技術領域：

本發(fā)明涉及含有雜環(huán)化合物的醫(yī)藥配制品，具體涉及來自姜科植物的黃酮醇類化合物的抗瘤藥物制劑。

背景技術：
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肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的癌癥，是威脅人類生命和健康最大的惡性腫瘤之一，并在相當長的一段時間內將仍然是導致人類因癌癥死亡的首要疾病。全球肺癌的發(fā)病率和死亡率仍然居高不下，并呈繼續(xù)增長的趨勢，尤其在中國等經濟發(fā)展中國家。在我國，隨著工業(yè)化速度加快、環(huán)境污染加重、人口老齡化加劇，肺癌的癌癥負擔日益加重，迫切需要開發(fā)更有效的治療方法和藥物。目前，肺癌的控制已成為全世界廣泛關注的問題，手術、放療和化療是常見的西醫(yī)治療方法，目前中藥治療也日益受到重視。

山奈酚(kaempferol)主要來源于姜科植物山柰(kaempferiagalangall)的根莖，廣泛存在于各種水果、蔬菜及飲料中。山奈酚屬于黃酮醇類化合物，其化學名稱為3,5,7-trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4h-chromen-4-one，分子量為286.23，微溶于水，溶于熱乙醇，乙醚和堿，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等多種功效。但是，目前尚未見山奈酚具有抗肺癌作用的報道。

技術實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明要解決的技術問題是提供山奈酚的新用途，即在制藥中的新應用。

上述在制藥中的新應用即為，山奈酚在制備抗肺癌藥物中的應用。

上述應用中，所述的藥物由吳茱萸堿和醫(yī)學上可接受的輔料組成。

上述應用中，所述的藥物為片劑或注射劑。

本發(fā)明所述應用中的山奈酚與set7/9甲基轉移酶具有較好的親和力，在體外對肺癌細胞有很強的生長抑制作用。

附圖說明：

圖1為肺癌細胞活力與山奈酚濃度關系的曲線圖。

圖2為不同濃度的山奈酚與set7/9分子對接的效果圖。

圖3為山奈酚與set7/9進行熱轉移實驗的原理示意圖，其中，a圖中左邊為蛋白質免疫印跡電泳圖，右邊為統(tǒng)計曲線圖；b圖中左邊為蛋白質免疫印跡電泳圖，右邊為統(tǒng)計曲線圖。

圖4為不同濃度的山奈酚與set7/9共定位情況的顯微照片。

具體實施方式：

實驗例1：山奈酚對體外肺癌細胞的抑制作用

取對數生長的腫瘤細胞，以3000/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜，細胞生長狀態(tài)良好后，棄去原有的培養(yǎng)基，然后按照設計的山奈酚濃度作用于a549細胞5天后停止培養(yǎng)；然后加入0.5mg/ml的mtt溶液，處理4小時后，棄上清，最后加入150μldmso震蕩混勻，置于酶標儀中年測定其吸光度值(測定波長為570nm)。結果如圖1所示，山奈酚可明顯抑制肺癌細胞a549的生長。

實驗例2：分子對接技術分析山奈酚與set7/9結合能力情況

為了評估山奈酚與set7/9作用親和力。蛋白-配體的結合能量是由autodock4.2版進行對接。山奈酚配體的3d結構(pubchemcid:5280863)是通過openbabelgui軟件轉換為pdbqt格式。對于對接研究，蛋白靶標(ncbiproteinid:xp_016864150.1)的3d晶體結構被分配于蛋白序列比對。預期的蛋白配體復合物被最優(yōu)化以及根據經驗打分函數screenscore排名，從而評估配體-受體復合物的結合自由能以及ki值。結果如圖2所示，山奈酚-set7/9對接成功，山奈酚與set7/9有很好的結合能力，親和性很好。

實驗例3：細胞熱轉移實驗分析山奈酚與set7/9結合能力情況

不同濃度山奈酚處理a549細胞后，收集細胞，pbs清洗細胞，加入一定體積含蛋白酶抑制劑pmsf的pbs。用液氮反復凍融細胞團塊，然后置于離心機中4℃，20000g離心20分鐘，取上清，分成兩份，一份用山奈酚處理，一份用作dmso對照。室溫30分鐘孵育，每份取出6個10μl溶液，在abi常規(guī)pcr儀按照溫度梯度44℃、46℃、48℃、50℃、52℃、54℃加熱6分鐘，然后在室溫下平衡3分鐘。之后置于離心機中4℃，20000g離心20分鐘，取上清。其中上清中包含剩下的可溶蛋白，加入上樣緩沖液，用westernblot檢測分析。另一個以濃度梯度作曲線，以dmso，50，100，200，400，600，800μm山奈酚與a549細胞裂解液于上同樣的孵育過程以及處理方法。結果如圖3所示，山奈酚組灰度值下降比dmso組緩慢，具有統(tǒng)計學差異，說明山奈酚與set7/9有很好的結合能力。

實驗例4：激光共聚焦顯微技術分析山奈酚與set7/9結合能力情況

取對數生長的腫瘤細胞，種于共聚焦小皿中，于co2培養(yǎng)箱中孵育6小時。用pbs清洗細胞1-2次，加預冷甲醇，固定細胞30分鐘。棄去甲醇，用pbs清洗細胞3次，加0.5％triton-100處理細胞30分鐘。棄去0.5％triton-100，用pbs清洗細胞3次，加2％bsa封閉1小時。棄去封閉液，用pbs清洗細胞3次，加一抗于4℃過夜?；厥找豢?，用pbs清洗細胞3次，加二抗，于室溫孵育1小時?；厥斩梗胮bs清洗細胞3次，于488nm激發(fā)光，發(fā)射光515–535nm，直接捕獲圖像。用徠卡tcssp8共聚焦顯微鏡進行圖像的捕獲和分析。所有樣本的所有圖像在相同的參數下采集。結果如圖4所示，隨著山奈酚的濃度上升，與set7/9結合能力逐漸增強。

實驗例5：藥物制劑的制備例

例1(片劑)

取山奈酚10g和β-環(huán)糊精10g加入研缽，研磨攪拌20min，等量遞加法加入處方量的羧甲基淀粉鈉與淀粉，混合均勻，加入質量分數為10％的淀粉漿適量制軟材，2200μm篩制粒，60℃干燥，控制干顆粒水的質量分數在1％～2％，停止干燥，2200μm篩整粒，加入干顆粒的滑石粉質量分數為1％為潤滑劑，混合均勻，調節(jié)壓片機，壓制片重為200mg環(huán)糊精山奈酚片劑，每片含山奈酚50mg。

例2(亞微乳注射劑)

稱取山奈酚30mg加入5g注射用大豆油中，加熱攪拌使溶解制得油相；將2g磷脂經高速剪切分散于20ml注射用水中，加1.2g甘油制得水相。將油相和水相預熱至60℃，將油相加入水相中，高速剪切得初乳。高壓均質，一定壓力下均質數次，調節(jié)ph至6.5，補加注射用水至100ml，以0.22μm微孔濾膜擠出過濾，灌裝熔封，100℃流通蒸汽滅菌30min，即得。

技術特征：

技術總結
本發(fā)明涉及山奈酚在制備抗肺癌藥物中的應用。本發(fā)明所述應用中的山奈酚與SET7/9甲基轉移酶具有較好的親和力，在體外對肺癌細胞有很強的生長抑制作用。

技術研發(fā)人員：劉中秋;盧琳琳;何書貴;姬利延;馮潛;王瑩;戚笑笑;吳鵬;朱麗君
受保護的技術使用者：廣州中醫(yī)藥大學
技術研發(fā)日：2017.06.02
技術公布日：2017.08.11