc的半衰期平均為約18小時。一般來說，與fviii-fc在施用于具有平均水平的vwf的個體時的半衰期相比，fviii-fc在具有高水平vwf的患者體內(nèi)展現(xiàn)至少約1.2倍的增加的半衰期。在一個實施方案中，與fviii-fc施用于具有平均水平vwf的個體時的半衰期相比，fviii-fc展現(xiàn)至少約1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍或2.5倍的增加的半衰期。在一個實施方案中，在表達高水平vwf的受試者中，fviii-fc的半衰期在至少約20小時與約40小時之間。在另一實施方案中，fviii-fc的半衰期為至少約21小時、22小時、23小時、24小時、25小時、26小時、27小時、28小時、29小時、30小時、31小時、31小時、32小時、33小時、34小時、35小時、36小時、37小時、38小時、39小時或40小時。在一個實施方案中，在具有高水平vwf的受試者中，fviii-fc的半衰期在約20小時與約27小時之間。因此，在一個實施方案中，fviii-fc的半衰期與平均值相比的增加指示受試者適于在使用本發(fā)明的長效fviii多肽時的更長給藥間隔。

在另一實施方案中，使用短效fviii多肽的半衰期來鑒別表達高水平vwf的患者。如本文所用，術(shù)語“短效fviii”是指未添加半衰期延長劑的fviii多肽。在一個實施方案中，短效fviii多肽由全長或b結(jié)構(gòu)域缺失的fviii組成。短效fviii多肽的實例為和

因為短效fviii的半衰期還至少部分視vwf水平而變化，所以短效fviii多肽還可用于鑒別適于本發(fā)明長效fviii多肽的更長給藥間隔的患者。在一個實施方案中，與短效fviii在施用于具有平均水平的vwf的個體時的半衰期相比，短效fviii在表達高水平vwf的個體體內(nèi)展現(xiàn)至少約1.2倍的增加的半衰期。在另一實施方案中，與短效fviii在施用于具有平均水平的vwf的個體時的半衰期相比，短效fviii在表達高水平vwf的個體體內(nèi)展現(xiàn)至少約1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2.0倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍或2.5倍的增加的半衰期。因此，在施用短效fviii時顯示至少約1.2倍的增加的半衰期的個體適于在使用本發(fā)明長效fviii多肽時的更長給藥間隔。

如本文所用，“給藥間隔”意指施用于受試者的多次劑量之間逝去的時間量。給藥間隔的比較可在單一受試者中或在受試者群體中進行，且接著可計算在所述群體中獲得的平均值。

施用嵌合因子viii多肽，例如本發(fā)明的嵌合因子viii-fc多肽(包含因子viii的多肽或雜合體)時的給藥間隔可為相等劑量的無非因子viii部分(例如無fc部分)的所述因子viii(由所述因子viii組成的多肽)所需要的給藥間隔的至少約一倍半長。給藥間隔可為相等劑量的無非因子viii部分(例如無fc部分)的所述因子viii(由所述因子viii組成的多肽)所需要的給藥間隔的至少約一倍半至六倍長、一倍半至五倍長、一倍半至四倍長、一倍半至三倍長或一倍半至兩倍長。給藥間隔可為相等劑量的無非因子viii部分(例如無fc部分)的所述因子viii(由所述因子viii組成的多肽)所需要的給藥間隔的至少約一倍半、兩倍、兩倍半、三倍、三倍半、四倍、四倍半、五倍、五倍半或六倍長。給藥間隔可為約每三天、每四天、每五天、每六天、每七天、每八天、每九天、每十天、每十一天、每十二天、每十三天或每十四天或更長時間。給藥間隔可為至少約一天半至5天、一天半、2天、3天、4天或5天或更長時間。對于按需治療，所述嵌合多肽或雜合體的給藥間隔為約每24-36小時、每24-48小時、每24-72小時、每24-96小時、每24-120小時、每24-144小時、每24-168小時、每24小時、每25小時、每26小時、每27小時、每28小時、每29小時、每30小時、每31小時、每32小時、每33小時、每34小時、每35小時、每36小時、每37小時、每38小時、每39小時、每40小時、每41小時、每42小時、每43小時、每44小時、每45小時、每46小時、每47小時、每48小時、每49小時、每50小時、每51小時、每52小時、每53小時、每54小時、每55小時、每56小時、每57小時、每58小時、每59小時、每60小時、每61小時、每62小時、每63小時、每64小時、每65小時、每66小時、每67小時、每68小時、每69小時、每70小時、每71小時或每72小時或更長時間一次。

在一個實施方案中，有效劑量為25-80iu/kg(25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、62、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80iu/kg)且給藥間隔為每3-5天、每3-6天、每3-7天、每3天、每4天、每5天、每6天、每7天或每8天或更多天一次，或每周三次，或每周不超過三次。在一個實施方案中，有效劑量為80iu/kg且給藥間隔為每3天一次。在另一實施方案中，向小兒科受試者施用以每3天的給藥間隔給予的80iu/kg的有效劑量。在另一實施方案中，有效劑量為65iu/kg且給藥間隔為每周一次或每6-7天一次。只要需要，即可重復(fù)施用劑量(例如至少10、20、28、30、40、50、52或57周、至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年)。

在某些實施方案中，用于按需治療的有效劑量為20-50iu/kg(20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50iu/kg)。按需治療可為一次性給藥或重復(fù)給藥。對于重復(fù)給藥，給藥間隔可為每12-24小時、每24-36小時、每24-48小時、每36-48小時或每48-72小時。

“長效因子viii”為相比于參考因子viii具有增加的半衰期(在本文中又稱為t1/2、t1/2β、消除半衰期及hl)的因子viii。長效因子viii的半衰期增加可由于融合于一個或多個非因子viii多肽，例如像fc、xten、白蛋白、pas序列、轉(zhuǎn)鐵蛋白、ctp(具有4個o-聚糖的hcg的28個氨基酸的c端肽(ctp))、聚乙二醇(peg)、羥乙基淀粉(hes)、白蛋白結(jié)合多肽、白蛋白結(jié)合小分子或其兩個或更多個組合。半衰期的增加可由于一個或多個修飾，如聚乙二醇化。示例性長效因子viii多肽包括例如包含fc的嵌合因子viii多肽、包含xten的嵌合因子viii多肽及包含白蛋白的嵌合因子viii多肽。其它示例性長效因子viii多肽包括例如聚乙二醇化因子viii。

在長效嵌合因子viii多肽的情況下，“參考”多肽為基本上由嵌合多肽的因子viii部分組成的多肽，例如無fc部分、無xten部分或無白蛋白部分的相同因子viii部分。同樣，在修飾的因子viii的情況下，參考多肽為無修飾的相同因子viii，例如無聚乙二醇化的因子viii。

在一些實施方案中，長效因子viii當施用于受試者時具有一種或多種以下性質(zhì)：

在所述受試者中的平均滯留時間(mrt)(活性)為約14-41.3小時；

在所述受試者中的清除率(cl)(活性)為約1.22-5.19ml/h/kg或1.22-5.19ml/h/kg以下；

在所述受試者中的t1/2β(活性)為約11-26.4小時；

在所述受試者中的增量回收率(k值)(活性；觀測值)為每iu/kg約1.38-2.88iu/dl；

在所述受試者中的vss(活性)為約37.7-79.4ml/kg；及

在所述受試者中的auc/劑量為每iu/kg約19.2-81.7iu*h/dl。

在一些實施方案中，長效因子viii當施用于患者群體時具有一種或多種以下性質(zhì)：

平均增量回收率(k值)(活性；觀測值)大于每iu/kg1.38iu/dl；

平均增量回收率(k值)(活性；觀測值)為每iu/kg至少約1.5、至少約1.85或至少約2.46iu/dl；

在所述患者群體中的平均清除率(cl)(活性)為約2.33±1.08ml/h/kg或2.33±1.08ml/h/kg以下；

在所述患者群體中的平均清除率(cl)(活性)為約1.8-2.69ml/h/kg；

在所述患者群體中的平均清除率(cl)(活性)為包含無修飾的所述因子viii的多肽的清除率的約65％；

在所述患者群體中的平均平均滯留時間(mrt)(活性)為至少約26.3±8.33小時；

在所述患者群體中的平均mrt(活性)為約25.9-26.5小時；

在所述患者群體中的平均mrt(活性)為包含無修飾的所述因子viii的多肽的平均mrt的約1.5倍長；

在所述患者群體中的平均t1/2β(活性)為約18.3±5.79小時；

在所述患者群體中的平均t1/2β(活性)為約18-18.4小時；

在所述患者群體中的平均t1/2β(活性)為包含無修飾的所述因子viii的多肽的平均t1/2β的約1.5倍長；

在所述患者群體中的平均增量回收率(k值)(活性；觀測值)為每iu/kg約2.01±0.44iu/dl；

在所述患者群體中的平均增量回收率(k值)(活性；觀測值)為每iu/kg約1.85-2.46iu/dl；

在所述患者群體中的平均增量回收率(k值)(活性；觀測值)為包含無修飾的所述因子viii的多肽的平均增量回收率的約90％；

在所述患者群體中的平均vss(活性)為約55.1±12.3ml/kg；

在所述患者群體中的平均vss(活性)為約45.3-56.1ml/kg；

在所述患者群體中的平均auc/劑量(活性)為每iu/kg約49.9±18.2iu*h/dl；

在所述患者群體中的平均auc/劑量(活性)為每iu/kg約44.8-57.6iu*h/dl。

在其它實施方案中，長效因子viii當施用于患者群體時具有一種或多種以下性質(zhì)：

當通過單級(aptt)測定或兩級(顯色)測定測量時，施用嵌合多肽的所述受試者中的cmax_obs與施用相同量的由全長、成熟因子viii組成的多肽的受試者中的cmax_obs相當；

當施用約25iu/kg嵌合多肽時，如通過單級(aptt)測定所測量，在所述受試者中的cmax_obs為約60.5iu/dl、約60.5±1iu/dl、約60.5±2iu/dl、約60.5±3iu/dl、約60.5±4iu/dl、約60.5±5iu/dl、約60.5±6iu/dl、約60.5±7iu/dl、約60.5±8iu/dl、約60.5±9iu/dl或約60.5±10iu/dl；

當施用約25iu/kg嵌合多肽時，如通過單級(aptt)測定所測量，在所述受試者中的cmax_obs為約53.1-69iu/dl；

當施用約65iu/kg嵌合多肽時，如通過單級(aptt)測定所測量，在所述受試者中的cmax_obs為約119iu/dl、約119±1iu/dl、約119±2iu/dl、約119±3iu/dl、約119±4iu/dl、約119±5iu/dl、約119±6iu/dl、約119±7iu/dl、約119±8iu/dl、約119±9iu/dl、約119±10iu/dl、約119±11iu/dl、約119±12iu/dl、約119±13iu/dl、約119±14iu/dl、約119±15iu/dl、約119±16iu/dl、約119±17iu/dl或約119±18iu/dl；

當施用約65iu/kg嵌合多肽時，如通過單級(aptt)測定所測量，在所述受試者中的cmax_obs為約103-136iu/dl；

當施用約25iu/kg嵌合多肽時，如通過兩級(顯色)測定所測量，在所述受試者中的cmax_obs為約76.5iu/dl、約76.5±1iu/dl、約76.5±2iu/dl、約76.5±3iu/dl、約76.5±4iu/dl、約76.5±5iu/dl、約76.5±6iu/dl、約76.5±7iu/dl、約76.5±8iu/dl、約76.5±9iu/dl、約76.5±10iu/dl、約76.5±11iu/dl、約76.5±12iu/dl、約76.5±13iu/dl、約76.5±14iu/dl或約76.5±15iu/dl；

當施用約25iu/kg嵌合多肽時，如通過兩級(顯色)測定所測量，在所述受試者中的cmax_obs為約64.9-90.1iu/dl；

當施用約65iu/kg嵌合多肽時，如通過兩級(顯色)測定所測量，在所述受試者中的cmax_obs為約182iu/dl、約182±2iu/dl、約182±4iu/dl、約182±6iu/dl、約182±8iu/dl、約182±10iu/dl、約182±12iu/dl、約182±14iu/dl、約182±16iu/dl、約182±18iu/dl或約182±20iu/dl；或

當施用約65iu/kg嵌合多肽時，如通過兩級(顯色)測定所測量，在所述受試者中的cmax_obs為約146-227iu/dl、約146±5iu/dl、約146±10iu/dl、約227±5iu/dl或約146±10iu/dl。

在某些實施方案中，長效因子viii當施用于患者群體時具有一種或多種以下性質(zhì)：

當通過單級(aptt)測定或兩級(顯色)測定所測量時，在所述受試者中的t1/2β(活性)為施用相同量的由全長、成熟因子viii組成的多肽的受試者中的t1/2β(活性)的至少1.48、1.49、1.50、1.51、1.52、1.53、1.54、1.55、1.56、1.57、1.58、1.59、1.60、1.61、1.62、1.63、1.64、1.65、1.66、1.67、1.68、1.69、1.70、1.71、1.72、1.73、1.74、1.75、1.76、1.77、1.78、1.79、1.80、1.81、1.82、1.83、1.84、1.85、1.86、1.87、1.88、1.89或1.90倍高；

如通過單級(aptt)測定所測量，在所述受試者中的t1/2β(活性)為約18.8小時、18.8±1小時、18.8±1小時、18.8±2小時、18.8±3小時、18.8±4小時、18.8±5小時、18.8±6小時、18.8±7小時、18.8±8小時、18.8±9小時、18.8±10小時或18.8±11小時；

如通過單級(aptt)測定所測量，在所述受試者中的t1/2β(活性)為約14.3-24.5小時；

如通過兩級(顯色)測定所測量，在所述受試者中的t1/2β(活性)為約16.7小時、16.7±1小時、16.7±2小時、16.7±3小時、16.7±4小時、16.7±5小時、16.7±6小時、16.7±7小時、16.7±8小時、16.7±9小時、16.7±10小時或16.7±11小時；

如通過兩級(顯色)測定所測量，在所述受試者中的t1/2β(活性)為約13.8-20.1小時；

如通過兩級(顯色)測定所測量，在所述受試者中的t1/2β(活性)為約19.8小時、19.8±1小時、19.8±2小時、19.8±3小時、19.8±4小時、19.8±5小時、19.8±6小時、19.8±7小時、19.8±8小時、19.8±9小時、19.8±10小時或19.8±11小時；或

如通過兩級(顯色)測定所測量，在所述受試者中的t1/2β(活性)為約14.3-27.5小時。

在某些實施方案中，長效因子viii當施用于患者群體時具有一種或多種以下性質(zhì)：

當通過單級(aptt)測定或兩級(顯色)測定所測量時，在所述受試者中的清除率(cl)(活性)為施用相同量的由全長、成熟因子viii組成的多肽的受試者中的清除率的0.51、0.52、0.53、0.54、0.55、0.56、0.57、0.58、0.59、0.60、0.61、0.62、0.63、0.64、0.65、0.66、0.67、0.68、0.69或0.70倍低；

當施用約25iu/kg嵌合多肽時，如通過單級(aptt)測定所測量，在所述受試者中的清除率(cl)(活性)為約1.68ml/h/kg、1.68±0.1ml/h/kg、1.68±0.2ml/h/kg、1.68±0.3ml/h/kg、1.68±0.4ml/h/kg、1.68±0.5ml/h/kg、1.68±0.6ml/h/kg或1.68±0.7ml/h/kg；

當施用約25iu/kg嵌合多肽時，如通過單級(aptt)測定所測量，在所述受試者中的清除率(cl)(活性)為約1.31-2.15ml/h/kg；

當施用約65iu/kg嵌合多肽時，如通過單級(aptt)測定所測量，在所述受試者中的清除率(cl)(活性)為約2.32ml/h/kg、2.32±0.1ml/h/kg、2.32±0.2ml/h/kg、2.32±0.3ml/h/kg、2.32±0.4ml/h/kg、2.32±0.5ml/h/kg、2.32±0.6ml/h/kg或2.32±0.7ml/h/kg；

當施用約65iu/kg嵌合多肽時，如通過單級(aptt)測定所測量，在所述受試者中的清除率(cl)(活性)為約1.64-3.29ml/h/kg；

當施用約25iu/kg嵌合多肽時，如通過兩級(顯色)測定所測量，在所述受試者中的清除率(cl)(活性)為約1.49ml/h/kg、1.49±0.1ml/h/kg、1.49±0.2ml/h/kg、1.49±0.3ml/h/kg、1.49±0.4ml/h/kg、1.49±0.5ml/h/kg、1.49±0.6ml/h/kg或1.49±0.7ml/h/kg；

當施用約25iu/kg嵌合多肽時，如通過兩級(顯色)測定所測量，在所述受試者中的清除率(cl)(活性)為約1.16-1.92ml/h/kg；

當施用約65iu/kg嵌合多肽時，如通過兩級(顯色)測定所測量，在所述受試者中的清除率(cl)(活性)為約1.52ml/h/kg、1.52±0.1ml/h/kg、1.52±0.2ml/h/kg、1.52±0.3ml/h/kg、1.52±0.4ml/h/kg、1.52±0.5ml/h/kg、1.52±0.6ml/h/kg或1.52±0.7ml/h/kg；或

當施用約65iu/kg嵌合多肽時，如通過兩級(顯色)測定所測量，在所述受試者中的清除率(cl)(活性)為約1.05-2.20ml/h/kg。

在一些實施方案中，長效因子viii當施用于患者群體時具有一種或多種以下性質(zhì)：

當通過單級(aptt)測定或兩級(顯色)測定所測量時，在所述受試者中的mrt為施用相同量的由全長、成熟因子viii組成的多肽的受試者中的mrt的至少1.46、1.47、1.48、1.49、1.50、1.51、1.52、1.53、1.54、1.55、1.56、1.57、1.58、1.59、1.60、1.61、1.62、1.63、1.64、1.65、1.66、1.67、1.68、1.69、1.70、1.71、1.72、1.73、1.74、1.75、1.76、1.77、1.78、1.79、1.80、1.81、1.82、1.83、1.84、1.85、1.86、1.87、1.88、1.89、1.90、1.91、1.92或1.93倍高；

如通過單級(aptt)測定所測量，在所述受試者中的mrt(活性)為約27小時、27±1小時、27±2小時、27±3小時、27±4小時、27±5小時、27±6小時、27±7小時、27±8小時、27±9小時或27±10小時；

如通過單級(aptt)測定所測量，在所述受試者中的mrt(活性)為約20.6-35.3小時；

如通過兩級(顯色)測定所測量，在所述受試者中的mrt(活性)為約23.9-28.5小時；

如通過兩級(顯色)測定所測量，在所述受試者中的mrt(活性)為約19.8-28.9小時；或

如通過兩級(顯色)測定所測量，在所述受試者中的mrt(活性)為約20.5-39.6小時。

在其它實施方案中，長效因子viii當施用于患者群體時具有一種或多種以下性質(zhì)：

當通過單級(aptt)測定或兩級(顯色)測定測量時，在所述受試者中的增量回收率與施用相同量的由全長、成熟因子viii組成的多肽的受試者中的增量回收率相當；

當施用約25iu/kg嵌合多肽時，如通過單級(aptt)測定所測量，在所述受試者中的增量回收率為每iu/kg約2.44iu/dl、每iu/kg2.44±0.1iu/dl、每iu/kg2.44±0.2iu/dl、每iu/kg2.44±0.3iu/dl、每iu/kg2.44±0.4iu/dl、每iu/kg2.44±0.5iu/dl、每iu/kg2.44±0.6iu/dl、每iu/kg2.44±0.7iu/dl、每iu/kg2.44±0.8iu/dl、每iu/kg2.44±0.9iu/dl、每iu/kg2.44±1.0iu/dl、每iu/kg2.44±1.1iu/dl或每iu/kg2.44±1.2iu/dl；

當施用約25iu/kg嵌合多肽時，如通過單級(aptt)測定所測量，在所述受試者中的增量回收率為每iu/kg約2.12-2.81iu/dl；

當施用約65iu/kg嵌合多肽時，如通過單級(aptt)測定所測量，在所述受試者中的增量回收率為每iu/kg約1.83iu/dl、每iu/kg1.83±0.1iu/dl、每iu/kg1.83±0.2iu/dl、每iu/kg1.83±0.3iu/dl、每iu/kg1.83±0.4iu/dl、每iu/kg1.83±0.5iu/dl、每iu/kg1.83±0.6iu/dl、每iu/kg1.83±0.7iu/dl、每iu/kg1.83±0.8iu/dl、每iu/kg1.83±0.9iu/dl、每iu/kg1.83±1.0iu/dl或每iu/kg1.83±1.1iu/dl；

當施用約65iu/kg嵌合多肽時，如通過單級(aptt)測定所測量，在所述受試者中的增量回收率為每iu/kg約1.59-2.10iu/dl；

當施用約25iu/kg嵌合多肽時，如通過兩級(顯色)測定所測量，在所述受試者中的增量回收率為每iu/kg約3.09iu/dl、每iu/kg3.09±0.1iu/dl、每iu/kg3.09±0.2iu/dl、每iu/kg3.09±0.3iu/dl、每iu/kg3.09±0.4iu/dl、每iu/kg3.09±0.5iu/dl、每iu/kg3.09±0.6iu/dl、每iu/kg3.09±0.7iu/dl、每iu/kg3.09±0.8iu/dl、每iu/kg3.09±0.9iu/dl、每iu/kg3.09±1.0iu/dl、每iu/kg3.09±1.1iu/dl、每iu/kg3.09±1.2iu/dl或每iu/kg3.09±1.3iu/dl；

當施用約65iu/kg嵌合多肽時，如通過兩級(顯色)測定所測量，在所述受試者中的增量回收率為每iu/kg約2.80iu/dl、每iu/kg2.80±0.1iu/dl、每iu/kg2.80±0.2iu/dl、每iu/kg2.80±0.3iu/dl、每iu/kg2.80±0.4iu/dl、每iu/kg2.80±0.5iu/dl、每iu/kg2.80±0.6iu/dl、每iu/kg2.80±0.7iu/dl、每iu/kg2.80±0.8iu/dl、每iu/kg2.80±0.9iu/dl、每iu/kg2.80±1.0iu/dl、每iu/kg2.80±1.1iu/dl或每iu/kg2.80±1.2iu/dl；

當施用約25iu/kg嵌合多肽時，如通過兩級(顯色)測定所測量，在所述受試者中的增量回收率為每iu/kg約2.61-3.66iu/dl；或

當施用約65iu/kg嵌合多肽時，如通過兩級(顯色)測定所測量，在所述受試者中的增量回收率為每iu/kg約2.24-3.50iu/dl。

在其它實施方案中，長效因子viii當施用于患者群體時具有一種或多種以下性質(zhì)：

當通過單級(aptt)測定或兩級(顯色)測定測量時，在所述受試者中的vss(活性)與施用相同量的由全長、成熟因子viii組成的多肽的受試者中的vss(活性)相當；

當施用約25iu/kg嵌合多肽時，如通過單級(aptt)測定所測量，在所述受試者中的vss(活性)為約45.5ml/kg、45.5±1ml/kg、45.5±2ml/kg、45.5±3ml/kg、45.5±4ml/kg、45.5±5ml/kg、45.5±6ml/kg、45.5±7ml/kg、45.5±8ml/kg、45.5±9ml/kg、45.5±10ml/kg或45.5±11ml/kg；

當施用約25iu/kg嵌合多肽時，如通過單級(aptt)測定所測量，在所述受試者中的vss(活性)為約39.3-52.5ml/kg；

當施用約65iu/kg嵌合多肽時，如通過單級(aptt)測定所測量，在所述受試者中的vss(活性)為約62.8ml/kg、62.8±1ml/kg、62.8±2ml/kg、62.8±3ml/kg、62.8±4ml/kg、62.8±5ml/kg、62.8±6ml/kg、62.8±7ml/kg、62.8±8ml/kg、62.8±9ml/kg、62.8±10ml/kg、62.8±11ml/kg、62.8±12ml/kg、62.8±13ml/kg、62.8±14ml/kg、62.8±15ml/kg或62.8±16ml/kg；

當施用約65iu/kg嵌合多肽時，如通過單級(aptt)測定所測量，在所述受試者中的vss(活性)為約55.2-71.5ml/kg；

當施用約25iu/kg嵌合多肽時，如通過兩級(顯色)測定所測量，在所述受試者中的vss(活性)為約35.9ml/kg、35.9±1ml/kg、35.9±2ml/kg、35.9±3ml/kg、35.9±4ml/kg、35.9±5ml/kg、35.9±6ml/kg、35.9±7ml/kg、35.9±8ml/kg、35.9±9ml/kg、35.9±10ml/kg、35.9±11ml/kg、35.9±12ml/kg或35.9±13ml/kg；

當施用約25iu/kg嵌合多肽時，如通過兩級(顯色)測定所測量，在所述受試者中的vss(活性)為約30.4-42.3ml/kg；

當施用約65iu/kg嵌合多肽時，如通過兩級(顯色)測定所測量，在所述受試者中的vss(活性)為約43.4ml/kg、43.4±1ml/kg、43.4±2ml/kg、43.4±3ml/kg、43.4±4ml/kg、43.4±5ml/kg、43.4±6ml/kg、43.4±7ml/kg、43.4±8ml/kg、43.4±9ml/kg、43.4±10ml/kg、43.4±11ml/kg、43.4±12ml/kg、43.4±13ml/kg、43.4±14ml/kg、43.4±15ml/kg或43.4±16ml/kg；或

當施用約65iu/kg嵌合多肽時，如通過兩級(顯色)測定所測量，在所述受試者中的vss(活性)為約38.2-49.2ml/kg。

在其它實施方案中，長效因子viii當施用于患者群體時具有一種或多種以下性質(zhì)：

當通過單級(aptt)測定或兩級(顯色)測定所測量時，在所述受試者中的aucinf為施用相同量的由全長、成熟因子viii組成的多肽的受試者中的aucinf的至少1.45、1.46、1.47、1.48、1.49、1.50、1.51、1.52、1.53、1.54、1.55、1.56、1.57、1.58、1.59、1.60、1.61、1.62、1.63、1.64、1.65、1.66、1.67、1.68、1.69、1.70、1.71、1.72、1.73、1.74、1.75、1.76、1.77、1.78、1.79、1.80、1.81、1.82、1.83、1.84、1.85、1.86、1.87、1.88、1.89、1.90倍高；

當施用約25iu/kg嵌合多肽時，如通過單級(aptt)測定所測量，在所述受試者中的aucinf為每iu/kg約1440±316hr*iu/dl；

當施用約25iu/kg嵌合多肽時，如通過單級(aptt)測定所測量，在所述受試者中的aucinf為每iu/kg約1160-1880hr*iu/dl；

當施用約25iu/kg嵌合多肽時，如通過單級(aptt)測定所測量，在所述受試者中的aucinf為每iu/kg約1480hr*iu/dl、每iu/kg1480±100hr*iu/dl、每iu/kg1480±200hr*iu/dl、每iu/kg1480±300hr*iu/dl、每iu/kg1480±400hr*iu/dl、每iu/kg1480±500hr*iu/dl、每iu/kg1480±600hr*iu/dl、每iu/kg1480±700hr*iu/dl、每iu/kg1480±800hr*iu/dl、每iu/kg1480±900hr*iu/dl或每iu/kg1480±1000hr*iu/dl；

當施用約65iu/kg嵌合多肽時，如通過單級(aptt)測定所測量，在所述受試者中的aucinf為每iu/kg約2910±1320hr*iu/dl；

當施用約65iu/kg嵌合多肽時，如通過單級(aptt)測定所測量，在所述受試者中的aucinf為每iu/kg約1980-3970hr*iu/dl；

當施用約65iu/kg嵌合多肽時，如通過單級(aptt)測定所測量，在所述受試者中的aucinf為每iu/kg約2800hr*iu/dl、每iu/kg2800±100hr*iu/dl、每iu/kg2800±200hr*iu/dl、每iu/kg2800±300hr*iu/dl、每iu/kg2800±400hr*iu/dl、每iu/kg2800±500hr*iu/dl、每iu/kg2800±600hr*iu/dl、每iu/kg2800±700hr*iu/dl、每iu/kg2800±800hr*iu/dl、每iu/kg2800±900hr*iu/dl或每iu/kg2800±1000hr*iu/dl；

當施用約25iu/kg嵌合多肽時，如通過兩級(顯色)測定所測量，在所述受試者中的aucinf為每iu/kg約1660hr*iu/dl、每iu/kg1660±100hr*iu/dl、每iu/kg1660±200hr*iu/dl、每iu/kg1660±300hr*iu/dl、每iu/kg1660±400hr*iu/dl、每iu/kg1660±500hr*iu/dl、每iu/kg1660±600hr*iu/dl、每iu/kg1660±700hr*iu/dl、每iu/kg1660±800hr*iu/dl、每iu/kg1660±900hr*iu/dl或每iu/kg1660±1000hr*iu/dl；

當施用約25iu/kg嵌合多肽時，如通過兩級(顯色)測定所測量，在所述受試者中的aucinf為每iu/kg約1300-2120hr*iu/dl；

當施用約65iu/kg嵌合多肽時，如通過兩級(顯色)測定所測量，在所述受試者中的aucinf為每iu/kg約4280hr*iu/dl、每iu/kg4280±100hr*iu/dl、每iu/kg4280±200hr*iu/dl、每iu/kg4280±300hr*iu/dl、每iu/kg4280±400hr*iu/dl、每iu/kg4280±500hr*iu/dl、每iu/kg4280±600hr*iu/dl、每iu/kg4280±700hr*iu/dl、每iu/kg4280±800hr*iu/dl、每iu/kg4280±900hr*iu/dl、每iu/kg4280±1000hr*iu/dl、每iu/kg4280±1100hr*iu/dl、每iu/kg4280±1200hr*iu/dl、每iu/kg4280±1300hr*iu/dl、每iu/kg4280±1400hr*iu/dl、每iu/kg4280±1500hr*iu/dl或每iu/kg4280±1600hr*iu/dl；或

當施用約65iu/kg嵌合多肽時，如通過兩級(顯色)測定所測量，在所述受試者中的aucinf為每iu/kg約2960-6190hr*iu/dl。

如本文所用，“按需治療”意指意圖在短時程內(nèi)進行且響應(yīng)于現(xiàn)有病狀(如出血事件)或認為需要(如計劃手術(shù))的治療。可能需要按需治療的病狀包括例如出血事件、關(guān)節(jié)積血、肌肉出血、口腔出血、流血、肌肉內(nèi)流血、口腔流血、創(chuàng)傷、頭部創(chuàng)傷、胃腸出血、顱內(nèi)流血、腹內(nèi)流血、胸內(nèi)流血、骨折、中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血、咽后間隙出血、腹膜后間隙出血或髂腰肌鞘出血。受試者可能需要手術(shù)預(yù)防、圍手術(shù)期管理或用于手術(shù)的治療。所述手術(shù)包括例如小手術(shù)、大手術(shù)、拔牙、扁桃體切除術(shù)、腹股溝疝氣切開術(shù)、滑膜切除術(shù)、全膝置換、開顱術(shù)、骨縫合術(shù)、創(chuàng)傷外科手術(shù)、顱內(nèi)手術(shù)、腹內(nèi)手術(shù)、胸內(nèi)手術(shù)或關(guān)節(jié)置換手術(shù)。

在一個實施方案中，按需治療在單一劑量中消退多于80％(多于80％、多于81％、多于82％、多于83％、多于84％、多于85％、多于86％、多于87％、多于88％、多于89％、多于90％、多于91％、多于92％、多于93％、多于94％、多于95％、多于96％、多于97％、多于98％、多于99％或100％)或80-100％、80-90％、85-90％、90-100％、90-95％或95-100％的出血(例如自發(fā)性出血)。在另一實施方案中，在按需治療后多于80％(多于81％、多于82％、多于83％、多于84％、多于85％、多于86％、多于87％、多于88％、多于89％、多于90％、多于91％、多于92％、多于93％、多于94％、多于95％、多于96％、多于97％、多于98％或100％)或80-100％、80-90％、85-90％、90-100％、90-95％或95-100％的出血事件由醫(yī)師評級為優(yōu)良或良好。在其它實施方案中，在按需治療后多于5％(多于6％、多于7％、多于8％、多于9％、多于10％、多于11％、多于12％、多于13％、多于14％、多于15％、多于16％、多于17％、多于18％、多于19％、多于20％)或5-20％、5-15％、5-10％、10-20％或10-15％的出血事件由醫(yī)師評級為合格。

“多肽”、“肽”及“蛋白質(zhì)”可互換使用且指的是由共價連接的氨基酸殘基構(gòu)成的聚合化合物。

“多核苷酸”與“核酸”可互換使用且指的是由共價連接的核苷酸殘基構(gòu)成的聚合化合物。多核苷酸可為dna、cdna、rna、單鏈或雙鏈、載體、質(zhì)粒、噬菌體或病毒。多核苷酸包括例如表1中的那些多核苷酸，其編碼表2的多肽(參見表1)。多核苷酸還包括例如表1的多核苷酸的片段，例如編碼表2的多肽的片段的那些，所述多肽片段為如因子viii、fc、信號序列、6his及表2的多肽的其它片段。

如本文所用，“預(yù)防性治療”意指經(jīng)歷一定時程向受試者以多個劑量施用因子viii多肽以增加受試者血漿中因子viii活性的水平。增加的水平可足以降低自發(fā)性出血的發(fā)生率或預(yù)防出血，例如在不可預(yù)見的損傷事件中。在預(yù)防性治療期間，受試者體內(nèi)的血漿蛋白水平可能并不下降低于所述受試者的基線水平，或低于表征重度血友病的因子viii水平(<1iu/dl[1％])。

在一個實施方案中，預(yù)防方案是根據(jù)單個患者例如通過測定各患者的pk數(shù)據(jù)且以維持1-3％fviii活性的谷水平的給藥間隔施用本發(fā)明因子viii來“定制”?？稍谑茉囌呓?jīng)歷不可接受的出血事件(定義為在連續(xù)兩個月的時間內(nèi)≥2次自發(fā)性出血事件)時進行調(diào)整。在此情況下，調(diào)整的目標為3-5％的谷水平。在另一實施方案中，預(yù)防性治療使得出血得到預(yù)防和控制、出血得到持續(xù)控制、持續(xù)防止出血和/或持續(xù)益處。預(yù)防(例如持續(xù)保護)可由相比于短效fviii而言至最后測量的時間點的auc(auc-last)增加及清除率降低，從而使得終末t1/2增加得以證明。預(yù)防可由相比于短效fviii而言cmax更佳、tmax更佳和/或平均滯留時間更長得以證明。在一些實施方案中，預(yù)防使得在注射(例如最后一次注射)后約24小時、36小時、48小時、72小時或96小時(例如25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、96、87、88、89、90、91、92、93、94、95或96小時)內(nèi)無自發(fā)性出血事件。在某些實施方案中，預(yù)防使得在每周一次給藥(例如65iu/kg)的情況下每年的出血事件平均減少多于30％(例如多于31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、96、87、88、89或90％，例如多于50％)。如本文所用，“治療劑量”意指達成如本文所述的治療目標的劑量。因子viii的所需劑量的計算是基于根據(jù)經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)每公斤體重1iu的因子viii平均使血漿因子viii活性升高約2iu/dl。所需劑量使用下式來確定：

所需單位＝體重(kg)×所要因子viii升高(iu/dl或正常值的％)×0.5(每iu/dl的iu/kg數(shù))

可用于本發(fā)明方法中的治療劑量為約10-100iu/kg，更特定來說為10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或90-100iu/kg，且更特定來說為10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100iu/kg。

可用于本發(fā)明方法中的其它治療劑量為約10至約150iu/kg，更特定來說為約100-110、110-120、120-130、130-140、140-150iu/kg，且更特定來說為約110、115、120、125、130、135、140、145或150iu/kg。

如本文所用，“變體”是指不同于原始多核苷酸或多肽，但保留其基本性質(zhì)(例如因子viii凝血活性或fc(fcrn結(jié)合)活性)的多核苷酸或多肽。一般來說，變體總體上接近類似，且在許多區(qū)中與原始多核苷酸或多肽同一。變體包括例如多肽及多核苷酸片段、缺失、插入及原始多肽的修飾型式。

變異多核苷酸可包含以下或者由以下組成：與例如seqidno:1、3或5中的核苷酸編碼序列(個別地或一起的因子viii部分、fc部分)或其互補鏈至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一的核苷酸序列、已知突變體及重組因子viii或fc(如本文引用的公布及專利中所公開的那些)的核苷酸編碼序列或其互補鏈、編碼seqidno:2、4或6的多肽(個別地或一起的因子viii部分、fc部分)的核苷酸序列，和/或這些核酸分子中任一個的多核苷酸片段(例如本文所述的那些片段)。還包括在嚴格雜合條件或較低嚴格度條件下與這些核酸分子雜合的多核苷酸作為變體，由這些多核苷酸編碼的多肽也是如此，只要其具功能性即可。

變異多肽可包含以下或者由以下組成：與例如seqidno:2、4或6中所示的多肽序列(個別地或一起的因子viii部分、fc部分)至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一的氨基酸序列，和/或這些多肽中任一個的多肽片段(例如本文所述的那些片段)。

至于具有與參考核苷酸序列至少例如95％“同一”的核苷酸序列的核酸，旨在除所述核酸的核苷酸序列可在每100個參考核苷酸序列的核苷酸中包括至多五個點突變外，所述核苷酸序列與參考序列同一。換句話說，為獲得具有與參考核苷酸序列至少95％同一的核苷酸序列的核酸，參考序列中的至多5％核苷酸可缺失或取代為另一核苷酸，或數(shù)目為參考序列中總核苷酸的至多5％的核苷酸可插入?yún)⒖夹蛄兄小２樵冃蛄锌蔀槔鐂eqidno:1或3中所示的完整序列、orf(開放閱讀框)或如本文所述指定的任何片段。

實際上，任何具體核酸分子或多肽是否與本發(fā)明的核苷酸序列或多肽至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一可使用已知的計算機程序常規(guī)地確定。在一個實施方案中，用于確定查詢序列(參考或原始序列)與主題序列之間的最佳總體匹配的方法(又稱為全面序列比對)可使用基于brutlag等,comp.app.biosci.6:237-245(1990)的算法的fastdb計算機程序確定，所述文獻以引用的方式整體并入本文。在序列比對中，查詢及主題序列均為dna序列。rna序列可通過將u轉(zhuǎn)化為t來進行比較。所述全面序列比對的結(jié)果為同一性百分比。在另一實施方案中，dna序列的fastdb比對中用于計算同一性百分比的參數(shù)為：矩陣＝單一，k-元組＝4，錯配罰分＝1，連接罰分＝30，隨機化組長度＝0，截止計分＝1，缺口罰分＝5，缺口大小罰分0.05，窗口大小＝500或主題核苷酸序列長度中的較短者。

如果主題序列由于5’或3’缺失而非由于內(nèi)部缺失而比查詢序列短，那么須對結(jié)果進行人工校正。這是因為fastdb程序在計算同一性百分比時不計入主題序列的5’及3’截短。對于相對于查詢序列在5’或3’端截短的主題序列，通過將位于主題序列的5’及3’的不匹配/對準的查詢序列的堿基數(shù)目計算為查詢序列總堿基的百分比來校正同一性百分比。核苷酸是否匹配/對準由fastdb序列比對的結(jié)果確定。接著將此百分比從通過上述fastdb程序使用指定參數(shù)計算的同一性百分比中扣除以獲得最終同一性百分比計分。此校正的計分為用于本發(fā)明目的的計分。僅計算未與查詢序列匹配/對準的如由fastdb比對所展示位于主題序列5’及3’堿基外部的堿基用于人工調(diào)整同一性百分比計分的目的。

舉例來說，將90個堿基的主題序列與100個堿基的查詢序列比對以確定同一性百分比。缺失發(fā)生于主題序列的5’端且因此fastdb比對不顯示5’端前10個堿基的匹配/對準。所述10個未配對堿基占序列的10％(位于5’及3’端的不匹配堿基的數(shù)目/查詢序列中堿基的總數(shù))，因此將10％從由fastdb程序計算的同一性百分比計分中扣除。如果剩余90個堿基完全匹配，那么最終同一性百分比將為90％。在另一實施例中，將90個堿基的主題序列與100個堿基的查詢序列比較。此時缺失為內(nèi)部缺失，因此在主題序列的5’或3’處不存在不與查詢序列匹配/對準的堿基。在此情況下，不對由fastdb計算的同一性百分比進行人工校正。再次，僅人工校正不與查詢序列匹配/對準的主題序列的5’及3’的堿基。出于本發(fā)明的目的，不進行其它人工校正。

至于具有與本發(fā)明的查詢氨基酸序列至少例如95％“同一”的氨基酸序列的多肽，旨在除主題多肽序列可在每100個查詢氨基酸序列的氨基酸中包括至多五個氨基酸改變外，主題多肽的氨基酸序列與查詢序列同一。換句話來說，為獲得具有與查詢氨基酸序列至少95％同一的氨基酸序列的多肽，主題序列中的至多5％的氨基酸殘基可插入、缺失(插入/缺失)或取代為另一氨基酸。參考序列的這些改變可發(fā)生于參考氨基酸序列的氨基或羧基端位置或那些末端位置之間個別地散布于參考序列中的殘基之間或以一個或多個連續(xù)群組散布于參考序列內(nèi)的任何位置。

實際上，任何具體多肽是否與例如seqidno:2(個別地或一起的因子viii部分、fc部分)或4或已知因子viii或fc多肽序列的氨基酸序列至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一可使用已知計算機程序常規(guī)地確定。在一個實施方案中，用于確定查詢序列(參考或原始序列)與主題序列之間的最佳總體匹配的方法(又稱為全面序列比對)可使用基于brutlag等,comp.app.biosci.6:237-245(1990)的算法的fastdb計算機程序確定，所述文獻以引用的方式整體并入本文。在序列比對中，查詢序列與主題序列均為核苷酸序列或均為氨基酸序列。所述全面序列比對的結(jié)果為同一性百分比。在另一實施方案中，fastdb氨基酸比對中所用的參數(shù)為：矩陣＝pam0，k-元組＝2，錯配罰分＝1，連接罰分＝20，隨機化組長度＝0，截止計分＝1，窗口大?。叫蛄虚L度，缺口罰分＝5，缺口大小罰分＝0.05，窗口大?。?00或主題氨基酸序列長度中的較短者。

如果主題序列由于n或c端缺失而非由于內(nèi)部缺失而比查詢序列短，那么須對結(jié)果進行人工校正。這是因為fastdb程序在計算全面同一性百分比時不計入主題序列的n及c端截短。對于相對于查詢序列在n或c端截短的主題序列，通過將位于主題序列的n及c端的與相應(yīng)主題殘基不匹配/對準的查詢序列的殘基數(shù)目計算為查詢序列總堿基的百分比來校正同一性百分比。殘基是否匹配/對準由fastdb序列比對的結(jié)果確定。接著將此百分比從通過上述fastdb程序使用指定參數(shù)計算的同一性百分比中扣除以獲得最終同一性百分比計分。此最終同一性百分比計分為用于本發(fā)明目的的計分。僅考慮位于主題序列n及c端的與查詢序列不匹配/對準的殘基用于人工調(diào)整同一性百分比計分的目的。即，僅查詢殘基位于主題序列的最遠n及c端殘基以外。

舉例來說，將90個氨基酸殘基的主題序列與100個殘基的查詢序列比對以確定同一性百分比。缺失發(fā)生于主題序列的n端且因此fastdb比對不顯示n端前10個殘基的匹配/對準。所述10個未配對殘基占序列的10％(位于n及c端的不匹配殘基的數(shù)目/查詢序列中殘基的總數(shù))，因此將10％從由fastdb程序計算的同一性百分比計分中扣除。如果剩余90個殘基完全匹配，那么最終同一性百分比將為90％。在另一實施例中，將90個殘基的主題序列與100個殘基的查詢序列比較。此時缺失為內(nèi)部缺失，因此在主題序列的n或c端不存在不與查詢序列匹配/對準的殘基。在此情況下，不對由fastdb計算的同一性百分比進行人工校正。再次，僅人工校正不與查詢序列匹配/對準的如fastdb比對中所展示的主題序列n及c端以外的殘基位置。出于本發(fā)明的目的，不進行其它人工校正。

多核苷酸變體可在編碼區(qū)、非編碼區(qū)或兩者中含有改變。在一個實施方案中，多核苷酸變體含有產(chǎn)生沉默取代、添加或缺失，但不改變所編碼多肽的性質(zhì)或活性的改變。在另一實施方案中，核苷酸變體由于遺傳密碼的簡并性而由沉默取代產(chǎn)生。在其它實施方案中，在變體中，5-10、1-5或1-2個氨基酸以任何組合取代、缺失或添加。多核苷酸變體可出于多種原因而產(chǎn)生，例如以針對具體宿主來優(yōu)化密碼子表達(將人類mrna中密碼子改變?yōu)槠渌?，例如細菌宿主，如大腸桿菌(e.coli))。

天然存在的變體被稱為“等位基因變體”，且指的是占據(jù)生物體染色體上給定基因座的基因的若干種替代形式的一種(genesii,lewin,b.編,johnwiley&sons,newyork(1985))。這些等位基因變體可在多核苷酸和/或多肽水平上不同且包括于本發(fā)明中?；蛘撸赏ㄟ^誘變技術(shù)或直接合成產(chǎn)生非天然存在的變體。

使用蛋白質(zhì)改造和重組dna技術(shù)的已知方法，可生成變體以改進或改變多肽的特征。舉例來說，可在不實質(zhì)性損失生物功能的情況下從分泌的蛋白的n端或c端缺失一個或多個氨基酸。ron等,j.biol.chem.268:2984-2988(1993)(以引用的方式整體并入本文)報道甚至在缺失3、8或27個氨基端氨基酸殘基后仍具有發(fā)夾結(jié)合活性的變異的kgf蛋白。類似地，干擾素γ在從這個蛋白的羧基端缺失8-10個氨基酸殘基后顯示高達十倍高的活性。(dobeli等,j.biotechnology7:199-216(1988)，以引用的方式整體并入本文)。

此外，大量證據(jù)證明變體經(jīng)常保留與天然存在的蛋白質(zhì)的生物活性類似的生物活性。舉例來說，gayle與合作者(j.biol.chem268:22105-22111(1993)，以引用的方式整體并入本文)對人類細胞激素il-1a進行了廣泛的突變分析。他們使用隨機誘變以生成超過3,500種單個il-1a突變體，所述突變體在分子的整個長度上平均每個變體具有2.5個氨基酸變化。在每個可能的氨基酸位置處檢查了多種突變。研究者發(fā)現(xiàn)“可在對[結(jié)合或生物活性]的影響極小的情況下改變[大部分]分子”。(參見摘要)。實際上，在所檢查的超過3,500種核苷酸序列中，僅23種獨特氨基酸序列產(chǎn)生了活性與野生型顯著不同的蛋白質(zhì)。

如上文所述，多肽變體包括例如修飾的多肽。修飾包括例如乙酰化、酰化、adp核糖基化、酰胺化、共價連接黃素、共價連接血紅素部分、共價連接核苷酸或核苷酸衍生物、共價連接脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物、共價連接磷脂酰肌醇、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、去甲基化、形成共價交聯(lián)、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲?；?、γ-羧基化、糖基化、gpi錨形成、羥基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化(mei等,blood116:270-79(2010)，其以引用的方式整體并入本文)、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移rna介導(dǎo)的氨基酸添加，如精氨?；?，及泛素化。在一些實施方案中，因子viii在任何適宜位置處被修飾(例如聚乙二醇化)。在一些實施方案中，因子viii在因子viii的表面暴露氨基酸(例如表面暴露半胱氨酸，其可為改造的半胱氨酸)上被聚乙二醇化。同上。在一些實施方案中，修飾的因子viii(例如聚乙二醇化的因子viii)為長效因子viii。

如本文所用，“穩(wěn)態(tài)下的分布體積(vss)”具有與藥理學中所用的術(shù)語相同的含義，其為藥物分布進入的表觀空間(體積)。vss＝體內(nèi)藥物的量除以穩(wěn)態(tài)下的血漿濃度。

如本文關(guān)于范圍所用，“約”修飾范圍的兩端。因此，“約10-20”意指“約10至約20”。

本文所用的嵌合多肽可包含加工過的因子viii或單鏈因子viii或其組合。如本文所用，“加工過的因子viii”意指已在精氨酸1648(對于全長因子viii)或精氨酸754(對于b結(jié)構(gòu)域缺失的因子viii)(即細胞內(nèi)加工位點)處裂解的因子viii。由于在細胞內(nèi)加工位點處的裂解，因此加工過的因子viii包含兩條多肽鏈，第一鏈為重鏈且第二鏈為輕鏈。舉例來說，加工過的因子viii-fc融合蛋白(即重鏈及輕鏈融合于fc)在非還原性sds-page上分別跑膠至約90kda及130kda且在還原性sds-page上分別跑膠至90kda及105kda。因此，在一個實施方案中，嵌合多肽中因子viii部分的至少約50％、約60％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％為加工過的因子viii。在另一實施方案中，嵌合多肽中因子viii部分的約50％、約60％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％為加工過的因子viii。在一個具體實施方案中，從包含單鏈因子viii的嵌合多肽純化(或分離)包含加工過的因子viii的嵌合多肽，且嵌合多肽中因子viii部分的至少約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％為加工過的因子viii。

如本文所用，“單鏈因子viii”、“sc因子viii”或“scfviii”意指尚未在精氨酸位點(對于全長因子viii來說為殘基1648(即seqidno:6的殘基1667)或?qū)τ赽結(jié)構(gòu)域缺失的因子viii來說為殘基754(即seqidno:2的殘基773))處裂解的因子viii。因此，本文所用的嵌合多肽中的單鏈因子viii包含單鏈。在一個實施方案中，單鏈因子viii含有完整的細胞內(nèi)加工位點。在另一實施方案中，本發(fā)明的單鏈因子viii包含對應(yīng)于精氨酸1645的氨基酸位置處的取代或突變、對應(yīng)于精氨酸1648的氨基酸位置處的取代或突變、或?qū)?yīng)于全長因子viii中精氨酸1645與精氨酸1648的氨基酸位置處的取代或突變。在其它實施方案中，在對應(yīng)于精氨酸1645的氨基酸位置處取代的氨基酸為與在對應(yīng)于精氨酸1648的氨基酸位置處取代的氨基酸不同的氨基酸。在某些實施方案中，取代或突變?yōu)槌彼嵋酝獾陌被?，例如異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、硒半胱氨酸、絲氨酸、酪氨酸、組氨酸、鳥氨酸、吡咯賴氨酸或?；撬帷捂溡蜃觱iii-fc融合蛋白可在非還原性sds-page上跑膠至約220kda且在還原性sds-page上跑膠至約195kda。

在一個實施方案中，從包含加工過的因子viii的嵌合多肽中純化(或分離)包含單鏈因子viii的嵌合多肽，且本文所用嵌合多肽的因子viii部分的至少約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約99％或約100％為單鏈因子viii。在另一實施方案中，嵌合多肽的因子viii部分的至少約1％、約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％或約35％為單鏈因子viii。在其它實施方案中，本文所用嵌合多肽的因子viii部分的約1％-約10％、約5％-約15％、約10％-約20％、約15％-約25％、約20％-約30％、約25％-約35％、約30％-約40％為單鏈因子viii。在一個具體實施方案中，本文所用嵌合多肽的因子viii部分的約1％、約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％為單鏈因子viii。在其它實施方案中，本文所用嵌合多肽的因子viii部分的約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約100％為單鏈因子viii。在一些實施方案中，嵌合多肽的單鏈因子viii與加工過的因子viii的比率為(a)約25％單鏈因子viii與約75％加工過的因子viii；(b)約20％單鏈因子viii與約80％加工過的因子viii；(c)約15％單鏈因子viii與約85％加工過的因子viii；(d)約10％單鏈因子viii與約90％加工過的因子viii；(e)約5％單鏈因子viii與約95％加工過的因子viii；(f)約1％單鏈因子viii與約99％加工過的因子viii；(g)約100％加工過的因子viii；(h)約30％單鏈因子viii與約70％加工過的因子viii；(i)約35％單鏈因子viii與約65％加工過的因子viii；或(j)約40％單鏈因子viii與約60％加工過的因子viii。在其它實施方案中，嵌合多肽的單鏈因子viii與加工過的因子viii的比率為(a)約30％單鏈因子viii與約70％加工過的因子viii；(b)約40％單鏈因子viii與約60％加工過的因子viii；(c)約50％單鏈因子viii與約50％加工過的因子viii；(d)約60％單鏈因子viii與約40％加工過的因子viii；(e)約70％單鏈因子viii與約30％加工過的因子viii；(f)約80％單鏈因子viii與約20％加工過的因子viii；(g)約90％單鏈因子viii與約10％加工過的因子viii；(h)約95％單鏈因子viii與約5％加工過的因子viii；(i)約99％單鏈因子viii與約1％加工過的因子viii；或(j)約100％單鏈因子viii。

本文所用嵌合多肽中的因子viii部分具有因子viii活性。因子viii活性可通過本領(lǐng)域中的任何已知方法測量。舉例來說，那些方法中的一種可為顯色測定。顯色測定機制是基于凝血級聯(lián)的原理，其中活化的因子viii加速在活化因子ix、磷脂及鈣離子存在下因子x向因子xa的轉(zhuǎn)化。因子xa活性是通過對因子xa具有特異性的對硝基酰苯胺(pna)底物的水解來評估。在405nm下測得的對硝基苯胺的初始釋放速率與因子xa活性正相關(guān)且因此與樣品中的因子viii活性正相關(guān)。顯色測定由國際血栓癥及止血協(xié)會(internationalsocietyonthrombosisandhemostatsis；isth)的科學標準化委員會(scientificandstandardizationcommittee；ssc)的因子viii與因子ix下屬委員會(factorviiiandfactorixsubcommittee)推薦。自1994年以來，顯色測定還已成為歐洲藥典關(guān)于fviii濃縮物效能指定的參考方法。因此，在一個實施方案中，當通過顯色測定體外測量因子viii活性時，包含單鏈因子viii的嵌合多肽具有與包含加工過的因子viii的嵌合多肽(例如基本上由或由兩個fc部分與加工過的因子viii組成的嵌合多肽，其中所述加工過的因子viii融合于所述兩個fc部分中的一個)相當?shù)囊蜃觱iii活性。

在另一實施方案中，本發(fā)明的包含單鏈因子viii的嵌合多肽具有與包含加工過的因子viii的嵌合多肽(例如基本上由或由兩個fc部分及加工過的因子viii組成的嵌合多肽，其中加工過的因子viii融合于所述兩個fc部分中的一個fc)相當?shù)囊蜃觴a產(chǎn)生速率。

為將因子x活化為因子xa，活化的因子ix(因子ixa)在ca2+、膜磷脂及因子viii輔因子存在下將因子x中的一個精氨酸-異亮氨酸鍵水解以形成因子xa。因此，因子viii與因子ix的相互作用為凝血途徑中的關(guān)鍵。在某些實施方案中，包含單鏈因子viii的嵌合多肽可以與包含加工過的因子viii的嵌合多肽(例如基本上由或由兩個fc部分及加工過的因子viii組成的嵌合多肽，其中加工過的因子viii融合于所述兩個fc部分中的一個fc)相當?shù)乃俾逝c因子ixa相互作用。

另外，因子viii當在循環(huán)中呈非活性時結(jié)合于馮·維勒布蘭德因子。因子viii在未結(jié)合于vwf時快速降解且通過凝血酶的作用而從vwf釋放。在一些實施方案中，包含單鏈因子viii的嵌合多肽可以與包含加工過的因子viii的嵌合多肽(例如基本上由或由兩個fc部分及加工過的因子viii組成的嵌合多肽，其中加工過的因子viii融合于所述兩個fc部分中的一個fc)相當?shù)某潭冉Y(jié)合于馮·維勒布蘭德因子。

因子viii可由活化的蛋白c在鈣及磷脂存在下滅活。活化的蛋白c在a1結(jié)構(gòu)域中精氨酸336后方裂解因子viii重鏈，這破壞了因子x底物相互作用位點，且在a2結(jié)構(gòu)域中精氨酸562后方裂解，這增強了a2結(jié)構(gòu)域的解離并且破壞與因子ixa的相互作用位點。此裂解還將a2結(jié)構(gòu)域(43kda)平分且產(chǎn)生a2-n(18kda)和a2-c(25kda)結(jié)構(gòu)域。因此，活化的蛋白c可催化重鏈中的多個裂解位點。在一個實施方案中，包含單鏈因子viii的嵌合多肽可以與包含加工過的因子viii的嵌合多肽(例如基本上由或由兩個fc部分及加工過的因子viii組成的嵌合多肽，其中加工過的因子viii融合于所述兩個fc部分中的一個fc)相當?shù)某潭扔苫罨牡鞍譪滅活。

在其它實施方案中，包含單鏈因子viii的嵌合多肽在體內(nèi)具有與包含加工過的因子viii的嵌合多肽(例如基本上由或由兩個fc部分及加工過的因子viii組成的嵌合多肽，其中加工過的因子viii融合于所述兩個fc部分中的一個fc)相當?shù)囊蜃觱iii活性。在一個具體實施方案中，在hema小鼠尾靜脈橫斷模型中，包含單鏈因子viii的嵌合多肽能夠以與包含加工過的因子viii的嵌合多肽(例如基本上由或由兩個fc部分及加工過的因子viii組成的嵌合多肽，其中所述加工過的因子viii融合于所述兩個fc部分中的一個fc)相當?shù)某潭缺Ｗohema小鼠。

如本文所用的術(shù)語“相當”意指通過使用嵌合多肽產(chǎn)生的比較速率或水平等于、大致上等于或類似于參考速率或水平。如本文所用的術(shù)語“類似”意指比較速率或水平與參考速率或水平(例如基本上由或由兩個fc部分及加工過的因子viii組成的嵌合多肽的fxa產(chǎn)生速率，其中所述加工過的因子viii融合于所述兩個fc部分中的一個fc)的差異不超過10％或不超過15％。術(shù)語“大致上相等”意指比較速率或水平與參考速率或水平的差異不超過0.01％、0.5％或1％。

本發(fā)明進一步包括包含具有因子viii活性的嵌合多肽的組合物，其中至少約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約85％、約90％、約95％或約99％的嵌合多肽包含為單鏈因子viii的因子viii部分及第二部分。在另一實施方案中，組合物中嵌合多肽的約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％或約99％為單鏈因子viii。在其它實施方案中，第二部分為fc、xten、白蛋白、pas序列、轉(zhuǎn)鐵蛋白、ctp(具有4個o-聚糖的hcg的28個氨基酸的c端肽(ctp))、聚乙二醇(peg)、羥乙基淀粉(hes)、白蛋白結(jié)合多肽、白蛋白結(jié)合小分子或其兩個或兩個以上組合。在其它實施方案中，本發(fā)明的組合物包含含加工過的因子viii的嵌合多肽與含單鏈因子viii的嵌合多肽的組合，(a)其中嵌合多肽的約30％因子viii部分為單鏈因子viii，且嵌合多肽的約70％因子viii部分為加工過的因子viii；(b)其中嵌合多肽的約40％因子viii部分為單鏈因子viii且嵌合多肽的約60％因子viii部分為加工過的因子viii；(c)其中嵌合多肽的約50％因子viii部分為單鏈因子viii且嵌合多肽的約50％因子viii部分為加工過的因子viii；(d)其中嵌合多肽的約60％因子viii部分為單鏈因子viii且嵌合多肽的約40％因子viii部分為加工過的因子viii；(e)其中嵌合多肽的約70％因子viii部分為單鏈因子viii且嵌合多肽的約30％因子viii部分為加工過的因子viii；(f)其中嵌合多肽的約80％因子viii部分為單鏈因子viii且嵌合多肽的約20％因子viii部分為加工過的因子viii；(g)其中嵌合多肽的約90％因子viii部分為單鏈因子viii且嵌合多肽的約10％因子viii部分為加工過的因子viii；(h)其中嵌合多肽的約95％因子viii部分為單鏈因子viii且嵌合多肽的約5％因子viii部分為加工過的因子viii；(i)其中嵌合多肽的約99％因子viii部分為單鏈因子viii且嵌合多肽的約1％因子viii部分為加工過的因子viii；或(j)其中嵌合多肽的約100％因子viii部分為單鏈因子viii。

在某些實施方案中，當通過顯色測定體外測量因子viii活性時，本發(fā)明的組合物具有與包含加工過的因子viii的組合物(例如包含基本上由或由兩個fc部分與加工過的因子viii組成的嵌合多肽的組合物，其中所述加工過的因子viii融合于所述兩個fc部分中的一個)相當?shù)囊蜃觱iii活性。

在其它實施方案中，本發(fā)明的組合物具有與包含加工過的因子viii的組合物(例如包含基本上由或由兩個fc部分及加工過的因子viii組成的嵌合多肽的組合物，其中加工過的因子viii融合于所述兩個fc部分中的一個fc)相當?shù)囊蜃觴a產(chǎn)生速率。在其它實施方案中，包含單鏈因子viii的組合物可以與包含加工過的因子viii的組合物(例如包含基本上由或由兩個fc部分及加工過的因子viii組成的嵌合多肽的組合物，其中加工過的因子viii融合于一個fc)相當?shù)乃俾逝c因子ixa相互作用。在其它實施方案中，本發(fā)明組合物的嵌合多肽中的單鏈因子viii以與組合物的嵌合多肽中的加工過的因子viii(例如包含基本上由或由兩個fc部分及加工過的因子viii組成的嵌合多肽的組合物，其中加工過的因子viii融合于所述兩個fc部分中的一個fc)相當?shù)某潭扔苫罨牡鞍譪滅活。在一個具體實施方案中，包含單鏈因子viii的組合物在體內(nèi)具有與包含加工過的因子viii的組合物(例如包含基本上由或由兩個fc部分及加工過的因子viii組成的嵌合多肽的組合物，其中加工過的因子viii融合于所述兩個fc部分中的一個fc)相當?shù)囊蜃觱iii活性。在一些實施方案中，在hema小鼠尾靜脈橫斷模型中，本發(fā)明的包含單鏈因子viii的組合物能夠以與包含加工過的因子viii的組合物(例如包含基本上由或由兩個fc部分及加工過的因子viii組成的嵌合多肽的組合物，其中所述加工過的因子viii融合于所述兩個fc部分中的一個fc)相當?shù)某潭缺Ｗohema小鼠。

本發(fā)明進一步提供使用本發(fā)明的組合物治療人類受試者的出血病狀的方法。示例性方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的包含具有因子viii活性的嵌合多肽的藥物組合物/制劑，其中至少約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約85％、約90％、約95％或約99％的嵌合多肽包含為單鏈因子viii的因子viii部分及第二部分。

出血病狀可由凝血病癥引起。凝血病癥又可稱為凝血病。在一個實施例中，可用本公開的藥物組合物治療的凝血病癥為血友病或馮·維勒布蘭德氏病(vonwillebranddisease；vwd)。在另一實施例中，可用本公開的藥物組合物治療的凝血病癥為血友病a。

在一些實施方案中，與出血病狀相關(guān)的出血類型選自關(guān)節(jié)積血、肌肉出血、口腔出血、流血、肌肉內(nèi)流血、口腔流血、創(chuàng)傷、頭部創(chuàng)傷、胃腸出血、顱內(nèi)流血、腹內(nèi)流血、胸內(nèi)流血、骨折、中樞神經(jīng)系統(tǒng)出血、咽后間隙出血、腹膜后間隙出血及髂腰肌鞘出血。

在其它實施方案中，患有出血病狀的受試者需要用于手術(shù)的治療，包括例如手術(shù)預(yù)防或圍手術(shù)期管理。在一個實施例中，手術(shù)選自小手術(shù)及大手術(shù)。示例性手術(shù)工序包括拔牙、扁桃體切除術(shù)、腹股溝疝氣切開術(shù)、滑膜切除術(shù)、開顱術(shù)、骨縫合術(shù)、創(chuàng)傷外科手術(shù)、顱內(nèi)手術(shù)、腹內(nèi)手術(shù)、胸內(nèi)手術(shù)或關(guān)節(jié)置換手術(shù)(例如全膝置換、髖關(guān)節(jié)置換及其類似手術(shù))、心臟手術(shù)及剖腹產(chǎn)。

在另一實施例中，受試者伴隨用fix來治療。因為本發(fā)明的化合物能夠活化fixa，所以其可用于在向受試者施用fixa前預(yù)活化fixa多肽。

本發(fā)明的方法可對需要預(yù)防性治療或按需治療的受試者實施。

包含至少30％單鏈因子viii的藥物組合物可配制用于任何適當投藥方式，包括例如局部(例如經(jīng)皮或眼部)、經(jīng)口、經(jīng)頰、經(jīng)鼻、陰道、直腸或胃腸外投藥。

如本文所用的術(shù)語胃腸外包括皮下、皮內(nèi)、血管內(nèi)(例如靜脈內(nèi))、肌肉內(nèi)、脊柱、顱內(nèi)、鞘內(nèi)、眼內(nèi)、眼周、眼眶內(nèi)、滑膜內(nèi)及腹膜內(nèi)注射以及任何類似注射或輸注技術(shù)。組合物還可為例如混懸液、乳液、持續(xù)釋放制劑、霜劑、凝膠或粉末。組合物可用傳統(tǒng)的粘合劑和載體(如甘油三酯)配制為栓劑。

在一個實施例中，藥物制劑為液體制劑，例如緩沖的等張水溶液。在另一實施例中，藥物組合物具有生理或接近生理的ph。在其它實施例中，水性制劑具有生理或接近生理的滲透壓和鹽度。其可含有氯化鈉和/或乙酸鈉。在一些實施例中，本發(fā)明的組合物被凍干。

現(xiàn)已詳細描述了本發(fā)明，其將通過參考以下實施例得到更清楚的理解，所述實施例包括于本文僅用于說明目的且不意圖限制本發(fā)明。本文提及的所有專利及公開明確以引用的方式并入本文。

實施例

實施例1

rfviiifc的克隆、表達和純化

所有分子生物學工序均根據(jù)標準技術(shù)執(zhí)行。人類fviii的編碼序列(基因庫登錄號nm_000132)(包括其天然信號序列)是通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(rt-pcr)從人類肝臟polyarna獲得。由于fviii的大尺寸，編碼序列以若干部分從分開的rt-pcr反應(yīng)獲得，并且通過一系列pcr反應(yīng)進行組裝，限制性消化并且連接至含有b結(jié)構(gòu)域缺失的(bdd)fviii編碼區(qū)的中間克隆載體中，其中在所述編碼區(qū)中，絲氨酸743(s743)融合于谷氨酰胺1638(q1638)，從而從全長fviii的b結(jié)構(gòu)域消除2682bp。人類igg1fc序列(例如基因庫登錄號y14735)通過pcr從白細胞cdna文庫獲得，并且制備最終表達盒的方式應(yīng)使得bddfviii序列直接融合于fc序列(鉸鏈、ch2和ch3結(jié)構(gòu)域，始于igg1序列的d221，eu編號)的n端而無插入接頭。為僅表達fc鏈，以合成寡核苷酸產(chǎn)生小鼠igκ(kappa)輕鏈信號序列并且使用pcr添加至fc編碼序列以使得所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物能夠分泌。將fviiifc和fc鏈編碼序列克隆至雙重表達載體pbudce4.1(invitrogen,carlsbad,ca)中。

使用脂轉(zhuǎn)染胺轉(zhuǎn)染試劑(invitrogen,carlsbad,ca)用psyn-fviii-013質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hek293h細胞(invitrogen,carlsbad,ca)，并且利用博萊霉素選擇穩(wěn)定細胞系。細胞在無血清懸浮培養(yǎng)物中生長，并且使用包括fviii特異性親和純化步驟的四管柱純化方法(mccuej.等,j.chromatogr.a.,1216(45):7824-30(2009))，接著通過陰離子交換管柱與疏水性相互作用管柱的組合從澄清的收集培養(yǎng)基純化rfviiifc蛋白。

實施例2

生物化學表征

加工過的重組fviii-fc(rfviiifc)合成為兩條多肽鏈，一條鏈由bdd-fviii(s743-q1638融合體，1438個氨基酸)融合于igg1的fc結(jié)構(gòu)域(鉸鏈、ch2和ch3結(jié)構(gòu)域)(226個氨基酸，從d221延伸至g456，eu編號)組成，總鏈長度為1664個氨基酸，另一條鏈由單獨的相同fc區(qū)組成(226個氨基酸)。盡管預(yù)期用fviiifc/fc雙重表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞分泌三種產(chǎn)物(fviiifc二聚體、fviiifc單體和fc二聚體)，但在條件培養(yǎng)基中僅檢測到fviiifc單體和fc二聚體。通過非還原性和還原性sds-page分析對純化的fviiifc進行分析(圖2a和圖2b)。對于非還原性sds-page，發(fā)現(xiàn)條帶遷移至約90kda和130kda，與fviiifc重鏈(hc)和輕鏈-二聚fc融合體(lcfc2)的預(yù)測分子量一致(圖2a，泳道3)。還在約220kda檢測到第三條帶，與單鏈fviiifc(scfviiifc；hc+lcfc2)的預(yù)測分子量一致，其中位置754(對于全長序列來說為1648)上的精氨酸殘基在分泌期間未裂解。對于還原性sds-page分析，見到主要條帶遷移至約25kda、90kda、105kda和195kda，與單鏈fc、hc、lcfc和scfviiifc的預(yù)測分子量一致(圖2b，泳道3)。用人類pc5(前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶(subtlisin)/kexin(pcsk)型蛋白酶的成員)共轉(zhuǎn)染引起rfviiifc產(chǎn)物的完全加工(圖2a、圖2b，泳道2)。

sds-page后，若干批rfviiifc的密度測定分析指示預(yù)期條帶的純度大于98％。還使用尺寸排阻色譜(sec)來評定所存在聚集的程度，并且發(fā)現(xiàn)所有批次均具有0.5％或0.5％以下的聚集物水平。

通過凝血酶裂解、還原和lc/uv與lc/ms分析進一步分析rfviiifc結(jié)構(gòu)。通過uv吸收(圖2c)可檢測到由凝血酶產(chǎn)生的四個因子viii片段(通過在位于位置372、740和795(795對應(yīng)于相對于全長fviii序列的1689)處的三個精氨酸殘基處裂解)，對應(yīng)于以下蛋白質(zhì)區(qū)段：fc(峰1)、輕鏈-fc(峰2)、來自重鏈的a1結(jié)構(gòu)域(峰3)和來自重鏈的a2結(jié)構(gòu)域(峰4)。14個氨基酸的b結(jié)構(gòu)域接頭和約6kda的a3相關(guān)肽因其尺寸小而未由uv吸收檢測到。

通過hplc/ms分析rfviiifc的凝血酶消化提供四個主要結(jié)構(gòu)域以及約6kdaa3相關(guān)肽的其它詳細信息，并且使用相同方法與(cho來源的重組bdd-fviii蛋白(rbddfviii))進行比較。使fviii樣品經(jīng)過detergent-outdtg-100x管柱(gbioscience,marylandheights,mo)以便移除tween，用凝血酶充分消化，還原并且通過rp-hplc-uv(porosr1/10,appliedbiosystems)或rp-hplc-ms(與agilent6210tof質(zhì)譜儀連接的agilent1200)使用乙腈的水+0.1％甲酸的梯度進行分析。還通過lysc肽定位證實肽序列，通過rp-hplc/ms(thermofinniganltq-xl-etd)進行分析。

如所預(yù)期，rfviiifc的總離子流(tic)色譜圖(圖2d)似乎與uv色譜圖(圖2c)類似。通過lc/ms可檢測到預(yù)期六種產(chǎn)物中的五種，包括由加工過的和單鏈異構(gòu)體產(chǎn)生的a3酸性區(qū)的兩種形式，以及用于消化的凝血酶。還觀察到a3酸性區(qū)的另一截短形式，并且在下文更詳細描述。rbddfviii產(chǎn)生類似tic色譜圖，但與rfviiifclc-fc相比無游離fc鏈并且具有不同lc質(zhì)量，此與缺乏fc區(qū)一致(數(shù)據(jù)未示出)。

由于大多數(shù)蛋白質(zhì)上糖基化的異質(zhì)性，a1、lc-fc和fc區(qū)的去卷積質(zhì)譜為復(fù)雜的并且因此未確立所有分子離子的密度。然而，發(fā)現(xiàn)來自fc區(qū)的三個主要峰的觀測質(zhì)量匹配igg分子上發(fā)現(xiàn)的g0、g1和g2，對應(yīng)于終止于0、1或2個半乳糖殘基的雙觸角寡糖。a3相關(guān)肽和a2結(jié)構(gòu)域的去卷積質(zhì)譜提供最具確定性的數(shù)據(jù)，因為在這些區(qū)中的翻譯后修飾中不存在異質(zhì)性，從而允許明確鑒別預(yù)期質(zhì)量。

如果從加工過的異構(gòu)體衍生，那么預(yù)期r1689裂解后從lc釋放的6kdan端肽包含a3酸性區(qū)(氨基酸e1649至r1689)，并且如果從單鏈異構(gòu)體衍生，那么包含融合于a3酸性區(qū)的14個氨基酸的截短b結(jié)構(gòu)域。發(fā)現(xiàn)rfviiifc與rbddfviii均含有a3區(qū)的兩種形式，與基于sds-page分析的預(yù)期水平成比例。此外，兩種蛋白質(zhì)均含有對應(yīng)于氨基酸d1658-r1689的a3區(qū)的截短形式，如對于其它fviii產(chǎn)物所報道，不過發(fā)現(xiàn)其在rbddfviii中的豐度比在rfviiifc中高。

a2結(jié)構(gòu)域含有三個潛在酪氨酸硫酸化位點，但沒有可能導(dǎo)致復(fù)雜異質(zhì)性的糖基化位點，并且因此可計算此區(qū)的確切質(zhì)量。除rfviiifc的去卷積質(zhì)譜中對應(yīng)于s373至r740序列的質(zhì)量的主要預(yù)期峰外(圖2e)，還鑒別出對應(yīng)于與在e720和y729處截短的a2結(jié)構(gòu)域相關(guān)的fviiihc的已知截短的兩種其它形式。在rbddfviiia2的去卷積質(zhì)譜中也直接觀察到所述報道的截短形式(圖2e)。rfviiifc與rbddfviiia2均含有類似相對量的在y729處截短的形式，而與rfviiifc中的相同形式相比，rbddfviiia2結(jié)構(gòu)域含有顯著較大量的在e720處截短的形式(圖2e)。

通過利用賴氨?；鶅?nèi)肽酶(lys-c)消化進行肽定位并隨后進行uv和質(zhì)譜檢測確認rfviiifc的一級序列。在由rfviiifc產(chǎn)生的99種理論肽中，檢測到81種，對應(yīng)于總序列的98％。還通過此方法表征rfviiifc的翻譯后修飾。fviii含有6個潛在酪氨酸硫酸化位點，對應(yīng)于位置346、718、719、723、1664和1680。當通過將總離子色譜圖整合于質(zhì)譜中進行評定時，發(fā)現(xiàn)對應(yīng)于所述六個位點的完全硫酸化肽，同時存在痕量對應(yīng)于位置1680的非硫酸化肽，并且沒有可檢測的對應(yīng)于其它位置的非硫酸化肽。bddfviii還含有6個潛在n糖基化位點，其中四個已報道在重組fviii產(chǎn)物中糖基化。與此一致，發(fā)現(xiàn)rfviiifc在相同的4個位點糖基化；發(fā)現(xiàn)n239和n2118含有高甘露糖結(jié)構(gòu)，同時發(fā)現(xiàn)n41和n1810含有更復(fù)雜的碳水化合物，與在rbddfviii上發(fā)現(xiàn)的那些類似。通過lc/ms發(fā)現(xiàn)fc區(qū)n連接型糖基化匹配利用凝血酶定位發(fā)現(xiàn)的g0、g1和g2異構(gòu)體。已報道fviii具有部分占據(jù)的ser741和743上的o糖基化位點，并且在rfviiifc的情況下也發(fā)現(xiàn)此情況。

在未共轉(zhuǎn)染加工酶的情況下產(chǎn)生的rfviiifc多肽顯示15-25％單鏈fviiifc(scfviiifc)，此與加工過的rfviiifc的不同之處在于r754與e755(相對于全長fviii來說為r1648/e1649)之間的單一肽鍵。純化此異構(gòu)體并且在所有上述生物化學分析中表征，并且如下所示發(fā)現(xiàn)與rfviiifc相當。在顯色測定中以及根據(jù)下文所述的各種功能測定，發(fā)現(xiàn)純化的單鏈fviiifc的活性與rfviiifc類似。

通過顯色和單級aptt測定測量fviii活性

通過fviii顯色測定測量fviii活性。通過顯色測定發(fā)現(xiàn)來自四個單獨批次rfviiifc的平均比活性為9762±449iu/mg，對應(yīng)于2148±99iu/nmol。通過aptt測定發(fā)現(xiàn)來自十四個單獨批次rfviiifc的平均比活性為8460±699iu/mg，并且通過顯色測定發(fā)現(xiàn)為9348±1353iu/mg，分別對應(yīng)于1861±154iu/nmol和2057±298iu/nmol。還通過顯色測定測量單鏈fviii:fc的fviii活性并且與完全加工的rfviii:fc或rfviii:fcds(含有約25％單鏈rfviii:fc)進行比較。如表3a所示，根據(jù)顯色測定，在存在和不存在馮·維勒布蘭德因子(vwf)的情況下，單鏈rfviiifc顯示fviii活性與完全加工的fviiifc或rfviiifcds的fviii活性無顯著差異。表3b示出如通過單級活化的部分促凝血酶原激酶時間(aptt)測定所測量，在不存在vwf的情況下觀測到scrfviiifc的完全活性。

表_3a_通過顯色測定獲得的fviii活性

*cv＝變異系數(shù)

表_3b_通過aptt測定獲得的fviii活性

在單級凝結(jié)測定(aptt)中，當血漿具有正常vwf水平時，scrfviiifc顯示活性降低60％，表明vwf在活化scrfviiifc中的潛在作用。此觀測結(jié)果通過再向去除fviii/vwf的血漿中添加人類vwf得到進一步證實(表3)，其中scrfviiifc的凝血活性降至與先天fviii缺乏血漿相同的程度。

xase復(fù)合物中的活性

還通過在鈣存在下在磷脂表面上培育活化的fix和凝血酶活化的或rfviiifc蛋白并且如通過顯色或熒光底物的裂解(由其測定fxa產(chǎn)生速率)所測量監(jiān)測fx向fxa的轉(zhuǎn)化，在xase復(fù)合物的情形下測量fviii活性。接著通過改變所述測定的一種組分，同時使其它組分保持恒定，來對所述測定加以修改以便檢查與各單個組分的相互作用。

對于rfviiifcds、rbddfviii和單鏈rfviiifc(圖3a)來說，fxa產(chǎn)生速率使用合成磷脂囊泡(25％磷脂酰絲氨酸/75％磷脂酰膽堿)測定為不同磷脂濃度的函數(shù)。發(fā)現(xiàn)兩種蛋白質(zhì)具有類似活性概況，其中峰值活性位于約156μm磷脂。

接著將fxa產(chǎn)生速率測定為不同fx濃度的函數(shù)，并且計算km和vmax值(圖3b)。發(fā)現(xiàn)rfviiifcds、rbddfviii和單鏈rfviiifc的活性概況類似，具有類似的km和vmax(表4)。最后，fxa產(chǎn)生速率測定為不同fix濃度的函數(shù)(圖3c)?；钚愿艣r看起來類似，具有類似的kd和vmax(表4)。使用血小板作為磷脂源獲得類似結(jié)果(未公開數(shù)據(jù)，2009年6月)。

表4.磷脂上fviii蛋白的fxa產(chǎn)生參數(shù)

表5.fixa與fviii蛋白的相互作用

通過apc的滅活

呈活性時，fviii通過由活化的蛋白c(apc)裂解以及a2結(jié)構(gòu)域解離而滅活。rfviiifc和rbddfviii均由凝血酶活化，接著與apc一起培育不同時間并且在fxa產(chǎn)生測定中測定活性(圖4)。在不存在凝血酶活化的情況下，檢測到極少fxa產(chǎn)生，并且其在凝血酶消化下顯著增加。用apc處理90分鐘導(dǎo)致fxa產(chǎn)生速率顯著降低，與未活化樣品類似，并且所述結(jié)果對于rfviiifcds、rbddfviii和單鏈rfviiifc來說為類似的。

對vwf的親和力

通過實時生物分子相互作用分析(biacore)基于表面等離子體共振(spr)技術(shù)測量fviii與馮·維勒布蘭德因子(vwf)的相互作用，以測定rfviiifc和rbddfviii對vwf的結(jié)合的動力學(表6)。在相同條件下測定各fviii相互作用的動力學速率參數(shù)ka(結(jié)合速率)和kd(解離速率)以及親和力kd(kd/ka)。發(fā)現(xiàn)rfviiifc和rbddfviii均對vwf具有低nm結(jié)合親和力(kd)，分別為1.64±0.37nm和0.846±0.181nm。所述蛋白質(zhì)具有類似解離速率，其中結(jié)合速率的兩倍差異導(dǎo)致親和力的兩倍差異。

表6.fviii蛋白對vwf的biocore結(jié)合分析

如表6中所示，發(fā)現(xiàn)rfviii:fcds或單鏈rfviiifc與vwf的親和力處于低nm范圍，約為僅bddfviii的親和力的兩倍大。在生理濃度下，這將導(dǎo)致與vwf復(fù)合的rfviiifc(加工過的或單鏈)的百分比與游離fviii相比稍微降低，然而體內(nèi)研究表明，盡管存在此稍微較低的親和力，但rfviiifc的半衰期比全長或bddfviii顯著延長，并且因此其似乎并不有損分子的半衰期。游離rfviiifc有可能更有效地通過fcrn途徑再循環(huán)，并且因此其可有助于半衰期更加延長。

對vwf的親和力和凝血酶介導(dǎo)的從vwf的釋放

在hek293細胞中表達重組b結(jié)構(gòu)域缺失的因子viiifc(rfviiifc)。在hek293細胞中的生物合成期間，通過限制蛋白水解加工大部分rfviiifc來生成fviii重鏈(hc)和fc部分所連接的fviii輕鏈(lc)。認為hc和lc在血漿中以及在fviii藥品儲存期間的自發(fā)性解離造成fviii活性降低。未加工的生物合成rfviiifc的剩余部分形成rfviiifc的單鏈異構(gòu)體(scrfviiifc)，其可提供與加工過的rfviiifc相比增強的可制造性和穩(wěn)定性。

此實施例描述比較scrfviiifc與馮·維勒布蘭德因子(vwf)的相互作用相對于rfviiifc與vwf的相互作用的測定。通過實時生物分子相互作用分析(biacore)基于表面等離子體共振(spr)技術(shù)測量與vwf的相互作用，以測定rfviiifc和scrfviiifc對vwf的結(jié)合的動力學(表11和圖16a)。通過氨偶合將不含fviii的人類血漿來源vwf以足夠低以防止質(zhì)量轉(zhuǎn)運限制的水平固定于生物傳感器表面上。rfviiifc和scrfviiifc依序以0.13nm至5.0nm范圍內(nèi)的濃度以單循環(huán)動力學模式注射。將傳感器圖數(shù)據(jù)擬合至1:1相互作用模型。

在相同條件下測定各fviii相互作用的動力學速率參數(shù)ka(結(jié)合速率)和kd(解離速率)以及親和力kd(kd/ka)。發(fā)現(xiàn)rfviiifc和scrfviiifc均對vwf具有低nm結(jié)合親和力(kd)，分別為0.34±0.1nm和0.31±0.1nm。兩種異構(gòu)體還具有類似的結(jié)合速率和解離速率。

表11.fviii蛋白對vwf的biocore結(jié)合分析

接著，在25℃和37℃下測量rfviiifc、scrfviiifc和缺乏fc部分的b結(jié)構(gòu)域缺失的fviii(rbddfviii)的凝血酶介導(dǎo)的釋放。通過氨偶合將人類vwf以類似含量固定于生物傳感器表面上的三個流量槽上。剩余流量槽用作空白用于參考目的。rfviiifc和scrfviiifc蛋白由vwf捕捉并且允許緩慢解離，并且調(diào)整rfviiifc和scrfviiifc的濃度以在解離相結(jié)束時獲得等摩爾捕捉水平。通過2倍連續(xù)稀釋制備人類α-凝血酶溶液并且以0.005u/ml至20u/ml范圍內(nèi)的濃度應(yīng)用，從而使fviiia物質(zhì)從vwf蛋白水解釋放。使用基于spr的光學生物傳感器實時監(jiān)測凝血酶介導(dǎo)的活化rfviiifc、scrfviiifc和rbddfviii從vwf的釋放(圖16b)?？鄢瞻讌⒖?圖16c)后，確定作為α-凝血酶濃度的函數(shù)的釋放速率(圖16d)。在25℃下，scrfviiifc的凝血酶半最大有效濃度(ec50)為12±1u/ml，相比之下rfviiifc為3.9±0.3u/ml，并且在37℃下，scrfviiifc的凝血酶半最大有效濃度(ec50)為15±1u/ml，相比之下rfviiifc為4.8±0.2u/ml(圖16e)。rfviiifc具有與rbddfviii類似的凝血酶ec50值，在25℃下，所具有的值分別為3.9±0.3u/ml和3.3±0.3u/ml，并且在37℃下，所具有的值分別為4.8±0.2u/ml和4.0±0.2u/ml。scrfviiifc具有約為rfviiifc的3倍高的凝血酶ec50值。凝血酶介導(dǎo)的從vwf的釋放的此降低可為存在vwf的aptt測定中所觀察到的scrfviiifc的比活性特異性降低的基礎(chǔ)(表3b)。

實施例3

設(shè)計i/iia期開放標記交叉劑量遞增多中心首次人類(first-in-human)研究來評估單次劑量rfviiifc在患有重度(定義為<1iu/dl[1％]內(nèi)源性因子viii[fviii])血友病a的受試者中的安全性、耐受性和藥物代謝動力學?？偣布s12名先前接受治療的患者入選并且給予25iu/kg或65iu/kg的rfviiifc。篩選(安排在第一劑量參考比較藥劑[rfviii]之前28天內(nèi))以及第一次注射前無fviii治療情況下經(jīng)過最少4天(96小時)后，約6名受試者接受單次25iu/kg劑量的接著為3天(72小時)藥物代謝動力學(pk)概況，隨后交叉并且接受25iu/kg單次開放標記劑量的rfviiifc用于7天(168小時)pk概況研究。對前3名受試者依序給藥。對給予25iu/kgrfviiifc的前三名(3)受試者，各受試者在注射rfviiifc后14天(336小時)進行抑制劑評定。一旦完成抑制劑測試，即進行下一個受試者的給藥(僅對于前三名受試者)。第3名受試者完成14天抑制劑評定后，25iu/kg的剩余三名受試者和65iu/kg的六名受試者在各劑量組內(nèi)依序間隔至少1天開始參與。

最后一名受試者接受25iu/kg劑量的rfviiifc一周后，招募約6名獨特受試者作為65iu/kg組。65iu/kg組中的各受試者接受單次65iu/kg劑量的接著為4天(96小時)pk概況研究，隨后交叉并且接受65iu/kg單次開放標記劑量的rfviiifc用于10天(240小時)概況研究。如果在任何組中在第一次注射rfviiifc前發(fā)生出血事件，那么使用受試者的先前研究fviii產(chǎn)物進行治療并且在接受第一次rfviiifc注射用于pk概況前必須經(jīng)過至少4天的間隔。

所有受試者接著在施用用于安全性的rfviiifc25iu/kg或65iu/kg后經(jīng)歷14天(336小時)和28天安全性評估期。所有受試者在給藥前后在指定時間點隨同用于分析fviii活性的血液樣品進行藥物代謝動力學取樣。

i/iia期臨床試驗的藥物代謝動力學數(shù)據(jù)對于fviiifc顯示以下結(jié)果。相比于(全長rfviii)，fviiifc的全身性暴露(aucinf)增加約50％，清除率(cl)降低約50％，并且終末半衰期和mrt增加約50-70％。此外，fviiifc顯示與相比，c168、tblp1、tblp3和tblp5值增加。

aucinf零至無窮大的濃度-時間曲線下面積

βhl消除相半衰期；又稱為t1/2β

c168給藥后約168小時時高于基線的估算fviiifc活性

cl清除率

mrt平均滯留時間

tblp1給藥后當fviiifc活性降至高于基線約1iu/dl時的模型預(yù)測時間

tblp3給藥后當fviiifc活性降至高于基線約3iu/dl時的模型預(yù)測時間

tblp5給藥后當fviiifc活性降至高于基線約5iu/dl時的模型預(yù)測時間

實施例4

產(chǎn)生重組b結(jié)構(gòu)域缺失的因子viii-fc(rfviiifc)融合蛋白作為延長fviii的半衰期的方法。在血友病a小鼠中比較rfviiifc與rfviii的藥物代謝動力學(pk)。我們發(fā)現(xiàn)rfviiifc的終末半衰期為rfviii的兩倍長。為證實半衰期延長的潛在機制是由于rfviiifc受到fcrn保護，在fcrn基因敲除和人類fcrn轉(zhuǎn)基因小鼠中評估pk。施用單次靜脈內(nèi)劑量(125iu/kg)并且使用顯色活性測定測量血漿濃度。在兩種小鼠品系中cmax在rfviiifc與rfviii之間類似。然而，雖然在fcrn基因敲除的小鼠中rfviiifc的半衰期與rfviii相當，但在hfcrn轉(zhuǎn)基因小鼠中rfviiifc的半衰期延長至rfviii半衰期的約兩倍長。所述結(jié)果證實fcrn介導(dǎo)或負責使rfviiifc的半衰期相比于rfviii延長。因為在血友病小鼠的出血模型中以及在臨床應(yīng)用中已顯示通過旋轉(zhuǎn)血栓彈性描計法測量的全血中的凝血與凝血因子的功效有關(guān)，因此我們尋求在血友病a小鼠中使用評估rfviiifc的離體功效。向血友病a小鼠施用單次靜脈內(nèi)劑量的50iu/kgrfviiifc、(fviii)或(fviii)。給藥后5分鐘時，凝塊形成的凝結(jié)時間(ct)、凝塊形成時間(cft)和α角類似。然而，與(fviii)和(fviii)相比，rfviiifc顯示在給藥后72和96小時時ct顯著改善，并且cft和α角在96小時時也改善，這與rfviiifc的pk延長一致。因此，構(gòu)建fviii的fc融合體產(chǎn)生具有確定作用機制的分子，其具有增加的半衰期以及提供延長的出血保護的潛能。

實施例5

本實施例呈示來自用25iu/kg和65iu/kgfviii產(chǎn)品治療的16名患者的最終fviii活性分析結(jié)果。參見實施例3。

在本實施例中，rfviiifc為由單個分子的重組b結(jié)構(gòu)域缺失的人類fviii(bdd-rfviii)融合于人類igg1的二聚fc結(jié)構(gòu)域構(gòu)成而無插入接頭序列的重組融合蛋白。此蛋白質(zhì)構(gòu)建體在本文中又稱為rfviiifc異二聚雜合蛋白、fviiifc單體fc融合蛋白、fviiifc單體雜合體、單體fviiifc雜合體以及fviiifc單體-二聚體。參見實施例1、圖1和表2a。

利用rfviiifc進行的臨床前研究顯示rfviii活性的半衰期與可商購獲得的rfviii產(chǎn)品相比延長約2倍。此研究的基本原理為評估冷凍液體制劑中單次劑量的rfviiifc的安全性和耐受性，并且提供重度血友病a受試者中pk的數(shù)據(jù)。對于此研究，可獲得16名可評估受試者用于pk評估。每公斤體重25iu(n＝6)和65iu(n＝10)標稱劑量的rfviiifc與的兩次劑量的單次施用是歷經(jīng)約10分鐘靜脈內(nèi)輸注的。在輸注前以及直至給藥后10天獲得用于血漿pk評定的血液樣品。在此研究中使用依賴于模型的方法表征與rfviiifc的fviii活性的pk。

目標

此研究的主要目標為評定在先前治療的12歲患者(ptp)和患有重度血友病a的上述患者中單次施用兩次劑量的rfviiifc(25iu/kg和65iu/kg)的安全性和耐受性。

第二目標為確定在單級凝結(jié)和顯色測定中，由與相比在單次施用25iu/kg或65iu/kgrfviiifc后，fviii隨時間的藥效學(pd)活性確定的藥物代謝動力學(pk)參數(shù)。

研究設(shè)計(參見實施例3)

在篩選訪問(在給予前28天以內(nèi))；第0天(注射)，注射前以及注射后10和30分鐘以及1、3、6和9小時；第1天，注射后24小時；第2天，注射后48小時；第3天，注射后72小時；以及第4天，注射高劑量(僅組b)后96小時，收集用于fviii活性pk評估的血液樣品。

在rfviiifc注射日，恰在施用rfviiifc之前、注射rfviiifc后10和30分鐘以及1、3、6和9小時；第1天，注射rfviiifc后24小時；第2至5天，注射rfviiifc后48、72、96和120小時；第7天，注射rfviiifc后168小時；第8、9和10天，注射高劑量rfviiifc(僅組b)后192、216和240小時，收集用于fviii活性pk評估的血液樣品。還在最終研究訪問(注射rfviiifc后28天)，注射rfviiifc后672小時時測量fviii活性。

藥物代謝動力學模型化和計算

縮寫

tblp1＝給藥后當fviii活性降至高于基線約1iu/dl時的模型預(yù)測時間。

tblp3＝給藥后當fviii活性降至高于基線約3iu/dl時的模型預(yù)測時間

kv_m＝cmax_m/實際劑量(iu/kg)

kv_ob＝cmax_ob/實際劑量(iu/kg)

ivr_m＝100×cmax_m×血漿體積(dl)/總劑量(iu)；其中血漿體積(ml)＝(23.7×ht(cm))+(9.0×wt(kg))–1709。

ivr_ob＝100×cmax_ob×血漿體積(dl)/總劑量(iu)；其中血漿體積(ml)＝(23.7×ht(cm))+(9.0×wt(kg))–1709。

結(jié)果

單劑量藥物代謝動力學(單級測定)

觀測到的fviii活性在短期靜脈內(nèi)輸注或rfviiifc后急劇增加，其中分別對于25iu/kg和65iu/kg劑量組，平均(±sd)模型預(yù)測cmax值對于來說為56.6±4.74iu/dl和121±28.2iu/dl，并且對于rfviiifc來說為55.6±8.18iu/dl和108±16.9iu/dl。所有用和rfviiifc治療的患者的fviii活性均具有劑量相關(guān)性增加。觀測到的cmax與aucinf的增加在比例上均與所評估劑量范圍內(nèi)的劑量相比稍低。

在輸注結(jié)束時，觀測到的fviii活性的下降顯示單指數(shù)衰減特征，直到達到基線水平。rfviiifc的fviii活性降低的速率低于其中分別對于25iu/kg和65iu/kg劑量組，平均(±sd)模型預(yù)測消除半衰期值對于來說為11.9±2.98小時和10.4±3.03小時，并且對于rfviiifc來說為18.0±3.88小時和18.4±6.99小時。消除半衰期值在對于兩種fviii產(chǎn)品所評估的劑量范圍內(nèi)似乎與劑量無關(guān)。

在25iu/kg和65iu/kg劑量水平下，rfviiifc施用后的總?cè)硇詅viii暴露量(通過aucinf所評定)分別比高約48％和61％。分別對于25iu/kg和65iu/kg劑量組，平均(±sd)模型預(yù)測aucinf值對于來說為974±259hr*iu/dl和1810±606hr*iu/dl，并且對于rfviiifc來說為1440±316hr*iu/dl和2910±1320hr*iu/dl。

類似于消除半衰期，rfviiifc的mrt相對于延長。分別對于25iu/kg和65iu/kg劑量組，平均(±sd)模型預(yù)測mrt值對于來說為17.1±4.29小時和14.9±4.38小時，并且對于rfviiifc來說為25.9±5.60小時和26.5±10.1小時。mrt值在對于兩種fviii產(chǎn)品所評估的劑量范圍內(nèi)似乎與劑量無關(guān)。

此外，測定cl和v的主要pk參數(shù)值。在相等劑量下，rfviiifc的cl值僅占對于所觀測到的cl值的約66％。分別對于25iu/kg和65iu/kg劑量組，平均(±sd)模型預(yù)測cl值對于來說為2.70±0.729ml/hr/kg和4.08±1.69ml/hr/kg，并且對于rfviiifc來說為1.80±0.409ml/hr/kg和2.69±1.25ml/hr/kg。v值在與rfviiifc之間相當，其中分別對于25iu/kg和65iu/kg劑量組，平均(±sd)模型預(yù)測v值對于來說為43.9±4.27ml/kg和56.1±13.4ml/kg，并且對于rfviiifc來說為45.3±7.23ml/kg和61.6±10.6ml/kg。隨和rfviiifc的劑量增加注意到平均cl和v值的稍微增加；然而，在65iu/kg劑量下與有限劑量水平偶聯(lián)的標準偏差增加干擾對所述參數(shù)的劑量依賴性的評定。舉例來說，rfviiifc治療組的cv％幾何平均cl值從23.0％(25iu/kg)增加至48.6％(65iu/kg)。

除主要pk參數(shù)外，還測定次級pk參數(shù)(例如k值、ivr等)以評估fviii作用持續(xù)時間。在rfviiifc的情況下還觀測到pk差異的證據(jù)，表明在相等劑量下與相比，tblp1和tblp3值增加。與rfviiifc的ivr和k值似乎相當。隨和rfviiifc的劑量增加觀測到tblp1和tblp3值稍微增加。相反，隨和rfviiifc的劑量增加注意到平均ivr和k值稍微降低。如先前所指示，所述參數(shù)的劑量依賴性的評定受到有限劑量水平干擾。

分別對于25iu/kg和65iu/kg劑量組，平均(±sd)所觀測tblp1對于來說為每iu/kg2.88±0.733iu/dl和2.93±0.848iu/dl，并且對于rfviiifc來說為每iu/kg4.28±0.873iu/dl和5.16±2.02iu/dl。分別對于25iu/kg和65iu/kg劑量組，平均(±sd)所觀測tblp3對于來說為每iu/kg2.06±0.527iu/dl和2.26±0.666iu/dl，并且對于rfviiifc來說為每iu/kg3.09±0.623iu/dl和3.93±1.59iu/dl。

使用觀測到的cmax值(扣除基線和模型內(nèi)的殘余藥物)計算的平均ivr和k值通常大于使用模型預(yù)測cmax值測定的值；與使用一室模型會稍微低估觀測到的峰值活性一致。分別對于25iu/kg和65iu/kg劑量組，平均(±sd)所觀測k值對于來說為每iu/kg2.57±0.198iu/dl和2.13±0.598iu/dl，并且對于rfviiifc來說為每iu/kg2.46±0.330iu/dl和1.85±0.332iu/dl。分別對于25iu/kg和65iu/kg劑量組，平均(±sd)所觀測ivr值對于來說為94.1±15.6％和85.8±16.5％，并且對于rfviiifc來說為89.5±11.9％和74.8±6.72％。

單劑量藥物代謝動力學(顯色測定)

觀測到的fviii活性在短期靜脈內(nèi)輸注或rfviiifc后急劇增加，其中分別對于25iu/kg和65iu/kg劑量組，平均(±sd)模型預(yù)測cmax值對于來說為70.2±9.60iu/dl和157±38.6iu/dl，并且對于rfviiifc來說為70.3±10.0iu/dl和158±34.7iu/dl。

所有用和rfviiifc治療的患者的fviii活性均具有劑量相關(guān)性增加。觀測到的cmax與aucinf的增加在比例上均與所評估劑量范圍內(nèi)的劑量相比稍低。

在輸注結(jié)束時，觀測到的fviii活性的下降顯示單指數(shù)衰減特征，直到達到基線水平。rfviiifc的fviii活性下降的速率低于其中分別對于25iu/kg和65iu/kg劑量組，平均(±sd)模型預(yù)測消除半衰期值對于來說為10.7±1.98小時和10.3±3.27小時，并且對于rfviiifc來說為16.2±2.92小時和19.0±7.94小時。消除半衰期值在對于兩種fviii產(chǎn)品所評估的劑量范圍內(nèi)似乎與劑量無關(guān)。

在25iu/kg和65iu/kg劑量水平下，rfviiifc施用后的總?cè)硇詅viii暴露量(通過aucinf所評定)分別比高約53％和84％。分別對于25iu/kg和65iu/kg劑量組，平均(±sd)模型預(yù)測aucinf值對于來說為1080±236hr*iu/dl和2320±784hr*iu/dl，并且對于rfviiifc來說為1650±408hr*iu/dl和4280±1860hr*iu/dl。

類似于消除半衰期，rfviiifc的mrt相對于延長。分別對于25iu/kg和65iu/kg劑量組，平均(±sd)模型預(yù)測mrt值對于來說為15.3±2.86小時和14.8±4.72小時，并且對于rfviiifc來說為23.4±4.22小時和27.3±11.4小時。mrt值在對于兩種fviii產(chǎn)品所評估的劑量范圍內(nèi)似乎與劑量無關(guān)。

此外，測定cl和v的主要pk參數(shù)值。在相等劑量下，rfviiifc的cl值僅占對于所觀測到的cl值的約58-66％。分別對于25iu/kg和65iu/kg劑量組，平均(±sd)模型預(yù)測cl值對于來說為2.39±0.527ml/hr/kg和3.21±1.40ml/hr/kg，并且對于rfviiifc來說為1.57±0.349ml/hr/kg和1.86±0.970ml/hr/kg。v值在與rfviiifc之間相當，其中分別對于25iu/kg和65iu/kg劑量組，平均(±sd)模型預(yù)測v值對于來說為35.8±5.52ml/kg和43.6±11.2ml/kg，并且對于rfviiifc來說為35.9±6.65ml/kg和42.7±8.91ml/kg。隨和rfviiifc的劑量增加，注意到平均cl和v值的增加；然而，在65iu/kg下與有限劑量水平偶聯(lián)的標準偏差增加干擾對所述參數(shù)的劑量依賴性的評定。

除主要pk參數(shù)外，還測定次級pk參數(shù)(例如k值、ivr等)以評估fviii作用持續(xù)時間。在rfviiifc的情況下還觀測到pk差異的證據(jù)，表明在相等劑量下與相比，tblp1和tblp3值增加。與rfviiifc的ivr和k值似乎相當。

隨和rfviiifc的劑量增加，觀測到tblp1和tblp3值稍微增加。相反，隨和rfviiifc的劑量增加，注意到平均ivr和k值稍微降低。如先前所指示，所述參數(shù)的劑量依賴性的評定受到有限劑量水平干擾。

分別對于25iu/kg和65iu/kg劑量組，平均(±sd)所觀測tblp1對于來說為每iu/kg2.70±0.511iu/dl和3.09±0.978iu/dl，并且對于rfviiifc來說為每iu/kg4.06±0.798iu/dl和5.66±2.38iu/dl。分別對于25iu/kg和65iu/kg劑量組，平均(±sd)所觀測tblp3對于來說為每iu/kg1.98±0.377iu/dl和2.39±0.718iu/dl，并且對于rfviiifc來說為每iu/kg3.04±0.598iu/dl和4.44±1.84iu/dl。

使用觀測到的cmax值(扣除基線和模型內(nèi)的殘余藥物)計算的平均ivr和k值通常大于使用模型預(yù)測cmax值測定的值；與使用一室模型會稍微低估觀測到的峰值活性一致。分別對于25iu/kg和65iu/kg劑量組，平均(±sd)所觀測k值對于來說為每iu/kg3.08±0.429iu/dl和2.85±0.721iu/dl，并且對于rfviiifc來說為每iu/kg3.12±0.451iu/dl和2.92±0.985iu/dl。分別對于25iu/kg和65iu/kg劑量組，平均(±sd)所觀測ivr值對于來說為112±14.5％和116±26.9％，并且對于rfviiifc來說為113±16.3％和117±33.6％。

結(jié)論

所有和rfviiifc治療的患者在所評估的劑量范圍內(nèi)均具有相當?shù)膭┝肯嚓P(guān)性cmax和aucinf增加。在輸注結(jié)束后第一小時內(nèi)觀測到和rfviiifc活性的峰值血漿水平，并且在給藥后若干天保持可檢測。在輸注結(jié)束后，基線校正的fviii活性的下降顯示單指數(shù)衰減直到達到兩種產(chǎn)品的基線。消除半衰期和mrt的參數(shù)值在對于兩種fviii產(chǎn)品所評估的劑量范圍內(nèi)似乎與劑量無關(guān)。隨和rfviiifc的劑量增加，注意到平均cl和v值的稍微增加；然而，在65iu/kg下與有限劑量水平偶聯(lián)的受試者間可變性增加干擾對所述參數(shù)的劑量依賴性的評定。

rfviiifc與活性pk的比較揭示在相當?shù)膭┝肯拢瑀fviiifc與相比，全身性暴露量增加約48-61％(單級測定)或53-84％(顯色測定)，清除率降低約30-40％，并且消除半衰期和mrt均增加約50-80％。在rfviiifc的情況下也觀測到pk差異的證據(jù)，表明在相等劑量下與相比，tblp1和tblp3值增加。與rfviiifc的ivr和k值似乎相當。

由顯色測定結(jié)果獲得的pk參數(shù)通常與由單級測定獲得的那些一致，顯色測定得到的暴露量參數(shù)(例如cmax、aucinf等)的較高估算除外。

鑒于觀測到pk的改善，因此rfviiifc可提供延長的出血保護，從而允許對于患有血友病a的個體給予較低頻率的注射。

實施例6

基于由rfviii:fc的首次人類研究(實施例3)獲得的臨時pk分析，設(shè)計a-long研究。a-long為重組因子viiifc融合體(fviii:fc)在先前治療的患有重度血友病a(定義為<1iu/dl[<1％]內(nèi)源性fviii)的受試者中預(yù)防和治療出血的安全性、藥物代謝動力學和功效的開放標記多中心評估。

約106名受試者將入選三種方案之一：定制預(yù)防方案(小組1)、每周給藥方案(小組2)和按需方案(小組3)。

小組1：定制預(yù)防方案

小組1將包括整個群組和pk子群。約66名受試者將入選。最初的方案為每周兩次，在第一天25iu/kg，接著在所述周的第四天50iu/kg。受試者將在此每周預(yù)防方案中施用rfviiifc直到獲得rfviiifc的pk結(jié)果?；谒鼋Y(jié)果，將對各受試者建立定制預(yù)防方案，其中將確定劑量和間隔以維持1-3％fviii活性的谷水平。各受試者接著將在整個研究中施用其單個定制的預(yù)防方案。

將在整個研究中監(jiān)測受試者并且進行不間斷的劑量和間隔調(diào)整。僅在受試者經(jīng)歷不可接受的出血事件(定義為在連續(xù)兩個月的時間內(nèi)≥2次自發(fā)性出血事件)時進行調(diào)整。在此情況下，調(diào)整的目標為3-5％的谷水平。

小組2：每周給藥方案

約20名受試者將入選/隨機化并且如下進行簡短rfviiifcpk概況分析：洗脫(washout)至少96小時；單次劑量的rfviiifc65iu/kg；在rfviiifc第0天開始簡短取樣，包括注射前以及注射開始后10(±2)分鐘、3小時(±15分鐘)、72(±2)小時[第3天]和96(±2)小時[第4天]。簡短pk概況分析后，受試者接著將每隔7天施用固定劑量的65iu/kgrfviiifc至少持續(xù)28周并且達52周。

小組3：按需方案

在研究中將評估至少5名受試者中的最少10次大手術(shù)。大手術(shù)定義為涉及全身麻醉和/或呼吸輔助的任何手術(shù)工序(選擇性或緊急性)，其中穿透并且暴露主要體腔，或身體或生理功能受到實質(zhì)性損害(例如剖腹術(shù)、開胸術(shù)、開顱術(shù)、關(guān)節(jié)置換和截肢)。

對于手術(shù)期間的預(yù)防，受試者將每12小時至24小時用20iu/kg至50iu/kgrfviiifc治療。手術(shù)前，醫(yī)師將審查受試者的rfviiifcpk概況并且評定所述類型的計劃手術(shù)通常需要的因子viii替代的劑量方案和受試者的臨床狀態(tài)。手術(shù)治療期(包括任何康復(fù)時間)中rfviiifc適當給藥的推薦將考慮這些因素。

所述研究的主要目標為(a)評估作為預(yù)防、按需和手術(shù)治療方案施用的rfviiifc的安全性和耐受性；以及(b)評估作為預(yù)防、按需和手術(shù)治療方案施用的rfviiifc的功效。所述研究的次級目標為(a)表征rfviiifc的pk概況并且將rfviiifc的pk與當前市售產(chǎn)品進行比較；(b)評估與fviiifc的單個反應(yīng)；以及(c)評估fviiifc消耗。

主要目標

●評估作為預(yù)防、每周、按需和手術(shù)治療方案施用的rfviiifc的安全性和耐受性

●評估作為定制預(yù)防、按需和手術(shù)治療方案施用的rfviiifc的功效

次級目標

●表征rfviiifc的pk概況并且將rfviiifc的pk概況與當前市售產(chǎn)品進行比較

●評估與rfviiifc的單個反應(yīng)

●表征在預(yù)防方案中充分預(yù)防出血；在手術(shù)環(huán)境中維持止血；或在按需、每周治療或預(yù)防環(huán)境中治療出血事件所需要的劑量范圍和時程

●評估rfviiifc消耗(例如每名受試者每年總rfviiifc消耗)

實施例7

臨床評定

在實施例7中的研究中，除通過單級活化的部分促凝血酶原激酶時間(aptt)測定測量血漿fviii活性外，還利用全血旋轉(zhuǎn)血栓彈性描計法來在2名受試者中(特定來說，1名在低劑量組中并且1名在高劑量組中)通過rfviiifc和評定全面止血的改善。

rfviiifc和當在rfviiifc治療前添加至受試者的血液中時在凝塊形成方面似乎具有類似活性。凝結(jié)時間(ct)關(guān)于rfviiifc和的劑量在正常值的100％的約1％范圍內(nèi)呈線性，并且劑量反應(yīng)在同一受試者中在rfviiifc與之間相當。

給予并且隨后給予rfviiifc后，在不同時間點對檸檬酸化全血進行取樣，并且通過監(jiān)測再鈣化后的凝塊形成。盡管在給予或rfviiifc前由于殘余fviii水平而具有可變基線ct，但兩種產(chǎn)品均在注射后30分鐘在相當?shù)乃缴嫌行Ｕ齝t。此外，在注射25iu/kgrfviiifc后3小時時以及之后，相對于在以此低劑量給藥的受試者中ct的改善得到更佳的維持。然而，rfviiifc與的改善差異在65iu/kg劑量下明顯程度低得多。

實施例8

使用hema小鼠進行尾夾研究。首先麻醉小鼠并且接著注射4.6μg/kg、1.38μg/kg或0.46μg/kg的加工過的rfviiifc(藥物物質(zhì)，其含有約75％-85％加工過的rfviiifc)和純化的單鏈rfviiifc。注射后，將尾從尖端切斷并且即刻放置在管中以收集血液。測量加工過的fviiifc(藥物物質(zhì))和單鏈fviiifc的存活保護百分比，如表7和圖7中所示。

表7.rfviii:fcds和單鏈rfviiifc的體內(nèi)功效

如表7和圖7中所示，單鏈rfviiifc的存活保護與加工過的rfviiifc(ds)相當。

通過體外rotem測定凝結(jié)活性

進一步以全血旋轉(zhuǎn)血栓彈性描計法(rotem)在一定濃度范圍研究rfviiifc的凝結(jié)效能，并且與rbddfviii(xyntha)和重組全長fviii(rflfviii；advate)進行比較。對于體外rotem，將rfviii蛋白以三份重復(fù)添加至從5-6只雄性hema小鼠的腔靜脈收集的檸檬酸化匯集血液中至最終濃度為正常血漿fviii水平的0、0.1％、1％、10％和100％。通過添加cacl2(natem)起始凝塊并且在rotem系統(tǒng)(pentapharmgmbh,munich,germany)上記錄凝結(jié)時間(ct)、凝塊形成時間(cft)、α角和最大凝塊堅實度(mcf)。以正常fviii水平的0.1-100％的遞增劑量添加至hema小鼠血液中的三種蛋白質(zhì)的凝結(jié)時間(ct)、凝塊形成時間(cft)和α角在圖14中示出。在正常值的0.1％至100％的寬范圍中，ct和cft在rfviiifc、rbddfviii和rflfviii之間相當。α角僅在10％的rfviiifc與rbddfviii之間顯著不同(p<0.05)。

通過離體rotem測定凝結(jié)活性

在單次靜脈內(nèi)注射至血友病a小鼠中后，將通過rotem測量的rfviiifc的藥效學與rbddfviii和rflfviii進行比較。對于離體rotem，向雄性hema小鼠靜脈內(nèi)注射單次劑量的50iu/kgrfviiifc、或并且在各時間點(給藥后5分鐘、24、48、72和96小時)處死5只小鼠。即刻在rotem系統(tǒng)上通過natem分析從腔靜脈收集的單個檸檬酸化全血并且如上所述測量參數(shù)。測定給藥后5分鐘至96小時獲取的樣品的ct、cft和α角，并且在圖15中示出。5分鐘時，全部的有效性相當，得到類似的ct、cft和α角(圖15a至圖15c)。然而，相對于rbddfviii和rflfviii，rfviiifc顯示顯著改善(p<0.05)72和96小時時的ct以及96小時時的cft和α角(圖15a至圖15c)。

實施例9

重組因子viiifc(rfviiifc)由遺傳融合于人類免疫球蛋白g1(igg1)的fc結(jié)構(gòu)域的b結(jié)構(gòu)域缺失的(bdd)rfviii蛋白構(gòu)成。在從hek293細胞分泌前，大部分rfviiifc加工成fviii重鏈(hc)和輕鏈(lc+fc)。在循環(huán)中，rfviiifc與馮·維勒布蘭德因子(vwf)復(fù)合并且在活化后以不可與天然fviii區(qū)分的方式釋放。認為hc和lc的自發(fā)性解離造成fviii活性在血漿中和在fviii藥品儲存期間降低。此處我們描述rfviiifc的單鏈未加工異構(gòu)體(scrfviiifc)，其可提供與天然fviii相比優(yōu)良的可制造性和增強的穩(wěn)定性。

從含有一部分未加工異構(gòu)體的rfviiifc中純化scrfviiifc。與rfviiifc相比，scrfviiifc顯示相等顯色活性，但在單級(aptt)測定中活性降低約60％(表3a至表3b)。使用校準的自動化凝血酶曲線(calibratedautomatedthrombogram)(來自)進行凝血酶產(chǎn)生測定(tga)。在凝血酶產(chǎn)生測定(tga)中，scrfviiifc還顯示與rfviiifc相比降低的凝血酶潛能(圖13a)和峰值凝血酶(圖13b)。然而，如表3b中所示，在不存在vwf的情況下通過aptt觀測到scrfviiifc的完全活性，表明從vwf的釋放可由于在scrfviiifc中的arg1680裂解后a3酸性區(qū)共價連接至hc而延遲，相比之下a3從完全加工的fviii的釋放和解離。從vwf的解離延遲可解釋在aptt測定和tga中觀測到的活性降低，而在兩級顯色測定中觀測到完全活性。在vwf存在下活化速率降低在利用限制凝血酶作為fviii活化劑的經(jīng)過修改的顯色底物測定中證實。

在hema小鼠尾靜脈橫斷(tvt)模型中評定scrfviiifc的體內(nèi)功能。在tvt前48小時將hema雄性小鼠用指定劑量的rfviiifc藥品或scrfviiifc處理。tvt后每小時監(jiān)測尾再出血和存活直到12小時，其中最后一次觀測在tvt后24小時進行。當在輸注后48小時進行tvt時，scrfviiifc與rfviiifc在此模型中顯示相等的體內(nèi)功效，其中ed50分別為1.17μg/kg和1.23μg/kg(圖7(a))。對于各測試劑量水平下的scrfviiifc和rfviiifc，在hema小鼠中觀測到相當?shù)膖vt后24小時存活曲線(p≥0.65)(圖7(b))和再出血速率(圖7(c))，表明scrfviiifc盡管具有較低表觀aptt活性，但其與rfviiifc同樣有效。因此在vwf存在下scrfviiifc的體外活化延遲似乎對其體內(nèi)功效并無顯著影響。因此，scrfviiifc代表一種具有潛在臨床應(yīng)用的rfviiifc的新型并且有效的異構(gòu)體。將需要其它研究來證明在此fc融合蛋白的情形下產(chǎn)品的穩(wěn)定性增強。

實施例10

現(xiàn)有因子viii(fviii)產(chǎn)品顯示約8-12小時的半衰期(t1/2)，從而需要頻繁靜脈內(nèi)注射以便預(yù)防和治療血友病a患者。rfviiifc為由單個fviii分子共價連接至用于延長循環(huán)rfviii半衰期的人類igg1的fc結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的重組融合蛋白。在患有重度血友病a的先前經(jīng)過治療的雄性受試者中進行的此首次人類研究對rfviiifc的安全性和藥物代謝動力學進行研究。十六名受試者接受單次劑量的25iu/kg或65iu/kg的接著接受相等劑量的rfviiifc。大部分不良事件與研究藥物無關(guān)。沒有研究受試者發(fā)展出抗fviiifc抗體或抑制劑。在整個劑量水平內(nèi)，與相比，rfviiifc顯示出1.54至1.71倍長的消除t1/2和平均滯留時間、1.49至1.56倍低的清除率和1.48至1.56倍高的總?cè)硇员┞读俊?imgfile="bda0001284457680000843.gif"wi="273"he="72"img-content="drawing"img-format="gif"orientation="portrait"inline="no"/>與rfviiifc具有相當?shù)膭┝恳蕾囆苑逯笛獫{濃度和回收率。在整個劑量水平內(nèi)達到fviii活性比基線高1％的時間為的約1.53至1.68倍長。因此，rfviiifc可提供切實可行的在患有血友病a的患者中獲得延長的止血保護作用并且給藥頻率較低的治療方法。

血友病a為導(dǎo)致關(guān)節(jié)和軟組織中頻繁自發(fā)性和創(chuàng)傷性出血的遺傳性出血病癥。mannuccipm,tuddenhamegd,nengljmed,344:1773-1779(2001)。當治療不充分時，此出血導(dǎo)致慢性關(guān)節(jié)病變、殘疾以及增加的死亡風險。souciejm等,blood.96(2):437-442(2000)。

利用血漿來源的fviii(pdfviii)和重組人類fviii(rfviii)產(chǎn)品來治療(按需療法)和預(yù)防(預(yù)防療法)出血事件。開發(fā)rfviii以降低血漿產(chǎn)品受hiv和肝炎病毒廣泛污染后血源性病原體傳播的風險，以及確保fviii產(chǎn)品的充分供應(yīng)。然而，利用當前fviii產(chǎn)品獲得的止血保護因約8-12小時的短半衰期(t1/2)而在時間上受到限制，對于大部分患者來說需要每周三次或每隔一天一次預(yù)防性注射，以維持fviii水平高于1％，已確定所述水平對大部分自發(fā)性出血事件具有保護性。manco-johnson等,newengljmed.357(6):535-44(2007)。

許多研究顯示，即使在高劑量下，按需療法在預(yù)防關(guān)節(jié)病變方面也無效。aledortl.等,jinternmed.236:391-399(1994)；petrinip.等,amjpediatrhematoloncol.13:280-287(1991)。在眾多臨床研究中^4,6-15和manco-johnson等,同上已證明預(yù)防性療法的效益，確定在首次關(guān)節(jié)出血后開始初級預(yù)防的兒童具有比按需治療的兒童顯著較少的出血和較少關(guān)節(jié)損傷。

與按需治療相比，預(yù)防性療法也減少殘疾、住院率和從學?；蚬ぷ鲹p失的時間^6,16；并且改善患者及其家人的生活質(zhì)量¹⁷。然而，預(yù)防性療法在兒童中通常需要使用中樞性神經(jīng)接入裝置，并且其伴隨感染、敗血癥和血栓癥的風險。此外，盡管具有效益，但部分由于不便利性和侵入性，預(yù)防的接受度和依從性隨年齡而降低^18,19。因此，具有延長的血漿t1/2的rfviii產(chǎn)品將可能為有益的。lillicrapd.,currentopinioninhematology17:393-397(2010)。

rfviiifc為由單個b結(jié)構(gòu)域缺失的rfviii分子共價連接至人類igg1fc結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的重組融合蛋白。fc融合蛋白的潛在益處包括較佳耐受性和延長的止血保護，并且fc結(jié)構(gòu)域代表沒有已知固有毒性的天然分子^21,22。連接至igg1fc結(jié)構(gòu)域允許結(jié)合至在多種細胞類型(包括內(nèi)皮細胞)中表達的新生兒fc受體(fcrn)。fcrn表達在一生中保持穩(wěn)定并且負責保護igg1和fc融合蛋白免于溶酶體降解，因此延長蛋白質(zhì)的t1/2^21,23。循環(huán)內(nèi)的眾多蛋白質(zhì)經(jīng)由非特異性胞飲作用內(nèi)化至襯于血管上的細胞中并且運至內(nèi)體和溶酶體降解途徑。

fc蛋白與駐留于內(nèi)體中的fcrn相互作用。含有fcrn的內(nèi)體引導(dǎo)fc融合蛋白返回至質(zhì)膜，以ph依賴性方式將其釋放至循環(huán)中²⁴，從而避免溶酶體降解。這個再循環(huán)方法已成功用于延長治療性生物劑的t1/2；多種基于fc融合體的藥物已批準用于臨床用途(例如伊納西普(etanercept)、羅米斯汀(romiplostim))并且其它正在開發(fā)^25,26。

rfviiifc的臨床前數(shù)據(jù)表明可以通過由fcrn介導(dǎo)的天然保護性途徑使fviii免于降解，因此延長t1/2。在血友病a小鼠和狗中，rfviiifc的終末血漿t1/2為rfviii的約2倍長^27,28?；谶@些數(shù)據(jù)，我們進行首次人類臨床研究以在患有血友病a的受試者中研究持久rfviiifc融合蛋白的安全性和pk。

研究設(shè)計：在先前經(jīng)過治療的患有重度血友病a的患者中的此開放標記劑量遞增多中心1/2a期研究在與(抗馮·維勒布蘭德因子[重組]，血漿/無白蛋白方法，octocogalfa,baxterhealthcare)比較的情況下研究rfviiifc的安全性及其藥物代謝動力學(pk)。根據(jù)uscfr和ich良好臨床實踐指南(guidelinesongoodclinicalpractices)執(zhí)行此研究。在任何測試前，從參與機構(gòu)審查委員會(participatinginstitutionalreviewboards)獲得批準并且從所有受試者獲得書面知情同意書。研究設(shè)計為依序的；以25iu/kg或65iu/kg施用單次劑量的接著為相等劑量的rfviiifc(圖8)。兩種藥物均經(jīng)約10分鐘靜脈內(nèi)注射。預(yù)期所述兩種劑量水平囊括典型治療劑量范圍。受試者在接受rfviiifc后跟蹤28天以進行安全性分析，包括在注射后14和28天測試抗fviii抗體和抑制劑。在注射前、rfviiifc注射后10和30分鐘、1、3、6、9、24、48、72、96、120和168小時(7天)測量受試者中的血漿fviii活性，其中對于給予65iu/kgrfviiifc的受試者另外在192、216和240小時(10天)取樣。在治療后的相同時間點測量血漿fviii活性，對于25iu/kg組至72小時并且對于65iu/kg組至96小時。

受試者：男性受試者為至少12歲，患有重度血友病a(定義為fviii活性水平<1％)并且具有至少100次有記錄的先前fviii濃縮物(pdfviii或rfviii)暴露日。排除對于小鼠或倉鼠蛋白質(zhì)具有已知過敏性、篩選時具有抑制劑或可檢測抑制劑效價病史或服用任何可能影響止血的藥物或全身性免疫抑制性藥物或者在篩選30天以內(nèi)經(jīng)歷活性細菌或病毒感染(除肝炎或hiv以外)的受試者。當已知時，在研究登記時記錄受試者的基因型。

治療產(chǎn)品：人類rfviiifc和fc轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至hek293細胞中并且廣泛測試細胞系的穩(wěn)定性、無菌性和病毒污染以確保安全性。純化的藥品由單體b結(jié)構(gòu)域缺失的fviii通過其羧基端共價連接至fc單體的n端構(gòu)成，所述fc單體的n端在合成和從細胞分泌期間與第二fc單體形成二硫鍵。通過色譜和納米過濾純化rfviiifc，并且在單級和顯色凝結(jié)測定中相對于可商購獲得的rfviii制劑完全具有活性。它作為每2ml溶液含有1000iu并且用l-組氨酸(ph7)、氯化鈉、氯化鈣、蔗糖、甘露糖醇和聚山梨醇酯20調(diào)配的冷凍液體供應(yīng)。對于注射，將產(chǎn)品用鹽水溶液(0.9％nacl)稀釋。

結(jié)果測量：研究的主要目標為安全性，通過身體檢查、治療緊急性不良事件(ae)的報道、抗體的發(fā)展和隨時間的實驗室監(jiān)測進行評估。次級目標包括從pk分析獲得的參數(shù)。實驗室評定包括凝血酶原時間、活化的部分促凝血酶原激酶時間(aptt)、國際正規(guī)化比率、d二聚體水平、馮·維勒布蘭德因子(vwf)抗原、標準血液學和血液化學測試以及尿分析。

在siemensbcs-xp分析儀上使用商業(yè)試劑(dadeactinfsl)在針對可追蹤至關(guān)于人類血漿的世界衛(wèi)生組織(who)第5版國際標準(is)的正常參考血漿(precisionbiologicscryocheck^tm)校準下通過單級凝結(jié)(aptt)測定來測量fviii活性。除aptt測定外，還使用符合歐洲藥典推薦的可商購獲得的試劑盒(aniarabiophenfviii:c)通過顯色底物測定²⁹來測量fviii活性。針對也具有針對who第5版is人類血漿標準指定的效能的正常人類參考血漿(instrumentationlaboratoriesorke45)校準顯色測定。

單級和顯色測定的定量下限(lloq)分別為0.5iu/dl和0.4iu/dl。通過經(jīng)過-*nijmegen修改的貝塞斯達(bethesda)測定測量fviii抑制劑并且少于0.6bu/ml視為陰性。使用特異性橋接電化學發(fā)光免疫測定評定抗rfviiifc抗體，所述電化學發(fā)光免疫測定使用生物素和磺基標簽的rfviiifc。使用抗人類fviii單株抗體作為替代對照測得測定敏感性為89ng/ml。在各種時間點在兩名受試者(各劑量水平一名)中進行探索性全血旋轉(zhuǎn)血栓彈性描計法以評定注射和rfviiifc后全面止血作用的改善。

藥物代謝動力學分析：在winnonlin中利用用戶定義的一室配置模型(其自動估算內(nèi)源性fviii水平和后續(xù)殘余衰減)以便分析單次施用或rfviiifc后的單個受試者血漿fviii活性對時間數(shù)據(jù)。實際取樣時間、劑量和注射持續(xù)時間用于計算參數(shù)，包括最大活性(cmax)、t1/2、清除率(cl)、穩(wěn)態(tài)分布體積(vss)、曲線下面積(時間零外推至無窮大[aucinf])、平均滯留時間(mrt)以及增量回收率。

rfviiifc活性對時間曲線的蒙特卡洛仿真(montecarlosimulation)-為在25iu/kg或65iu/kg的給藥方案后構(gòu)建fviii活性-時間曲線，使用和rfviiifc的群體pk模型進行蒙特卡洛仿真。在此1/2a期研究中基于來自16名受試者的和rfviiifc的單級(aptt)凝結(jié)測定活性數(shù)據(jù)估算所測試群體中模型參數(shù)(cl、分布體積)的平均估算值、個體間方差和殘余可變性。對于每個給藥方案，以每名受試者的15個取樣點模擬五百名受試者。估算在或rfviiifc的不同給藥方案后的不同時間點fviii活性高于或等于1％和3％的群體的百分比。

統(tǒng)計分析-使用方差分析模型比較rfviiifc和的所選pk參數(shù)。對于這些分析將pk參數(shù)進行對數(shù)轉(zhuǎn)化，并且轉(zhuǎn)化對數(shù)尺度上的估算平均值、平均差異和信賴區(qū)間以分別獲得原始尺度上的幾何平均值、幾何平均比率(gmr)和信賴區(qū)間的估算。gmr為rfviiifcpk參數(shù)值與pk參數(shù)值的受試者內(nèi)比率的幾何平均值。

結(jié)果

受試者配置-十九名受試者入選所述研究；16名進行和rfviiifc的pk評估。一名受試者在給予后的洗脫期前自己施用其先前產(chǎn)品并且因此從pk分析中排除，但包括于安全性分析中。三名受試者在接受研究藥物前中斷研究：一名自愿退出；第二名因無依從性而由研究者使其退出；并且一名因完成研究入選而在資助者要求下退出。在給藥的受試者中，六名受試者接受25iu/kg并且10名受試者接受65iu/kg的和rfviiifc。平均年齡為40.3歲(23至61歲)。收集七名受試者的基因型鑒定；在六名受試者中報道內(nèi)含子22倒位；并且在一名受試者中報道移碼缺陷。九名受試者的基因型未知。十三名受試者具有c型肝炎抗體，其中四名還為hiv陽性。

安全性-在治療和追蹤期期間由11(69％)名受試者報道四十四次治療緊急性ae。這包括advate或rfviiifc給藥日至給藥后觀察期28天。大部分事件視為輕度并且沒有人導(dǎo)致從研究中退出。一次事件(味覺障礙)在一名受試者中在接受65iu/kg劑量的rfviiifc時短暫發(fā)生并且認為與rfviiifc有關(guān)。

一名受試者在接受65iu/kgrfviiifc后經(jīng)歷焦慮發(fā)作，65iu/kgrfviiifc導(dǎo)致21次ae，其中19次分級為輕度，并且其中兩次(頭痛和畏光)分級為中度。在研究者看來沒有一個與rfviiifc有關(guān)。

未報道嚴重出血事件。未檢測到對注射的過敏性反應(yīng)的證據(jù)。所有所測試的血漿樣品對于fviii抑制劑和抗rfviiifc抗體呈陰性。未觀察到注射部位反應(yīng)跡象。未報道異常實驗室值的臨床上有意義的變化。

藥物代謝動力學：血漿中rfviiifc的aptt與顯色活性之間的相關(guān)性-在相同測定中使用可商購獲得的試劑和針對正常人類血漿標準的校準測定和rfviiifc活性。在具有高于lloq的活性的樣品中通過單級凝結(jié)測定和顯色測定獲得的結(jié)果之間存在強相關(guān)性。在給予后的151個樣品與給予rfviiifc后的185個樣品分別的兩個測定結(jié)果之間觀察到0.94和0.95的相關(guān)性系數(shù)(pearsonr²)。與aptt結(jié)果相比，顯色fviii活性平均高21％(對于)和高32％(對于rfviiifc)，無統(tǒng)計顯著性(圖9)。此觀測結(jié)果導(dǎo)致由兩種藥物的顯色評定獲得的暴露量參數(shù)的評估稍高。由顯色測定獲得的明顯較高fviii回收率對于在臨床分析中所測試的重組fviii產(chǎn)品為典型的，并且與大部分其它市售fviii產(chǎn)品一致^30-32。

rfviiifc的改善的藥物代謝動力學-從單級(aptt)凝結(jié)測定活性數(shù)據(jù)推導(dǎo)出初級pk估算值。在相等劑量的rfviiifc后接受25iu/kg或65iu/kg的受試者中，血漿fviii活性急劇上升并且在給藥后一小時內(nèi)達到cmax。觀測到的fviii活性的后續(xù)下降展現(xiàn)出單指數(shù)衰減特征，直到達到基線fviii活性(圖10)。cmax與劑量成比例增加，但在相等劑量的與rfviiifc之間相當(表8)?？偙┞读?aucinf)也與劑量成比例增加。然而，rfviiifc的aucinf分別為25iu/kg(p＝0.002)和65iu/kg(p<0.001)的的aucinf的1.48和1.56倍高(表8)。

表8.每個劑量組中通過單級(aptt)測定獲得的rfviiifc和的pk參數(shù)

ci＝信賴區(qū)間；geom.mean＝幾何平均值；obs＝觀測值。轉(zhuǎn)化估算平均值、平均值的95％ci和平均差異以分別獲得估算幾何平均值、幾何平均值的95％ci和幾何平均值比率。

t1/2、mrt、cl和vss似乎與劑量無關(guān)(表8)。rfviiifc的t1/2幾何平均值對于25iu/kg和65iu/kg劑量組均為18.8小時。這表示在相等劑量下，相比于(12.2小時和11.0小時)分別得到1.54和1.70倍改善(p<0.001)(表8)。比較rfviiifc的mrt(對于兩個劑量組均為27.0小時)與的mrt(對于25iu/kg為17.5小時并且對于65iu/kg為15.8小時)，觀察到相同的受試者內(nèi)改善(p<0.001)。與t1/2和mrt的改善一致，在25iu/kg(p＝0.002)和65iu/kg(p<0.001)劑量下受試者內(nèi)cl分別具有相應(yīng)1.49和1.56倍降低。在與rfviiifc之間，vss和增量回收率無顯著差異。因此，在各受試者中，rfviiifc顯示與相比，pk概況得到改善。還觀察到，在時具有較短半衰期的患者在rfviiifc時具有較短半衰期，并且在時具有較長半衰期的患者在rfviiifc時具有較長半衰期。

rfviiifc的pk概況改善使得給藥后到達1％fviii活性的時間增加，所述時間在25iu/kg(p<0.001)和65iu/kg(p<0.001)下分別為時的1.53和1.68倍長(數(shù)據(jù)未示出)，表明rfviiifc的潛在較長治療持續(xù)時間。

rfviiifc相對于有利的pk概況也通過在顯色測定中測量的fviii活性證明(表9)，其與由aptt測定得到的數(shù)據(jù)相當。然而，和rfviiifc基于顯色測定的暴露量(即cmax和aucinf)的估算稍高于基于單級(aptt)凝結(jié)測定。

表9.每個劑量組中通過兩級(顯色)測定獲得的rfviiifc和的pk參數(shù)

ci＝信賴區(qū)間；geom.mean＝幾何平均值；obs＝觀測值。轉(zhuǎn)化估算平均值、平均值的95％ci和平均差異以分別獲得估算幾何平均值、幾何平均值的95％ci和幾何平均值比率。

馮·維勒布蘭德因子與rfviiifc配置之間的相關(guān)性-因為循環(huán)中的大部分fviii與vwf復(fù)合³³并且因為基因組聯(lián)合研究已鑒定出fviii水平的遺傳決定子主要取決于vwf水平³⁴，我們檢查了vwf與rfviiifc之間的聯(lián)合。在vwf水平與rfviiifc和兩者的cl和t1/2之間觀察到強相關(guān)性。如圖10中所示，隨著vwf的水平增加，rfviiifc(p＝0.0016)和(p＝0.0012)的cl降低。

在vwf的水平與t1/2之間觀察到相反關(guān)系。隨著vwf的水平增加，rfviiifc(p＝0.0003)和(p<0.0001)的t1/2增加。此相關(guān)性表明rfviiifc的fc部分不改變vwf在保護fviii免于清除方面的作用。

全血上rfviiifc的延長的pk的作用-在施用研究藥物之前，向來自各劑量組中一名受試者的血液中添加相等劑量的rfviiifc或并且通過全血進行分析。凝結(jié)時間(ct)在正常值的約1％至100％的范圍內(nèi)關(guān)于劑量呈線性，并且劑量反應(yīng)在同一受試者中在rfviiifc與之間相當(數(shù)據(jù)未示出)，表明在凝塊形成中rfviiifc與具有相當?shù)男堋?/p>

盡管在施用或rfviiifc之前，由于殘余fviii水平而具有可變基線ct，但兩種產(chǎn)品均在給藥后30分鐘在相當?shù)乃缴嫌行Ｕ齝t(圖12)。在25iu/kg的劑量3小時后(圖12a)并且在65iu/kg的劑量24小時后(圖12b)，ct的改善由rfviiifc獲得的維持優(yōu)于

rfviiifc在兩種劑量下受試者均良好耐受。在臨床上未觀測到血液學、血液化學和尿分析參數(shù)的顯著變化。大部分ae為輕度的，與rfviiifc無關(guān)，并且可消退而無后遺癥。在研究期間未發(fā)生嚴重ae或死亡，并且任一劑量的受試者均未發(fā)展針對rfviiifc的中和或結(jié)合抗體。

rfviiifc顯示相對于顯著改善fviii活性pk概況，其中如通過單級(aptt)凝結(jié)測定所測量，t1/2和mrt在整個劑量水平內(nèi)為1.54至1.71倍長，并且通過兩級顯色測定測量時為1.59至1.84倍長。rfviiifc的活性延長預(yù)示可能的功效延長，從而允許在預(yù)防性治療患有血友病a的患者時以較低頻率給藥的方案。

采用由此研究獲得的pk參數(shù)，蒙特卡洛仿真預(yù)測與接受相等劑量的的患者相比，較高百分比的接受rfviiifc的患者將維持fviii水平高于1％或3％(表10)。舉例來說，在25iu/kg的劑量下，預(yù)測12.2％的患者與71.2％的rfviiifc患者在第4天時具有高于1％的fviii谷水平；在65iu/kg的劑量下，預(yù)測11.0％的患者與66.4％的rfviiifc患者在第4天時具有高于3％的fviii含量。計劃在大量患者中進行臨床試驗以證實由此1/2a期研究和蒙特卡洛仿真預(yù)測獲得的結(jié)果。

表10.在或rfviiifc的指定劑量方案下達到高于正常值的1％和3％的fviii谷水平的受試者的預(yù)測百分比

盡管對于多種蛋白質(zhì)治療劑，fc融合體技術(shù)在延長循環(huán)t1/2中獲得成功，但認為rfviii太大從而不能成功產(chǎn)生二聚fc融合體。因此我們制成單體fc融合蛋白，由此將單個效應(yīng)分子共價連接至二聚fc，使得能夠結(jié)合細胞內(nèi)fcrn并且后續(xù)再循環(huán)^21,22。體外凝血測定通過凝結(jié)或顯色測定使用可商購獲得的試劑和常用fviii參考標準證明，與b結(jié)構(gòu)域缺失的或天然fviii相比，對于rfviiifc的比活性未降低(jad,tl,scl等，2011年8月提交的原稿)。此外，這些結(jié)果指示rfviiifc可以在臨床環(huán)境中通過單級測定或顯色方法可靠地分析。

總之，此1/2a期臨床試驗為第一次證明rfviiifc在患有重度血友病a的患者中的安全性和延長的t1/2的試驗。關(guān)鍵的第3期研究正利用rfviiifc在進行，以建立用于患有血友病a的受試者的有效預(yù)防給藥方案。

實施例11

由在生物合成期間在殘基r1648處的不完全蛋白水解產(chǎn)生的因子viii(fviii)的新型單鏈(sc)異構(gòu)體可提供相對于天然fviii優(yōu)良的可制造性和穩(wěn)定性。融合于免疫球蛋白fc結(jié)構(gòu)域的單一重組b結(jié)構(gòu)域缺失的因子viii分子(rfviiifc)及其純化的sc對應(yīng)物(sc-rfviiifc)在使用去除馮·維勒布蘭德因子(vwf)的血漿的單級凝結(jié)測定中顯示類似比活性，但sc-rfviiifc在vwf存在下顯示較低的比活性。進行此研究以確定vwf結(jié)合的rfviiifc、sc-rfviiifc和rbdd-fviii(refacto)在凝血酶介導(dǎo)的從vwf蛋白水解釋放方面是否不同。

將等摩爾量的rfviiifc、sc-rfviiifc和rbdd-fviii捕捉于通過氨偶合固定有人類vwf的光學生物傳感器芯片上。將一定濃度范圍的人類α-凝血酶輸注在芯片表面上，并且實時監(jiān)測fviii從固定的vwf釋放的速率。測定各fviii物質(zhì)的α-凝血酶的半最大有效濃度(ec50)。

rfviiifc和rbdd-fviii的α-凝血酶ec50值相當(分別為3.7±0.2u/ml和3.2±0.3u/ml)，而sc-rfviiifc的ec50值大于3倍高(11.7±0.9u/ml)。sc-rfviiifc從vwf的釋放比rfviiifc或rbdd-fviii緩慢的此發(fā)現(xiàn)與先前觀測到的在單級凝結(jié)測定(aptt)中關(guān)于rfviiifc和sc-rfviiifc的活性的發(fā)現(xiàn)一致，在所述測定中，僅當在測定血漿樣品中存在vwf時，sc-fviiifc具有較低表觀活性。然而，所有樣品在小鼠出血模型中具有相等活性，指示在fviii從vwf的釋放中fviii制劑對凝血酶的反應(yīng)性與體內(nèi)功效不相關(guān)。

表1：多核苷酸序列

a.b結(jié)構(gòu)域缺失的fviiifc

(i)b結(jié)構(gòu)域缺失的fviiifc鏈dna序列(fviii信號肽加有下劃線，fc區(qū)呈粗體)(seqidno:1，其編碼seqidno:2)

(ii)fcdna序列(小鼠igκ信號肽加有下劃線)(seqidno:3，其編碼seqidno:4)

b.全長fviiifc

(i)全長fviiifcdna序列(fviii信號肽加有下劃線，fc區(qū)呈粗體)(seqidno:5，其編碼seqidno:6)

(ii)fc(序列與a(ii)相同(seqidno：3))]

表2：多肽序列

a.b結(jié)構(gòu)域缺失的fviii-fc單體雜合體(bddfviiifc單體二聚體)：通過bddfviiifc和fc鏈共表達產(chǎn)生。

構(gòu)建體＝hc-lc-fc融合體。fc表達盒與bddfviii-fc共轉(zhuǎn)染以生成bddfviiifc單體-。對于bddfviiifc鏈，fc序列以粗體顯示；hc序列以雙重下劃線顯示；剩余b結(jié)構(gòu)域序列以斜體顯示。信號肽加有下劃線。

i)b結(jié)構(gòu)域缺失的fviii-fc鏈(19個氨基酸的信號序列加有下劃線)(seqidno：2)

ii)fc鏈(來自小鼠igκ鏈的20個氨基酸的異源信號肽加有下劃線)(seqidno：4)

metdtlllwvlllwvpgstg

dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

b.全長fviiifc單體雜合體(全長fviiifc單體二聚體)：通過fviiifc和fc鏈共表達產(chǎn)生。

構(gòu)建體＝hc-b-lc-fc融合體。fc表達盒與全長fviii-fc共轉(zhuǎn)染以生成全長fviiifc單體。對于fviiifc鏈，fc序列以粗體顯示；hc序列以雙重下劃線顯示；b結(jié)構(gòu)域序列以斜體顯示。信號肽加有下劃線。

i)全長fviiifc鏈(fviii信號肽加有下劃線)(seqidno：6)

ii)fc鏈(來自小鼠igκ鏈的20個氨基酸的異源信號肽加有下劃線)(seoidno:4)

metdtlllwvlllwvpgstg

dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

引用的參考文獻

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34.smithn.l.等,circulation121:1382-1392(2010).

序列表

<110>比奧根依蒙菲利亞公司

<120>因子viii嵌合和雜合多肽及其使用方法

<130>2159.354pc07/eks/c-k/cmg

<140>待指定

<141>同此

<150>us61/657,641

<151>2012-06-08

<150>us61/622,789

<151>2012-04-11

<150>us61/586,443

<151>2012-01-13

<150>us61/569,158

<151>2011-12-09

<150>us61/541,561

<151>2011-09-30

<150>us61/522,647

<151>2011-08-11

<150>us61/506,015

<151>2011-07-08

<160>16

<170>patentin3.5版

<210>1

<211>5052

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>b結(jié)構(gòu)域缺失的fviiifc鏈

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(57)

<223>fviii信號

<220>

<221>misc_feature

<222>(4372)..(5052)

<223>fc區(qū)

<400>1

atgcaaatagagctctccacctgcttctttctgtgccttttgcgattctgctttagtgcc60

accagaagatactacctgggtgcagtggaactgtcatgggactatatgcaaagtgatctc120

ggtgagctgcctgtggacgcaagatttcctcctagagtgccaaaatcttttccattcaac180

acctcagtcgtgtacaaaaagactctgtttgtagaattcacggatcaccttttcaacatc240

gctaagccaaggccaccctggatgggtctgctaggtcctaccatccaggctgaggtttat300

gatacagtggtcattacacttaagaacatggcttcccatcctgtcagtcttcatgctgtt360

ggtgtatcctactggaaagcttctgagggagctgaatatgatgatcagaccagtcaaagg420

gagaaagaagatgataaagtcttccctggtggaagccatacatatgtctggcaggtcctg480

aaagagaatggtccaatggcctctgacccactgtgccttacctactcatatctttctcat540

gtggacctggtaaaagacttgaattcaggcctcattggagccctactagtatgtagagaa600

gggagtctggccaaggaaaagacacagaccttgcacaaatttatactactttttgctgta660

tttgatgaagggaaaagttggcactcagaaacaaagaactccttgatgcaggatagggat720

gctgcatctgctcgggcctggcctaaaatgcacacagtcaatggttatgtaaacaggtct780

ctgccaggtctgattggatgccacaggaaatcagtctattggcatgtgattggaatgggc840

accactcctgaagtgcactcaatattcctcgaaggtcacacatttcttgtgaggaaccat900

cgccaggcgtccttggaaatctcgccaataactttccttactgctcaaacactcttgatg960

gaccttggacagtttctactgttttgtcatatctcttcccaccaacatgatggcatggaa1020

gcttatgtcaaagtagacagctgtccagaggaaccccaactacgaatgaaaaataatgaa1080

gaagcggaagactatgatgatgatcttactgattctgaaatggatgtggtcaggtttgat1140

gatgacaactctccttcctttatccaaattcgctcagttgccaagaagcatcctaaaact1200

tgggtacattacattgctgctgaagaggaggactgggactatgctcccttagtcctcgcc1260

cccgatgacagaagttataaaagtcaatatttgaacaatggccctcagcggattggtagg1320

aagtacaaaaaagtccgatttatggcatacacagatgaaacctttaagactcgtgaagct1380

attcagcatgaatcaggaatcttgggacctttactttatggggaagttggagacacactg1440

ttgattatatttaagaatcaagcaagcagaccatataacatctaccctcacggaatcact1500

gatgtccgtcctttgtattcaaggagattaccaaaaggtgtaaaacatttgaaggatttt1560

ccaattctgccaggagaaatattcaaatataaatggacagtgactgtagaagatgggcca1620

actaaatcagatcctcggtgcctgacccgctattactctagtttcgttaatatggagaga1680

gatctagcttcaggactcattggccctctcctcatctgctacaaagaatctgtagatcaa1740

agaggaaaccagataatgtcagacaagaggaatgtcatcctgttttctgtatttgatgag1800

aaccgaagctggtacctcacagagaatatacaacgctttctccccaatccagctggagtg1860

cagcttgaggatccagagttccaagcctccaacatcatgcacagcatcaatggctatgtt1920

tttgatagtttgcagttgtcagtttgtttgcatgaggtggcatactggtacattctaagc1980

attggagcacagactgacttcctttctgtcttcttctctggatataccttcaaacacaaa2040

atggtctatgaagacacactcaccctattcccattctcaggagaaactgtcttcatgtcg2100

atggaaaacccaggtctatggattctggggtgccacaactcagactttcggaacagaggc2160

atgaccgccttactgaaggtttctagttgtgacaagaacactggtgattattacgaggac2220

agttatgaagatatttcagcatacttgctgagtaaaaacaatgccattgaaccaagaagc2280

ttctctcaaaacccaccagtcttgaaacgccatcaacgggaaataactcgtactactctt2340

cagtcagatcaagaggaaattgactatgatgataccatatcagttgaaatgaagaaggaa2400

gattttgacatttatgatgaggatgaaaatcagagcccccgcagctttcaaaagaaaaca2460

cgacactattttattgctgcagtggagaggctctgggattatgggatgagtagctcccca2520

catgttctaagaaacagggctcagagtggcagtgtccctcagttcaagaaagttgttttc2580

caggaatttactgatggctcctttactcagcccttataccgtggagaactaaatgaacat2640

ttgggactcctggggccatatataagagcagaagttgaagataatatcatggtaactttc2700

agaaatcaggcctctcgtccctattccttctattctagccttatttcttatgaggaagat2760

cagaggcaaggagcagaacctagaaaaaactttgtcaagcctaatgaaaccaaaacttac2820

ttttggaaagtgcaacatcatatggcacccactaaagatgagtttgactgcaaagcctgg2880

gcttatttctctgatgttgacctggaaaaagatgtgcactcaggcctgattggacccctt2940

ctggtctgccacactaacacactgaaccctgctcatgggagacaagtgacagtacaggaa3000

tttgctctgtttttcaccatctttgatgagaccaaaagctggtacttcactgaaaatatg3060

gaaagaaactgcagggctccctgcaatatccagatggaagatcccacttttaaagagaat3120

tatcgcttccatgcaatcaatggctacataatggatacactacctggcttagtaatggct3180

caggatcaaaggattcgatggtatctgctcagcatgggcagcaatgaaaacatccattct3240

attcatttcagtggacatgtgttcactgtacgaaaaaaagaggagtataaaatggcactg3300

tacaatctctatccaggtgtttttgagacagtggaaatgttaccatccaaagctggaatt3360

tggcgggtggaatgccttattggcgagcatctacatgctgggatgagcacactttttctg3420

gtgtacagcaataagtgtcagactcccctgggaatggcttctggacacattagagatttt3480

cagattacagcttcaggacaatatggacagtgggccccaaagctggccagacttcattat3540

tccggatcaatcaatgcctggagcaccaaggagcccttttcttggatcaaggtggatctg3600

ttggcaccaatgattattcacggcatcaagacccagggtgcccgtcagaagttctccagc3660

ctctacatctctcagtttatcatcatgtatagtcttgatgggaagaagtggcagacttat3720

cgaggaaattccactggaaccttaatggtcttctttggcaatgtggattcatctgggata3780

aaacacaatatttttaaccctccaattattgctcgatacatccgtttgcacccaactcat3840

tatagcattcgcagcactcttcgcatggagttgatgggctgtgatttaaatagttgcagc3900

atgccattgggaatggagagtaaagcaatatcagatgcacagattactgcttcatcctac3960

tttaccaatatgtttgccacctggtctccttcaaaagctcgacttcacctccaagggagg4020

agtaatgcctggagacctcaggtgaataatccaaaagagtggctgcaagtggacttccag4080

aagacaatgaaagtcacaggagtaactactcagggagtaaaatctctgcttaccagcatg4140

tatgtgaaggagttcctcatctccagcagtcaagatggccatcagtggactctctttttt4200

cagaatggcaaagtaaaggtttttcagggaaatcaagactccttcacacctgtggtgaac4260

tctctagacccaccgttactgactcgctaccttcgaattcacccccagagttgggtgcac4320

cagattgccctgaggatggaggttctgggctgcgaggcacaggacctctacgacaaaact4380

cacacatgcccaccgtgcccagctccagaactcctgggcggaccgtcagtcttcctcttc4440

cccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtg4500

gtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggag4560

gtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtc4620

agcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtc4680

tccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccc4740

cgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtc4800

agcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagc4860

aatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgttggactccgacggctcc4920

ttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttc4980

tcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctg5040

tctccgggtaaa5052

<210>2

<211>1684

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>b結(jié)構(gòu)域缺失的fviii-fc鏈

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(19)

<223>信號

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(753)

<223>重鏈(hc)

<220>

<221>misc_feature

<222>(760)..(773)

<223>b結(jié)構(gòu)域

<220>

<221>misc_feature

<222>(1457)..(1684)

<223>fc區(qū)

<400>2

metglnilegluleuserthrcysphepheleucysleuleuargphe

151015

cyspheseralathrargargtyrtyrleuglyalavalgluleuser

202530

trpasptyrmetglnseraspleuglygluleuprovalaspalaarg

354045

pheproproargvalprolysserphepropheasnthrservalval

505560

tyrlyslysthrleuphevalgluphethrasphisleupheasnile

65707580

alalysproargproprotrpmetglyleuleuglyprothrilegln

859095

alagluvaltyraspthrvalvalilethrleulysasnmetalaser

100105110

hisprovalserleuhisalavalglyvalsertyrtrplysalaser

115120125

gluglyalaglutyraspaspglnthrserglnargglulysgluasp

130135140

asplysvalpheproglyglyserhisthrtyrvaltrpglnvalleu

145150155160

lysgluasnglyprometalaseraspproleucysleuthrtyrser

165170175

tyrleuserhisvalaspleuvallysaspleuasnserglyleuile

180185190

glyalaleuleuvalcysarggluglyserleualalysglulysthr

195200205

glnthrleuhislyspheileleuleuphealavalpheaspglugly

210215220

lyssertrphissergluthrlysasnserleumetglnaspargasp

225230235240

alaalaseralaargalatrpprolysmethisthrvalasnglytyr

245250255

valasnargserleuproglyleuileglycyshisarglysserval

260265270

tyrtrphisvalileglymetglythrthrprogluvalhisserile

275280285

pheleugluglyhisthrpheleuvalargasnhisargglnalaser

290295300

leugluileserproilethrpheleuthralaglnthrleuleumet

305310315320

aspleuglyglnpheleuleuphecyshisileserserhisglnhis

325330335

aspglymetglualatyrvallysvalaspsercysprogluglupro

340345350

glnleuargmetlysasnasngluglualagluasptyraspaspasp

355360365

leuthraspserglumetaspvalvalargpheaspaspaspasnser

370375380

proserpheileglnileargservalalalyslyshisprolysthr

385390395400

trpvalhistyrilealaalagluglugluasptrpasptyralapro

405410415

leuvalleualaproaspaspargsertyrlysserglntyrleuasn

420425430

asnglyproglnargileglyarglystyrlyslysvalargphemet

435440445

alatyrthraspgluthrphelysthrargglualaileglnhisglu

450455460

serglyileleuglyproleuleutyrglygluvalglyaspthrleu

465470475480

leuileilephelysasnglnalaserargprotyrasniletyrpro

485490495

hisglyilethraspvalargproleutyrserargargleuprolys

500505510

glyvallyshisleulysasppheproileleuproglygluilephe

515520525

lystyrlystrpthrvalthrvalgluaspglyprothrlysserasp

530535540

proargcysleuthrargtyrtyrserserphevalasnmetgluarg

545550555560

aspleualaserglyleuileglyproleuleuilecystyrlysglu

565570575

servalaspglnargglyasnglnilemetserasplysargasnval

580585590

ileleupheservalpheaspgluasnargsertrptyrleuthrglu

595600605

asnileglnargpheleuproasnproalaglyvalglnleugluasp

610615620

proglupheglnalaserasnilemethisserileasnglytyrval

625630635640

pheaspserleuglnleuservalcysleuhisgluvalalatyrtrp

645650655

tyrileleuserileglyalaglnthrasppheleuservalphephe

660665670

serglytyrthrphelyshislysmetvaltyrgluaspthrleuthr

675680685

leuphepropheserglygluthrvalphemetsermetgluasnpro

690695700

glyleutrpileleuglycyshisasnserasppheargasnarggly

705710715720

metthralaleuleulysvalsersercysasplysasnthrglyasp

725730735

tyrtyrgluaspsertyrgluaspileseralatyrleuleuserlys

740745750

asnasnalailegluproargserpheserglnasnproprovalleu

755760765

lysarghisglnarggluilethrargthrthrleuglnseraspgln

770775780

glugluileasptyraspaspthrileservalglumetlyslysglu

785790795800

asppheaspiletyraspgluaspgluasnglnserproargserphe

805810815

glnlyslysthrarghistyrpheilealaalavalgluargleutrp

820825830

asptyrglymetserserserprohisvalleuargasnargalagln

835840845

serglyservalproglnphelyslysvalvalpheglngluphethr

850855860

aspglyserphethrglnproleutyrargglygluleuasngluhis

865870875880

leuglyleuleuglyprotyrileargalagluvalgluaspasnile

885890895

metvalthrpheargasnglnalaserargprotyrserphetyrser

900905910

serleuilesertyrglugluaspglnargglnglyalagluproarg

915920925

lysasnphevallysproasngluthrlysthrtyrphetrplysval

930935940

glnhishismetalaprothrlysaspglupheaspcyslysalatrp

945950955960

alatyrpheseraspvalaspleuglulysaspvalhisserglyleu

965970975

ileglyproleuleuvalcyshisthrasnthrleuasnproalahis

980985990

glyargglnvalthrvalglngluphealaleuphephethrilephe

99510001005

aspgluthrlyssertrptyrphethrgluasnmetgluargasn

101010151020

cysargalaprocysasnileglnmetgluaspprothrphelys

102510301035

gluasntyrargphehisalaileasnglytyrilemetaspthr

104010451050

leuproglyleuvalmetalaglnaspglnargileargtrptyr

105510601065

leuleusermetglyserasngluasnilehisserilehisphe

107010751080

serglyhisvalphethrvalarglyslysgluglutyrlysmet

108510901095

alaleutyrasnleutyrproglyvalphegluthrvalglumet

110011051110

leuproserlysalaglyiletrpargvalglucysleuilegly

111511201125

gluhisleuhisalaglymetserthrleupheleuvaltyrser

113011351140

asnlyscysglnthrproleuglymetalaserglyhisilearg

114511501155

asppheglnilethralaserglyglntyrglyglntrpalapro

116011651170

lysleualaargleuhistyrserglyserileasnalatrpser

117511801185

thrlysgluprophesertrpilelysvalaspleuleualapro

119011951200

metileilehisglyilelysthrglnglyalaargglnlysphe

120512101215

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122012251230

glylyslystrpglnthrtyrargglyasnserthrglythrleu

123512401245

metvalphepheglyasnvalaspserserglyilelyshisasn

125012551260

ilepheasnproproileilealaargtyrileargleuhispro

126512701275

thrhistyrserileargserthrleuargmetgluleumetgly

128012851290

cysaspleuasnsercyssermetproleuglymetgluserlys

129513001305

alaileseraspalaglnilethralasersertyrphethrasn

131013151320

metphealathrtrpserproserlysalaargleuhisleugln

132513301335

glyargserasnalatrpargproglnvalasnasnprolysglu

134013451350

trpleuglnvalasppheglnlysthrmetlysvalthrglyval

135513601365

thrthrglnglyvallysserleuleuthrsermettyrvallys

137013751380

glupheleuileserserserglnaspglyhisglntrpthrleu

138513901395

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140014051410

serphethrprovalvalasnserleuaspproproleuleuthr

141514201425

argtyrleuargilehisproglnsertrpvalhisglnileala

143014351440

leuargmetgluvalleuglycysglualaglnaspleutyrasp

144514501455

lysthrhisthrcysproprocysproalaprogluleuleugly

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glyproservalpheleupheproprolysprolysaspthrleu

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metileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspval

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serhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspgly

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152015251530

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glyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysserarg

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lys

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<212>dna

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<220>

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<220>

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<223>小鼠igκ信號

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<220>

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<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>來自小鼠igκ鏈的異源信號

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245

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<213>人工序列

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<223>全長fviiifc

<220>

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<223>fviii信號

<220>

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<222>(1)..(19)

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<220>

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<223>hc

<220>

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<222>(760)..(1667)

<223>b結(jié)構(gòu)域

<220>

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<222>(2352)..(2578)

<223>fc區(qū)

<400>6

metglnilegluleuserthrcysphepheleucysleuleuargphe

151015

cyspheseralathrargargtyrtyrleuglyalavalgluleuser

202530

trpasptyrmetglnseraspleuglygluleuprovalaspalaarg

354045

pheproproargvalprolysserphepropheasnthrservalval

505560

tyrlyslysthrleuphevalgluphethrasphisleupheasnile

65707580

alalysproargproprotrpmetglyleuleuglyprothrilegln

859095

alagluvaltyraspthrvalvalilethrleulysasnmetalaser

100105110

hisprovalserleuhisalavalglyvalsertyrtrplysalaser

115120125

gluglyalaglutyraspaspglnthrserglnargglulysgluasp

130135140

asplysvalpheproglyglyserhisthrtyrvaltrpglnvalleu

145150155160

lysgluasnglyprometalaseraspproleucysleuthrtyrser

165170175

tyrleuserhisvalaspleuvallysaspleuasnserglyleuile

180185190

glyalaleuleuvalcysarggluglyserleualalysglulysthr

195200205

glnthrleuhislyspheileleuleuphealavalpheaspglugly

210215220

lyssertrphissergluthrlysasnserleumetglnaspargasp

225230235240

alaalaseralaargalatrpprolysmethisthrvalasnglytyr

245250255

valasnargserleuproglyleuileglycyshisarglysserval

260265270

tyrtrphisvalileglymetglythrthrprogluvalhisserile

275280285

pheleugluglyhisthrpheleuvalargasnhisargglnalaser

290295300

leugluileserproilethrpheleuthralaglnthrleuleumet

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aspleuglyglnpheleuleuphecyshisileserserhisglnhis

325330335

aspglymetglualatyrvallysvalaspsercysprogluglupro

340345350

glnleuargmetlysasnasngluglualagluasptyraspaspasp

355360365

leuthraspserglumetaspvalvalargpheaspaspaspasnser

370375380

proserpheileglnileargservalalalyslyshisprolysthr

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trpvalhistyrilealaalagluglugluasptrpasptyralapro

405410415

leuvalleualaproaspaspargsertyrlysserglntyrleuasn

420425430

asnglyproglnargileglyarglystyrlyslysvalargphemet

435440445

alatyrthraspgluthrphelysthrargglualaileglnhisglu

450455460

serglyileleuglyproleuleutyrglygluvalglyaspthrleu

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glyvallyshisleulysasppheproileleuproglygluilephe

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proargcysleuthrargtyrtyrserserphevalasnmetgluarg

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ileleupheservalpheaspgluasnargsertrptyrleuthrglu

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alaalaproalaserproalaproalaalaproseralaproalapro

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20