本發(fā)明涉及抗癌藥物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種通過調(diào)控shh信號(hào)通路抑制白血病干細(xì)胞更新和增殖的一種藥物。
背景技術(shù)：
：萊菔硫烷（sulforaphane，sfn）是一種存在于西蘭花和其它十字花科蔬菜中的異硫氰酸鹽物質(zhì)，具有抗增殖能力，目前研究發(fā)現(xiàn)sfn對(duì)卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，是一種新型的抗癌成分。但是，sfn對(duì)造血腫瘤細(xì)胞的作用及機(jī)制則報(bào)道較少。急性白血病是一類造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病，白血病細(xì)胞因?yàn)樵鲋呈Э?、分化障礙、凋亡受阻等機(jī)制在骨髓和其它造血組織中大量增殖，并浸潤(rùn)其它組織和器官，同時(shí)正常造血受到抑制。近年來研究發(fā)現(xiàn)在白血病患者體內(nèi)除了含有大量白血病細(xì)胞外，也存在著一群比例極少的白血病干細(xì)胞（leukemiastemcells，lscs），能夠自我更新、無限增殖、分化為白血病原始細(xì)胞。白血病干細(xì)胞的免疫標(biāo)志有cd34+、cd38-、cd71-、hla-dr-、cd90-、cdll7-和cdl23+，且公認(rèn)的cd34+、cd38-、cdl23+是lsc表面的主要標(biāo)志。白血病細(xì)胞在特定條件下可逆轉(zhuǎn)為lscs，lscs的多少是影響患者育后的重要因素之一。目前的觀點(diǎn)認(rèn)為白血病復(fù)發(fā)、耐藥及育后不良與lscs相關(guān)?；焹H能殺傷白血病原始細(xì)胞，而對(duì)lscs無效，這部分干細(xì)胞便是復(fù)發(fā)耐藥及育后不良的根源。只有清除lscs才有可能根治白血病。在各類成人白血病中，以急性髓系白血?。╝cutemyeloidleukaemia，aml）發(fā)病率最高，且化療緩解率較低。并且化療具有嚴(yán)重的毒副作用，這些化療的局限性促使研究者一直努力尋找一種更加有效、特異性更高且毒副作用低的能夠替代或聯(lián)合治療白血病的藥物。hedgehog信號(hào)通路與細(xì)胞的自我更新有關(guān)。正常情況下，該信號(hào)通路處于關(guān)閉狀態(tài)。該信號(hào)的缺失可導(dǎo)致多個(gè)臟器的畸形，而其異常激活則與多種腫瘤形成有關(guān)。sonichedgehog（shh）作為hedgehog基因家族成員之一，與多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系，另有多項(xiàng)研究表明shh信號(hào)通路維持腫瘤干細(xì)胞的自我更新特性。kgla細(xì)胞來源于男性急性髓系白血病耐藥的細(xì)胞株，其高表達(dá)cd34和cd123，低表達(dá)cd38，處于白血病干祖細(xì)胞早期發(fā)育階段，其具有白血病干細(xì)胞的特征，是目前研究白血病干細(xì)胞的理想模型。本發(fā)明以不同濃度的sfn作用kg1a細(xì)胞，觀察其對(duì)kg1a細(xì)胞自我更新和增殖能力的的影響，分析sfn抑制kg1a細(xì)胞增殖的作用和機(jī)制。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供了一種通過調(diào)控shh信號(hào)通路抑制白血病干細(xì)胞更新和增殖的藥物。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題采用如下技術(shù)方案，通過調(diào)控shh信號(hào)通路抑制白血病干細(xì)胞更新和增殖的一種藥物，其特征在于：該藥物的功能成分為萊菔硫烷。進(jìn)一步優(yōu)選，所述的白血病干細(xì)胞為急性白血病干細(xì)胞kg1a。本發(fā)明首次探討了sfn對(duì)急性白血病干細(xì)胞kg1a的自我更新和增殖的作用，結(jié)果表明sfn通過調(diào)控shh信號(hào)通路抑制急性白血病細(xì)胞的自我更新和增殖，這不僅是理論上的突破，而且具有潛在的臨床意義，sfn可以作為一種治療白血病的潛在候選藥物，為急性白血病的治療提供了新的思路。附圖說明圖1是sfn作用kgla細(xì)胞后對(duì)cd34+/cd38-、cd34+/cdl23+和cdl23+/cd38-表達(dá)影響圖；圖2是sfn作用kgla細(xì)胞后對(duì)kgla細(xì)胞增殖能力影響圖；圖3是sfn作用kgla細(xì)胞不同時(shí)間對(duì)kgla細(xì)胞增殖能力影響圖；圖4是sfn作用kgla細(xì)胞后對(duì)kgla細(xì)胞自我更新與增殖能力影響圖；圖5是qpcr技術(shù)檢測(cè)sfn作用kgla細(xì)胞后shh信號(hào)通路中的正向調(diào)控因子shh、smo和gli1變化圖；圖6是westernbloting技術(shù)檢測(cè)sfn作用kgla細(xì)胞后shh信號(hào)通路中的正向調(diào)控因子shh、smo和gli1變化圖。具體實(shí)施方式以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不應(yīng)該將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)驗(yàn)材料：萊菔硫烷（批號(hào)28911701）購(gòu)自美國(guó)lktlaboratories公司，純度98%。1640培養(yǎng)液和胎牛血清為美國(guó)gibco公司產(chǎn)品。cck-8試劑盒購(gòu)自日本dojindo公司，pemouseanti-humancd34、fitcmouseanti-humancd123和apcmouseanti-humancd38為美國(guó)bd公司產(chǎn)品，甲基纖維束細(xì)胞克隆培養(yǎng)基為美國(guó)干細(xì)胞公司，rna提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、superrealpremax（sybrgreen）購(gòu)自上海天根生物公司，兔抗人shhmab、smomab、gli1mab均為美國(guó)abcam公司產(chǎn)品，抗人gapdhpab，及hrp-羊抗兔pab為世紀(jì)康為公司提供。流式細(xì)胞儀（facscaibur型）為美國(guó)bd公司產(chǎn)品，mk3酶標(biāo)儀、abi7300型實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀和nd2000超微量分光光度計(jì)系美國(guó)thermo公司產(chǎn)品，凝膠圖像分析系統(tǒng)由英國(guó)genegenius公司生產(chǎn)，流式細(xì)胞儀為美國(guó)bd公司。eclipseti-s倒置顯微鏡購(gòu)自日本nikon公司，為美國(guó)thermal公司產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)步驟：1、細(xì)胞培養(yǎng)人急性髓系白血病細(xì)胞kgla細(xì)胞株由本室保存，以含10wt%胎牛血清rpmi1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中預(yù)先加入青霉素l00u/ml、鏈霉素100ug/ml、谷氨酰胺100μmol/l，置于體積分?jǐn)?shù)為5%的co2培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及時(shí)換液傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞做后續(xù)試驗(yàn)。2、流式分析收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，1500r/min離心5min，pbs洗滌3次，用1mlpbs重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，取50ul細(xì)胞懸液，加入cd38apc1ul、cd123fitc1ul、cd34pe1ul，避光反應(yīng)20min，用pbs洗掉未反應(yīng)的熒光，加入500ulpbs重懸細(xì)胞，每管獲取10000個(gè)細(xì)胞，用cellquest分析軟件分析。3、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)將傳代培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期kg1a細(xì)胞，計(jì)數(shù)，按照每孔細(xì)胞密度為1×105/l接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，分別加入終濃度分別為0、2、4、6、8、10、12μmol/l的sfn（0.9%ns溶解稀釋為2×103μmol/l），37℃培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入cck-8試劑10ul繼續(xù)孵育4h，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀od值為450nm處測(cè)量各孔的od值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。細(xì)胞相對(duì)存活率=（實(shí)驗(yàn)組-空白組）/（對(duì)照組-空白組）×100%。同時(shí)，在光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。根據(jù)kg1a細(xì)胞存活率，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，選取合適sfn濃度做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。4、腫瘤球?qū)嶒?yàn)將甲基纖維素細(xì)胞克隆形成培養(yǎng)基放在4℃冰箱中過夜，次日取出，搖動(dòng)混勻，分別取出3ml培養(yǎng)基放置于離心管中，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用pbs洗滌，按照1×103cells/ml濃度接種至甲基纖維素細(xì)胞培養(yǎng)集中.震蕩混勻后，移至培養(yǎng)皿中，置于體積分?jǐn)?shù)為5%的co2培養(yǎng)箱中于37℃繼續(xù)培養(yǎng)。7天后觀察細(xì)胞的集落數(shù)和集落大小，顯微鏡下拍照。5、westernbloting分析shh的蛋白收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用冰預(yù)冷的sds裂解緩沖液溶解20min，12000×g離心15min，抽提蛋白，bca蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白含量，蛋白上樣量為30μg，10wt%sds-page電泳；電轉(zhuǎn)到pvdf膜，5wt%的脫脂奶粉封閉，1:1000一抗4℃過夜，tbst洗膜3次之后，1:5000二抗室溫2h，再用tbst洗滌3次，ecl化學(xué)發(fā)光液顯影拍照。用imagej對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。7、qpcr檢測(cè)smo、gli1和shh的mrna表達(dá)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用trizol法提取總rna，用核酸蛋白定量?jī)x檢測(cè)rna純度和濃度，純度在1.8-2.0之間，濃度在1-3μg/μl。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cdna，轉(zhuǎn)錄體系為20ul。shh(f)5’-cgcacctgctctttgtgg-3’，(r)5’-ggagcggttagggctactct-3’；smo(f)5’-tcgctaccctgctgttattc-3’，(r)5’-gacgcaggacagagtctcat-3’；gli1(f)5’-ctggatcggataggtggtct-3’，(r)5’-cagaggttgggaggtaagga-3’；bata-actin為內(nèi)參基因。pcr反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1min，按95℃5s、55℃30s和72℃延伸1min進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，產(chǎn)物從60℃加熱至95℃反應(yīng)20min，以確定pcr產(chǎn)物的特異性，2-??ct作為目的基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：表1sfn對(duì)kg1a細(xì)胞cd34、cd38和cd123表達(dá)的影響cd34+cd38-cd34+cd123+cd123+cd38-作用前97.72%78.37%79.2%作用后79.81%*6.14%*3.2%**與作用前相比，p<0.051、流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示kg1a細(xì)胞中富含白血病干細(xì)胞，cd34+/cd38-占97.72%，cdl23+/cd38-占79.2%，是一種符合研究白血病干細(xì)胞的細(xì)胞株。利用8μmol/l的sfn作用于kg1a細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)cd34+/cd38-、cd34+/cdl23+和cdl23+/cd38-的表達(dá)明顯下降（圖1）。表1顯示sfn作用于kg1a細(xì)胞后cd34+/cd38-、cd34+/cdl23+和cdl23+/cd38-的表達(dá)明顯下降，與sfn作用前相比*p﹤0.05。2、利用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)cck8試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)sfn具有抑制kg1a細(xì)胞增殖的作用，并且kg1a細(xì)胞的增殖能力隨著sfn濃度和作用時(shí)間的增加逐漸呈下降趨勢(shì)（圖2）。在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞增殖能力也符合以上結(jié)果，8μmol/l的sfn作用于kg1a細(xì)胞后，隨時(shí)間延長(zhǎng)kg1a細(xì)胞的數(shù)量減少（圖3）。3、細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)顯示kg1a細(xì)胞在甲基纖維素細(xì)胞克隆培養(yǎng)基上可以形成集落的能力，進(jìn)一步說明kg1a細(xì)胞的干細(xì)胞特性，具有不斷的自我更新和增殖能力，利用sfn進(jìn)行干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)kg1a形成的集落數(shù)數(shù)和腫瘤球的體積受到抑制（圖4）。4、利用qpcr和westernbloting技術(shù)檢測(cè)8μmol/l的sfn作用于kg1a細(xì)胞后，shh信號(hào)通路中的正向調(diào)控因子shh、smo和gli1出現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)三次，*p﹤0.05（圖5和圖6）。以上實(shí)施例描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及優(yōu)點(diǎn)，本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明原理的范圍下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)均落入本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)。sequencelisting<110>新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院<120>通過調(diào)控shh信號(hào)通路抑制白血病干細(xì)胞更新和增殖的一種藥物<130>2017<160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>18<212>rna<213>人工序列<400>1cgcacctgctctttgtgg18<210>2<211>20<212>rna<213>人工序列<400>1ggagcggttagggctactct20<210>3<211>20<212>rna<213>人工序列<400>1tcgctaccctgctgttattc20<210>4<211>20<212>rna<213>人工序列<400>1gacgcaggacagagtctcat20<210>5<211>20<212>rna<213>人工序列<400>1ctggatcggataggtggtct20<210>6<211>20<212>rna<213>人工序列<400>1cagaggttgggaggtaagga20當(dāng)前第1頁12