本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及安石榴苷在制備治療或預(yù)防流感病毒感染引起的炎癥的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

流感病毒感染嚴重威脅著人類健康，給社會帶來嚴重的經(jīng)濟損失。1918年流感大流行，全世界范圍內(nèi)約有5億人感染，導(dǎo)致5000萬～1億人死亡。2009年爆發(fā)的豬流感波及200多個國家，導(dǎo)致約18000人死亡。2013年，出現(xiàn)在中國的高致病性禽流感h7n9再次引起人們對流感病毒及如何控制流感的關(guān)注。除了流感大爆發(fā)外，每年的季節(jié)性流感也給社會帶來很大的損失，在全球范圍內(nèi)約25萬人～50萬人死于流感。目前，流感感染的治療主要依賴于抗病毒治療?？共《舅幬镄枰诎Y狀出現(xiàn)后48小時內(nèi)服用才會有較好療效。況且，神經(jīng)氨酸酶抑制劑的耐藥株不斷出現(xiàn)，推出新療法的任務(wù)非常重要。研究顯示，單獨使用抗炎藥物或者抗病毒藥物和抗炎藥物聯(lián)合治療流感感染小鼠，可顯著提高小鼠存活率。這些研究提示，抑制流感引發(fā)的炎癥可以顯著改善流感感染的癥狀，同時，研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子ip-10敲除及用ip-10抗體治療都可以顯著提高流感感染后的小鼠存活率，說明ip-10在流感致病過程中發(fā)揮重要作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子通路和病毒復(fù)制通路雖有交叉點，但也有各自的特異性，所以，同時針對將兩者做藥物靶點，篩選出各自的抑制劑很有必要。

石榴不僅可以食用，而且具有很多醫(yī)用功能(降血脂、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗菌、治療糖尿病、治療腹瀉以及抗蠕蟲等)且無毒，已被用作中藥運用到很多疾病的治療中。在中國石榴果皮已經(jīng)被用于治療腹瀉、子宮不規(guī)則出血、子宮滲血、腹痛，石榴花用于治療糖尿病，在印度草藥醫(yī)學(xué)中其樹皮和根用作驅(qū)蟲藥，而在南非則用石榴果治療腹瀉。由于石榴功能眾多，且具有強大的抗氧化功能，現(xiàn)在已越來越受醫(yī)藥科研工作者的青睞。安石榴苷(punicalagin)是從石榴里提取的天然小分子化合物，目前并無安石榴苷在抑制流感病毒引起的炎癥，尤其是關(guān)鍵炎癥因子ip-10方面的作用的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，是在于提供了安石榴苷在制備治療或預(yù)防流感病毒感染引起的炎癥的藥物中的應(yīng)用，安石榴苷在無毒性范圍內(nèi)能夠有效地抑制受流感病毒感染的細胞分泌ip-10，這是一種新靶點，因此可進一步開發(fā)為抗炎藥物，具有廣泛的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的保護范圍包括還不限于：安石榴苷在制備抑制流感病毒誘導(dǎo)的炎癥因子ip-10的藥物中的應(yīng)用、安石榴苷在制備抑制polyi:c誘導(dǎo)的炎癥因子ip-10的分泌藥物中的應(yīng)用、安石榴苷在制備同時抑制流感病毒復(fù)制及其誘導(dǎo)的炎癥因子ip-10的分泌的藥物中的應(yīng)用。

為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

安石榴苷在制備治療或預(yù)防流感病毒感染引起的炎癥中的應(yīng)用，安石榴苷英文名punicalagin,化學(xué)名為2,3-(s)-hexahydroxydiphenoyl-4,6-(s,s)-gallagyl-d-glucose，具有結(jié)構(gòu)式ⅰ所示的結(jié)構(gòu)式：

其中：h為氫，o為氧，-oh為羥基。

安石榴苷在制備治療或預(yù)防流感病毒感染引起的炎癥的藥物中的應(yīng)用，其步驟是：

a.藥物對a549與293t的細胞毒性實驗：a549細胞按1×10⁴個細胞/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，細胞貼壁后加入用培養(yǎng)基稀釋的各濃度的藥物，每組重復(fù)三個孔，置于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后，alamarblue法檢測細胞的存活率。結(jié)果顯示，安石榴苷對a549與293t的cc50(半數(shù)致死濃度)>100μm。

b.藥物對流感病毒誘導(dǎo)的炎癥因子ip-10的分泌抑制效果評價：將a549細胞鋪于96孔板，每孔10⁴個，待細胞貼壁后，用100μl的10⁵pfu/ml的pr8(h1n1)感染細胞1小時。1小時后，棄病毒液，細胞pbs洗兩次后，添加梯度稀釋后的藥物溶液。比較加藥組和對照組中流感病毒和炎癥因子的水平，確定藥物的抗病毒和抗炎效果。一列設(shè)為陰性對照孔，一列感染病毒但不加藥孔，其余孔添加3倍梯度稀釋的藥物，每個濃度3個平行，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。加藥培養(yǎng)48h后收取培養(yǎng)上清，檢測上清液病毒復(fù)制水平以及ip-10分泌量。結(jié)果顯示安石榴苷可以劑量依賴的抑制培養(yǎng)基上清中的流感病毒神經(jīng)氨酸酶(na)活性以及ip-10的分泌量，對na的ec50為35.1μm。對ip-10的ec50為0.8μm。

c.藥物對流感病毒rna模擬物(polyi:c)誘導(dǎo)的炎癥因子ip-10的分泌抑制作用研究：poly(i:c)(聚肌苷酸胞苷酸)是一種合成的雙鏈rna(dsrna)類似物，能夠誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生炎癥因子，與病毒復(fù)制無關(guān)。將293t鋪于96孔板，每孔10⁴個，24小時后進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時，每孔加入lipo0.3μl，poly(i:c)濃度為1μg/ml，轉(zhuǎn)染溶劑(opti-mem)為10μl。將lipo和poly(i:c)加入對應(yīng)的opti-mem中。然后將二者徹底震蕩混勻，靜置5分鐘后加入相應(yīng)的培養(yǎng)基中，分別加入到細胞中，每孔100ul。1小時后，棄上清，細胞用pbs洗兩次后，添加梯度稀釋后的藥物溶液。為比較加藥組和對照組流感病毒和炎癥因子的水平，確定藥物的抗病毒和抗炎效果。一列設(shè)為陰性對照孔，一列轉(zhuǎn)染polyi:c但不加藥物處理，其余孔添加3倍梯度稀釋的藥物，每個濃度3個平行，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞加藥培養(yǎng)48h后收取培養(yǎng)上清，用elisa檢測試劑盒檢測培養(yǎng)上清中ip-10含量。結(jié)果顯示，安石榴苷對ip-10的ec50為1.3μm。由此可見，安石榴苷是通過對炎癥信號通路的抑制來實現(xiàn)其抗炎效果。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果：

1.安石榴苷在大鼠體內(nèi)的生物利用度和代謝、毒性已被充分研究，其生物利用度高，毒性小，代謝途徑明確。

2.在對安石榴苷進行抗炎研究中發(fā)現(xiàn)其是以ip-10為靶點實現(xiàn)抗炎效果的?，F(xiàn)在臨床上尚未有可以有效抑制ip-10的藥物。而此化合物可以直接抑制ip-10的分泌，將有可能治療流感病毒感染引起的炎癥。

附圖說明

圖1為安石榴苷對不同細胞的毒性檢測示意圖；

其中圖1a為安石榴苷對a549的細胞毒性檢測示意圖；圖1b為安石榴苷對293t的細胞毒性檢測示意圖。

圖2為安石榴苷對流感病毒誘導(dǎo)的炎癥因子ip-10的分泌抑制效果示意圖。

圖3為安石榴苷對poly(i:c)誘導(dǎo)的炎癥因子ip-10的分泌抑制效果示意圖。

具體實施方式

為了更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面結(jié)合具體實施方法對本發(fā)明內(nèi)容作進一步說明，但本發(fā)明的保護內(nèi)容不局限于以下實施例。

細胞培養(yǎng)模型是最常用的篩選模型，其優(yōu)點在于：可提供大量遺傳性狀相同的細胞為研究對象，操作方便，可消除其它外界因素的影響，并可以檢測藥物的有效濃度和治療指數(shù)，為后期機理研究提供更多基礎(chǔ)。本發(fā)明采用了能夠大量分泌炎癥因子ip-10的細胞系a549和293t檢測安石榴苷抗炎活性。

實施例1：

安石榴苷抑制流感病毒引起炎癥的評價

1.實驗材料

1.1細胞和藥物

a549購自atcc，pr8(h1n1)病毒由雞胚培養(yǎng)得到。安石榴苷購于四川維克奇生物科技有限公司。

1.2試劑

1640，dmem培養(yǎng)基和胎牛血清(fbs)購自gibco公司；人源檢測試劑盒購于武漢博士德生物科技有限公司；opti-mem、lipo2000、alamarblue試劑購自invitrogen公司。

2.實驗方法與結(jié)果

細胞于37℃，5％co2加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用含有10％fbs、100u/ml的青霉素和鏈霉素的1640(a549)與dmem(293t)培養(yǎng)基。細胞至90％匯合度后傳代，傳代比例1/3–1/4。細胞按1×10⁴個細胞/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，細胞貼壁后備用；用培養(yǎng)基將安石榴苷進行梯度稀釋，每梯度3個復(fù)孔。培養(yǎng)48h后棄去培養(yǎng)上清，于每孔中加入100ul含有10％alamarblue試劑的新的培養(yǎng)基，置細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)2h后用多功能檢測儀分別測量熒光和吸光值，計算細胞存活率。

結(jié)果顯示(圖1a、1b):安石榴苷對a549與293t的cc50>100μm

實施例2：

安石榴苷抑制流感病毒復(fù)制以及流感誘導(dǎo)的炎癥因子ip-10分泌的檢測

1.實驗材料

1.1細胞和藥物

a549購自atcc，pr8(h1n1)病毒由雞胚培養(yǎng)得到。安石榴苷購于四川維克奇生物科技有限公司。

1.2試劑

1640，dmem培養(yǎng)基和胎牛血清(fbs)購自gibco公司；人源檢測試劑盒購于武漢博士德生物科技有限公司；opti-mem、lipo2000、alamarblue試劑購自invitrogen公司。

2.實驗方法與結(jié)果

將a549鋪于96孔板，每孔10⁴個，待細胞貼壁后，用10⁵pfu/ml的pr8(h1n1)感染細胞1小時。1小時后，棄病毒液，細胞用pbs洗兩次后，添加梯度稀釋后的藥物溶液。為比較加藥組和對照組流感病毒和炎癥因子的水平，確定藥物的抗病毒和抗炎效果。一列設(shè)為陰性對照孔，一列感染病毒但不加藥孔，其余孔添加梯度稀釋的藥物，每個濃度3個平行，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。加藥培養(yǎng)48h后收取培養(yǎng)上清，檢測上清液病毒復(fù)制水平，2'-(4-methylumbelliferyl)-α-d-acetylneuraminicacid(munana)是na的特異性熒光底物。將40μl病毒上清和20μl的20μm的munana放入96孔黑色optiplates。37℃孵育1小時后，用wallacenvision多標(biāo)記讀板機讀板(激發(fā)光355nm，發(fā)射光485nm)，na活性可以代表流感病毒在細胞上的復(fù)制情況。用elisa檢測試劑盒檢測培養(yǎng)上清中ip-10含量。

結(jié)果顯示(圖2):安石榴苷可以劑量依賴的抑制培養(yǎng)基上清中的na活性以及ip-10的分泌量，經(jīng)spss軟件計算，在a549細胞中安石榴苷在作用48h對na的ec50為35.1μm。對ip-10的ec50為0.8μm，提示安石榴苷對ip-10的抑制效果要好于對流感病毒復(fù)制的抑制效果。

實施例3：

安石榴苷抑制病毒rna模擬物(polyi:c)誘導(dǎo)的炎癥因子ip-10的分泌檢測

1.1細胞和藥物

293t細胞購自atcc，安石榴苷購于四川維克奇生物科技有限公司。

1.2試劑

1640培養(yǎng)基，dmem培養(yǎng)基和胎牛血清(fbs)購自gibco公司；人源檢測試劑盒購于武漢博士德生物科技有限公司；opti-mem、lipo2000、alamarblue試劑購自invitrogen公司。

2.實驗方法與結(jié)果

將293t細胞鋪于96孔板，每孔10⁴個，待細胞貼壁后，24小時后進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時，每孔lipo0.3μl，poly(i:c)濃度為1μg/ml，轉(zhuǎn)染溶劑(opti-mem)為10μl。將lipo和poly(i:c)加入對應(yīng)的opti-mem中。然后將二者徹底震蕩混勻，靜置5分鐘后加入相應(yīng)的培養(yǎng)基中，分別加入到細胞中，每孔100ul。1小時后，棄上清，細胞用pbs洗兩次后，添加梯度稀釋后的藥物溶液。為比較加藥組和對照組流感病毒和炎癥因子的水平，確定藥物的抗病毒和抗炎效果。一列設(shè)為陰性對照孔，一列轉(zhuǎn)染poly(i:c)但不加藥處理，其余孔添加梯度稀釋的藥物，每個濃度3個平行，細胞于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞加藥培養(yǎng)48h后收取培養(yǎng)上清，用elisa檢測試劑盒檢測培養(yǎng)上清中ip-10含量。

結(jié)果顯示(圖3):安石榴苷可以劑量依賴的抑制培養(yǎng)基上清中ip-10的分泌量，經(jīng)spss軟件計算，在293t細胞中安石榴苷在作用48h對ip-10的ec50為1.3μm，提示安石榴苷是通過對炎癥信號通路的抑制來實現(xiàn)其抗炎效果。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。