本發(fā)明醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及人成纖維生長(zhǎng)因子21(fgf21)的一種新用途，特別涉及人fgf21在制備用于治療腦卒中藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：腦卒中俗稱“中風(fēng)”，具有高發(fā)病率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率和高死亡率的特點(diǎn)，是世界上最重要的致死性疾病之一，也是我國(guó)第一位致殘和致死性疾病。腦卒中主要分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中兩大類，其中80％左右為缺血性腦卒中。缺血性腦卒中是由于腦動(dòng)脈的血流短暫或持久減少引起的。腦保護(hù)藥物是目前神經(jīng)學(xué)界的研究熱點(diǎn)，目前唯一被證實(shí)有效且被推薦為常規(guī)治療的藥物是阿司匹林。缺血性腦卒中起病后3小時(shí)內(nèi)使用r-tpa、6小時(shí)內(nèi)動(dòng)脈使用前尿激酶也被證明有一定療效。然而，腦卒中的復(fù)雜性和多向性仍使其腦保護(hù)藥物在臨床實(shí)踐上的有效數(shù)量極大受限。值得注意的是，缺血性腦卒中還是糖尿病多種并發(fā)癥之一，是糖尿病發(fā)展到后期(即合并癥期)而出現(xiàn)的腦系病變。據(jù)統(tǒng)計(jì)，糖尿病患者對(duì)缺血性腦卒中的敏感性是2-6倍，大約30％的腦卒中患者患有糖尿病并且90％為ii型糖尿病(t2d)。與非糖尿病人群相比，糖尿病合并缺血性腦卒中的死亡率提高到兩倍，殘疾率和復(fù)發(fā)率高，神經(jīng)功能損傷恢復(fù)慢，神經(jīng)再生能力減弱以及由于其更高的出血性轉(zhuǎn)化，使得缺血性腦中風(fēng)的標(biāo)準(zhǔn)用藥r-tpa治療效果變小。目前，尚未發(fā)現(xiàn)或公布有對(duì)糖尿病合并腦卒中具有較好的治療效果的藥物。隨著生活水平提高及老齡化程度加重，糖尿病患者日益增多，糖尿病增加了缺血性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)，糖尿病合并缺血性腦卒中已成為威脅公眾健康的巨大因素。然而，盡管糖尿病引起的腎臟和視網(wǎng)膜微血管并發(fā)癥已有大量的報(bào)道，但對(duì)糖尿病引起的神經(jīng)病變(如腦卒中)機(jī)制仍知之甚少。t2d患者通常具有高血糖癥、血脂異常和胰島素抵抗，這些因素加重其中風(fēng)后長(zhǎng)期的功能缺失，也限制了大腦固有的神經(jīng)修復(fù)和重建能力。研究表明對(duì)t2d患者中風(fēng)后單一的胰島素血糖控制并不能逆轉(zhuǎn)其中風(fēng)后功能損傷。因此，尋找有效的靶點(diǎn)藥物以治療腦卒中、甚至糖尿病合并腦卒中是目前亟待解決的問(wèn)題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量的研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21可以改善腦卒中患者、t2d腦卒中患者的癥狀，并對(duì)改善癥狀的機(jī)理進(jìn)行了闡述，從而完成本發(fā)明。本發(fā)明的目的是提供一種人成纖維生長(zhǎng)因子21在制備用于治療腦卒中的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的是提供一種治療腦卒中的藥物，所述藥物中含有治療有效劑量的人成纖維生長(zhǎng)因子21。根據(jù)本發(fā)明提供的一種人成纖維生長(zhǎng)因子21在制備用于治療腦卒中的藥物中的應(yīng)用，具有以下有益效果：(1)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)人fgf21能夠：1.通過(guò)激活pparγ來(lái)保護(hù)血腦屏障(bbb)；2.通過(guò)抑制nfκb蛋白的表達(dá)減輕神經(jīng)炎癥；3.促進(jìn)由ampk/nrf2調(diào)節(jié)的血管/白質(zhì)的重構(gòu)，從而促進(jìn)腦卒中后的神經(jīng)再生，因而其可作為各種劑型藥物的有效成分，對(duì)于腦卒中、糖尿病合并腦卒中的治療具有極其重大的意義。(2)fgf21是fgf家族中目前發(fā)現(xiàn)的唯一沒(méi)有促有絲分裂的基因，從而大大降低了臨床用藥的風(fēng)險(xiǎn)。(3)本發(fā)明中公開(kāi)的治療機(jī)理，對(duì)以后研究治療腦卒中、糖尿病合并腦卒中的藥物具有指導(dǎo)意義。附圖說(shuō)明圖1為純化后fgf21的電泳圖；圖2為純化后fgf21高效液相色譜圖；圖3為粘貼去除實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖4為前肢踩空實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖5為握力實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖6為y迷宮試驗(yàn)結(jié)果；圖7為各組梗死體積大小及定量圖；圖8為小鼠腦中fgf21、p-fgfr1和fgfr1-β-klotho復(fù)合物的表達(dá)；圖9為fgf21處理對(duì)高糖加il-1β合并誘導(dǎo)損傷腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接蛋白表達(dá)的影響；圖10為fgf21處理對(duì)高糖加il-1β合并誘導(dǎo)損傷腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附因子表達(dá)的影響；圖11為fgf21處理對(duì)高糖加il-1β合并誘導(dǎo)損傷腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性的影響；圖12為fgf21對(duì)磷酸化fgfr1表達(dá)的影響；圖13為fgf21對(duì)pparγ表達(dá)的影響；圖14為pparγ對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞滲透性的影響；圖15為fgf21對(duì)抗炎因子m2型小膠質(zhì)細(xì)胞的影響；圖16為fgf21對(duì)lps誘導(dǎo)的細(xì)胞中炎癥因子的影響；圖17為fgf21對(duì)lps誘導(dǎo)的細(xì)胞中fgfr1磷酸化、nfκb活性、及pparγ表達(dá)水平的影響；圖18為fgf21對(duì)軸突損傷和髓鞘丟失的影響；圖19為fgf21對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞再生的影響；圖20為fgf21對(duì)腦中腦血管密度的影響；圖21為fgf21對(duì)腦中ampk/nrf2活性的影響；圖22為fgf21處理的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)opc細(xì)胞增殖的影響；圖23為fgf21對(duì)ii型糖尿病合并腦卒中小鼠血糖的調(diào)節(jié)。具體實(shí)施方式以下通過(guò)具體實(shí)施方式本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將隨著這些說(shuō)明而變得更為清楚。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(fgf21)是最新發(fā)現(xiàn)的和糖脂代謝有關(guān)的因子，能改善胰島β細(xì)胞的功能，促進(jìn)脂肪組織中的葡萄糖吸收，是fgf家族中目前發(fā)現(xiàn)的唯一沒(méi)有促有絲分裂的基因，從而大大降低了臨床用藥的風(fēng)險(xiǎn)。它主要在肝臟中表達(dá)，在腦中各區(qū)域、膠質(zhì)細(xì)胞中均有少量表達(dá)。其中，人fgf21(mw:19.5kd)有181個(gè)氨基酸，與鼠fgf21的肽鏈有75％的同一性。經(jīng)過(guò)研究表明，在一些病理?xiàng)l件下，fgf21發(fā)揮著組織損傷修復(fù)的功能。重組fgf21已經(jīng)在多種動(dòng)物模型如肝臟疾病、糖尿病腎病、動(dòng)脈硬化斑形成、心肌梗塞、以及糖尿病性心肌病中，顯示出一定的治療效果。雖然fgf21介導(dǎo)的信號(hào)通路仍不清楚，但其治療作用機(jī)制可能涉及血管保護(hù)和重塑、抗炎、抗氧化應(yīng)激、晚期糖化終產(chǎn)物的形成抑制和促進(jìn)組織修復(fù)。目前，尚未有關(guān)于fgf21對(duì)于腦卒中或糖尿病合并腦卒中的腦代謝、腦保護(hù)或認(rèn)知方面的報(bào)道，更未有對(duì)這些方面的系統(tǒng)研究。本發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量的試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外源重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(rfgf21)可以激活fgfr1-β-klotho復(fù)合物，(1)通過(guò)激活pparγ實(shí)現(xiàn)對(duì)血腦屏障(bbb)的保護(hù)；(2)抑制nfκb介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥；(3)促進(jìn)ampk/nrf2活化介導(dǎo)的血管/白質(zhì)重塑；提高了中風(fēng)后神經(jīng)功能的恢復(fù)，改善了腦卒中患者、t2d腦卒中患者的癥狀。因此，本發(fā)明的一方面，提供了一種人成纖維生長(zhǎng)因子21在制備用于治療腦卒中的藥物中的應(yīng)用。在本發(fā)明中，所述腦卒中包括糖尿病合并腦卒中，包括ii型糖尿病合并腦卒中(即t2d腦卒中)。臨床和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，t2d患者通常具有高血糖癥、血脂異常和胰島素抵抗，這些因素加劇了對(duì)血腦屏障的滲透性和神經(jīng)炎癥，加重了中風(fēng)后長(zhǎng)期的神經(jīng)功能缺失，也限制了大腦固有的神經(jīng)修復(fù)和重建能力，而這些能力在中風(fēng)后恢復(fù)正常中發(fā)揮著重要作用。為實(shí)現(xiàn)人fgf21在制備用于治療腦卒中的藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明通過(guò)微生物發(fā)酵法獲得外源重組人fgf21。根據(jù)genbank上人fgf21(np_061986.1)的蛋白序列優(yōu)化設(shè)計(jì)了相應(yīng)的dna序列，構(gòu)建合適的表達(dá)載體，將表達(dá)載體轉(zhuǎn)移至原核宿主細(xì)胞中，得到高蛋白表達(dá)水平的菌株，對(duì)菌株進(jìn)行活化和擴(kuò)增，誘導(dǎo)表達(dá)fgf21，通過(guò)多步驟分離純化得到高純度的fgf21(如圖1和圖2所示)。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，編碼人fgf21蛋白的核苷酸序列如seqidno.1所示，其在5'端有ndeⅰ酶切位點(diǎn)，3'端有bamhⅰ酶切位點(diǎn)。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述表達(dá)載體中插入了人fgf21的編碼序列，優(yōu)選所述表達(dá)載體為原核細(xì)胞表達(dá)載體，如含iptg誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的質(zhì)粒pet3c，其適用于原核細(xì)胞，尤其適合在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞，優(yōu)選為大腸桿菌，如大腸桿菌bl21(de3)。大腸桿菌特別是大腸桿菌bl21(de3)適于表達(dá)載體特別是質(zhì)粒pet3c的表達(dá)。本發(fā)明人通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，fgf21在t2d腦卒中對(duì)血腦屏障(bbb)的完整性有保護(hù)作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病常引起血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能的劇烈變化，血腦屏障的通透性顯著提高以致血漿白蛋白這樣的大分子物質(zhì)都可通過(guò)屏障，嚴(yán)重腦損傷導(dǎo)致血腦屏障的嚴(yán)重破壞。通過(guò)對(duì)fgf21處理前后t2d腦卒中模型即經(jīng)末梢大腦中動(dòng)脈閉塞手術(shù)后db/db小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能和認(rèn)知功能測(cè)試，發(fā)現(xiàn)fgf21處理可減輕db/db小鼠腦中風(fēng)后神經(jīng)功能的損傷(圖3～圖6)。同時(shí)，對(duì)小鼠腦梗死體積大小進(jìn)行比較，fgf21處理后db/db腦卒中小鼠腦梗死體積較處理前明顯減小(圖7)。以上體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均說(shuō)明，fgf21在t2d腦卒中對(duì)血腦屏障完整性具有保護(hù)作用，降低了與血腦屏障相關(guān)的二級(jí)損傷。血腦屏障通透性的增加是由于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接的開(kāi)放直接導(dǎo)致的。糖尿病合并腦中風(fēng)加劇了血腦屏障破壞，其中緊密連接蛋白表達(dá)減少是一個(gè)很重要的因素。而中風(fēng)后內(nèi)皮粘附因子在白細(xì)胞向腦內(nèi)滲透中起著舉足輕重的作用，此過(guò)程會(huì)引起大腦炎癥以及血腦屏障的破壞。因而，進(jìn)一步地，使用高含量葡萄糖和致炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β(il-1β)合并損傷引起的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)模擬急性期db/dbt2d小鼠腦中風(fēng)體外模型，通過(guò)對(duì)fgf21處理前后，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性、內(nèi)皮細(xì)胞粘附因子、以及緊密連接蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步確定fgf21對(duì)血腦屏障的影響。研究發(fā)現(xiàn)，高含量葡萄糖加il-1β合并誘導(dǎo)損傷使腦血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)減少(圖9)、內(nèi)皮細(xì)胞中粘附因子增加(圖10)、腦血管內(nèi)皮細(xì)胞滲透性增加(圖11)，說(shuō)明血腦屏障可能會(huì)被破壞。而fgf21處理能夠增加損傷后緊密連接蛋白的表達(dá)，抑制粘附因子表達(dá)，降低腦血管內(nèi)皮細(xì)胞滲透性。從體外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步確定了fgf21對(duì)血腦屏障的保護(hù)作用。fgf21信號(hào)傳導(dǎo)需要激活fgf受體(fgfr)，尤其是fgfr1以及它的共受體β-klotho。通過(guò)對(duì)db/dbt2d腦中風(fēng)小鼠皮下注射fgf21，發(fā)現(xiàn)其腦中fgf21和磷酸化fgfr(p-fgfr1)表達(dá)增加，同時(shí)腦中有fgfr1-β-klotho復(fù)合物的生成，且表達(dá)明顯(圖8)。可以確定，fgf21與其他fgf家族成員不同，因其與肝素之間非常低的親和力，使得fgf21能通過(guò)簡(jiǎn)單擴(kuò)散透過(guò)血腦屏障，激活fgfr1-β-klotho復(fù)合物，實(shí)現(xiàn)信號(hào)傳導(dǎo)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，pparγ(過(guò)氧化物酶體增生物激活受體γ)的激活可能改變緊密連接蛋白的表達(dá)，fgf21對(duì)血腦屏障通透性的保護(hù)可能與其激活相關(guān)。我們通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)可以確定，fgf21激活fgfr1-β-klotho復(fù)合物，進(jìn)而使下游pparγ得到激活，實(shí)現(xiàn)對(duì)血腦屏障的保護(hù)。在體外實(shí)驗(yàn)中，使用高含量葡萄糖和il-1β合并損傷引起的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證。相較于未經(jīng)fgf21處理的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，fgf21處理后能使其中fgfr1磷酸化表達(dá)增加的同時(shí)(圖12)，促進(jìn)pparγ蛋白表達(dá)水平和活性(圖13)。抑制pparγ表達(dá)，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性增加，fgf21的保護(hù)作用失效(圖14)。進(jìn)一步地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，fgf21可抑制神經(jīng)炎癥。t2d腦卒中會(huì)產(chǎn)生明顯的腦部炎癥，通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，fgf21能夠增加db/dbt2d小鼠腦中風(fēng)后腦中抗炎細(xì)胞m2型小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量(圖15)。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，fgf21能夠抑制經(jīng)脂多糖(lps)刺激原代培養(yǎng)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞(opc)中m1型促炎因子inos和tnf-αmrna的表達(dá)，同時(shí)增加m2型抗炎因子arg1和igf-1mrna的表達(dá)，進(jìn)而參與損傷后的修復(fù)(圖16)。在小膠質(zhì)細(xì)胞中，pparγ在同型ppars中是最主要，也是一個(gè)關(guān)鍵的“信息傳遞者”轉(zhuǎn)錄因子，它可通過(guò)影響小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的表型和已活化的小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中釋放的炎癥因子來(lái)控制轉(zhuǎn)錄過(guò)程。nfκb是一個(gè)早期的調(diào)節(jié)炎癥的關(guān)鍵因子。中風(fēng)后會(huì)使nfκb的表達(dá)增加，激活小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，增加有害的促炎因子的釋放。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，fgf21能夠明顯減少lps誘導(dǎo)的nfκb活性，增加小膠質(zhì)細(xì)胞核中pparγ的水平(圖17)。fgf21作用小膠質(zhì)細(xì)胞，能使其fgfr1磷酸化的表達(dá)增加，而給予fgfr抑制劑，fgfr1的磷酸化被抑制。fgf21也能降低經(jīng)lps誘導(dǎo)的原代大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞核中nfκb的活性，同時(shí)增加細(xì)胞核蛋白中細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子pparγ的表達(dá)，同樣加入fgfr抑制劑后，fgf21對(duì)pparγ表達(dá)的增加和nfκb活性的降低效果均收到抑制。因而，fgf21激活fgfr1-β-klotho復(fù)合物后，還可使下游nfκb活性降低，抑制神經(jīng)炎癥。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，fgf21可推動(dòng)血管和白質(zhì)的重塑。ii型糖尿病在缺血性中風(fēng)之后會(huì)加重血管和白質(zhì)的損傷，并且減弱其重塑功能。本發(fā)明研究表明，在體內(nèi)和體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中，fgf21對(duì)腦血管的保護(hù)和重構(gòu)有潛在作用。對(duì)fgf21處理前后的db/dbt2d腦中風(fēng)小鼠進(jìn)行對(duì)比，在分離到的大腦微血管片段中，fgf21提高了促血管生成因子(vegf-a，igf-1和enos)mrna水平(表1)。在db/dbt2d小鼠中風(fēng)后，fgf21可減輕軸突的損傷和髓鞘的丟失(圖18)；增加損傷周圍區(qū)域血管密度及少突膠質(zhì)細(xì)胞的再生(圖20和圖19)。通過(guò)fgf21處理過(guò)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液能促進(jìn)體外少突膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞的增殖(圖22)。在ii型糖尿病模型的腦中，早期炎癥和氧化應(yīng)激干擾了代謝和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致與ampk和nrf2信號(hào)通路相關(guān)功能的缺失，從而引起腦血管和退行性疾病。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，fgf21處理可明顯增加腦中ampk的磷酸化以及細(xì)胞核中nrf2的活性(圖21)，確定了fgf21的一部分作用機(jī)制是fgf21上調(diào)了ampk和nrf2活性，而中風(fēng)后ampk和nrf2的活性增加能夠促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)和神經(jīng)功能的恢復(fù)。fgf21除對(duì)t2d合并腦卒中的腦部治療有效外，還能夠降低腦中風(fēng)后的高血糖(圖23)。研究證明，相對(duì)于未經(jīng)治療的糖尿病合并腦卒中模型，fgf21治療后，其血液中葡萄糖的濃度明顯降低，同時(shí)fgf21也能明顯地降低糖化血紅蛋白(hba1c)的水平。這些均表明fgf21能調(diào)節(jié)t2d合并腦卒中后對(duì)糖的代謝功能。在本發(fā)明中，腦卒中和腦中風(fēng)含義相同，t2d腦卒中和t2d腦中風(fēng)含義相同。本發(fā)明的第二方面是提供用于治療腦卒中，特別是ii型糖尿病合并腦卒中的藥物，所述藥物中含有治療有效劑量的人成纖維生長(zhǎng)因子21。所述藥物還包括其它藥學(xué)上可接受的載體或輔料，如藥學(xué)上允許的賦形劑、填充劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、增效劑或其它添加劑。所述藥物的給藥形態(tài)可為針劑。所述藥物的制劑形態(tài)可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知常用的制備方法獲得。所述藥物的給藥途徑可為皮下注射、靜脈注射、肌肉注射或其它有效注射形態(tài)。所述藥物對(duì)腦卒中，特別是糖尿病合并腦卒中的作用主要表現(xiàn)為(1)保護(hù)血腦屏障的完整性；(2)抑制腦中神經(jīng)炎癥；(3)促進(jìn)腦中血管和白質(zhì)重塑。其中，保護(hù)血腦屏障的完整性主要體現(xiàn)在：(1a)fgf21減輕了腦中風(fēng)后感覺(jué)功能和認(rèn)知功能的損傷；(1b)fgf21減小了腦中風(fēng)后腦梗死大小；(1c)fgf21增加腦血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白zo-1和ve-cadherin的表達(dá)；(1d)fgf21抑制腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中粘附因子vcam-1和e-selectin的表達(dá)；(1e)fgf21降低腦血管內(nèi)皮細(xì)胞滲透性；(1f)fgf21使腦中fgfr1磷酸化表達(dá)增加，和/或促進(jìn)pparγ表達(dá)。抑制腦中神經(jīng)炎癥主要體現(xiàn)在：(2a)fgf21增加腦中抗炎細(xì)胞m2型小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量；(2b)fgf21降低腦中促炎因子inosmrna和tnf-αmrna的表達(dá)水平；(2c)fgf21提高腦中抗炎因子arg1mrna和igf-1mrna的表達(dá)水平；(2d)fgf21降低腦中炎癥因子il-1βmrna的表達(dá)水平；(2e)fgf21降低腦中nfκb的活性。促進(jìn)腦中血管和白質(zhì)重塑主要體現(xiàn)在：(3a)fgf21減輕軸突的損傷和髓鞘的丟失；(3b)fgf21促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的再生；(3c)fgf21增加腦血管密度；(3d)fgf21增加腦血管片段中促血管生成因子vegfmrna、enosmrna、和igf-1mrna的表達(dá)水平。實(shí)施例以下通過(guò)具體優(yōu)選的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明。這些實(shí)施例僅是說(shuō)明性的，并不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1獲得外源重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21實(shí)施例1.1高表達(dá)菌株的構(gòu)建首先根據(jù)genbank上人源fgf21(np_061986.1)的蛋白序列優(yōu)化設(shè)計(jì)了相應(yīng)的dna序列，如seqidno.1所示。隨后人工合成了相應(yīng)的dna片段，其在5'端有ndeⅰ酶切位點(diǎn)，3'端有bamhⅰ酶切位點(diǎn)。將所得的fgf21的dna用ndeⅰ和bamhⅰ雙酶切，表達(dá)空載體pet3c用相同的酶進(jìn)行處理。兩種酶切片段用t4dna連接酶連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌dh5α，ampicillin抗性篩選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行dna序列分析，以確保所得fgf21的cdna序列是正確的。將所得的重組質(zhì)粒命名為pet3c-fgf21。將重組質(zhì)粒pet3c-fgf21轉(zhuǎn)入進(jìn)大腸桿菌bl21(de3)，ampicillin抗性篩選轉(zhuǎn)化子。最終得到高表達(dá)fgf21的菌株。實(shí)施例1.2菌株的活化和擴(kuò)增(fgf21發(fā)酵)將檢定合格的菌株接種(接種量10％)于一代培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)4h，轉(zhuǎn)接(接種量10％)到二代培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)10～12h供發(fā)酵罐接種用。將發(fā)酵培養(yǎng)基裝入200l容積的發(fā)酵罐中(發(fā)酵罐預(yù)先進(jìn)行空消115℃，30min)，然后進(jìn)行實(shí)消滅菌(115℃，30min)，再將適量上述培養(yǎng)的二代種子液接種(接種量10％)于發(fā)酵罐中，采用高密度發(fā)酵培養(yǎng)工藝，通過(guò)控制葡萄糖的流加速率、通氣量及攪拌速率等控制培養(yǎng)液do值不低于30％，當(dāng)菌體od600達(dá)到15-18左右，加入iptg進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)1h后加流加培養(yǎng)基，誘導(dǎo)4h終止發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，用管式離心機(jī)(16000r/min)分離發(fā)酵液中的菌體，收取菌體。實(shí)施例1.3fgf21純化1)包涵體的制備將濕菌體懸浮于10倍體積(w/v)的含25mmol/ltris(ph8.0)、150mmol/lnacl、10mmol/ledta-2na的緩沖液中；按所需的fgf21濕菌體，以1:1000(w/w)、1：10000(w/w)比例稱取溶菌酶和dna酶，將其用裂解液溶解加入至菌體混懸液中，室溫?cái)嚢枇呀膺^(guò)夜，鏡檢破菌液至視野內(nèi)無(wú)完整菌體，再用高速冷凍離心機(jī)(9000r/min，4℃)分離、收集沉淀。將上一步的沉淀懸浮于相對(duì)于濕菌體15倍體積(w/v)的含25mmol/ltris(ph8.0)、150mmol/lnacl、10mmol/ledta-2na，0.2％去氧膽酸鈉的洗滌液ⅰ中，充分?jǐn)嚢枞芙饣靹蚝螅酶咚倮鋬鲭x心機(jī)(9000r/min，4℃)分離、收集沉淀。再將上一步的沉淀懸浮于相對(duì)于濕菌體20倍體積(w/v)的含25mmol/ltris(ph8.0)、150mmol/lnacl、10mmol/ledta-2na，0.2％triton-x100的洗滌液ⅱ中，充分?jǐn)嚢枞芙饣靹蚝?，用高速冷凍離心機(jī)(9000r/min，4℃)分離、收集沉淀即為fgf21包涵體。2)包涵體變復(fù)性將包涵體懸浮于15倍體積(w/v)的含25mmol/ltris(ph8.9)、2mmol/ledta-2na、8mol/l尿素的變性液中，4℃充分?jǐn)嚢枞芙饣靹蚝?，加入至透析?截留分子量為7000kd)中。再將fgf21變性液置于200倍體積(w/v)的含25mmol/ltris(ph8.9)、2mmol/ledta-2na的復(fù)性液中4℃透析過(guò)夜。透析結(jié)束后，用高速冷凍離心機(jī)(9000r/min，4℃)分離、收集上清。3)純化將上述所得粗制fgf21上清液首先過(guò)deaesepharosefastflow離子交換柱，用25mmol/ltris(ph8.9)、10mmol/ledta-2na、0.03mol/lnacl平衡液平衡并除雜蛋白后，用25mmol/ltris(ph8.9)、10mmol/ledta-2na、0.1mol/lnacl的洗脫液進(jìn)行洗脫，收集目的蛋白峰。將上一步目的蛋白收集液再過(guò)疏水柱，先用25mmol/ltris(ph8.9)、2mol/lnacl的緩沖液平衡并除雜蛋白后，將上樣溶液nacl濃度調(diào)至2mol/l后上樣，再用25mmol/ltris(ph8.9)、0.1mol/lnacl的洗脫液進(jìn)行洗脫，收集目的蛋白峰。將收集的目的蛋白溶液濃縮后過(guò)sephadexg25coarse凝膠過(guò)濾層析柱，用20mmol/lpb(ph7.4)，50mmnacl的緩沖液進(jìn)行洗脫，收集活性峰，經(jīng)sds-page和高效液相色譜檢測(cè)，得到純度＞95％的fgf21蛋白，即外源重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(rfgf21)，說(shuō)明書(shū)附圖中示為rfgf21，說(shuō)明書(shū)中簡(jiǎn)稱fgf21，如圖1和圖2所示。圖中1為取三份純化后的fgf21蛋白樣品(樣品1、2和3)進(jìn)行sds-page后圖譜；圖2為fgf21的高效液相色譜圖。實(shí)施例2fgf21在t2d腦卒中對(duì)血腦屏障完整性的影響實(shí)施例2.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(體內(nèi)實(shí)驗(yàn))ii型糖尿病模型(t2d模型)：在肥胖誘導(dǎo)的ii型糖尿病研究中，使用最廣泛的動(dòng)物模型是先天瘦素缺失(ob/ob)和瘦素受體缺失(db/db)的嚙齒動(dòng)物模型。本發(fā)明中使用c57blks-leprdbii型糖尿病小鼠(db/dbt2d小鼠，杰克遜實(shí)驗(yàn)室?guī)齑嫣?hào)000642，12-13周齡)。此模型已廣泛用在糖代謝和并發(fā)癥新機(jī)制的研究，而且db/dbt2d腦卒中模型反映了bbb的破壞、神經(jīng)炎癥、血管/白質(zhì)受損。缺血性腦卒中模型：由于ii型糖尿病嚙齒類動(dòng)物模型大腦中動(dòng)脈閉塞(mcao)的死亡率高達(dá)70％，我們選擇了ii型糖尿病且大腦中動(dòng)脈閉塞的小鼠作為缺血性腦卒中模型。獲得缺血性腦卒中模型的步驟如下：將ii型糖尿病小鼠麻醉后呈仰臥位固定，在手術(shù)顯微鏡下，沿頸前部正中切開(kāi)皮膚，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，用縫線穿過(guò)但不結(jié)扎；將小鼠右側(cè)臥位固定，在眼內(nèi)眥與外耳道連線處做一縱向切口，分離顳肌，用縫線將顳肌向兩邊牽拉暴露顳骨；用顱鉆鉆孔，去除骨瓣，剝離硬腦膜，暴露大腦中動(dòng)脈；小心鉤起大腦中動(dòng)脈并用電凝器凝斷，用生理鹽水沖洗降溫；再次將小鼠仰臥位并用血管夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，縫合傷口，60min后松開(kāi)動(dòng)脈夾并縫合皮膚。所有來(lái)自于fgf21處理db/dbt2d腦卒中小鼠的數(shù)據(jù)都和兩個(gè)非治療腦卒中的對(duì)照組相比，即正常血糖對(duì)照組(db/+)和db/dbt2d組。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：采用1.5mg/kg外源重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(rfgf2，說(shuō)明書(shū)附圖中示為rfgf21，說(shuō)明書(shū)中簡(jiǎn)稱fgf21)皮下注射c57blks-leprdbdb/dbt2d小鼠(杰克遜實(shí)驗(yàn)室?guī)欤坌裕?2周齡)，每12h一次，每天劑量3.0mg/kg，共給藥14天。分3組進(jìn)行測(cè)試并比較：正常血糖db/+小鼠組(簡(jiǎn)稱db/+組，非治療組)、db/dbt2d小鼠組(簡(jiǎn)稱db/db組，非治療組)和fgf21治療成年雄性db/dbt2d小鼠組(簡(jiǎn)稱db/db+fgf21組，治療組)，每組12只。腦中風(fēng)后即為db/+腦中風(fēng)組，db/db腦中風(fēng)組，db/db+fgf21腦中風(fēng)組。數(shù)據(jù)處理：對(duì)于參數(shù)和連續(xù)變量的測(cè)量，如病灶大小、血腦屏障通透性、mrna和蛋白表達(dá)水平、免疫組織化學(xué)、生化分析，使用tukey-kramerpost-hoctests方差分析。對(duì)于非參數(shù)序數(shù)據(jù)(例如，神經(jīng)行為的結(jié)果)，我們使用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，post-hocmann-whitneytests。p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)施例2.1.1fgf21減輕了腦中風(fēng)后神經(jīng)功能的損傷在中風(fēng)前以及中風(fēng)后1、3、5、7和14天，通過(guò)粘貼去除實(shí)驗(yàn)、前肢踩空實(shí)驗(yàn)和握力實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估感覺(jué)功能，中風(fēng)后28天通過(guò)y迷宮測(cè)試認(rèn)知功能。所述試驗(yàn)為本領(lǐng)域中常規(guī)的測(cè)試手段，在此不做具體限定。測(cè)試結(jié)果如圖3～圖6所示，其中，*p<0.01，與db/+腦中風(fēng)組相比；#p<0.01，與db/db腦中風(fēng)組相比。如圖3所示，粘貼去除實(shí)驗(yàn)表明，db/db腦中風(fēng)組所花的時(shí)間與db/+腦中風(fēng)組相比增加，而fgf21可使其時(shí)間降低。如圖4所示，前肢踩空實(shí)驗(yàn)表明，db/db腦中風(fēng)組的腳步錯(cuò)誤的百分?jǐn)?shù)與db/+腦中風(fēng)組相比增加，而fgf21用藥的第3天至第14天可使其腳步錯(cuò)誤降低。如圖5所示，握力實(shí)驗(yàn)表明，db/db腦中風(fēng)組握力與db/+腦中風(fēng)組相比沒(méi)明顯變化，而fgf21用藥的第3天、第5天、第7天和第14天可使其握力增加。如圖6所示，y迷宮實(shí)驗(yàn)，db/db腦中風(fēng)組的正確交替選擇百分?jǐn)?shù)與db/+腦中風(fēng)組相比明顯降低，而fgf21用藥第14天可使其增加。由上述測(cè)試結(jié)果可知，fgf21減輕了db/db小鼠腦中風(fēng)后神經(jīng)功能的損傷。實(shí)施例2.1.2fgf21減小了腦中風(fēng)后腦梗死大小在上述行為學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)試后處死小鼠，取腦組織進(jìn)行腦梗死大小的測(cè)定。檢測(cè)結(jié)果如圖7所示，左圖是he染色腦梗死大小圖，右圖是各組梗死體積的定量圖。(n＝6)。*p<0.05，與db/+腦中風(fēng)組相比；#p<0.05，與db/db腦中風(fēng)組相比。he染色及定量分析結(jié)果顯示，與db/+腦中風(fēng)組相比，db/db腦中風(fēng)小鼠腦梗死體積明顯增大，給藥14天后，fgf21明顯減小了db/db腦中風(fēng)小鼠腦梗死體積。實(shí)施例2.1.3fgf21可穿過(guò)bbb激活腦中的fgfr1發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用(機(jī)理)fgf21信號(hào)傳導(dǎo)需要激活fgfr，尤其是fgfr1及其共受體β-klotho復(fù)合體。采用2mg/kgfgf21皮下注射c57blks-leprdbdb/dbt2d小鼠，2h后取腦，westernblot測(cè)定小鼠腦中fgf21和磷酸化的fgfr1(p-fgfr1)的表達(dá)(圖8a)，通過(guò)免疫共沉淀檢測(cè)fgfr1-β-klotho復(fù)合物形成(圖8c)，以未經(jīng)fgf21處理的c57blks-leprdbdb/dbt2d小鼠作對(duì)照組。由圖8a和8b可知，相較于未注射fgf21組小鼠，注射fgf21組小鼠腦中fgf21水平增加，相應(yīng)地，p-fgfr1的表達(dá)得到顯著增加。由圖8c可知，相較于未注射fgf21的小鼠，注射fgf21組小鼠腦中出現(xiàn)fgfr1-β-klotho復(fù)合物。圖8a～c說(shuō)明皮下注射fgf21后，fgf21可穿過(guò)bbb激活腦中的fgfr1及fgfr1-β-klotho復(fù)合物，實(shí)現(xiàn)信號(hào)傳導(dǎo)。實(shí)施例2.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)由于t2d腦中風(fēng)病理生理的異質(zhì)性，在體外我們不能得到類似體內(nèi)環(huán)境的理想模型。高血糖和炎癥細(xì)胞因子對(duì)于早期bbb的完整性分布起著重要作用，也會(huì)導(dǎo)致t2d中風(fēng)的二次腦損傷。因此，我們將采用高含量葡萄糖(hg)加il-1β合并損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞完整性的體外模型來(lái)模擬t2d腦卒中bbb的損傷。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：采用25mmol/ld-葡萄糖加30ng/lil-1β合并損傷腦血管內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)模擬急性期db/dbt2d小鼠腦中風(fēng)體外模型。實(shí)施例2.2.1fgf21增加腦血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)糖尿病合并腦卒中加劇了血腦屏障的破壞，其中緊密連接蛋白表達(dá)減少是一個(gè)很重要的因素。腦血管內(nèi)皮細(xì)胞用高糖(hg)加il-1β合并損傷處理后，加50nmol/lfgf21處理，為hg-il-1β+fgf21組。其與對(duì)照組：正常腦血管內(nèi)皮細(xì)胞和hg-il-1β合并損傷處理后的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行比較。通過(guò)rt-pcr和westernblot分析緊密連接蛋白zo-1和粘附連接蛋白ve-cadherin的表達(dá)，檢測(cè)結(jié)果如圖9所示。其中，a.westernblot檢測(cè)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)。b.zo-1的定量圖。c.ve-cadherin的定量圖。(n＝5)。*p<0.01，與正常對(duì)照組相比；#p<0.01，與hg-il-1β+fgf21組相比。*p<0.01，與正常對(duì)照組相比；#p<0.01，與hg-il-1β組相比。由圖9可知，高糖加il-1β合并誘導(dǎo)損傷使腦血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)減少，而fgf21能夠增加損傷后緊密連接蛋白的表達(dá)。實(shí)施例2.2.2fgf21抑制腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中粘附因子的表達(dá)中風(fēng)后腦血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附因子在白細(xì)胞向腦內(nèi)滲透中起著舉足輕重的作用，此過(guò)程會(huì)引起大腦炎癥以及血腦屏障的破壞。腦血管內(nèi)皮細(xì)胞用高含量葡萄糖(高糖，hg)加il-1β合并損傷處理后，加50nmol/lfgf21處理，為hg-il-1β+fgf21組。其與對(duì)照組：正常腦血管內(nèi)皮細(xì)胞和hg-il-1β合并損傷處理后的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行比較。通過(guò)rt-pcr和westernblot檢測(cè)血管粘附因子vcam-1和e-selectin的表達(dá)，檢測(cè)結(jié)果如圖10所示其中，a.westernblot檢測(cè)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)高糖加il-1β?lián)p傷24h后vcam-1和e-selectin的表達(dá)。b.vcam-1的定量圖。c.e-selectin的定量圖。(n＝5)。*p<0.01，與正常對(duì)照組相比；#p<0.01，與hg-il-1β組相比。由圖10可知，高糖加il-1β?lián)p傷處理后的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中粘附因子vcam-1和e-selectin增加，說(shuō)明血腦屏障可能被破壞。加入fgf21后其水平降低，說(shuō)明fgf21能夠抑制高糖加il-1β誘導(dǎo)引起的內(nèi)皮細(xì)胞中粘附因子vcam-1和e-selectin的表達(dá)。實(shí)施例2.2.3fgf21降低腦血管內(nèi)皮細(xì)胞滲透性腦血管內(nèi)皮細(xì)胞用高糖加il-1β合并損傷處理后，加50nmol/lfgf21處理，為hg-il-1β+fgf21組。其與對(duì)照組：正常腦血管內(nèi)皮細(xì)胞和hg-il-1β合并損傷處理后的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行比較。通過(guò)70kdfitc-葡聚糖檢測(cè)給藥24h后血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透，檢測(cè)結(jié)果如圖11所示。其中，*p<0.01，與正常對(duì)照組相比；#p<0.01，與hg-il-1β組相比。由圖11可知，高糖加il-1β?lián)p傷處理后的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞較未處理的正常細(xì)胞滲透性明顯增大，經(jīng)fgf21給藥后，滲透性得到恢復(fù)，說(shuō)明fgf21能夠減輕高糖加il-1β合并損傷引起的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性。實(shí)施例2.2.4fgf21使fgfr1磷酸化表達(dá)增加(機(jī)理)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞用高糖加il-1β合并損傷處理后，加50nmol/lfgf21、10nmol/lfgfr1抑制劑(pd173074)或兩者結(jié)合處理，確定fgf21對(duì)fgfr1磷酸化表達(dá)的影響。圖12為westernblot檢測(cè)給藥2h后fgfr1磷酸化表達(dá)。(n＝5)。*p<0.01，與正常對(duì)照組相比；#p<0.01，與hg-il-1β組相比。由圖12可知，與hg-il-1β組相比，hg-il-1β+fgf21組中fgfr1水平得到顯著提升，加入fgfr1抑制劑后fgf21失效，說(shuō)明加入fgf21能使fgfr1磷酸化表達(dá)增加。由于fgf21信號(hào)傳導(dǎo)需要激活fgfr，尤其是fgfr1及其共受體β-klotho復(fù)合體，fgfr1磷酸化表達(dá)的增加可進(jìn)一步印證fgf21對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞起保護(hù)作用。實(shí)施例2.2.5fgf21通過(guò)激活fgfr1促進(jìn)pparγ表達(dá)(機(jī)理)將腦血管內(nèi)皮細(xì)胞分別經(jīng)高糖(hg)加il-1β合并損傷、損傷后50nmol/lfgf21處理、損傷后fgf21加fgfr1抑制劑(pd173074，10nmol/l)處理，測(cè)定細(xì)胞中pparγ的表達(dá)水平和活性，以確定fgf21對(duì)pparγ表達(dá)的影響，及fgfr1磷酸化和pparγ激活之間的關(guān)系。測(cè)定結(jié)果如圖13所示，其中，a圖為westernblot檢測(cè)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞核中pparγ蛋白表達(dá)水平，*p<0.05，與正常對(duì)照組相比；#p<0.05，與fgf21組相比。b圖為核中pparγ的活性。由圖13可知，hg和il-1β的加入雖然沒(méi)有明顯降低pparγ蛋白表達(dá)水平，但其活性下降。加入fgf21后，損傷后的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中pparγ蛋白表達(dá)水平和活性明顯增加；而加入fgfr1抑制劑pd173074后，pparγ蛋白表達(dá)水平和活性降低。由實(shí)施例2.2.4和實(shí)施例2.2.5說(shuō)明，fgf21能明顯促進(jìn)與fgfr1表達(dá)成正相關(guān)的核中pparγ水平和活性。實(shí)施例2.2.6fgf21激活pparγ保護(hù)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性腦血管內(nèi)皮細(xì)胞分別經(jīng)高糖(hg)加il-1β合并損傷、損傷后50nmol/lfgf21處理、損傷后10nmol/lpparγ拮抗劑gw9662處理，損傷后fgf21加pparγ拮抗劑gw9662聯(lián)合處理，通過(guò)70kdfitc-葡聚糖檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透，確定pparγ對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞滲透性的影響，檢測(cè)結(jié)果如圖14所示，*p<0.05，與正常對(duì)照組相比。圖14顯示，fgf21能減輕腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性，使用pparγ抑制劑gw9662后，fgf21的保護(hù)作用受到抑制。結(jié)合實(shí)施例2.2.4～實(shí)施例2.2.5說(shuō)明，fgf21可以激活fgfr1(或fgfr1-β-klotho復(fù)合物)，進(jìn)而激活pparγ來(lái)保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性。實(shí)施例3fgf21對(duì)t2d腦卒中神經(jīng)炎癥的影響實(shí)施例3.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)ii型糖尿病模型(t2d模型)、缺血性腦卒中模型的構(gòu)建，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)給藥和分組(db/+、db/db和db/db+fgf21組)、以及數(shù)據(jù)處理同實(shí)施例2.1。實(shí)施例3.1.1fgf21增加抗炎細(xì)胞-m2型小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量通過(guò)免疫組化方法測(cè)定腦中m2型小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物cd206+的免疫組化圖，并定量cd206+陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖15，a圖為cd206+/dapi免疫組化圖(其中，紅色示出cd206+陽(yáng)性細(xì)胞)；b圖為cd206+陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的定量圖。(n＝6)。*p<0.05，與db/+腦中風(fēng)組相比；#p<0.05，與db/db腦中風(fēng)組相比。其中，免疫組化方法為：選取中風(fēng)后14天小鼠處死，取腦部，采用常規(guī)免疫組化方法進(jìn)行測(cè)定。cd206+陽(yáng)性細(xì)胞定量：使用圖像分析軟件imageproplus進(jìn)行定量。由圖15可見(jiàn)，fgf21能夠增加db/dbt2d小鼠腦中風(fēng)后，腦中抗炎因子-m2型小膠質(zhì)細(xì)胞(cd206+陽(yáng)性細(xì)胞)的數(shù)量。實(shí)施例3.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)原代大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng):分離出生0-2day的大鼠的皮層組織，用0.25％胰酶37℃消化15-20min，加入含10％fbs的dmem培養(yǎng)基，吹打后種植于75cm2的培養(yǎng)瓶，每隔兩天換液一次。培養(yǎng)8-12day后，37℃恒溫?fù)u床上搖2h，搖速218rpm。然后將上清1000g離心5min，將細(xì)胞種植于培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿上用于實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分成正常對(duì)照組、lps組和lps+fgf21組。脂多糖(lps)的濃度為50ng/ml，fgf21的濃度為50nmol/l。實(shí)施例3.2.1fgf21減輕小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)采用rt-pcr檢測(cè)m1型小膠質(zhì)細(xì)胞促炎因子inos和tnf-αmrna表達(dá)，以及m2型小膠質(zhì)細(xì)胞抗炎因子arg1和igf-1mrna表達(dá)。結(jié)果如圖16所示，其中，a.rt-pcr測(cè)定fgf21作用于lps刺激原代大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞各因子mrna的表達(dá)，*p<0.01，與lps組相比；b.rt-pcr測(cè)定fgf21作用于靜息態(tài)原代大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞各因子mrna的表達(dá)。(n＝5)，*p<0.01，與正常對(duì)照組相比。由圖16可知，fgf21能夠抑制經(jīng)lps刺激原代培養(yǎng)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中m1型促炎因子基因的表達(dá)，同時(shí)增加m2型抗炎因子基因的表達(dá)。通過(guò)rt-pcr測(cè)定各因子mrna的表達(dá)結(jié)果表明，m1型標(biāo)志物inosmrna明顯降低，同時(shí)促炎因子tnf-αmrna表達(dá)也顯著降低，說(shuō)明fgf21能抑制lps誘導(dǎo)的原代大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞向m1型轉(zhuǎn)化。fgf21作用原代大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞8h，結(jié)果顯示m2型標(biāo)志物arg1mrna的表達(dá)增加，同時(shí)抗炎因子igf-1mrna的表達(dá)也增加，說(shuō)明fgf21能促進(jìn)靜息態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞向具有神經(jīng)保護(hù)作用的m2型轉(zhuǎn)換。實(shí)施例3.2.2fgf21促進(jìn)fgfr1的磷酸化抑制nfκb的活性(機(jī)理)通過(guò)正常細(xì)胞組、lps組、lps+fgf21組、及l(fā)ps+fgf21+fgfr抑制劑pd173074(10nmol/l)組的對(duì)照試驗(yàn)，測(cè)定lps誘導(dǎo)的原代大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中fgfr1的磷酸化水平、nfκb活性及pparγ的表達(dá)。檢測(cè)結(jié)果如圖17所示，其中，a.westernblot測(cè)定p-fgfr1表達(dá)；c.westernblot測(cè)定核蛋白中細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子pparγ的表達(dá)，*p<0.01與對(duì)照組相比；#p<0.01與lps+fgf21組相比。b.試劑盒測(cè)定nfκb的活性的表達(dá)；*p<0.01與對(duì)照組相比；#p<0.01與lps+fgf21+抑制劑組相比。由圖17表明，fgf21作用fgfr原代大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞2h，能使其fgfr1磷酸化的表達(dá)增加，而給予fgfr抑制劑pd173074，fgfr1的磷酸化被抑制。同時(shí)，fgf21也能降低經(jīng)lps誘導(dǎo)的原代大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞核中nfκb的活性，增加細(xì)胞核蛋白中細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子pparγ的表達(dá)，加入fgfr抑制劑pd173074后，fgf21對(duì)pparγ的表達(dá)和nfκb的活性效果均降低?？芍?，fgf21能夠通過(guò)促進(jìn)fgfr1的磷酸化抑制lps誘導(dǎo)產(chǎn)生的nfκb的活性，增加小膠質(zhì)細(xì)胞核中pparγ的表達(dá)水平。實(shí)施例4fgf21對(duì)t2d腦卒中血管和白質(zhì)重塑作用的影響實(shí)施例4.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)ii型糖尿病模型(t2d模型)、缺血性腦卒中模型的構(gòu)建，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)給藥和分組(db/+、db/db和db/db+fgf21組)、以及數(shù)據(jù)處理同實(shí)施例2.1。實(shí)施例4.1.1fgf21減輕軸突的損傷和髓鞘的丟失通過(guò)中風(fēng)14天后，對(duì)三組小鼠腦組織取樣，測(cè)定fgf21對(duì)軸突損傷和髓鞘丟失的影響。通過(guò)smi32免疫組化法鑒定軸突，通過(guò)mbp免疫組化檢測(cè)髓鞘。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖18，其中，上圖左側(cè)是軸突損傷的標(biāo)志物smi32免疫組化圖(其中，紅色示出標(biāo)志物smi32)，右側(cè)是其定量圖。下圖左側(cè)是髓鞘的標(biāo)志物mbp的免疫組化圖(其中，綠色示出標(biāo)志物mbp)，右側(cè)是其定量圖。(n＝6)。*p<0.05，與db/+腦中風(fēng)組相比；#p<0.05，與db/db腦中風(fēng)組相比。由圖18可知，db/db腦卒中較db/+腦卒中加劇了軸突的損傷及髓鞘的丟失。經(jīng)fgf21處理后，db/db腦卒中小鼠中軸突損傷雖未達(dá)到db/+腦卒中組的水平，但經(jīng)未處理前有明顯改善；而髓鞘水平可恢復(fù)至與db/+腦卒中小鼠相同水平。說(shuō)明fgf21可極大減輕軸突的損傷和髓鞘的丟失。實(shí)施例4.1.2fgf21促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的再生通過(guò)中風(fēng)14天后，對(duì)三組小鼠腦組織取樣，在相同的大腦區(qū)域，采用免疫組化法檢測(cè)ng2來(lái)鑒別少突膠質(zhì)細(xì)胞(opc細(xì)胞)的再生。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖19，其中，左側(cè)是opc細(xì)胞的標(biāo)志物ng2的免疫組化圖(其中，綠色示出標(biāo)志物ng2)，右側(cè)是其定量圖。(n＝6)*p<0.05，與db/+腦中風(fēng)組相比；#p<0.05，與db/db腦中風(fēng)組相比。由圖19可知，經(jīng)fgf21處理后，db/db腦卒中小鼠的膠質(zhì)細(xì)胞雖然低于db/+腦卒中小鼠，但顯著高于未經(jīng)fgf21處理的db/db腦卒中小鼠。說(shuō)明fgf21能促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的再生。實(shí)施例4.1.3fgf21增加腦血管密度通過(guò)中風(fēng)14天后，對(duì)三組小鼠腦組織取樣，測(cè)定fgf21對(duì)小鼠腦血管密度的影響。通過(guò)免疫組化法檢測(cè)和量化cd31陽(yáng)性細(xì)胞來(lái)分析腦血管密度。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖20，其中，左側(cè)是內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物cd31的免疫組化圖(其中，紅色示出標(biāo)志物cd31)，右側(cè)是其定量圖。(n＝6)，#p<0.05，與db/db腦中風(fēng)組相比。由圖20可知，經(jīng)fgf21處理后，db/db腦卒中小鼠的腦血管密度高于db/+腦卒中小鼠，顯著高于未經(jīng)fgf21處理的db/db腦卒中小鼠。說(shuō)明fgf21在增加正常血糖的腦卒中和ⅱ型糖尿病腦卒中的腦血管密度方面具有明顯的效果。實(shí)施例4.1.4fgf21增加腦血管片段中促血管生成因子mrna的表達(dá)通過(guò)中風(fēng)14天后，對(duì)三組小鼠腦組織取樣，測(cè)定fgf21對(duì)小鼠腦血管再生的影響。通過(guò)rt-pcr測(cè)定相關(guān)因子mrna表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)表1。其中，*p<0.05，與db/+腦中風(fēng)組相比；#p<0.05，與db/db腦中風(fēng)組相比，n＝6。表1小鼠腦微血管片段中mrna水平genesdb/+db/dbdb/db+fgf21vegfa10.35±0.05*0.78±0.12#enos11.05±0.092.19±0.25#igf-110.50±0.06*2.75±0.18#il-1β11.91±0.17*1.17±0.14#由表1中rt-pcr結(jié)果表明，db/dbt2d小鼠腦中風(fēng)后fgf21給藥14天，fgf21提高了促血管生成因子vegfa、enos和igf-1mrna的表達(dá)，減少炎癥因子il-1βmrna的表達(dá)。實(shí)施例4.1.5fgf21增加腦中ampk/nrf2的活性，從而促進(jìn)腦血管和白質(zhì)的重構(gòu)(機(jī)理)通過(guò)中風(fēng)7天后，對(duì)三組小鼠腦組織取樣，通過(guò)westernblot和活性試劑盒測(cè)定腦中ampk、p-ampk和nrf2的活性，結(jié)果見(jiàn)圖21。其中，a.westernblot測(cè)定p-ampk/ampk的表達(dá)；b.p-ampk/ampk的定量圖；c.核蛋白中nrf2的活性。(n＝5)。*p<0.01，與db/+組相比；#p<0.01，與db/db組相比。由圖21可知，db/dbt2d中風(fēng)后，p-ampk/ampk表達(dá)及nrf2的活性較db/+中風(fēng)顯著下降。db/dbt2d小鼠用fgf21以3.0mg/kg/day劑量給藥7天后，能明顯增加腦中ampk的磷酸化以及細(xì)胞核中nrf2的活性。實(shí)施例4.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：fgf21處理的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞(opc)增殖添加液或內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液的收集：(1)無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基組；(2)無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基+fgf21(50nmol/l)組；(3)正常內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)組；(4)正常內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)+fgf21(50nmol/l)組：50nmol/lfgf21加入到內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基6小時(shí)后，接著更換成新的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h，最后收集內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液。將添加液或內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到大鼠原代opc細(xì)胞中，其中，(3)組和(4)組內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液與opc細(xì)胞培養(yǎng)液以1:1混合，轉(zhuǎn)移作用于opc細(xì)胞，(2)組中fgf21加入水平與(4)組相當(dāng)。通過(guò)mtt法測(cè)定各組細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果如圖22所示。其中，(n＝6)，*p<0.01，與無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液相比；#p<0.01，與內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液組相比。由圖22可知，fgf21處理的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)opc細(xì)胞的增殖較其他組有明顯增加，并且在此之后，換用未經(jīng)fgf21處理的正常腦血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)opc細(xì)胞，opc細(xì)胞的增殖仍較(1)、(2)、(3)組有顯著提高。說(shuō)明fgf21處理的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液可能促進(jìn)opc增殖。實(shí)施例5fgf21對(duì)ii型糖尿病腦卒中小鼠血糖的調(diào)節(jié)ii型糖尿病模型(t2d模型)、缺血性腦卒中模型的構(gòu)建，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)給藥和分組(db/+、db/db和db/db+fgf21組)、以及數(shù)據(jù)處理同實(shí)施例2.1。對(duì)中風(fēng)前后各組小鼠的體重、血糖和糖化血紅蛋白(hba1c)的水平進(jìn)行監(jiān)控。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖23，其中，中風(fēng)后體重(左側(cè))、血糖(中間)和糖化血紅蛋白(hba1c)(右側(cè))的定量圖。(n＝12)。*p<0.01，與db/+腦中風(fēng)組相比；#p<0.01，與db/db腦中風(fēng)組相比。由圖23可知，fgf21能夠降低db/dbt2d小鼠腦中風(fēng)后的高血糖。與對(duì)照組相比，體重略有降低，但無(wú)明顯改變。但從第3天到第14天，血液中葡萄糖的濃度明顯降低。同時(shí)fgf21也能明顯地降低糖化血紅蛋白的水平。這些數(shù)據(jù)表明fgf21能調(diào)節(jié)db/dbt2d小鼠腦中風(fēng)后糖的代謝功能。sequencelisting<110>溫州市生物醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心麻省總醫(yī)院(massachusettsgeneralhospital)<120>人成纖維生長(zhǎng)因子21在制備用于治療腦卒中藥物中的應(yīng)用<130>2010<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>561<212>dna<213>人工序列<400>1catatgcatccgattccggatagcagcccgctgctgcagtttggtggtcaggtgcgtcag60cgttatctgtataccgatgatgcgcagcagaccgaagcgcatctggaaattcgtgaagat120ggtaccgtgggtggtgcggcggatcagagcccggaaagcctgctgcagctgaaagcgctg180aaaccgggtgtgattcagattctgggtgtgaaaaccagccgttttctgtgccagcgtccg240gatggtgcgctgtatggtagcctgcattttgatccggaagcgtgcagctttcgtgaactg300ctgctggaagatggttataatgtgtatcagagcgaagcgcatggtctgccgctgcatctg360ccgggtaataaaagcccgcatcgtgatccggcgccgcgtggtccggcgcgttttctgccg420ctgccgggtctgccgccggcgctgccggaaccgccgggtattctggcgccgcagccgccg480gatgtgggtagcagcgatccgctgagcatggtgggtccgagccagggtcgtagcccgagc540tatgcgagctaatgaggatcc561當(dāng)前第1頁(yè)12