本發(fā)明屬于藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及人法尼酯衍x受體激動劑在抑制脂肪肉瘤方面的新用途。

背景技術(shù)：

軟組織肉瘤(softtissuesarcoma,sts)是一組源于黏液、纖維、脂肪、平滑肌、滑膜、橫紋肌、間皮、血管和淋巴管等結(jié)締組織的惡性腫瘤。軟組織腫瘤的發(fā)病率在2/10萬之內(nèi)，約占全部惡性腫瘤的1％。好發(fā)于青少年和45～55歲中年人。其具有局部復發(fā)和晚期遠處轉(zhuǎn)移的特征。在美國，估計每年有11,930例sts新病例和4870例死亡。

脂肪肉瘤(lps)是最常見的sts，并大約占成年軟組織肉瘤患者中的20％，多發(fā)于肢體和腹膜后。根據(jù)2002年世界衛(wèi)生組織(who)的分類標準，脂肪肉瘤分為5個組織亞型，歸類為3個生物學類型：①高分化脂肪肉瘤(welldifferentiatedliposarcoma,wdlps)和去分化脂肪肉瘤(dedifferentiatedliposarcoma,ddlps)；②黏液細胞型脂肪肉瘤(myxoidliposarcoma,mls)和圓型細胞型脂肪肉瘤(roundcellliposarcoma,rcls)；③多形性脂肪肉瘤(plemorphicliposarcoma,pls)。根據(jù)具體的亞型和位置，脂肪肉瘤可以在超過80％的病例中復發(fā)，其死亡率從1～90％不等，腫瘤的位置以及大小是重要的預后因素。

手術(shù)切除是目前主要治療手段，但往往難以完全切除，術(shù)后復發(fā)率高，多次復發(fā)者復發(fā)間期逐漸縮短，手術(shù)切除機會也降低。脂肪肉瘤反復復發(fā)手術(shù)往往導致患者肢體缺失或重要臟器功能的障礙，而且放化療等對脂肪肉瘤效果都不明顯。目前，脂肪肉瘤總的術(shù)后5年生存率為40％-60％，患者多數(shù)死于腫瘤的局部復發(fā)引起的并發(fā)癥。近年來，雖然關(guān)于脂肪肉瘤的分子機制研究取得很大進展，但這并未能顯著改善脂肪肉瘤的治療現(xiàn)狀。因此，我們迫切地需要開發(fā)新的診斷標記和治療靶點。

在脂肪肉瘤的多種亞型中，去分化和高分化脂肪肉瘤作為最常見的病理類型，目前臨床上卻無反應良好的藥物，使得不能手術(shù)切除或發(fā)生復發(fā)的患者難以獲得良好的治療。而黏液細胞型的脂肪肉瘤，雖然對多柔吡星聯(lián)合異環(huán)磷酰胺的化療方案敏感，但該方案對患者具有較大的生理負擔，常因多種不良反應發(fā)生而被迫停藥，影響患者的治療。

臨床上，ddlps比wdlps更具侵略性，轉(zhuǎn)移率約15-20％，并且5年總生存(os)與wdlps的90％相比只有30％，可見ddlps的惡性程度要遠高于wdlps。約有10％的初始分化良好的脂肪肉瘤復發(fā)時，可表現(xiàn)為去分化區(qū)域的特征。組織病理學研究顯示，高分化脂肪肉瘤移行為去分化脂肪肉瘤之后，腫瘤細胞惡性程度升高并且伴隨著細胞分化能力的減弱或喪失，那么通過促進去分化脂肪肉瘤細胞重新分化，是否有可能降低腫瘤的惡性程度，并抑制腫瘤的某些生物學特性呢？發(fā)明人隨即將誘導去分化脂肪肉瘤脂分化以改善脂肪肉瘤的惡性程度確定為研究的新思路。

法尼酯衍生物x受體(farnesoidxreceptor，fxr)，又稱為nr1h4，屬于核受體超家族成員。具有典型的核受體結(jié)構(gòu)，即包括氨基端配體非依賴的轉(zhuǎn)錄活化域(af-1)、dna結(jié)合域(dbd)、鉸鏈區(qū)、配體結(jié)合域(lbd)和羧基端配體依賴的轉(zhuǎn)錄活化域(af-2)等。fxr通過和視黃醛衍生物受體(retinoidxreceptor,rxr)形成異源二聚體，與特定dna反應元件(ir-1)結(jié)合，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達。生理狀態(tài)下fxr調(diào)控一系列代謝相關(guān)基因的表達，在糖代謝中發(fā)揮重要作用。

不同惡性腫瘤具有不同的發(fā)病機制和特點。近年來，文獻報導了fxr可以在不同腫瘤中表現(xiàn)出不同的作用。在肝癌和睪丸間質(zhì)瘤中可以抑制腫瘤的生長，而在食管癌和胰腺癌中可以促進腫瘤的生長。說明fxr在不同腫瘤中，依據(jù)腫瘤特點不同，可能發(fā)揮抑制或促進的作用。fxr在脂肪肉瘤該種惡性腫瘤的作用未有報道及研究。

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)fxr受體激動劑誘導多種亞型的脂肪肉瘤細胞分化，抑制脂肪肉瘤的增值、遷移，侵襲。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

法尼酯x受體(fxr)是一種膽汁酸激活的核激素受體，屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。本發(fā)明提供了fxr激動劑在制備治療脂肪肉瘤相關(guān)疾病藥物中的用途，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)fxr激動劑能誘導一種或多種亞型的脂肪肉瘤細胞分化，抑制脂肪肉瘤的增殖、遷移、侵襲，從而提供了fxr激動劑在治療脂肪肉瘤方面的新應用。

本發(fā)明所述的fxr激動劑優(yōu)選自：6-ecdca、way-362450、gw4064、int-767、px-104、cdca、udca，體外實驗顯示6-ecdca、way-362450、gw4064、int-767、px-104、cdca、udca可抑制多種脂肪肉瘤細胞系的增殖能力、克隆能力和侵襲力，并且具有促進脂肪肉瘤細胞分化的作用，而在pdx脂肪肉瘤小鼠口服fxr激動劑實驗中，顯示6-ecdca、way-362450、gw4064、int-767、px-104、cdca、udca具有腫瘤抑制效果。

具體而言，本發(fā)明的6-ecdca，6-乙基鵝去氧膽酸，又名奧貝膽酸(6-ethylchenodeoxycholicacid,oca)，是人初級膽汁酸中鵝去氧膽酸的一種新型衍生物，為法尼酯x受體(farnesoidxreceptor,fxr)的天然配體，其具有式(ⅰ)的結(jié)構(gòu)，其化學式為：分子式c26h44o44，分子量420.63。

本發(fā)明的gw4064是一種完全激動劑，1μm濃度時對其它核受體依然沒有活性，包括維甲酸受體。因此，gw4064是一種強有效和選擇性的非類固醇fxr激動劑，其具有式(ⅱ)的結(jié)構(gòu)，其化學式為：c28h22cl3no4，分子量為542.84。

本發(fā)明的way-362450，又稱turofexorateisopropyl(xl335)，是一種有效的、選擇性的fxr激動劑，ec50為4nm，其具有式(ⅲ)的結(jié)構(gòu)，其化學式為：c25h24f2n2o3，分子量為438.47。

本發(fā)明的int-767是一種fxr/tgr5雙激動劑，其具有式(ⅳ)的結(jié)構(gòu)，其化學式為：c25h43nao6s，分子量為494.66。

本發(fā)明的px-104是一種有效的、選擇性的fxr激動劑，其具有式(ⅴ)的結(jié)構(gòu)，其化學式為：c29h22cl3no4，分子量為554.85。

本發(fā)明的cdca(鵝去氧膽酸)是一種有效的、選擇性的fxr激動劑，其具有式(ⅵ)的結(jié)構(gòu)，其化學式為：c24h40o4，分子量為392.58。

本發(fā)明的udca(熊去氧膽酸)是一種有效的、選擇性的fxr激動劑，其具有式(ⅵ)的結(jié)構(gòu)，其化學式為：c24h40o4，分子量為392.58。

基于以上發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供法尼酯x受體激動劑，包括6-ecdca、way-362450、gw4064、int-767、px-104、cdca、udca：式(ⅰ)、(ⅱ)、(ⅲ)、(ⅳ)、(ⅴ)、(ⅵ)和(ⅶ)的化合物治療脂肪肉瘤方面的新應用，其優(yōu)點為體外實驗顯示可抑制多種脂肪肉瘤細胞系的增殖能力、遷移能力和侵襲能力，并且具有促進脂肪肉瘤細胞分化的作用，小鼠口服法尼酯x受體激動劑6-ecdca、way-362450、gw4064、int-767、px-104、cdca、udca顯示法尼酯x受體激動劑具有脂肪肉瘤腫瘤抑制效果。

在一個實施方式中，本發(fā)明提供式(ⅰ)、(ⅱ)、(ⅲ)、(ⅳ)、(ⅴ)、(ⅵ)和(ⅶ)的化合物抑制多種脂肪肉瘤細胞系的增殖能力、遷移能力和侵襲能力。

在一個實施方式中，本發(fā)明提供式(ⅰ)的化合物誘導脂肪肉瘤細胞脂肪源性分化，促進細胞脂肪堆積。

在一個實施方式中，本發(fā)明提供式(ⅰ)、(ⅱ)、(ⅲ)、(ⅳ)、(ⅴ)、(ⅵ)和(ⅶ)的化合物在小鼠脂肪肉瘤pdx模型中顯著可以抑制脂肪肉瘤增長速度。

在一個實施方式中，所述藥物還包括任何活性或非活性的成分。在一個實施方式中，所述藥物還包含藥學上可接受的賦形劑。

在一個實施方式中，本發(fā)明藥物可與任何活性或非活性的成分聯(lián)合制備或聯(lián)合給藥。

在一個實施方式中，本發(fā)明藥物制備成適合口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部、透皮、經(jīng)眼、經(jīng)鼻、局部、吸入、皮下、肌內(nèi)、口含、舌下或直腸給藥的劑型。在一個實施方式中，本發(fā)明藥物劑型包括但不限于片劑、膠囊、丸劑、顆粒制劑、注射液。

附圖說明

圖1是6-ecdca抑制脂肪肉瘤細胞的遷移，左側(cè)6-ecdca是實驗組，右側(cè)nc為對照組。

圖2是gw4064抑制脂肪肉瘤細胞的遷移，左側(cè)gw4064是實驗組，右側(cè)nc為對照組。

圖3是way-362450抑制脂肪肉瘤細胞的遷移，左側(cè)way-362450是實驗組，右側(cè)nc為對照組。

圖4是int-767抑制脂肪肉瘤細胞的遷移，左側(cè)int-767是實驗組，右側(cè)nc為對照組。

圖5是px-104抑制脂肪肉瘤細胞的遷移，左側(cè)px-104是實驗組，右側(cè)nc為對照組。

圖6是cdca抑制脂肪肉瘤細胞的遷移，左側(cè)cdca是實驗組，右側(cè)nc為對照組。

圖7是udca抑制脂肪肉瘤細胞的遷移，左側(cè)udca是實驗組，右側(cè)nc為對照組。

圖8是6-ecdca誘導脂肪肉瘤細胞分化，6孔板內(nèi)細胞生長到約50％～60％時，分組分別滴加激動劑6-ecdca以及陰性對照組(只加dmso)，進行油紅染色。6-ecdca處理組油紅染色率高，表明6-ecdca處理脂肪肉瘤細胞發(fā)生了分化。

圖9是6-ecdca、way-362450、gw4064、int-767、px-104、cdca、udca，在去分化脂肪肉瘤小鼠pdx模型中，都顯示了顯著的腫瘤抑制效果。

圖10是6-ecdca、way-362450、gw4064、int-767、px-104、cdca、udca，在粘液型脂肪肉瘤小鼠pdx模型中，都顯示了顯著的腫瘤抑制效果。

圖11是6-ecdca口服處理的實驗裸小鼠，進行油紅染色發(fā)現(xiàn)其腫瘤發(fā)生了較對照組更明顯的分化，細胞脂肪堆積增加。

具體實施方式

在描述本發(fā)明材料和方法之前，應該理解本發(fā)明不限于所述的具體方法、方案、材料和試劑，因為其可以不同。還應理解本文所用的術(shù)語僅僅出于描述具體實施方式的目的，而并非旨在限制僅由隨后提交的非臨時申請所限定的本發(fā)明范圍。

除非另有定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的意義。雖然可采用與本文所述那些相似或等效的任何方法和材料來實施或測試本發(fā)明，但目前描述的是優(yōu)選的方法和材料。本文具體提及的所有出版物和專利通過引用納入本文以用于所有目的，包括描述和公開出版物中報道的可與本發(fā)明聯(lián)用的化學物質(zhì)、儀器、統(tǒng)計學分析和方法。本說明書中引用的所有參考文獻應視作表明本領(lǐng)域的技術(shù)水平。本文所有內(nèi)容均不應理解為承認本發(fā)明本能憑借在先發(fā)明而先于這些公開內(nèi)容。

i.概述

如本文所用，術(shù)語“包含”、“包括”和其等同形式包括“含有”以及“由……組成”的含義，例如“包含”x的組合物可僅由x組成或可含有其它物質(zhì)，例如x+y。

除非上下文中另有明確指示，否則本文和所附權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式“一個”、“一種”和“該”包括復數(shù)指示物。同樣，術(shù)語“一個”(或“一種”)、“一種或多種”和“至少一個”在本文可互換使用。

如本文所用，術(shù)語“脂肪肉瘤”是成人最常見的軟組織肉瘤，也可見于青少年和兒童。脂肪肉瘤通常體積較大，一般為深在性、無痛性、逐漸長大的腫物，最常發(fā)生于下肢(如腘窩和大腿內(nèi)側(cè))、腹膜后、腎周、腸系膜區(qū)以及肩部。在不同部位的發(fā)生率主要取決于該腫瘤的亞型，包括非典型性脂肪瘤性腫瘤/高分化脂肪肉瘤，去分化脂肪肉瘤，黏液樣脂肪肉瘤，多形性脂肪肉瘤，混合型脂肪肉瘤。

如本文所用，“pdx”是指來源于患者原代腫瘤組織的腫瘤移植模型(patient-derivedxenograft模型，pdx模型)。是當前臨床前藥效的評估以及生物標志物的鑒定的研發(fā)手段。與使用細胞系建立的腫瘤模型相比，pdx模型減少了體外培養(yǎng)步驟，保持臨床腫瘤細胞的形態(tài)和分子生物學特征，因而用該模型做出的藥效結(jié)果將更為準確，與臨床試驗結(jié)果更為接近。

如本文所用，術(shù)語“核受體超家族”是一組配體(包括固醇類激素、維生素d、蛻化素、9-順式和全部反式視黃酸、甲狀腺激素、脂肪酸、氧化甾醇、前列腺素j2、白三烯b4、法呢醇代謝產(chǎn)物等)激活的轉(zhuǎn)錄因子家族，通過在信號分子與轉(zhuǎn)錄應答間建立聯(lián)系，調(diào)控著細胞的生長和分化。在人類，核受體家族包含48個成員，例如ppar、fxr、lxr、vdr、rxr等。近年來，核受體家族在代謝性疾病領(lǐng)域受到廣泛的關(guān)注，已有研究證明，它們與糖尿病、脂肪肝等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，也被稱為代謝性核受體。

如本文所用，術(shù)語“過氧化物酶體增殖物激活受體(ppar)”是核激素受體家族中的配體激活受體，在不同的物種中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了它的3種亞型，控制許多細胞內(nèi)的代謝過程，屬于配體誘導核受體(ligand-induciblenuclearreceptors)。ppars與配體結(jié)合激活后，與視黃醇類x受體(rxr)形成異二聚體，形成的pparγ/rxr異二聚體與靶基因啟動子上游的ppar反應元件(ppre)結(jié)合，最終調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。其配體為脂溶性分子，受體與配體結(jié)合后，主要通過調(diào)節(jié)靶基因的表達產(chǎn)生生物效應。ppars與各自的配體結(jié)合后引起本身的構(gòu)象的變化，促進或抑制靶基因的表達。

如本文所用，術(shù)語“激動劑”指的是促進核受體激動表達的藥劑，也叫誘導劑。本發(fā)明所述激動劑包括了配體的誘導劑以及受體天然配體的衍生物。本發(fā)明所述6-ecdca，是法尼酯衍生物x受體天然配體鵝脫氧膽酸的衍生物。6-ecdca是fxr配體中激動效率較高的激動劑。

如本文所用，術(shù)語“抑制”指藥物或化合物在脂肪肉瘤細胞系的體外實驗或者pdx的體內(nèi)實驗中，使得脂肪肉瘤細胞的增長速度低于對照組，或者使得脂肪肉瘤細胞在細胞遷移實驗、克隆形成實驗或者增殖實驗中的功能低于對照組。

如本文所用，術(shù)語“去分化”指高分化型脂肪肉瘤移行為去分化為去分化脂肪肉瘤的過程，伴隨著細胞分化能力的減弱或喪失和腫瘤細胞侵襲力的增強，發(fā)生去分化之后的脂肪肉瘤細胞被認為具有更差的遠期生存率和預后。

本發(fā)明涉及將化合物以治療有效量給予患者?；衔锟蓡为毥o予或作為藥學上可接受的組合物的一部分來給予。此外，化合物或組合物可例如通過推注一次性全部給予、例如通過一系列片劑多次給予、或例如通過使用透皮遞送在一段時間內(nèi)基本上均勻地遞送。另外，化合物的劑量可隨時間而變化?？墒褂眉瘁屝椭苿?、控釋型制劑或其組合來給予化合物。

本發(fā)明的藥物組合物可以單一單位劑量或以多種單一單位劑量制備、包裝或大批出售。如本文中所用，“單位劑量”為包含預定量的活性成分的藥物組合物的個別量。活性成分的量通常等于將給予患者的活性成分的劑量或此劑量的適當比率，例如，此劑量的二分之一或三分之一。

在一個實施方式中，本發(fā)明的化合物單獨給藥。在另一個實施方式中，本發(fā)明化合物與其它活性或非活性的成分聯(lián)合給藥，在另一個實施方式中，本發(fā)明化合物與其它活性或非活性的成分聯(lián)合制備。

本發(fā)明的藥物組合物中的活性成分、藥學上可接受的載體和任何附加成分的相對量將根據(jù)所治療的人的種類、身材和病癥而變化，并且還根據(jù)所述組合物的給予途徑而變化。舉例而言，所述組合物可包含0.1％-100％(w/w)的活性成分?；蛘弑景l(fā)明藥物組合物包含3μm–20μm奧貝膽酸，優(yōu)選3μm、5μm、10μm、20μm奧貝膽酸。在一個實施方式中，本發(fā)明藥物組合物包含100μm鵝去氧膽酸。

如本文中所用，“給藥”包括將本發(fā)明的化合物引入身體，優(yōu)選引入全身循環(huán)的任何方式。本發(fā)明的化合物可以通過任何有效途徑來給藥，包括但不限于口服、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部、透皮、經(jīng)眼、經(jīng)鼻、局部、吸入、皮下、肌內(nèi)、口含、舌下、直腸給藥等。

本發(fā)明的藥物組合物可以制備成任何適當?shù)膭┬?，例如片劑、膠囊、丸劑、顆粒制劑、注射液、栓劑、氣霧劑、泡騰片、滴劑、滴丸劑、滴眼劑、滴鼻劑、眼用軟膏劑、含漱劑、舌下片劑、粘貼片、貼膜劑、溶液劑、洗劑、搽劑、軟膏劑、硬膏劑、糊劑等。本發(fā)明所述劑型還包括固體或可注射植入物或貯存劑。

適于注射的組合物包含與藥學上可接受的載體例如生理學上可接受的無菌水溶液或非水溶液、分散體、懸浮液或乳劑聯(lián)用的活性成分，或可包含用于在無菌可注射溶液或分散體中復溶的無菌粉末。合適的水性和非水性載體、稀釋劑、溶劑或載劑的實例包括水、等滲鹽水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、其合適的混合物、甘油三酯，包括植物油如橄欖油，或可注射的有機酯如油酸乙酯。可例如通過使用包衣如卵磷脂、如果是分散體則通過保持所需粒度、和/或通過使用表面活性劑來保持適當?shù)牧鲃有?。此類制劑可以適于推注給予或連續(xù)給予的形式制備、包裝或出售?？勺⑸渲苿┛梢詥挝粍┬椭苽洹b或出售，例如安瓿瓶、包含防腐劑的多劑量容器或用于自動注射或通過醫(yī)師注射的單次使用裝置。

藥物組合物還以可注射的無菌水性或油性(乳劑)懸浮液或溶液的形式制備、包裝或出售。此懸浮液或溶液可根據(jù)本領(lǐng)域已知技術(shù)進行配制，并且除了活性成分還可包含附加成分，例如本文所述的分散劑、潤濕劑或懸浮劑。例如，可使用胃腸外可接受的無毒稀釋劑或溶劑例如水或1,3-丁二醇來制備此類無菌可注射制劑。其它可接受的稀釋劑和溶劑包括林格溶液、等滲氯化鈉溶液和非揮發(fā)性油類，例如合成單甘油酯或二甘油酯。其它有用的胃腸外可接受的制劑包括含活性成分的那些制劑，所述活性成分呈微晶形式、在脂質(zhì)體制劑中或作為可生物降解聚合物體系的一部分。用于緩釋或植入的組合物可包含藥學上可接受的聚合或疏水材料，例如乳劑、離子交換樹脂、微溶聚合物或微溶鹽。

根據(jù)本發(fā)明的化合物還可包含佐劑，例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和/或分散劑，包括例如對羥基苯甲酸脂、氯代丁醇、酚、山梨酸等。還可能需要包括等滲劑，例如糖、氯化鈉等?？赏ㄟ^使用能延遲吸收的藥劑例如單硬脂酸鋁和/或明膠來引起可注射藥物組合物的長期吸收。具體而言，其中可用脂質(zhì)體、膠粒和乳化劑，從而使本發(fā)明化合物更易于溶解以便遞送。

用于口服給予的固體劑型包括膠囊、片劑、粉末和顆粒。在此類固體劑型中，活性化合物與至少一種常規(guī)惰性賦形劑(或載體)混合，所述賦形劑例如檸檬酸鈉或磷酸二鈣或(a)填料或增量劑，例如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖醇或硅酸；(b)粘結(jié)劑，例如羧甲基纖維素、海藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖或阿拉伯樹膠；(c)濕潤劑，例如甘油；(d)崩解劑，例如，瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、藻酸、某些復合硅酸鹽或碳酸鈉；(e)溶液緩聚劑，例如石蠟；(f)吸收加速劑，例如季銨化合物；(g)潤濕劑，例如鯨蠟醇或單硬脂酸甘油酯；(h)吸附劑，例如高嶺土或膨潤土；和/或(i)潤滑劑，例如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉或它們的混合物。在膠囊和片劑的情況中，劑型還可包含緩沖劑。

片劑可例如通過壓縮或模制活性成分來制備，其任選地包含一種或多種附加成分。可通過在合適的裝置中將活性成分壓縮為自由流動形式(如粉末或顆粒制劑)來制備壓縮片劑，所述活性成分任選地與粘結(jié)劑、潤滑劑、賦形劑、表面活性劑和分散劑中的一種或多種混合?？赏ㄟ^在合適的裝置中對活性成分、藥學上可接受的載體和至少足以潤濕混合物的液體的混合物進行模制來制備模制片劑。

用于生產(chǎn)片劑的藥學上可接受的賦形劑包括惰性稀釋劑、成粒劑和崩解劑、粘結(jié)劑和潤滑劑。已知的分散劑包括馬鈴薯淀粉和羥乙酸淀粉鈉。已知的表面活性劑包括月桂基硫酸鈉。已知的稀釋劑包括碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、微晶纖維素、磷酸鈣、磷酸氫鈣和磷酸鈉。已知的成粒劑和崩解劑包括玉米淀粉和藻酸。已知的粘結(jié)劑包括明膠、阿拉伯樹膠、預膠凝的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和羥丙基甲基纖維素。已知的潤滑劑包括硬脂酸鎂、硬脂酸、硅石和滑石。

片劑可未經(jīng)包衣或其可使用已知的方法包衣以實現(xiàn)在人體胃腸道中的延遲崩解，從而使活性成分持續(xù)釋放和吸收。舉例而言，例如甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯的材料可用于對片劑進行包衣。片劑還可包含甜味劑、調(diào)味劑、染色劑、防腐劑或這些的某種組合，以提供藥學上優(yōu)質(zhì)的和可口的制劑。

可制備具有包衣或外殼，例如腸溶包衣和本領(lǐng)域中熟知的其它包衣的固體劑型，如片劑、糖衣丸劑、膠囊和顆粒。其還可包含遮光劑，并且還可具有使其以延遲方式釋放活性化合物的組合物?？捎玫陌窠M合物的實例為聚合物和蠟。活性化合物還可呈微囊化形式，適當時具有上述賦形劑中的一種或多種。

相似類型的固體組合物可在使用如乳糖或奶糖、以及高分子量聚乙二醇等作為賦形劑的軟質(zhì)或硬質(zhì)明膠填充的膠囊中用作填料。可使用可生理降解的組合物如明膠來制備包含活性成分的硬質(zhì)膠囊。此類硬質(zhì)膠囊包含活性成分，并且還可包含附加成分，包括例如惰性固體稀釋劑如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土?？墒褂每缮斫到獾慕M合物如明膠來制備包含活性成分的軟質(zhì)明膠膠囊。此類軟質(zhì)膠囊包含可與水或油介質(zhì)如花生油、液體石蠟或橄欖油混合的活性成分。

可使用已知技術(shù)來制備口腔組合物，其專門在人類患者的小腸或大腸內(nèi)釋放口服給予的藥劑。例如，用于遞送至胃腸系統(tǒng)(包括結(jié)腸)的制劑包括腸溶衣系統(tǒng)，其基于例如僅在ph6及以上溶解的甲基丙烯酸酯共聚物如聚(甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯)，從而所述聚合物只有在進入小腸時才開始溶解。所述聚合物制劑崩解的位置取決于小腸通過速率和所含聚合物的量。例如，相對較厚的聚合物包衣用于遞送至結(jié)腸近端。還可使用能夠提供位置特異性結(jié)腸遞送的聚合物，其中所述聚合物依賴于大腸菌落來提供聚合物包衣的酶促降解從而釋放藥物。例如，偶氮聚合物、配糖物以及各種天然獲得和修飾的多糖可用于此類制劑中。

用于口服給予的液體劑型包括藥學上可接受的乳劑、溶液、懸浮液、糖漿和酏劑。除了活性化合物之外，液體劑型可包含本領(lǐng)域中常用的惰性稀釋劑例如水或其它溶劑、等滲鹽水、增溶劑和乳化劑，例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、芐醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油類，具體為杏仁油、花生油、椰子油、棉籽油、落花生油、玉米胚油、橄欖油、蓖麻油、芝麻油、甘油、分餾的植物油、礦物油如液體石蠟、四氫糠醇、聚乙二醇、脫水山梨糖醇的脂肪酸酯或這些物質(zhì)的混合物等。

除了這些惰性稀釋劑之外，本發(fā)明的化合物還可包括佐劑如潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、緩和劑、防腐劑、緩沖劑、鹽、甜味劑、調(diào)味劑、染色劑和芳香劑。除了活性化合物之外，懸浮液還可包含懸浮劑例如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯或脫水山梨糖醇酯、微晶纖維素、氫化的食用脂、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍膠、阿拉伯樹膠、瓊脂和纖維素衍生物如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤土或這些物質(zhì)的混合物等。適于口服給予的本發(fā)明藥物組合物的液體制劑可以液體形式或以旨在使用前用水或另一合適的載劑復溶的干燥產(chǎn)品的形式來制備、包裝和出售。

已知的分散劑或潤濕劑包括天然存在的磷脂如卵磷脂，環(huán)氧烷與脂肪酸、與長鏈脂族醇、與衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯、或與衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的縮合產(chǎn)物(例如分別為聚氧乙烯硬脂酸酯、十七基乙烯氧基鯨蠟醇、聚氧乙烯山梨糖醇單油酸酯和聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯)。已知的乳化劑包括卵磷脂和阿拉伯樹膠。已知的防腐劑包括甲基、乙基或正丙基-對-羥基苯甲酸、抗壞血酸和山梨酸。已知的甜味劑包括例如，甘油、丙二醇、山梨醇、蔗糖和糖精。已知的用于油性懸浮液的增稠劑包括例如蜂蠟、硬石蠟和鯨蠟醇。

活性成分在水性或油性溶劑中的液體溶液可以基本上與液體懸浮液相同的方式進行制備，主要的不同之處在于活性成分是溶解而非懸浮在溶劑中。本發(fā)明藥物組合物的液體溶液可包含關(guān)于液體懸浮液所述的各組分，應理解懸浮劑未必有助于活性成分在溶劑中的溶解。水性溶劑包括例如水和等滲鹽水。油性溶劑包括例如杏仁油、油性酯、乙醇、植物油如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油、分餾的植物油和礦物油如液體石蠟。

本發(fā)明藥物組合物可以適于含服給予的制劑來制備、包裝或出售。此類制劑例如可用常規(guī)方法制成片劑或錠劑的形式，并且可例如包含有效量的活性成分，含口腔可溶解或降解組合物和任選地一種或多種本文所述附加成分中的剩余部分?；蛘?，適于含服給予的制劑可包括含活性成分的粉末或氣霧化或霧化的溶液或懸浮液。此類粉末狀、氣霧化或霧化制劑在分散時優(yōu)選具有約0.1-約200nm的平均粒徑或液滴大小，并且還可包含本文所述附加成分的一種或多種。

為了在非人動物中施用，本發(fā)明的化合物可以糊劑或粒料的形式制備。糊劑制劑可通過將化合物分散在藥學上可接受的油如花生油、芝蔴油、玉米油等中來制備。包含治療有效量的化合物的粒料可通過將化合物與稀釋劑如碳蠟、卡洛巴蠟等混合來制備，并且可添加潤滑劑如硬脂酸鎂或硬脂酸鈣以改善造粒工藝。當然，認識到可將不止一種粒料給予動物以達到所需劑量水平。

本發(fā)明化合物是否直接給予細胞、含細胞的組織、接觸細胞的體液或化合物從中擴散或運送至細胞的位置并不關(guān)鍵。以一定的量和途徑將化合物給予患者從而所述化合物的量通過該途徑足以使細胞中的脂質(zhì)直接或間接抵達細胞就足夠了。最小量隨化合物的特征而變化。

可使用的具體劑量和劑量范圍取決于多種因素，包括患者的需求、所治療病癥的嚴重程度以及所給予化合物的藥理活性。根據(jù)本公開，對具體患者的劑量范圍和最佳劑量的確定完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的普通技術(shù)范圍之內(nèi)。應理解普通醫(yī)師、牙醫(yī)或獸醫(yī)將易于確定和開出有效量的化合物處方，以在患者中移動脂質(zhì)貯存、導致體重減輕或抑制食欲。在前述中，醫(yī)師或獸醫(yī)可例如首先開出較低劑量處方，隨后增加劑量直至獲得適當響應。然而還應理解，對于任何特定個人的具體劑量水平將取決于多種因素，包括所用具體化合物的活性、人的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食、給藥時間、給藥途徑、分泌速率、任何藥物組合以及所治療失調(diào)的嚴重程度。

本發(fā)明組合物還可包括一種或多種藥學上合適的賦形劑，如溶劑和共溶劑、增溶劑、潤濕劑、懸浮劑、增稠劑、乳化劑、螯合劑、緩沖液、ph調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑、還原劑、抗微生物防腐劑、增量劑、保護劑、張力調(diào)節(jié)劑和特殊添加劑。

ii.三種激動劑對脂肪肉瘤細胞系的激動效率

在一個實施方式中，5nm到20nm的6-ecdca對93t-449高分化脂肪肉瘤細胞系抑制率為：10％到60％(見表1)。

在一個實施方式中：10nm到25nm的way-362450對93t-449高分化脂肪肉瘤細胞系抑制率為：7％到25％(見表2)。

在一個實施方式中，5nm到20nm的gw4064對93t-449高分化脂肪肉瘤細胞系抑制率為：13％到47％(見表3)。

在一個實施方式中：10nm到100nm的int-767對93t-449高分化脂肪肉瘤細胞系抑制率為：20％到57％(見表4)。

在一個實施方式中：10nm到100nm的px-104對93t-449高分化脂肪肉瘤細胞系抑制率為：22％到77％(見表5)。

在一個實施方式中：10μm到100μm的cdca對93t-449高分化脂肪肉瘤細胞系抑制率為：20％到74％(見表6)。

在一個實施方式中：10μm到100μm的udca對93t-449高分化脂肪肉瘤細胞系抑制率為：4％到44％(見表7)。

iii.fxr激動劑對脂肪肉瘤細胞系的遷移有抑制效果

在另一個實施方式中，6-ecdca5nm對脂肪肉瘤細胞系的遷移侵襲能力具有抑制作用：5nm6-ecdca在transwell細胞遷移實驗中，抑制了94t-778細胞系的穿膜侵襲能力，見圖1。

在另一個實施方式中，gw40645nm對脂肪肉瘤細胞系的侵襲能力具有抑制作用：5nmgw4064a在transwell細胞遷移實驗中，抑制了94t-778細胞系的穿膜侵襲能力，見圖2。

在另一個實施方式中，way-36245010nm對脂肪肉瘤細胞系的侵襲能力具有抑制作用：10nmway-362450在transwell細胞遷移實驗中，抑制了94t-778細胞系的穿膜侵襲能力，見圖3。

在另一個實施方式中，int-76710nm對脂肪肉瘤細胞系的侵襲能力具有抑制作用：10nmint-767在transwell細胞遷移實驗中，抑制了94t-778細胞系的穿膜侵襲能力，見圖4。

在另一個實施方式中，px-10410nm對脂肪肉瘤細胞系的侵襲能力具有抑制作用：10nmpx-104在transwell細胞遷移實驗中，抑制了94t-778細胞系的穿膜侵襲能力，見圖5。

在另一個實施方式中，cdca10μm對脂肪肉瘤細胞系的侵襲能力具有抑制作用：10μmcdca在transwell細胞遷移實驗中，抑制了94t-778細胞系的穿膜侵襲能力，見圖6。

在另一個實施方式中，udca10μm對脂肪肉瘤細胞系的侵襲能力具有抑制作用：10μmudca在transwell細胞遷移實驗中，抑制了94t-778細胞系的穿膜侵襲能力，見圖7。

iv.fxr激動劑促進多種脂肪肉瘤細胞系分化及脂肪堆積

在另一個實施方式中，6-ecdca促進多種脂肪肉瘤細胞系脂肪堆積：6-ecdca在5nm的工作濃度下，多種脂肪肉瘤細胞系的油紅實驗可見差異，6-ecdca激動的細胞組油紅染色率明顯高于對照組(見圖8)。

v.口服fxr激動劑后可在多種脂肪肉瘤pdx小鼠上抑制腫瘤增速

在一個實施方式中，口服給予6-ecdca后具有抑制腫瘤增長速度的效果：在6-ecdca口服(5mg/kg/day)給藥4周小鼠中，口服6-ecdca有效抑制腫瘤增長趨勢，并使截尾時腫瘤平均體積明顯小于對照組(見圖9和圖10)。

在一個實施方式中，口服給予gw4064后具有抑制腫瘤增長速度的效果：在gw4064口服(10mg/kg/day)給藥4周小鼠中，口服gw4064有效抑制腫瘤增長趨勢，并使截尾時腫瘤平均體積明顯小于對照組(見圖9和圖10)。

在一個實施方式中，口服給予way-362450后具有抑制腫瘤增長速度的效果：在way-362450口服(5mg/kg/day)給藥4周小鼠中，口服way-362450有效抑制腫瘤增長趨勢，并使截尾時腫瘤平均體積明顯小于對照組(見圖9和圖10)。

在一個實施方式中，口服給予int-767后具有抑制腫瘤增長速度的效果：在int-767口服(15mg/kg/day)給藥4周小鼠中，口服int-767有效抑制腫瘤增長趨勢，并使截尾時腫瘤平均體積明顯小于對照組(見圖9和圖10)。

在一個實施方式中，口服給予px-104后具有抑制腫瘤增長速度的效果：在px-104口服(10mg/kg/day)給藥4周小鼠中，口服px-104有效抑制腫瘤增長趨勢，并使截尾時腫瘤平均體積明顯小于對照組(見圖9和圖10)。

在一個實施方式中，口服給予cdca后具有抑制腫瘤增長速度的效果：在cdca口服(40mg/kg/day)給藥4周小鼠中，口服cdca有效抑制腫瘤增長趨勢，并使截尾時腫瘤平均體積明顯小于對照組(見圖9和圖10)。

在一個實施方式中，口服給予udca后具有抑制腫瘤增長速度的效果：在udca口服(50mg/kg/day)給藥4周小鼠中，口服udca有效抑制腫瘤增長趨勢，并使截尾時腫瘤平均體積明顯小于對照組(見圖9和圖10)。

vi.口服fxr激動劑后可在脂肪肉瘤pdx小鼠模型上促進脂肪肉瘤細胞系脂肪性分化及脂肪堆積

在一個實施方式中，口服給予6-ecdca后具有促進脂肪肉瘤細胞系脂肪性分化及脂肪堆積的效果：在6-ecdca口服(5mg/kg/day)給藥4周小鼠中，口服6-ecdca的實驗裸小鼠，其腫瘤發(fā)生了較對照組更明顯的脂肪源性的分化(見圖11)。

實施例

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于以任何方式限制本發(fā)明的范圍。通過上述說明和以下實施例，在本文示出和描述的那些之外的本發(fā)明的各種修改對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見，并且落在所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。

除非另行定義，所有專業(yè)與科學用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。

實施例1.fxr激動劑的體外實驗可抑制脂肪肉瘤細胞生長和遷移

本實施例的目的是證明fxr激動劑6-ecdca、way-362450、gw4064、int-767、px-104、cdca、udca可以在體外抑制脂肪肉瘤細胞的生長增殖和遷移。

在本實施例中，fxr激動劑均采購自selleck或sigma公司，粉劑，純度大于等于97％；脂肪肉瘤細胞系包括，高分化型細胞株93t—449、94t—778，以及未分化多形性細胞株sw872。所有細胞株均采購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(americantypeculturecollection，atcc)。93t449細胞株以及94t-778細胞株采用以，高糖rpmi培養(yǎng)基+10％胎牛血清+雙抗+支原體預防劑配成的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。sw872細胞株采用以l-15培養(yǎng)基+10％太牛血清+雙抗+支原體預防劑配成的完全培養(yǎng)基在air-free的孵箱中培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)6-ecdca、way-362450、gw4064、int-767、px-104、cdca、udca可以分別在體外抑制脂肪肉瘤細胞的生長增殖(表1，表2，表3，表4，表5，表6，表7)和遷移(圖1，圖2，圖3，圖4，圖5，圖6，圖7)。

實驗方法：

1、將貼壁生長的脂肪肉瘤細胞配制成細胞懸液，接種于6孔板內(nèi)。

2、待6孔板內(nèi)細胞生長到約50％～60％時，分組分別滴加fxr激動劑，以及陰性對照組(只加dmso)，滴加后充分混勻培養(yǎng)基，每組三個副孔，培養(yǎng)12h后，pbs清洗后換液再培養(yǎng)24h。

3、消化細胞，用細胞計數(shù)板計數(shù)3次以上，或者用臺盼藍染色后電子細胞計數(shù)儀計數(shù)2次。

4、計算濃度后，取9×10⁴個細胞接種于放有transwell小室的24孔板，每組3個副孔，行transwell細胞遷移實驗。

5、取3×10⁴個細胞接種于96孔板，每孔2000個細胞，每組三個副孔，行五日cck-8細胞增殖實驗。

6、取各個組1×10⁵個細胞，按照試劑盒說明，加入trizol提取rna，進行逆轉(zhuǎn)錄pcr以及qpcr，檢測激動劑的激動效率。rt-qpcr的試劑盒來自takara公司。

表1：6-ecdca濃度依賴抑制脂肪肉瘤細胞生長

表2：way-362450濃度依賴抑制脂肪肉瘤細胞生長

表3：gw4064濃度依賴抑制脂肪肉瘤細胞生長

表4：int-767濃度依賴抑制脂肪肉瘤細胞生長

表5：px-104濃度依賴抑制脂肪肉瘤細胞生長

表6：cdca濃度依賴抑制脂肪肉瘤細胞生長

表7：udca濃度依賴抑制脂肪肉瘤細胞生長

實施例2.6-ecdca(奧貝膽酸)體外實驗誘導脂肪肉瘤細胞分化

本實施例的目的是證明fxr激動劑可以誘導脂肪肉瘤細胞分化。在本實例中，細胞培養(yǎng)步驟同實例2，油紅o染色試劑盒來自上海博古生物有限公司。細胞處理同實施例2，待6孔板內(nèi)細胞生長到約50％～60％時，分組分別滴加激動劑6-ecdca以及陰性對照組(只加dmso)，滴加后充分混勻培養(yǎng)基，每組三個副孔，培養(yǎng)12h后，pbs清洗后換液再培養(yǎng)48h。根據(jù)試劑盒說明書進行油紅o染色。檢測原理為：脂肪肉瘤細胞內(nèi)含有的脂滴會被油紅應用染色液染為橘紅色，非脂肪組織不會染色，之后用蘇木精復染。不同細胞中，油紅染色率高的細胞株為脂肪堆積明顯的細胞，即細胞脂肪源性表達增加，分化級別增加。實驗結(jié)果如圖8所示，深灰色區(qū)域為油紅染色區(qū)。

實施例3.體內(nèi)實驗口服fxr激動劑可以抑制脂肪肉瘤增長速度

本實施例的目的是證明fxr激動劑6-ecdca、way-362450、gw4064、int-767、px-104、cdca、udca在體外實驗中可以抑制脂肪肉瘤增速。在本實施例中，發(fā)明人建立了去分化型和粘液型脂肪肉瘤人源腫瘤移植的裸小鼠模型(pdx)，小鼠種屬為balb/cnude♀6-8wbk，瘤體于右側(cè)腹部皮下種植。建模成功后挑選腫瘤體積仿佛的小鼠，分別灌胃給予fxr激動劑6-ecdca、way-362450、gw4064、int-767、px-104、cdca、udca，并設溶劑組為陰性對照，每日定時給藥，具體給藥方案如表格所示。

分組及給藥劑量如表格所示：

本實例具體實驗步驟如下：

1、在連續(xù)培養(yǎng)28天后，按照動物倫理委員會要求，在所有動物瘤體超過3000mm³，對實驗動物進行統(tǒng)一處理，co2箱內(nèi)處死。

2、處死實驗小鼠后立即完整剝離皮下腫瘤，稱重，測量體積，切塊后行冰凍切片+油紅o染色。

3、留取實驗動物照片，并統(tǒng)計數(shù)據(jù)。實驗結(jié)果如圖10和11所示，可見奧貝膽酸體內(nèi)實驗中仍然體現(xiàn)了脂肪肉瘤的抑制效果。

本實例中，6-ecdca、way-362450、gw4064、int-767、px-104、cdca、udca處理組在去分化脂肪肉瘤(圖9)，粘液型脂肪肉瘤(圖10)兩種分型的脂肪肉瘤pdx模型中，都顯示了顯著的腫瘤抑制效果，尤其在粘液型中抑制效果更為突出。通過在新鮮腫瘤組織的速凍切片油紅染色，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，經(jīng)6-ecdca(奧貝膽酸)處理的粘液性脂肪肉瘤組織，油紅o染色率比對照組更高，意味著經(jīng)6-ecdca口服處理的實驗裸小鼠，其腫瘤發(fā)生了較對照組更明顯的分化(圖11)，且腫瘤生長速度顯著低于對照組。

本發(fā)明所涉及的多個方面已做如上闡述。然而，應理解的是，在不偏離本發(fā)明之精神與范圍的前提下，對上述描述的任何修飾都是允許的。同樣，類似的情況也包括在權(quán)利要求中。