本申請(qǐng)是2008年2月1日提交的題為“活化素-actriia拮抗劑及在治療或預(yù)防乳腺癌中的用途”的國(guó)家申請(qǐng)?zhí)枮?00880011264.x(pct/us2008/001429)的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考

本申請(qǐng)要求于2007年2月1日提交的序列號(hào)為60/899,070的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)和于2007年10月25日提交的序列號(hào)為61/000,540的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)的權(quán)益。上述申請(qǐng)的全部教導(dǎo)在此引入作為參考。

本發(fā)明涉及抗乳腺癌分子靶標(biāo)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及活化素拮抗劑及其在治療或預(yù)防乳腺癌中的用途。

背景技術(shù)：

乳腺癌是西方國(guó)家女性中最常見的癌癥類型，每年影響超過180,000美國(guó)女性。該病發(fā)生在由分枝導(dǎo)管系統(tǒng)組成的乳腺。每一個(gè)乳腺或乳房包含15到20個(gè)稱為乳腺小葉(lobe)的部分，每個(gè)乳腺小葉包含一系列匯集到乳頭的分枝的導(dǎo)管。沿(line)每條導(dǎo)管排列的上皮細(xì)胞負(fù)責(zé)生產(chǎn)乳汁。侵襲性乳腺癌被認(rèn)為是由末梢導(dǎo)管/小葉單位的正常上皮細(xì)胞通過一系列不斷增加的異常增殖性病變產(chǎn)生。一旦腫瘤獲得轉(zhuǎn)移的能力，乳腺癌細(xì)胞會(huì)擴(kuò)散到其它器官，使治療更加困難。最常見的乳腺癌轉(zhuǎn)移部位是肺、肝、和骨骼。向骨骼的轉(zhuǎn)移通常會(huì)伴隨劇痛、骨質(zhì)流失、以及骨折風(fēng)險(xiǎn)增高。在乳腺癌治療中應(yīng)用的很多抗雌激素療法也會(huì)伴隨骨質(zhì)流失加速。

診斷為乳腺癌的患者通常進(jìn)行手術(shù)和/或放射療法來治療原發(fā)瘤，然后用輔助療法治療可能擴(kuò)散到遠(yuǎn)處的癌細(xì)胞。輔助療法由細(xì)胞毒化療和/或內(nèi)分泌療法組成。雖然化療對(duì)治療多種惡性腫瘤有效，但是很多抗腫瘤化合物會(huì)誘導(dǎo)不良的副作用。另外，很多腫瘤對(duì)化療和內(nèi)分泌療法沒有反應(yīng)或產(chǎn)生抗性。雖然輔助療法改善了乳腺癌患者的死亡率，但是最常見的組織病理學(xué)類型的侵襲性乳腺癌患者的10年生存率仍然只有35％到50％(weigelt等人2005nat.rev.cancer5：591-602)。此外，由于缺乏預(yù)后標(biāo)準(zhǔn)，通過單獨(dú)局部療法治愈的很多女性不必要地接受了輔助療法。

因此，需要更高效率的且更有效的抗乳腺癌分子靶標(biāo)。比化療和內(nèi)分泌療法更低毒性和/或更有效的替代療法可改善治療方法并提高生存率。此外，有些患者可能存在發(fā)展成擴(kuò)散性或轉(zhuǎn)移性乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)，可對(duì)這些患者進(jìn)行預(yù)防性治療的藥劑在臨床上是有用的。因此，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供替代性組合物和方法，用于治療乳腺癌或者抑制或預(yù)防乳腺癌的進(jìn)展。

發(fā)明概述

部分而言，本公開內(nèi)容涉及使用活化素拮抗劑以及actriia拮抗劑治療或預(yù)防乳腺癌或乳腺癌伴隨的骨質(zhì)流失(boneloss)。具體來說，本公開內(nèi)容提供了治療或預(yù)防乳腺癌的方法，該方法使用充當(dāng)活化素抑制劑的可溶形式的actriia。盡管可溶性actriia可能通過活化素拮抗以外的機(jī)制影響癌細(xì)胞生長(zhǎng)或存活，但是合意的治療劑可在活化素拮抗或actriia拮抗或者兩者的基礎(chǔ)上進(jìn)行選擇。此類藥劑被統(tǒng)稱為活化素-actriia拮抗劑。因此，在某些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供使用活化素-actriia拮抗劑在有此需要的患者中治療或預(yù)防乳腺癌的方法，所述活化素-actriia拮抗劑包括，例如，活化素-結(jié)合actriia多肽(activin-bindingactriiapolypepitde)、抗活化素抗體、抗actriia抗體、靶向活化素或actriia的小分子和適體、以及減少活化素和actriia表達(dá)的核酸。如序列號(hào)為11/603,485的美國(guó)專利申請(qǐng)(在此引入作為參考)所述，活化素-actriia拮抗劑可用于促進(jìn)骨生長(zhǎng)和提高骨密度。如本文所述，此類拮抗劑還可用于治療或預(yù)防乳腺癌、乳腺癌向骨骼的轉(zhuǎn)移、以及乳腺癌伴隨的骨質(zhì)流失。

在某些方面，本公開內(nèi)容提供使用多肽治療或預(yù)防乳腺癌的方法，所述多肽包括與活化素結(jié)合的可溶性、活化素-結(jié)合actriia多肽?？蓪ctriia多肽配制成包含該活化素-結(jié)合actriia多肽和藥學(xué)上可接受的載體的藥物制劑。該活化素-結(jié)合actriia多肽可以小于1微摩爾或小于100、10或1納摩爾的kd與活化素結(jié)合。任選地，相對(duì)于gdf11和/或gdf8，該活化素-結(jié)合actriia多肽選擇性地結(jié)合活化素，并任選地以比結(jié)合gdf11和/或gdf8至少低10倍、20倍或50倍的kd結(jié)合活化素。盡管不希望受到特定作用機(jī)制的束縛，預(yù)期這種活化素抑制勝過gdf11/gdf8抑制的選擇性程度說明了對(duì)骨骼或腫瘤存活或生長(zhǎng)的影響，而對(duì)肌肉沒有一致可測(cè)的影響。在許多實(shí)施方案中，將選擇actriia多肽，從而在達(dá)到對(duì)癌細(xì)胞的所需影響的劑量下，引起肌肉中小于15％、小于10％或小于5％的增長(zhǎng)。如通過尺寸排阻色譜所估計(jì)，該組合物相對(duì)于其它多肽成分可具有至少95％的純度，任選地，該組合物具有至少98％的純度。用于此類制劑的活化素-結(jié)合actriia多肽可以是本文所述的那些多肽的任意種，例如具有選自seqidnos：2、3、7或12的氨基酸序列的多肽，或具有與選自seqidnos：2、3、7、12或13的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的氨基酸序列的多肽?；罨?結(jié)合actriia多肽可包含天然actriia多肽的功能性片段，例如包含選自序列seqidnos：1-3或序列seqidno：2的至少10、20、30、50或90個(gè)或更多氨基酸，缺失c-末端10至15個(gè)氨基酸(“尾部”)的功能性片段。

可溶性、活化素-結(jié)合actriia多肽可包括相對(duì)天然存在的actriia多肽在氨基酸序列(例如，在配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域)中的一個(gè)或多個(gè)變化。在wo2006/012627的第59-60頁(在此引入作為參考)中提供了變化的actriia多肽的實(shí)例。氨基酸序列中的變化可以例如，當(dāng)其在哺乳動(dòng)物、昆蟲或其它真核細(xì)胞中生成時(shí)改變多肽的糖基化，或者相對(duì)于天然存在的actriia多肽改變多肽的蛋白酶解裂解。

活化素-結(jié)合actriia多肽可以是一種融合蛋白，其具有作為一種結(jié)構(gòu)域的actriia多肽(例如，actriia的配體結(jié)合部分)和提供所需特性(例如改善的藥代動(dòng)力學(xué)、更簡(jiǎn)單的純化、增強(qiáng)的對(duì)特定組織的靶向等)的一種或多種其它結(jié)構(gòu)域。例如，融合蛋白的結(jié)構(gòu)域可增強(qiáng)以下各項(xiàng)中的一種或多種：體內(nèi)穩(wěn)定性、體內(nèi)半衰期、攝取/給藥、組織定位或分布、蛋白復(fù)合物的形成、該融合蛋白的多聚和/或純化?；罨?結(jié)合actriia融合蛋白可包含提供所需特性(例如改善的藥代動(dòng)力學(xué)、提高的溶解度或提高的穩(wěn)定性)的免疫球蛋白fc結(jié)構(gòu)域(野生型或突變體)或血清白蛋白或其它多肽部分。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，actriia-fc融合包含位于fc結(jié)構(gòu)域和胞外actriia結(jié)構(gòu)域之間的相對(duì)非結(jié)構(gòu)化(unstructured)的接頭。該非結(jié)構(gòu)化的接頭可對(duì)應(yīng)于在actriia的胞外結(jié)構(gòu)域的c-末端的約15個(gè)氨基酸的非結(jié)構(gòu)化區(qū)(“尾部”)，或者它可以是相對(duì)不含二級(jí)結(jié)構(gòu)的1、2、3、4或5個(gè)氨基酸的人工序列或長(zhǎng)度在5與15、20、30、50或更多氨基酸之間的人工序列，或者兩者的混合物。接頭可富含甘氨酸或脯氨酸殘基，并可以例如，含有蘇氨酸/絲氨酸和甘氨酸的單獨(dú)序列或蘇氨酸/絲氨酸和甘氨酸的重復(fù)序列(例如，tg4或sg4單態(tài)或重復(fù))。融合蛋白可包含純化子序列(subsequence)，例如表位標(biāo)記、flag標(biāo)記、聚組氨酸序列和gst融合。任選地，可溶性actriia多肽包含選自如下的一種或多種修飾的氨基酸殘基：糖基化氨基酸、聚乙二醇化(pegylated)氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化氨基酸、與脂質(zhì)部分綴合(conjugated)的氨基酸以及與有機(jī)衍生劑綴合的氨基酸。藥物制劑還可包含一種或多種額外化合物，例如可用于治療骨病的化合物。優(yōu)選地，藥物制劑基本不含熱原。一般而言，優(yōu)選在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中表達(dá)actriia蛋白，其合適地介導(dǎo)actriia蛋白的天然糖基化，從而減少患者中的不利免疫應(yīng)答的可能性。人和cho細(xì)胞系已被成功使用，預(yù)期其它常見的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)將是有用的。另外，酵母和其它細(xì)胞類型已被遺傳改造以表達(dá)催化糖基化的哺乳動(dòng)物酶，從而允許在這些非哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的蛋白上產(chǎn)生嚴(yán)格控制的類似哺乳動(dòng)物的糖基化。這些重組細(xì)胞系還可用于表達(dá)本文所述的蛋白。

如本文所述的actriia蛋白特指具有所需特性的actriia-fc(在actriia部分和fc部分之間具有最小接頭的形式)，所述特性包括在動(dòng)物模型中相對(duì)gdf8和/或gdf11的選擇性結(jié)合活化素、高親和性配體結(jié)合和大于兩周的血清半衰期。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供使用actriia-fc多肽和包含此類多肽和藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物制劑來治療或預(yù)防乳腺癌的方法。

在某些方面，本公開內(nèi)容提供使用編碼可溶性活化素-結(jié)合aetriia多肽的核酸治療或預(yù)防乳腺癌的方法。分離的多核苷酸可包含例如上述可溶性、活化素-結(jié)合actriia多肽的編碼序列。例如，分離的核酸可包含編碼actriia的胞外結(jié)構(gòu)域(例如，配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域)的序列以及編碼actriia的部分或全部跨膜結(jié)構(gòu)域和/或細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，除定位在該跨膜結(jié)構(gòu)域或細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中、或定位在該胞外結(jié)構(gòu)域與該跨膜結(jié)構(gòu)域或細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域之間的終止密碼子外的序列。例如，分離的多核苷酸可包含全長(zhǎng)actriia多核苷酸序列(例如，seqidno：4或5)，或部分截短的形式(truncatedversion)，所述分離的多核苷酸進(jìn)一步包含在3′-末端之前至少六百個(gè)核苷酸處或其它位置的轉(zhuǎn)錄終止密碼子，從而使該多核苷酸的翻譯形成任選地融合至全長(zhǎng)actriia的截短部分的胞外結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選的核酸序列為seqidno：14。對(duì)本文所述方法有用的核酸可操作地連接至表達(dá)用啟動(dòng)子，且本公開內(nèi)容提供用此類重組多核苷酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。所述細(xì)胞優(yōu)選為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如中國(guó)倉鼠卵巢(cho)細(xì)胞。

本公開內(nèi)容還提供制備可用于治療或預(yù)防乳腺癌的可溶性、活化素-結(jié)合actriia多肽的方法。所述方法可包括在合適的細(xì)胞(例如cho細(xì)胞)中表達(dá)本文公開的任意核酸(例如，seqidno：4、5或14)。此類方法可包括：a)在適于表達(dá)所述可溶性actriia多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，其中用可溶性actriia表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞；和b)回收如此表達(dá)的可溶性actriia多肽?？扇苄詀ctriia多肽可作為粗制的、部分純化的或高度純化的級(jí)分回收。可通過一系列純化步驟實(shí)現(xiàn)純化，所述純化步驟包括例如，任意順序的如下步驟中的一種、兩種或三種或多種：a蛋白色譜、陰離子交換色譜(例如q瓊脂糖)、疏水作用色譜(例如苯基瓊脂糖)、尺寸排阻色譜以及陽離子交換色譜。

在某些方面，本文公開的活化素-actriia拮抗劑(例如可溶性、活化素-結(jié)合actriia多肽)可用于在對(duì)象中治療、預(yù)防或抑制乳腺癌的方法，包括例如，延遲乳腺癌發(fā)作、抑制乳腺癌進(jìn)展、減小腫瘤尺寸、防止腫瘤生長(zhǎng)、延遲轉(zhuǎn)移發(fā)生或防止轉(zhuǎn)移(包括向骨骼轉(zhuǎn)移)的方法。在某些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供在有此需要的患者中減少或抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)或存活的方法。一種方法可包括對(duì)有此需要的對(duì)象給予有效量的活化素-actriia拮抗劑。在某些方面，本公開內(nèi)容提供活化素-actriia拮抗劑在制備用于治療或預(yù)防本文所述乳腺癌的藥物中的用途。本公開內(nèi)容還涉及聯(lián)合療法，其包含活化素-actriia拮抗劑與放射療法、化療(例如，細(xì)胞毒藥劑)和/或內(nèi)分泌療法。所述拮抗劑可以是actriia-fc融合蛋白，其中所述aetriia-fc融合蛋白包含與seqidno：3的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。

在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在具有一種或多種乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)因素的患者中預(yù)防或延遲乳腺癌發(fā)作的方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及在已診斷患有原發(fā)乳腺腫瘤或乳腺增殖性病變的患者中預(yù)防或延遲轉(zhuǎn)移性疾病發(fā)作的方法。在病人中預(yù)防或延遲乳腺癌發(fā)作的方法可包括對(duì)有此需要的病人給予有效量的多肽，所述多肽選自：a)包含與seqidno：2具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽；b)包含與seqidno：3具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽；c)包含選自seqidno：2的至少50個(gè)連續(xù)氨基酸的多肽。

本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及在患有乳腺癌的病人中抑制活化素介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的方法。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括對(duì)所述病人給予有效量的活化素-actriia拮抗劑。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述拮抗劑是選自以下的多肽：a)包含與seqidno：2具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽；b)包含與seqidno：3具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽；c)包含選自seqidno：2的至少50個(gè)連續(xù)氨基酸的多肽。

在某些方面，本公開內(nèi)容提供用于鑒定抑制癌細(xì)胞(例如，乳腺癌細(xì)胞)生長(zhǎng)或存活的藥劑的方法。所述方法包括：a)鑒定與活化素或actriia多肽的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的測(cè)試藥劑；b)評(píng)估所述藥劑對(duì)癌細(xì)胞增殖、存活或凋亡的影響。

附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了在cho細(xì)胞中表達(dá)的actriia-hfc的純化。所述蛋白純化為單一的、充分確定(well-defined)的峰，其通過分級(jí)柱(sizingcolumn)(左圖)和考馬斯染色的sds-page(右圖)顯現(xiàn)(左泳道：分子量標(biāo)準(zhǔn)物；右泳道：actriia-hfc)。

圖2顯示了通過biacore^tm分析測(cè)定的aetriia-hfc與活化素及gdf-11的結(jié)合。

圖3顯示了在轉(zhuǎn)移性乳腺癌的小鼠模型中aetriia-mfc治療顯著減少了轉(zhuǎn)移性病變的形成。在心內(nèi)注射表達(dá)熒光素酶的mda-mb-231乳腺癌細(xì)胞5周后，對(duì)小鼠進(jìn)行非侵入性觀察(麻醉，熒光成像)。只載體處理的小鼠中12只顯示可見的轉(zhuǎn)移性病變，但是12只actriia-mfc處理的小鼠中只有4只顯示可見的病變。

發(fā)明詳述

1.綜述

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(tgf-β)超家族包含各種具有共同的序列元件和結(jié)構(gòu)基序的生長(zhǎng)因子。這些蛋白已知對(duì)脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物兩者中的各種各樣的細(xì)胞類型產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。該超家族的成員在胚胎發(fā)育過程中在圖式形成和組織特化中起重要功能，并能影響各種分化過程，包括脂肪生成、肌細(xì)胞生成、軟骨發(fā)生、心臟發(fā)生、血細(xì)胞生成、神經(jīng)發(fā)生以及上皮細(xì)胞分化。該家族被分為兩大分支：bmp/gdf和tgf-β/活化素分支，其成員具有不同的，通常是互補(bǔ)的作用。通過操控tgf-β家族成員的活性，通?？赡芤鹩袡C(jī)體的明顯生理變化。例如，皮埃蒙特牛與比利時(shí)藍(lán)牛品種攜帶gdf8(也稱為肌肉生長(zhǎng)抑制因子)基因的功能喪失突變，其導(dǎo)致肌肉質(zhì)量的明顯增加。grobet等人，natgenet.1997，17(1)：71-4。此外，在人中，滅活gdf8等位基因與肌肉質(zhì)量的上升相關(guān)，且據(jù)報(bào)道與異常的力量相關(guān)。schuelke等人，nengljmed2004，350：2682-8。

活化素是二聚多肽生長(zhǎng)因子，其屬于tgf-β超家族。存在三種主要的活化素形式(a、b和ab)，其為兩種密切相關(guān)的β亞基的同源/異源二聚體(分別為βaβa、βbβb和βaβb)。人基因組還編碼活化素c和活化素e，其主要在肝中表達(dá)，還已知含有βc或βe的異源二聚體形式。在tgf-β超家族中，活化素是獨(dú)特且多功能的因子，它能刺激卵巢和胎盤細(xì)胞中的激素生成，支持神經(jīng)元細(xì)胞存活，根據(jù)細(xì)胞類型積極或消極影響細(xì)胞周期進(jìn)展，并至少在兩棲動(dòng)物胚胎中誘導(dǎo)中胚層的分化(depaolo等人，1991，procsocepbiolmed.198：500-512；dyson等人，1997，currbiol.7：81-84；woodruff，1998，biochempharmacol.55：953-963)。此外，業(yè)已顯示活化素b涉及小鼠乳腺上皮細(xì)胞分化的調(diào)控(robinson和hennighausen，1997development124：2701-2708)。在數(shù)種組織中，活化素信號(hào)傳導(dǎo)被它的相關(guān)異源二聚體抑制素所拮抗。例如，在從腦垂體釋放促濾泡激素(fsh)的過程中，活化素促進(jìn)fsh分泌和合成，而抑制素阻止fsh的分泌和合成。可調(diào)節(jié)活化素生物活性和/或與活化素結(jié)合的其它蛋白包括促濾泡抑制素(fs)、促濾泡抑制素相關(guān)蛋白(fsrp)和α2-巨球蛋白。

tgf-β信號(hào)由i型和ii型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體的異聚復(fù)合物介導(dǎo)，其在受到配體刺激時(shí)磷酸化和激活下游smad蛋白(massagué，2000，nat.rev.mol.cellbiol.1：169-178)。這些i型和ii型受體為跨膜蛋白，由具有富含半胱氨酸區(qū)的配體-結(jié)合胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和具有預(yù)測(cè)的絲氨酸/蘇氨酸特異性的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域所組成。i型受體為信號(hào)傳導(dǎo)所必需；ii型受體為結(jié)合配體以及表達(dá)i型受體所需要。i和ii型活化素受體在配體結(jié)合后形成穩(wěn)定的復(fù)合物，導(dǎo)致i型受體被ii型受體磷酸化。

兩種有關(guān)的ii型受體(actriia和actriib)已被鑒定為活化素的ii型受體(mathews和vale，1991，cell65：973-982；attisano等人，1992，cell68：97-108)。除了活化素外，actriia和actriib能夠與數(shù)種其它的tgf-β家族蛋白(包括bmp7、nodal、gdf8和gdf11)進(jìn)行生化相互作用(yamashita等人，1995，j.cellbiol.130：217-226；lee和mcpherron，2001，proc.natl.acad.sci.98：9306-9311；yeo和whitman，2001，mol.cell7：949-957；oh等人，2002，genesdev.16：2749-54)。alk4是活化素(特別是活化素a)的主要的i型受體，而alk-7也可用作活化素(特別是活化素b)的受體。

如本文所述，相對(duì)其它tgf-β家族成員(例如gdf8或gdf11)明顯優(yōu)先結(jié)合活化素a的可溶性actriia多肽(sactriia)可用于治療或預(yù)防癌癥，特別是乳腺癌。雖然不希望受到任何具體機(jī)制的束縛，假定在這些研究中所用的具體sactriia構(gòu)建體顯示極強(qiáng)的活化素結(jié)合(皮摩爾解離常數(shù))，預(yù)期sactriia的作用主要由活化素拮抗劑作用所引起?；罨?actriia拮抗劑包括，例如，活化素-結(jié)合的可溶性actriia多肽、結(jié)合活化素(具體來說活化素a和b亞基，也稱為βa和βb)并破壞actriia結(jié)合的抗體、結(jié)合actriia并破壞活化素結(jié)合的抗體、選擇用于活化素或actriia結(jié)合的非抗體蛋白(此類蛋白及其設(shè)計(jì)和選擇的方法的實(shí)例參見例如wo/2002/088171、wo/2006/055689和wo/2002/032925)、選擇用于活化素或actriia結(jié)合的隨機(jī)化的肽，通常附著在fc結(jié)構(gòu)域上。具有活化素或actriia結(jié)合活性的兩種不同蛋白(或其它部分)，特別是分別阻斷i型(例如可溶性i型活化素受體)和ii型(例如可溶性ii型活化素受體)結(jié)合位點(diǎn)的活化素結(jié)合劑，可連接在一起創(chuàng)建雙功能結(jié)合分子。抑制該活化素-actriia信號(hào)傳導(dǎo)軸的核酸適體、小分子和其它藥劑也可使用。各種蛋白具有活化素-actriia拮抗劑活性，包括抑制素(即抑制素α亞基)(盡管抑制素并不在所有的組織中普遍拮抗活化素)、促濾泡抑制素(例如促濾泡抑制素-288和促濾泡抑制素-315)、fsrp、活化素c、α(2)-巨球蛋白、以及m108a(在位置108處由蛋氨酸突變?yōu)楸彼?突變活化素a。一般而言，活化素的替代形式(特別是在i型受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域中具有替代的那些形式)能夠結(jié)合ii型受體且不能形成活性三元復(fù)合物，因此充當(dāng)拮抗劑。此外，抑制活化素a、b、c或e或者尤其抑制actriia表達(dá)的核酸，例如反義分子、sirna或核酶可被用作活化素-actrii拮抗劑。待使用的活化素-actriia拮抗劑相對(duì)于其它tgf-β家族成員，特別是相對(duì)于gdf8和gdf11，可對(duì)抑制活化素介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)顯示選擇性。可溶性actriib蛋白確實(shí)與活化素結(jié)合，但是該野生型蛋白相對(duì)于gdf8/11不顯示出對(duì)結(jié)合活化素的顯著選擇性。雖然如此，此類actriib多肽，以及具有不同結(jié)合特性的actriib的變化形式(參見，例如wo2006/012627，pp.55-59，在此引入作為參考)，可對(duì)癌細(xì)胞實(shí)現(xiàn)所需的作用。通過與另一種活化素選擇性結(jié)合劑偶聯(lián)，天然的或變化的actriib可獲得增加的對(duì)活化素的特異性。

在本發(fā)明的上下文中以及在每個(gè)術(shù)語所用的特定的上下文中，在本說明書中所用的術(shù)語通常具有其在本領(lǐng)域中的普通含義。在下文以及說明書的其它部分討論了某些術(shù)語，以在描述本發(fā)明的組合物和方法以及如何制造和使用它們的方面為從業(yè)者提供額外的指導(dǎo)。術(shù)語的任何使用范圍或含義將從該術(shù)語所用的特定上下文變得顯而易見。

“大約”和“約”一般指在給定測(cè)量法的性質(zhì)和精確性的前提下測(cè)得數(shù)值的可接受誤差程度。典型地，示例性誤差程度為在給定的數(shù)值或數(shù)值范圍的20％以內(nèi)，優(yōu)選在10％以內(nèi)，更優(yōu)選在5％以內(nèi)。

或者，特別是在生物系統(tǒng)中，術(shù)語“大約”和“約”可表示在一定數(shù)量級(jí)范圍內(nèi)，優(yōu)選在給定值的5倍以內(nèi)，更優(yōu)選在2倍以內(nèi)的平均值。除非另有說明，本文給出的數(shù)量為近似值，表示在未明確指出時(shí)，可推出術(shù)語“大約”或“約”。

本發(fā)明的方法可包括對(duì)序列彼此比較的步驟，包括將野生型序列與一種或多種突變體(序列變體)進(jìn)行比較。此類比較通常包括聚合物序列的比對(duì)，例如，采用本領(lǐng)域熟知的序列比對(duì)程序和/或算法(例如，稍加舉例，blast、fasta和megalign)進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地理解：在此類比對(duì)中，當(dāng)突變包含殘基插入或刪除時(shí)，該序列比對(duì)將在不包含該插入或刪除殘基的聚合物序列中引入“間隙”(通常由破折號(hào)或“a”表示)。

“同源性”及其所有的語法形式和拼寫變體均指具有“共同進(jìn)化起源”的兩種蛋白(包括來自相同生物物種的超家族的蛋白，以及來自不同生物物種的同源性蛋白)之間的關(guān)系。此類蛋白(及其編碼核酸)具有序列同源性，這反映在它們的序列相似性，不管是就百分比同一性而言還是在通過特定殘基或基序以及保守位置的存在方面。

術(shù)語“序列相似性”及其所有的語法形式指可享有或可不享有共同進(jìn)化起源的核酸或氨基酸序列之間的同一性或?qū)?yīng)性程度。

然而，在通常的使用以及在本申請(qǐng)中，當(dāng)術(shù)語“同源性”被副詞例如“高度”修飾時(shí)，可表示序列相似性，并可涉及或可不涉及共同進(jìn)化起源。

術(shù)語“乳腺癌”指乳腺的任何增殖性病變或增殖性異常，其包括，例如，良性病變、惡化前和惡性病變、實(shí)體腫瘤以及轉(zhuǎn)移性疾病(局部轉(zhuǎn)移，例如iii期，和更廣泛的轉(zhuǎn)移，例如iv期)。乳腺癌包括但不限于腺癌、小葉(小細(xì)胞)癌、導(dǎo)管內(nèi)癌、乳腺髓樣癌、乳腺粘液腺癌、乳腺小管癌、乳頭乳腺癌、佩吉特氏病以及炎性乳腺癌。乳腺癌還指源于乳腺轉(zhuǎn)移性病變的其它器官(例如肺、肝和骨骼)疾病。乳腺癌還包括激素應(yīng)答性和激素非依賴性癌癥。一般而言，激素非依賴性乳腺癌的特征是雌激素和/或孕酮受體水平的缺失或降低，并且這些癌癥典型地對(duì)用抗激素(特別是抗雌激素)療法的治療具有頑固性。乳腺癌還以her2表達(dá)為基礎(chǔ)分類，其中her2⁺腫瘤比her2-腫瘤的預(yù)后更差。

2.actriia多肽

在某些方面，本發(fā)明涉及使用actriia多肽治療或預(yù)防乳腺癌的方法。本文所用的術(shù)語“actriia”指來自任意物種的iia型活化素受體(actriia)蛋白以及通過突變或其它修飾從該actriia蛋白衍生的變體的家族。本文提及actriia時(shí)，應(yīng)理解為提及目前鑒定的形式中的任意一種。該actriia家族的成員通常為跨膜蛋白，由具有富含半胱氨酸區(qū)的配體結(jié)合胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域以及具有預(yù)測(cè)的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域所組成。

術(shù)語“actriia多肽”包括包含任何天然存在的actriia家族成員多肽及其保留了有用活性的任意變體(包括突變體、片段、融合體以及擬肽形式)的多肽。參見，例如wo/2006/012627。例如，actriia多肽包括由任意已知actriia的序列所衍生的多肽，其中該已知actriia具有與actriia多肽序列有至少80％同一性、任選至少85％、90％、95％、97％、99％或更高同一性的序列。例如，本發(fā)明的actriia多肽可結(jié)合actriia蛋白和/或活化素并抑制其功能?？筛鶕?jù)在體內(nèi)抑制癌細(xì)胞增殖或存活的活性選擇actriia多肽。actriia多肽的實(shí)例包括人actriia前體多肽(seqidno：1)和可溶性人actriia多肽(例如，seqidnos：2、3、7和12)。

人actriia前體蛋白序列如下：

mgaaaklafavfliscssgayynillyslvplmliagivicafwvyrhhkmayppvlvptqdpgppppspllglkplqllevkargrfgcvwkaqllneyvavkifpiqdkqswqneyevyslpgmkhenilqfigaekrgtsvdvdlwlitafhekgslsdflkanvvswnelchiaetmarglaylhedipglkdghkpaishrdiksknvllknnltaciadfglalkfeagksagdthgqvgtrrymapevlegainfqrdaflridmyamglvlwelasrctaadgpvdeymlpfeeeigqhpsledmqevvvhkkkrpvlrdywqkhagmamlcetieecwdhdaearlsagcvgeritqmqrltniittedivtvvtmvtnvdfppkessl(seqidno：1)

信號(hào)肽以單下劃線表示；胞外結(jié)構(gòu)域以粗體表示，而潛在的n-連接的糖基化位點(diǎn)以雙下劃線表示。

人actriia可溶性(胞外)、加工的多肽序列如下：

ilgrsetqeclffnanwekdrtnqtgvepcygdkdkrrhcfatwknisgsieivkqgcwlddincydrtdcvekkdspevyfcccegnmcnekfsyfpemevtqptsnpvtpkpp(seqidno：2)

應(yīng)注意經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定n-末端序列以“ilg...”起始，并且與文獻(xiàn)中通常主張的“ail...”n-末端序列不同。胞外結(jié)構(gòu)域的c-末端“尾部”以下劃線表示。刪除“尾部”的序列(a15序列)表示如下：

ilgrsetqeclffnanwekdrtnqtgvepcygdkdkrrhcfatwknisgsieivkqgcwlddincydrtdcvekkdspevyfcccegnmcnekfsyfpem(seqidno：3)

編碼人actriia前體蛋白的核酸序列(genbank條目nm_001616的核苷酸164-1705)如下：

atgggagctgctgcaaagttggcgtttgccgtctttcttatctcctgttcttcaggtgctatacttggtagatcagaaactcaggagtgtcttttctttaatgctaattgggaaaaagacagaaccaatcaaactggtgttgaaccgtgttatggtgacaaagataaacggcggcattgttttgctacctggaagaatatttctggttccattgaaatagtgaaacaaggttgttggctggatgatatcaactgctatgacaggactgattgtgtagaaaaaaaagacagccctgaagtatatttttgttgctgtgagggcaatatgtgtaatgaaaagttttcttattttccagagatggaagtcacacagcccacttcaaatccagttacacctaagccaccctattacaacatcctgctctattccttggtgccacttatgttaattgcggggattgtcatttgtgcattttgggtgtacaggcatcacaagatggcctaccctcctgtacttgttccaactcaagacccaggaccacccccaccttctccattactagggttgaaaccactgcagttattagaagtgaaagcaaggggaagatttggttgtgtctggaaagcccagttgcttaacgaatatgtggctgtcaaaatatttccaatacaggacaaacagtcatggcaaaatgaatacgaagtctacagtttgcctggaatgaagcatgagaacatattacagttcattggtgcagaaaaacgaggcaccagtgttgatgtggatctttggctgatcacagcatttcatgaaaagggttcactatcagactttcttaaggctaatgtggtctcttggaatgaactgtgtcatattgcagaaaccatggctagaggattggcatatttacatgaggatatacctggcctaaaagatggccacaaacctgccatatctcacagggacatcaaaagtaaaaatgtgctgttgaaaaacaacctgacagcttgcattgctgactttgggttggccttaaaatttgaggctggcaagtctgcaggcgatacccatggacaggttggtacccggaggtacatggctccagaggtattagagggtgctataaacttccaaagggatgcatttttgaggatagatatgtatgccatgggattagtcctatgggaactggcttctcgctgtactgctgcagatggacctgtagatgaatacatgttgccatttgaggaggaaattggccagcatccatctcttgaagacatgcaggaagttgttgtgcataaaaaaaagaggcctgttttaagagattattggcagaaacatgctggaatggcaatgctctgtgaaaccattgaagaatgttgggatcacgacgcagaagccaggttatcagctggatgtgtaggtgaaagaattacccagatgcagagactaacaaatattattaccacagaggacattgtaacagtggtcacaatggtgacaaatgttgactttcctcccaaagaatctagtctatga(seqidno：4)

編碼人actriia可溶性(胞外)多肽的核酸序列如下：

atacttggtagatcagaaactcaggagtgtcttttctttaatgctaattgggaaaaagacagaaccaatcaaactggtgttgaaccgtgttatggtgacaaagataaacggcggcattgttttgctacctggaagaatatttctggttccattgaaatagtgaaacaaggttgttggctggatgatatcaactgctatgacaggactgattgtgtagaaaaaaaagacagccctgaagtatatttttgttgctgtgagggcaatatgtgtaatgaaaagttttcttattttccagagatggaagtcacacagcccacttcaaatccagttacacctaagccaccc(seqidno：5)

在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使用可溶性actriia多肽治療或預(yù)防乳腺癌的方法。本文所述的術(shù)語“可溶性actriia多肽”通常指包含actriia蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的多肽。本文所用的術(shù)語“可溶性actriia多肽”包括任何天然存在的actriia蛋白及其任何變體(包括突變體、片段以及擬肽形式)的胞外結(jié)構(gòu)域?；罨?結(jié)合actriia多肽是一種保留了與活化素(包括例如，活化素aa、ab、bb或包含c或e亞基的形式)結(jié)合的能力的多肽?；罨?結(jié)合actriia多肽將任選以1nm或更小的解離常數(shù)與活化素aa結(jié)合。actriia蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域與活化素結(jié)合，并通常為可溶的，因此可被稱為可溶性、活化素-結(jié)合actriia多肽?？扇苄浴⒒罨?結(jié)合actriia多肽的實(shí)例包括seqidnos：2、3、7、12和13所示的可溶性多肽。seqidno：7被稱為actriia-hfc，并在實(shí)施例中進(jìn)一步描述?？扇苄?、活化素-結(jié)合actriia多肽的其它實(shí)例包含actriia蛋白胞外結(jié)構(gòu)域以外的信號(hào)序列，例如，蜜蜂蜂毒肽前導(dǎo)序列(seqidno：8)、組織纖溶酶原激活物(tpa)前導(dǎo)序列(seqidno：9)或天然actriia前導(dǎo)序列(seqidno：10)。在seqidno：13中所示的actriia-hfc多肽采用tpa前導(dǎo)序列。

actriia多肽的功能活性片段可通過篩選從編碼actriia多肽的核酸的相應(yīng)片段重組生成的多肽獲得。此外，可采用本領(lǐng)域已知技術(shù)(如常規(guī)的merrifield固相f-moc或t-boc化學(xué))來化學(xué)合成片段?？?通過重組或化學(xué)合成)生成該片段并進(jìn)行測(cè)試，以鑒定能夠充當(dāng)actriia蛋白或活化素介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的拮抗劑(抑制劑)的那些肽基片段。

actriia多肽的功能活性變體可通過從編碼actriia多肽的相應(yīng)突變核酸重組生成的經(jīng)修飾的多肽庫中篩選獲得?？缮稍撟凅w并進(jìn)行測(cè)試，以鑒定能夠充當(dāng)actriia蛋白或活化素介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的拮抗劑(抑制劑)的那些變體。在某些實(shí)施方案中，actriia多肽的功能變體包含與選自seqidno：2或3的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。在某些情況下，該功能變體具有與選自seqidno：2或3的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

功能變體可通過為諸如增強(qiáng)治療效力或穩(wěn)定性(例如，先體外后體內(nèi)保存期以及對(duì)體內(nèi)蛋白酶解降解的耐受性)等目的對(duì)actriia多肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾來生成。在選擇保留活化素結(jié)合時(shí)，此類修飾的actriia多肽被認(rèn)為是天然存在的actriia多肽的功能等價(jià)物。修飾的actriia多肽還可通過例如，氨基酸置換、刪除或添加來生成。例如，可以合理預(yù)期單獨(dú)的以異亮氨酸或纈氨酸置換亮氨酸、以谷氨酸置換天冬氨酸、以絲氨酸置換蘇氨酸或以結(jié)構(gòu)相關(guān)氨基酸進(jìn)行的類似氨基酸置換(例如，保守突變)將不對(duì)所得分子的生物活性產(chǎn)生較大的影響。保守置換是發(fā)生在其側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸家族內(nèi)的那些置換。在actriia多肽的氨基酸序列中的變化是否產(chǎn)生功能性同系物可通過評(píng)估actriia多肽變體在細(xì)胞中以類似于野生型actriia多肽的方式產(chǎn)生應(yīng)答的能力容易地測(cè)定。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明預(yù)期使用具有改變?cè)摱嚯牡奶腔奶囟ㄍ蛔兊腶ctriia多肽來治療或預(yù)防乳腺癌的方法。可對(duì)此類突變進(jìn)行選擇，以便引入或消除一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)，例如o-連接的或n-連接的糖基化位點(diǎn)。天冬酰胺-連接的糖基化識(shí)別位點(diǎn)通常包含三肽序列，天冬酰胺-x-蘇氨酸或天冬酰胺-x-絲氨酸(其中“x”為任意氨基酸)，其被適當(dāng)?shù)募?xì)胞糖基化酶特異性識(shí)別。還可通過對(duì)野生型actriia多肽序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基的添加或置換(針對(duì)o-連接的糖基化位點(diǎn))來進(jìn)行這種改變。在糖基化識(shí)別位點(diǎn)的第一或第三氨基酸位置之一或兩者進(jìn)行的各種氨基酸置換或刪除(和/或在第二位置的氨基酸刪除)導(dǎo)致在修飾的三肽序列處的非糖基化。增加actriia多肽上的糖部分的數(shù)量的另一種方式是通過將糖苷化學(xué)或酶促偶聯(lián)至該actriia多肽。根據(jù)所用的偶聯(lián)模式，該糖可被連接至(a)精氨酸和組氨酸；(b)游離羧基基團(tuán)；(c)游離巰基基團(tuán)，例如半胱氨酸中的那些巰基；(d)游離羥基基團(tuán)，例如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸中的那些羥基；(e)芳族殘基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸中的那些芳族殘基；或者(f)谷氨酰胺中的酰胺基團(tuán)。可通過化學(xué)和/或酶促法來實(shí)現(xiàn)將存在于actriia多肽上的一個(gè)或多個(gè)糖部分去除?；瘜W(xué)去糖基化可涉及，例如，將actriia多肽暴露至化合物三氟甲磺酸或同等的化合物。該處理導(dǎo)致除了連接糖(n-乙酰基葡萄糖胺或n-乙酰基半乳糖胺)以外大部分或全部糖的裂解，同時(shí)保持氨基酸序列完整。actriia多肽上的糖部分的酶促裂解可通過采用thotakura等人(1987)meth.enzymol.138：350所述的各種內(nèi)切和外切糖苷酶來實(shí)現(xiàn)。適當(dāng)時(shí)，actriia多肽的序列可根據(jù)所用表達(dá)系統(tǒng)的類型進(jìn)行調(diào)整，因?yàn)椴溉閯?dòng)物、酵母、昆蟲和植物細(xì)胞均可導(dǎo)入可受到肽的氨基酸序列影響的不同的糖基化類型(pattern)。一般而言，雖然其它的哺乳動(dòng)物表達(dá)細(xì)胞系也預(yù)期有用，但是用于人類的actriia蛋白可在提供適當(dāng)糖基化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系(例如hek293或cho細(xì)胞系)中表達(dá)。

本公開內(nèi)容進(jìn)一步預(yù)期生成突變體的方法，特別是生成actriia多肽的組合突變體組和截短突變體的方法；組合突變體集合對(duì)于鑒定功能變體序列特別有用。篩選此類組合庫的目的可以是生成例如結(jié)合活化素或其它配體的actriia多肽變體。下文提供了各種篩選分析，此類分析可用于評(píng)估變體。例如，可針對(duì)結(jié)合aetriia配體的能力篩選actriia多肽變體，以防止actriia配體與actriia多肽結(jié)合或者干擾actriia配體引起的信號(hào)傳導(dǎo)。

actriia多肽或其變體的活性也可在基于細(xì)胞的測(cè)定或體內(nèi)測(cè)定中進(jìn)行測(cè)試。例如，可以評(píng)估actriia多肽變體對(duì)癌細(xì)胞增殖或存活的影響。癌細(xì)胞可指在活體對(duì)象中構(gòu)成實(shí)體腫瘤的細(xì)胞或者在活體對(duì)象中來源于腫瘤并擴(kuò)散到其它部位的細(xì)胞(即，轉(zhuǎn)移細(xì)胞)。此外，癌細(xì)胞可指得自或源自腫瘤或癌生長(zhǎng)并在體外培養(yǎng)的細(xì)胞。癌細(xì)胞還包括例如，可在體外培養(yǎng)或用于動(dòng)物異種移植研究的細(xì)胞系。癌細(xì)胞還指通過轉(zhuǎn)移后的細(xì)胞分裂來自轉(zhuǎn)移細(xì)胞的細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是激素應(yīng)答的(例如雌激素受體陽性)或激素非依賴性的(例如雌激素受體陰性)。癌細(xì)胞增殖或存活可以在一種或多種重組actriia配體蛋白(例如活化素)的存在下進(jìn)行評(píng)估，且可轉(zhuǎn)染細(xì)胞以生成actriia多肽和/或其變體，以及任選的actriia配體。同樣地，可對(duì)小鼠或其它動(dòng)物給予actriia多肽，并進(jìn)行一種或多種測(cè)量，例如可以評(píng)估腫瘤尺寸、或者相對(duì)于對(duì)照的細(xì)胞增殖或凋亡速率。

可生成相對(duì)于天然存在的actriia多肽具有選擇性或通常提高的效力的源自組合的變體(combinatorially-derivedvariants)。同樣地，突變可產(chǎn)生變體，該變體的胞內(nèi)半衰期明顯不同于相應(yīng)的野生型actriia多肽。例如，該改變的蛋白可使蛋白酶解降解或其它導(dǎo)致天然actriia多肽的破壞或其它形式失活的細(xì)胞過程更加穩(wěn)定或更加不穩(wěn)定。此類變體以及編碼它們的基因可用于通過調(diào)節(jié)actriia多肽的半衰期來改變actriia多肽水平。例如，短的半衰期可以產(chǎn)生更為短暫的生物學(xué)效應(yīng)，并對(duì)于部分的可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，可允許更緊密地控制細(xì)胞中的重組actriia多肽水平。在fc融合蛋白中，可在接頭(如果有)和/或fc部分進(jìn)行突變以改變蛋白的半衰期。

可通過編碼多肽庫的基因的簡(jiǎn)并庫產(chǎn)生組合庫，所述每個(gè)多肽包含至少一部分的潛在actriia多肽序列。例如，可將合成的寡核苷酸混合物酶促連接入基因序列中，從而使?jié)撛赼ctriia多肽核苷酸序列的簡(jiǎn)并組能作為單獨(dú)多肽進(jìn)行表達(dá)，或者，作為更大的融合蛋白組進(jìn)行表達(dá)(例如針對(duì)噬菌體展示)。

可通過多種方式從簡(jiǎn)并寡核苷酸序列生成潛在同系物的庫。簡(jiǎn)并基因序列的化學(xué)合成可在自動(dòng)dna合成儀中進(jìn)行，然后可將合成的基因連接入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)用載體中。簡(jiǎn)并寡核苷酸的合成為本領(lǐng)域熟知(例如參見narang，sa(1983)tetrahedron39：3；itakura等人，(1981)recombinantdna，proc.3rdclevelandsympos.macromolecules，agwalton編，amsterdam：elsevierpp273-289；itakura等人，(1984)annu.rev.biochem.53：323；itakura等人，(1984)science198：1056；ike等人，(1983)nucleicacidres.11：477)。此類技術(shù)已經(jīng)被用于其它蛋白的定向進(jìn)化中(例如參見scott等人，(1990)science249：386-390；roberts等人，(1992)pnasusa89：2429-2433；devlin等人，(1990)science249：404-406；cwirla等人，(1990)pnasusa87：6378-6382；以及美國(guó)專利5,223,409、5,198,346和5,096,815)。

或者，可采用其它的突變形式來生成組合庫。例如，可通過如下方式生成和從庫中篩選分離actriia多肽變體，例如，丙氨酸分區(qū)突變等(ruf等人，(1994)biochemistry33：1565-1572；wang等人，(1994)j.biol.chem.269：3095-3099；balint等人，(1993)gene137：109-118；grodberg等人，(1993)eur.j.biochem.218：597-601；nagashima等人，(1993)j.biol.chem.268：2888-2892；lowman等人，(1991)biochemistry30：10832-10838；以及cunningham等人，(1989)science244：1081-1085)、接頭分區(qū)突變(gustin等人，(1993)virology193：653-660；brown等人，(1992)mol.cellbiol.12：2644-2652；mcknight等人，(1982)science232：316)、飽和突變(meyers等人，(1986)science232：613)、pcr突變(leung等人，(1989)methodcellmolbiol1：11-19)；或者隨機(jī)突變，包括化學(xué)突變等(miller等人，(1992)ashortcourseinbacterialgenetics，cshlpress，coldspringharbor，ny；以及greener等人，(1994)strategiesinmolbiol7：32-34)。接頭分區(qū)突變(特別是在組合設(shè)置中)是一種具有吸引力的鑒定截短(生物活性)形式的actriia多肽的方法。

本領(lǐng)域已知用于篩選通過點(diǎn)突變和截短得到的組合庫中的基因產(chǎn)品，以及就此而言，用于篩選具有某種特性的基因產(chǎn)品的cdna庫的各種技術(shù)。此類技術(shù)通常適用于通過actriia多肽組合突變生成的基因庫的快速篩選。篩選大型基因庫最廣泛使用的技術(shù)通常包括將該基因庫克隆進(jìn)入可復(fù)制的表達(dá)載體，用所得的載體庫轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)募?xì)胞，并在其中所需活性的檢測(cè)促使編碼所檢測(cè)的產(chǎn)物的基因的載體相對(duì)容易分離的條件下表達(dá)組合基因。優(yōu)選的測(cè)定包括活化素結(jié)合測(cè)定和活化素介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)測(cè)定。

在某些實(shí)施方案中，在本文所述方法中有用的actriia多肽可進(jìn)一步包括在actriia多肽中天然存在的任意修飾之外的翻譯后修飾。這些修飾包括，但不限于，乙?；Ⅳ然?、糖基化、磷酸化、脂質(zhì)化(lipidation)和?；＝Y(jié)果是，修飾的actriia多肽可包含非氨基酸元件，例如聚乙二醇、脂質(zhì)、多糖或單糖以及磷酸酯/鹽。此類非氨基酸元件對(duì)actriia多肽功能的影響可如本文對(duì)于其它actriia多肽變體所述進(jìn)行測(cè)試。當(dāng)通過裂解actriia多肽的新生形式在細(xì)胞中生成actriia多肽時(shí)，翻譯后加工也可對(duì)蛋白的正確折疊和/或功能重要。不同的細(xì)胞(例如cho、hela、mdck、wi38、nih-3t3或hek293)對(duì)于此類翻譯后活動(dòng)具有特定的細(xì)胞結(jié)構(gòu)(cellularmachinery)和特征機(jī)制，并可被選擇以確保actriia多肽的正確修飾和加工。

在某些方面，actriia多肽的功能變體或修飾形式包括具有至少一部分actriia多肽和一種或多種融合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。眾所周知的此類融合結(jié)構(gòu)域的實(shí)例包括但不限于聚組氨酸、giu-glu、谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶(gst)、硫氧還蛋白、a蛋白、g蛋白、免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)(fc)、麥芽糖結(jié)合蛋白(mbp)或人血清白蛋白?？蛇x擇融合結(jié)構(gòu)域來賦予所需的特性。例如，一些融合結(jié)構(gòu)域特別有用于通過親和色譜分離融合蛋白。就親和純化而言，使用親和色譜用的相關(guān)基質(zhì)，例如谷胱甘肽-、淀粉酶-、以及鎳-或鈷-綴合的樹脂。許多此類基質(zhì)可以“試劑盒”形式得到，例如pharmaciagst純化系統(tǒng)和qiaexpress^tm系統(tǒng)(qiagen)與有用的(his6)融合伴侶。作為另一實(shí)例，可選擇融合結(jié)構(gòu)域以促進(jìn)actriia多肽的檢測(cè)。此類檢測(cè)結(jié)構(gòu)域的實(shí)例包括各種熒光蛋白(例如，gfp)以及“表位標(biāo)記”，其通常為可獲得特異性抗體的短肽序列。容易獲得的特異性單克隆抗體的眾所周知的表位標(biāo)記包括flag、流感病毒血細(xì)胞凝集素(ha)和c-myc標(biāo)記。在一些情況下，融合結(jié)構(gòu)域具有蛋白酶切割位點(diǎn)，例如對(duì)于xa因子和凝血酶的切割位點(diǎn)，其允許相關(guān)的蛋白酶部分消化該融合蛋白，從而從中釋放重組蛋白。釋放的蛋白可隨后通過后續(xù)的色譜分離從融合結(jié)構(gòu)域中分離。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，actriia多肽與在體內(nèi)穩(wěn)定actriia多肽的結(jié)構(gòu)域(“穩(wěn)定劑”結(jié)構(gòu)域)相融合?！胺€(wěn)定”表示增加血清半衰期的任意情況(anything)，而不論這是否由破壞減少、腎臟清除率降低或其它藥代動(dòng)力學(xué)作用所引起。已知與免疫球蛋白的fc部分的融合為各種蛋白賦予所需的藥代動(dòng)力學(xué)特性。同樣地，與人血清白蛋白的融合可賦予所需特性?？晒┻x擇的其它融合結(jié)構(gòu)域類型包括多聚(例如，二聚、四聚)結(jié)構(gòu)域和功能結(jié)構(gòu)域(其賦予另外的生物學(xué)功能)。

作為具體的實(shí)例，本發(fā)明提供治療或預(yù)防乳腺癌的方法，其使用包含與fc結(jié)構(gòu)域融合的actriia的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的融合蛋白(例如seqidno：6)。

thtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvd(a)vshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykck(a)vsnkalpvpiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgpfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhn(a)hytqkslslspgk^＊

任選地，fc結(jié)構(gòu)域在例如asp-265、賴氨酸322和asn-434等殘基處具有一個(gè)或多個(gè)突變。在某些情況下，具有一個(gè)或多個(gè)這些突變(例如asp-265突變)的突變體fc結(jié)構(gòu)域與fcγ受體的結(jié)合能力相對(duì)于野生型fc結(jié)構(gòu)域有所下降。在其它情況下，具有一個(gè)或多個(gè)這些突變(例如asn-434突變)的突變體fc結(jié)構(gòu)域與i類mhc相關(guān)fc受體(fcrn)的結(jié)合能力相對(duì)于野生型fc結(jié)構(gòu)域有所上升。一般理解，fc結(jié)構(gòu)域可包含更小或更大部分的免疫球蛋白恒定區(qū)，條件是所得的fc結(jié)構(gòu)域保留通過二硫鍵共價(jià)二聚的能力并形成相對(duì)穩(wěn)定的可溶性蛋白。

應(yīng)理解該，融合蛋白的不同元件可以與所需功能一致的任意方式排列。例如，actriia多肽可置于異源結(jié)構(gòu)域的c-末端，或者，異源結(jié)構(gòu)域可置于actriia多肽的c-末端。actriia多肽結(jié)構(gòu)域和異源結(jié)構(gòu)域無需在融合蛋白中相鄰，在任一結(jié)構(gòu)域的c-或n-末端或者在結(jié)構(gòu)域之間可包含另外的結(jié)構(gòu)域或氨基酸序列。

在某些實(shí)施方案中，在本文所述方法中有用的actriia多肽可包含能夠穩(wěn)定actriia多肽的一種或多種修飾。例如，此類修飾提高actriia多肽的體外半衰期，提高actriia多肽的循環(huán)半衰期或減少actriia多肽的蛋白酶解降解。此類穩(wěn)定修飾包括但不限于融合蛋白(包括，例如，包含actriia多肽和穩(wěn)定劑結(jié)構(gòu)域的融合蛋白)、糖基化位點(diǎn)的修飾(包括，例如，向actriia多肽附加糖基化位點(diǎn))以及碳水化合物部分的修飾(包括，例如，從actriia多肽除去碳水化合物部分)。本文所用的術(shù)語“穩(wěn)定劑結(jié)構(gòu)域”不僅指融合蛋白情況下的融合結(jié)構(gòu)域(例如fc)，還包括非蛋白質(zhì)修飾，例如碳水化合物部分，或非蛋白質(zhì)部分，例如聚乙二醇。

在某些實(shí)施方案中，本文所述方法使用actriia多肽的分離和/或純化形式，其分離自其他蛋白，或者基本不含其它蛋白。actriia多肽通常通過從重組核酸表達(dá)而產(chǎn)生。

3.編碼actriia多肽的核酸

本文提供編碼本文公開的任意actriia多肽(例如可溶性actriia多肽)，包括片段、功能變體和融合蛋白的分離和/或重組核酸。例如，seqidno：4編碼天然存在的人actriia前體多肽，而seqidno：5編碼加工的actriia胞外結(jié)構(gòu)域。目標(biāo)(subject)核酸可以是單鏈的或是雙鏈的。這樣的核酸可以是dna或rna分子。這些核酸可以在，例如，制備actriia多肽的方法中使用，或者直接用作治療劑(例如在基因療法中)。

在某些方面，編碼actriia多肽的目標(biāo)核酸應(yīng)進(jìn)一步理解為包括為seqidno：4或5的變體的核酸。變體核苷酸序列包括通過一個(gè)或多個(gè)核苷酸置換、添加或刪除加以區(qū)別的序列，例如等位基因變體。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療或預(yù)防乳腺癌的方法，其使用與seqidno：4或5具有至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同一性的分離或重組核酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解：與seqidno：4或5互補(bǔ)的核酸序列、以及seqidno：4或5的變體同樣在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本文所述核酸序列可被分離、重組和/或與異源核苷酸序列融合，或者在dna庫中。

在其它實(shí)施方案中，在本文所述方法中有用的核酸還包括在高度嚴(yán)格的條件下與seqidno：4或5所示的核苷酸序列、seqidno：4或5的互補(bǔ)序列或其片段進(jìn)行雜交的核苷酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易理解：促進(jìn)dna雜交的合適的嚴(yán)格條件是可以變化的。例如，可在6.0x氯化鈉/檸檬酸鈉(ssc)、約45℃下進(jìn)行雜交，然后在2.0xssc、50℃下洗滌。例如，洗滌步驟中的可選擇鹽濃度從低嚴(yán)格性的約2.0xssc、50℃至高嚴(yán)格性的約0.2xssc、50℃。此外，洗滌步驟中的溫度可從低嚴(yán)格條件的室溫(約22℃)上升至高嚴(yán)格條件的約65℃。溫度和鹽可都變化，或者可將溫度或鹽濃度之一保持恒定，而改變另一變量。在一種實(shí)施方案中，本文所述方法中使用的核酸在6xssc、室溫的低嚴(yán)格條件下雜交，然后在2xssc、室溫下洗滌。

由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而不同于seqidno：4或5所示核酸的分離核酸也考慮用于本文所述的方法中。例如，許多氨基酸由超過一個(gè)的三聯(lián)體所表示。表示相同氨基酸的密碼子，或同義密碼子(例如，cau和cac為組氨酸的同義密碼子)可導(dǎo)致不影響蛋白的氨基酸序列的“沉默”突變。然而，預(yù)期在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在確實(shí)導(dǎo)致目標(biāo)蛋白的氨基酸序列變化的dna序列多態(tài)性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解：編碼特定蛋白的核酸中的一個(gè)或多個(gè)核苷酸(至多約3-5％的核苷酸)的這些變異由于天然等位基因變異可在給定物種的個(gè)體中存在。任何或全部的此類核苷酸變異以及所產(chǎn)生的氨基酸多態(tài)性均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

在某些實(shí)施方案中，本文所述的重組核酸可以在表達(dá)構(gòu)建體中可操作地連接至一種或多種調(diào)節(jié)性核苷酸序列。調(diào)節(jié)性核苷酸序列通常適合用于表達(dá)的宿主細(xì)胞。本領(lǐng)域已知用于各種宿主細(xì)胞的多種類型的合適的表達(dá)載體以及合適的調(diào)節(jié)性序列。所述一種或多種調(diào)節(jié)性核苷酸序列通常可包括但不限于啟動(dòng)子序列、前導(dǎo)或信號(hào)序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列以及增強(qiáng)子或活化子序列。本發(fā)明考慮本領(lǐng)域已知的組成型或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子可以是天然存在的啟動(dòng)子，或者是合并超過一個(gè)啟動(dòng)子的元件的雜交啟動(dòng)子。表達(dá)構(gòu)建體可存在于細(xì)胞中的游離體(例如質(zhì)粒)上，或者表達(dá)構(gòu)建體可插入染色體中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)載體包含可選擇的標(biāo)記基因，以允許選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞?？蛇x擇的標(biāo)記基因?yàn)楸绢I(lǐng)域所熟知，并將隨著所使用的宿主細(xì)胞而變化。

在某些方面，本文所述方法使用包含編碼actriia多肽并可操作地連接到至少一個(gè)調(diào)節(jié)性序列的核苷酸序列的表達(dá)載體。調(diào)節(jié)性序列為本領(lǐng)域所了解，并被選擇來引導(dǎo)actriia多肽的表達(dá)。因此，術(shù)語調(diào)節(jié)性序列包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子以及其它表達(dá)控制元件。示例性的調(diào)節(jié)性序列描述于goeddel；geneexpressiontechnology：methodsinenzymology，academicpress，sandiego，ca(1990)中。例如，可在這些載體中使用各種在與dna序列可操作地連接時(shí)控制該dna序列表達(dá)的表達(dá)控制序列中的任意一種，以表達(dá)編碼actriia多肽的dna序列。此類有用的表達(dá)控制序列包括，例如，sv40的早期和晚期啟動(dòng)子、tet啟動(dòng)子、腺病毒和巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子、rsv啟動(dòng)子、lac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、tac或trc系統(tǒng)、由t7rna聚合酶引導(dǎo)表達(dá)的t7啟動(dòng)子、λ噬菌體的主要操縱子和啟動(dòng)子區(qū)、fd包被蛋白(coatprotein)的控制區(qū)、3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動(dòng)子、酸性磷酸酶的啟動(dòng)子(例如pho5)、酵母α-交配因子的啟動(dòng)子、桿狀病毒系統(tǒng)的多角體啟動(dòng)子以及已知控制原核或真核細(xì)胞或其病毒的基因表達(dá)的其它序列，及其各種組合。應(yīng)當(dāng)理解，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可取決于諸如待轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的選擇和/或需要表達(dá)的蛋白類型等因素。此外，還應(yīng)考慮載體的拷貝數(shù)、控制拷貝數(shù)的能力以及由該載體編碼的任何其它蛋白(例如抗生素標(biāo)記)的表達(dá)。

可通過將克隆的基因或其部分連接入適合在原核細(xì)胞、真核細(xì)胞(酵母、鳥類、昆蟲或哺乳動(dòng)物)或兩者中表達(dá)的載體中產(chǎn)生本文所述的重組核酸。用于生產(chǎn)重組actriia多肽的表達(dá)載體包括質(zhì)粒和其它載體。例如，合適的載體包括如下類型的質(zhì)粒：用于在原核細(xì)胞(例如大腸桿菌)中表達(dá)的pbr322-衍生質(zhì)粒、pembl-衍生質(zhì)粒、pex-衍生質(zhì)粒、pbtac-衍生質(zhì)粒以及puc-衍生質(zhì)粒。

一些哺乳動(dòng)物表達(dá)載體同時(shí)包含促進(jìn)載體在細(xì)菌中繁殖的原核序列和一種或多種在真核細(xì)胞中表達(dá)的真核轉(zhuǎn)錄單元。pcdnai/amp、pcdnai/neo、prc/cmv、psv2gpt、psv2neo、psv2-dhfr、ptk2、prsvneo、pmsg、psvt7、pko-neo和phyg衍生載體是適合真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體的實(shí)例。這些載體中的一些用來自細(xì)菌質(zhì)粒(如pbr322)的序列進(jìn)行修飾，以促進(jìn)在原核和真核細(xì)胞中的復(fù)制和藥物抗性選擇?；蛘?，病毒的衍生物如牛乳頭瘤病毒(bpv-1)或epstein-barr病毒(phebo、prep-衍生的和p205)可用于在真核細(xì)胞中蛋白的瞬時(shí)表達(dá)。其它病毒(包括逆轉(zhuǎn)錄病毒)表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例可在下文基因治療傳遞系統(tǒng)的描述中找到。制備質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化宿主生物所采用的各種方法為本領(lǐng)域熟知。其它合適原核和真核細(xì)胞兩者的表達(dá)系統(tǒng)以及一般的重組步驟參見molecularcloningalaboratorymanual，第三版，sambrook，fritsch和maniatis編(coldspringharborlaboratorypress，2001)。在某些情況下，可能需要采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)重組多肽。此類桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例包括pvl-衍生載體(例如pvl1392、pvl1393和pvl941)、pacuw-衍生載體(例如pacuw1)以及pbluebac-衍生載體(例如含β-gal的pbluebaciii)。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)載體用于在cho細(xì)胞中產(chǎn)生目標(biāo)actriia多肽，例如pcmv-script載體(stratagene，lajolla，calif)、pcdna4載體(invitrogen，carlsbad，calif.)和pci-neo載體(promega，madison，wisc)。顯而易見地，目標(biāo)基因構(gòu)建體可用于引起目標(biāo)actriia多肽在培養(yǎng)物中繁殖的細(xì)胞中表達(dá)，例如，以產(chǎn)生蛋白，包括融合蛋白或變體蛋白，以供純化。

本公開內(nèi)容還涉及用包含一種或多種目標(biāo)actriia多肽的編碼序列(例如，seqidno：4或5)的重組基因轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可以是任何原核或真核細(xì)胞。例如，本文所述的actriia多肽可在細(xì)菌細(xì)胞(如大腸桿菌)、昆蟲細(xì)胞(例如采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng))、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。其它合適的宿主細(xì)胞為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。

本文還提供制備目標(biāo)actriia多肽的方法。例如，用編碼actriia多肽的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞可在適當(dāng)適當(dāng)條件下培養(yǎng)，以允許發(fā)生actriia多肽表達(dá)。actriia多肽可被分泌并從細(xì)胞和含有actriia多肽的培養(yǎng)基的混合物中分離?；蛘?，actriia多肽可保留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)或者在膜組分中，收獲、裂解細(xì)胞并分離蛋白。細(xì)胞培養(yǎng)物包含宿主細(xì)胞、培養(yǎng)基和其它副產(chǎn)品。細(xì)胞培養(yǎng)的合適培養(yǎng)基為本領(lǐng)域熟知。采用本領(lǐng)域已知的純化蛋白的技術(shù)，可將目標(biāo)actriia多肽從細(xì)胞培養(yǎng)基、宿主細(xì)胞或兩者中分離，所述技術(shù)包括離子交換色譜、凝膠過濾色譜、超濾、電泳、采用aetriia多肽的特定表位的特異性抗體的免疫親和純化、以及采用與actriia多肽融合的結(jié)構(gòu)域結(jié)合的試劑的親和純化(例如，a蛋白柱可用于純化actriia-fc融合體)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，actriia多肽是包含促進(jìn)其純化的結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過一系列的柱色譜步驟實(shí)現(xiàn)純化，包括，例如，以任意順序的三種或更多的以下步驟：a蛋白色譜、q瓊脂糖色譜、苯基瓊脂糖色譜、尺寸排阻色譜以及陽離子交換色譜。純化可通過病毒過濾和緩沖液交換完成。如本文所證明，actriia-hfc蛋白被純化至通過尺寸排阻色譜測(cè)定＞98％，且用sdspage測(cè)定＞95％的純度。該純度水平足以在小鼠、大鼠和非人靈長(zhǎng)動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)所需的結(jié)果。

在另一實(shí)施方案中，編碼純化前導(dǎo)序列(例如在重組actriia多肽的所需部分n末端處的聚組氨酸/腸激酶切割位點(diǎn)序列)的融合基因，可允許采用ni²⁺金屬樹脂通過親和色譜來純化所表達(dá)的融合蛋白。然后該純化前導(dǎo)序列可通過用腸激酶處理去除，以提供純化的actriia多肽(例如，參見hochuli等人，(1987)j.chromatography411：177；和janknecht等人，pnasusa88：8972)。

制備融合基因的技術(shù)是眾所周知的。實(shí)質(zhì)上，按照常規(guī)技術(shù)將編碼不同多肽序列的各種dna片段連接，采用平頭(blunt-ended)或交錯(cuò)(stagger-ended)末端進(jìn)行連接，限制性酶消化以提供合適的末端，適當(dāng)時(shí)填補(bǔ)粘性末端，堿性磷酸酶處理以避免不想要的連接，以及酶連接。在另一實(shí)施方案中，融合基因可通過包括自動(dòng)dna合成儀等常規(guī)技術(shù)來合成。或者，可使用在兩個(gè)連續(xù)基因片段之間產(chǎn)生互補(bǔ)性懸掛的錨定引物進(jìn)行基因片段的pcr擴(kuò)增，此兩個(gè)連續(xù)基因片段隨后可退火形成嵌合基因序列(例如，參見currentprotocolsinmolecularbiology，ausubel等人編，johnwiley&sons：1992)。

4.替代性活化素(alternativeactivin)和actriia拮抗劑

本公開內(nèi)容涉及使用活化素-actriia信號(hào)傳導(dǎo)的拮抗劑治療或預(yù)防乳腺癌的方法。盡管可溶性actriia多肽，特別是actriia-fc是優(yōu)選的拮抗劑，且盡管此類拮抗劑可通過不同于活化素拮抗的機(jī)制影響乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)或存活(例如，活化素抑制可以是一種藥劑抑制一系列分子活性的傾向的指示劑，所述分子有可能包括tgf-β超家族的其它成員，且此類集體抑制可導(dǎo)致對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的所需影響)，其它類型的活化素-actriia拮抗劑預(yù)期也是有用的，包括抗活化素(例如，活化素βa、βb、βc和βe)抗體，抗actriia抗體，抑制actriia產(chǎn)生的反義、rnai或核酶核酸，以及其它的活化素或actriia抑制劑，特別是破壞活化素-actriia結(jié)合的那些抑制劑。在某些實(shí)施方案中，對(duì)活化素b有特異性的拮抗劑(例如抗活化素b抗體)在本發(fā)明的方法中是有用的。

與actriia多肽(例如可溶性actriia多肽)特異性反應(yīng)并與actriia多肽競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合配體或者其它形式抑制actriia介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)的抗體可用作actriia多肽活性的拮抗劑。同樣地，與活化素βa、βb、βc或βe多肽或其任何異源二聚體特異性反應(yīng)并破壞actriia結(jié)合的抗體可用作拮抗劑。

使用由actriia多肽或活化素多肽衍生的免疫原，可通過標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程(protocols)制備抗蛋白/抗肽抗血清或單克隆抗體(參見，例如antibodies：alaboratorymanual，harlow和lane編(coldspringharborpress：1988))。哺乳動(dòng)物如小鼠、倉鼠或兔可通過actriia多肽的免疫原形式、能夠引發(fā)抗體應(yīng)答的抗原性片段，或融合蛋白進(jìn)行免疫。給蛋白或肽賦予免疫原性的技術(shù)包括與載體綴合或本領(lǐng)域熟知的其它技術(shù)。可在佐劑的存在下給予actriia或活化素多肽的免疫原部分。免疫的進(jìn)展可通過檢測(cè)血漿或血清中的抗體滴度進(jìn)行監(jiān)測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)的elisa或其它免疫測(cè)定可用于以免疫原作為抗原評(píng)估抗體水平。

在用actriia多肽的抗原性制劑免疫動(dòng)物后可獲得抗血清，且在需要時(shí)可從該血清中分離多克隆抗體。為了產(chǎn)生單克隆抗體，可從免疫的動(dòng)物采集抗體生成細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)，并通過標(biāo)準(zhǔn)的體細(xì)胞融合步驟與永生化細(xì)胞(如骨髓瘤細(xì)胞)融合以獲得雜交瘤細(xì)胞。此類技術(shù)為本領(lǐng)域熟知，其包括，例如，雜交瘤技術(shù)(最初由kohler和milstein開發(fā)，(1975)nature，256：495-497)、人b細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(kozbar等人，(1983)immunologytoday，4：72)、以及產(chǎn)生人單克隆抗體的ebv-雜交瘤技術(shù)(cole等人，(1985)monoclonalantibodiesandcancertherapy，alanr.liss，inc.pp.77-96)?？赏ㄟ^免疫化學(xué)篩選用于產(chǎn)生與aetriia多肽特異性反應(yīng)的抗體的雜交瘤細(xì)胞，并從包含該種雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)物分離單克隆抗體。還可通過篩選抗體可變區(qū)或fab片段文庫(例如噬菌體呈現(xiàn)文庫)來產(chǎn)生抗體，以鑒定與選擇的抗原(例如活化素或actriia)相結(jié)合的結(jié)合物。這種體外方法通常用于在哺乳動(dòng)物(尤其是小鼠和人)之間高度保守的蛋白。

本文所用的術(shù)語“抗體”意在包括完整的抗體，例如任意抗體同種型(igg、iga、igm、ige等)，并且包括與選擇的抗原反應(yīng)的免疫球蛋白的片段或結(jié)構(gòu)域?？贵w可使用常規(guī)技術(shù)片段化，并根據(jù)實(shí)用性和/或與感興趣的特異性表位的相互作用篩選片段。因此，該術(shù)語包括能夠與某種蛋白選擇性反應(yīng)的抗體分子的蛋白酶解裂解片段或重組制備的部分。此類蛋白酶解和/或重組的片段的非限制性實(shí)例包括fab、f(ab′)2、fab′、fv以及包含通過肽接頭連接的v[l]和/或v[h]結(jié)構(gòu)域的單鏈抗體(scfv)。scfv可共價(jià)或非共價(jià)連接，以形成具有兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的抗體。術(shù)語抗體還包括多克隆抗體、單克隆抗體、或抗體和重組抗體的其它純化制劑。術(shù)語“重組抗體”表示從使用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建的核酸表達(dá)的抗體或免疫球蛋白的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如從單鏈抗體開發(fā)的人源化抗體或全人源抗體。單結(jié)構(gòu)域和單鏈抗體也包括在術(shù)語“重組抗體”之內(nèi)。

在某些實(shí)施方案中，本文所述方法可使用抗體，例如單克隆抗體。還提供了產(chǎn)生新型抗體的方法。例如，產(chǎn)生特異性結(jié)合actriia多肽或活化素多肽的單克隆抗體的方法可包括給予小鼠一定量的免疫原性組合物(其包含有效刺激可檢測(cè)免疫應(yīng)答的抗原多肽)，，從該小鼠獲得產(chǎn)生抗體的細(xì)胞(例如來自脾的細(xì)胞)將該產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，以獲得產(chǎn)生抗體的雜交瘤，并測(cè)試該產(chǎn)生抗體的雜交瘤，以鑒定產(chǎn)生特異性結(jié)合該抗原的單克隆抗體的雜交瘤。一旦獲得后，雜交瘤在可在細(xì)胞培養(yǎng)物中繁殖，任選采用雜交瘤衍生細(xì)胞產(chǎn)生特異性結(jié)合該抗原的單克隆抗體的培養(yǎng)條件。單克隆抗體可從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化。

形容詞“與...特異性反應(yīng)”在指代抗體時(shí)，如本領(lǐng)域通常理解的那樣，有意表示抗體在感興趣抗原(例如actriia多肽)與其它非感興趣抗原之間具有足夠的選擇性，使得該抗體至少有用于在具體類型的生物樣本中檢測(cè)該感興趣抗原的存在。在使用抗體的某些方法中，例如治療性應(yīng)用中，可能需要更高程度的結(jié)合特異性。單克隆抗體通常具有更強(qiáng)的趨勢(shì)(與多克隆抗體相比)有效區(qū)分所需的抗原和交叉反應(yīng)性多肽(cross-reactingpolypeptide)。影響抗體：抗原相互作用特異性的一個(gè)特征是抗體對(duì)該抗原的親和性。盡管可通過一定范圍的不同親和性實(shí)現(xiàn)所需的特異性，一般優(yōu)選抗體具有約10^-6、10^-7、10^-8、10^-9m或更小的親和性(解離常數(shù))。

此外，用于篩選抗體以鑒定所需抗體的技術(shù)可影響所得抗體的特性。例如，如果抗體用于在溶液中結(jié)合抗原，測(cè)試溶液結(jié)合可能是合意的。可利用各種不同的技術(shù)來測(cè)試抗體和抗原之間的相互作用，以鑒定具體所需的抗體。此類技術(shù)包括elisa、表面等離子體共振結(jié)合測(cè)定(例如，biacore^tm結(jié)合測(cè)定，biacoreab，瑞典uppsala)、夾心測(cè)定(例如，順磁珠系統(tǒng)(paramagneticbeadsystem)，igeninternational，inc.，gaithersburg，maryland)、蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀測(cè)定以及免疫組化。

作為活化素或actriia拮抗劑的核酸化合物類別的實(shí)例包括反義核酸、rnai構(gòu)建體和催化性核酸(catalyticnucleicacid)構(gòu)建體。核酸化合物可以是單鏈或雙鏈的。雙鏈化合物還可包含突出端(overhang)或非互補(bǔ)的區(qū)域，其中一條或另一條鏈為單鏈的。單鏈化合物可包含自身互補(bǔ)的區(qū)域，表示該化合物形成所謂的“發(fā)夾”或“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)，具有雙鏈螺旋結(jié)構(gòu)的區(qū)域。核酸化合物可包含與由全長(zhǎng)actriia核酸序列或活化素βa、βb、βc或βe核酸序列的不超過1000個(gè)、不超過500個(gè)、不超過250個(gè)、不超過100個(gè)或不超過50、35、25、22、20、18或15個(gè)核苷酸組成的區(qū)域互補(bǔ)的核苷酸序列?；パa(bǔ)區(qū)域優(yōu)選至少8個(gè)核苷酸，并任選約18至35個(gè)核苷酸。互補(bǔ)區(qū)域可落入內(nèi)含子中，后者是目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物的編碼序列或非編碼序列，例如編碼序列部分。一般而言，核酸化合物具有約8至約500個(gè)核苷酸或堿基對(duì)的長(zhǎng)度，且任選該長(zhǎng)度為約14至約50個(gè)核苷酸。核酸可以是dna(特別是用作反義時(shí))、rna或rna：dna雜交體。任意一條鏈可包括dna和rna的混合物以及不能簡(jiǎn)單分類為dna或rna的修飾形式。同樣地，雙鏈化合物可以是dna：dna、dna：rna或rna：rna，且任意一條鏈也可包含dna和rna的混合物以及不能簡(jiǎn)單分類為dna或rna的修飾形式。核酸化合物可包含各種修飾的任意一種，包括對(duì)骨架(天然核酸中的糖-磷酸酯/鹽部分，包括核苷酸間連鎖)或堿基部分(天然核酸的嘌呤或嘧啶部分)的一個(gè)或多個(gè)修飾。反義核酸化合物將優(yōu)選具有約15至約30個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，并通常包含一個(gè)或多個(gè)修飾以改善其特征，例如在血清、在細(xì)胞或在該化合物可能傳遞位置(例如口服傳遞化合物情況下的胃以及吸入化合物時(shí)的肺)中的穩(wěn)定性。對(duì)于rnai構(gòu)建體的情況，與目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)的鏈通常為rna或其修飾。另一條鏈可以是rna、dna或任意其它變體。雙鏈或單鏈“發(fā)夾”rnai構(gòu)建體的雙鏈體部分通常具有18-40個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，任選約21-23個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，只要其用作dicer酶底物。催化性或酶促性核酸可以是核酶或dna酶，并且還可包含修飾的形式。核酸化合物可在生理?xiàng)l件下，在無義或有義控制影響很小或沒有影響的濃度下與細(xì)胞接觸時(shí)抑制約50％、75％、90％或更多的目標(biāo)的表達(dá)。用于測(cè)試核酸化合物影響的優(yōu)選濃度為1、5和10微摩爾。還可測(cè)試核酸化合物對(duì)例如，乳腺癌細(xì)胞或乳腺腫瘤的增殖或存活的影響。

5.篩選測(cè)定

在某些方面，本發(fā)明涉及使用actriia多肽(例如可溶性actriia多肽)和活化素多肽鑒定作為活化素-actriia信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激動(dòng)劑或拮抗劑的化合物(藥劑)。通過這種篩選鑒定的化合物可被測(cè)試，以評(píng)估它們?cè)隗w內(nèi)或體外調(diào)節(jié)癌細(xì)胞，特別是乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)或存活的能力。這些化合物可以在例如動(dòng)物模型(如小鼠異種移植模型)中測(cè)試。一種有用的動(dòng)物模型是鼠mda-mb231乳腺癌模型；mda-mb231細(xì)胞不依賴于激素并易于向骨骼轉(zhuǎn)移。例如通過以下方法可產(chǎn)生乳腺癌的其它動(dòng)物模型：將大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(neu癌基因最初從此細(xì)胞中分離)或neu轉(zhuǎn)化的n1h-3t3細(xì)胞移植到裸小鼠中，基本如drebin等人，proc.nat.acad.sci.usa，83：9129-9133(1986)所述。

有多種方法來篩選通過靶向活化素和actriia信號(hào)傳導(dǎo)來治療或預(yù)防乳腺癌的治療劑。在某些實(shí)施方案中，可進(jìn)行化合物的高通量篩選來鑒定在選則的細(xì)胞系擾亂活化素或actriia介導(dǎo)的影響的藥劑。在某些實(shí)施方案中，實(shí)施該測(cè)定以篩選并鑒定特異性抑制或減少actriia多肽與活化素結(jié)合的化合物。或者，該測(cè)定可用于鑒定增強(qiáng)aetriia多肽與活化素結(jié)合的化合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，化合物可通過其與活化素或actriia多肽相互作用的能力來鑒定。

多種測(cè)定形式是足夠的，但是根據(jù)本公開內(nèi)容，那些未在本文明確描述的測(cè)定將被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解。如本文所述，測(cè)試化合物(藥劑)可通過任意組合的化學(xué)方法制備?；蛘?，目標(biāo)化合物可以是在體內(nèi)或體外合成的天然存在的生物分子。待測(cè)試其作為組織生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的能力的化合物(藥劑)可通過例如細(xì)菌、酵母、植物或其它生物體產(chǎn)生(例如天然產(chǎn)物)，通過化學(xué)產(chǎn)生(例如小分子，包括擬肽)，或通過重組產(chǎn)生。本文考慮的測(cè)試化合物包括非肽基有機(jī)分子、肽、多肽、擬肽、糖、激素和核酸分子。在具體的實(shí)施方案中，測(cè)試藥劑是分子量小于約2000道爾頓的有機(jī)小分子。

測(cè)試化合物可以單個(gè)的、離散的實(shí)體提供，或者在更復(fù)雜的庫中提供，例如通過組合化學(xué)制備。這些庫可包含例如醇、鹵代烷烴、胺、酰胺、酯、醛、醚以及其它有機(jī)化合物類別。測(cè)試化合物可在測(cè)試系統(tǒng)以分離形式或化合物的混合物形式存在，尤其是在初始的篩選步驟中。任選地，化合物任選可經(jīng)其它化合物衍生，并具有促進(jìn)該化合物分離的衍生基團(tuán)。衍生基團(tuán)的非限制性實(shí)例包括生物素、熒光素、地高辛、綠色熒光蛋白、同位素、聚組氨酸、磁珠、谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶(gst)、光激活交聯(lián)劑或其任意組合。

在許多對(duì)化合物和天然提取物庫進(jìn)行測(cè)試的藥物篩選程序中，高通量測(cè)定是合意的，以便使給定時(shí)段內(nèi)所考察的化合物數(shù)量達(dá)到最大化。在無細(xì)胞系統(tǒng)中進(jìn)行的測(cè)定(例如可通過純化或半純化蛋白得到)通常優(yōu)選作為“初級(jí)(primary)”篩選，因?yàn)榭缮伤鼈儯栽试S快速開發(fā)和相對(duì)容易地檢測(cè)由測(cè)試化合物介導(dǎo)的分子目標(biāo)的改變。此外，測(cè)試化合物的細(xì)胞毒性或生物利用度效應(yīng)通常在體外系統(tǒng)中可被忽略，該測(cè)定轉(zhuǎn)而主要集中在藥物對(duì)分子目標(biāo)的影響，因其可表現(xiàn)在actriia多肽與活化素之間的結(jié)合親和性的改變上。

僅為闡述目的，在示例性篩選測(cè)定中，感興趣的化合物與通常能夠結(jié)合活化素的分離并純化的actriia多肽接觸。然后向化合物與actriia多肽的混合物中加入含有actriia配體的組合物。對(duì)actriia/活化素復(fù)合物的檢測(cè)和定量提供了用于測(cè)定化合物抑制(或促進(jìn))actriia多肽和活化素之間的復(fù)合物形成效力的方法?；衔锏男Я赏ㄟ^使用各種濃度的測(cè)試化合物所得的數(shù)據(jù)生成劑量響應(yīng)曲線進(jìn)行評(píng)估。此外，還可進(jìn)行對(duì)照測(cè)定以提供比較基線。例如，在對(duì)照測(cè)定中，向含有actriia多肽的組合物中加入分離并純化的活化素，并在沒有測(cè)試化合物的情況下對(duì)actriia/活化素復(fù)合物的形成進(jìn)行定量。應(yīng)當(dāng)理解，一般而言，反應(yīng)物的混合順序可以變化，并且可以同時(shí)混合。此外，可使用細(xì)胞提取物和溶解物來代替純化蛋白，以提供合適的無細(xì)胞測(cè)定系統(tǒng)。

actriia多肽和活化素之間的復(fù)合物形成可通過各種技術(shù)檢測(cè)。例如，復(fù)合物形成的調(diào)節(jié)可采用例如可檢測(cè)標(biāo)記蛋白(如放射性標(biāo)記的(例如，³²p、³⁵s、¹⁴c或³h)、熒光標(biāo)記的(例如，fitc)、或酶標(biāo)記的actriia多肽或活化素)，通過免疫測(cè)定或通過色譜檢測(cè)進(jìn)行定量。

在某些實(shí)施方案中，熒光偏振測(cè)定和熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)測(cè)定可用于直接或間接測(cè)量actriia多肽與其結(jié)合蛋白之間的相互作用程度。其它合適的檢測(cè)模式包括，例如基于光波導(dǎo)(pct公開wo96/26432和美國(guó)專利5,677,196)、表面等離子體共振(spr)、表面電荷傳感器和表面力傳感器(surfaceforcesensors)的那些檢測(cè)。

相互作用陷阱測(cè)定(interactiontrapassay)，也稱為“雙雜交測(cè)定”，也可用于鑒定破壞或加強(qiáng)actriia多肽與其結(jié)合蛋白之間的相互作用的藥劑。參見例如，美國(guó)專利5,283,317；zervos等人(1993)cell72：223-232；madura等人(1993)jbiolchem268：12046-12054；bartel等人(1993)biotechniques14：920-924；以及iwabuchi等人(1993)oncogene8：1693-1696)。在具體的實(shí)施方案中，逆雙雜交系統(tǒng)可用于鑒定解離actriia多肽與其結(jié)合蛋白的相互作用的化合物(例如小分子或肽)。參見例如，vidal和legrain，(1999)nucleicacidsres27：919-29；vidal和legrain，(1999)trendsbiotechnol17：374-81；以及美國(guó)專利5,525,490、5,955,280和5,965,368。

在某些實(shí)施方案中，通過其與本文所述的actriia或活化素多肽相互作用的能力來鑒定化合物?；衔锱cactriia或活化素多肽之間的相互作用可以是共價(jià)或非共價(jià)的。例如，這種相互作用可在蛋白水平下使用體外生物化學(xué)方法鑒定，所述生物化學(xué)方法包括光交聯(lián)、放射標(biāo)記的配體結(jié)合、以及親和色譜(jakobywb等人，1974，methodsinenzymology46：1)。在某些情況下，化合物可通過基于機(jī)制的測(cè)定(例如檢測(cè)結(jié)合于活化素或actriia多肽的化合物的測(cè)定)進(jìn)行篩選。這可包括固相或液相結(jié)合事件?；蛘?，編碼活化素或actriia多肽的基因可與報(bào)告系統(tǒng)(例如，β-半乳糖苷酶、螢光素酶或綠色熒光蛋白)一起轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，并任選地通過高通量篩選對(duì)庫進(jìn)行篩選或?qū)斓膫€(gè)別成員進(jìn)行篩選。可使用其它基于機(jī)制的結(jié)合測(cè)定，例如，檢測(cè)自由能變化的結(jié)合測(cè)定?？稍谀繕?biāo)被固定至孔、珠或芯片或者被固定化抗體捕獲或者被毛細(xì)管電泳分辨的情況下實(shí)施結(jié)合測(cè)定。結(jié)合的化合物通?？刹捎帽壬ɑ驘晒饣虮砻娴入x子體共振來檢測(cè)。

6.示例性治療用途

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過對(duì)該個(gè)體給予治療有效量的活化素-actriia拮抗劑(例如actriia多肽)來在有此需要的個(gè)體中治療或預(yù)防乳腺癌的方法。這些方法可用于對(duì)具有發(fā)展乳腺癌的高風(fēng)險(xiǎn)的人(尤其是女性)的治療性和預(yù)防性治療。由于每一位女性都處于發(fā)展乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)中，具有發(fā)展乳腺癌的高風(fēng)險(xiǎn)的女性是與普通人群或處于某年齡段的女性人群相比，其風(fēng)險(xiǎn)因素賦予更大發(fā)展該病可能性的女性。示例性的風(fēng)險(xiǎn)因素包括年齡、家族史或遺傳特性(geneticmakeup)、生活方式習(xí)慣(例如鍛煉和飲食)、暴露于輻射或其它致癌劑、初次生育年齡、遺傳改變、以及絕經(jīng)期后的體重增加。

本文所用的“預(yù)防”疾病或病癥的治療系指在統(tǒng)計(jì)學(xué)樣本中，化合物在治療樣本中相對(duì)于未治療對(duì)照樣本減少疾病或病癥的發(fā)生，或者相對(duì)于未治療對(duì)照樣本，延遲疾病或病癥的一種或多種癥狀或特征的發(fā)作。例如，預(yù)防乳腺癌可指治療后沒有新的病變，或者沒有或延遲轉(zhuǎn)移性疾病。

術(shù)語“治療乳腺癌”系指相對(duì)于未治療對(duì)照或相對(duì)于治療前疾病的嚴(yán)重性，改善疾病的一種或多種癥狀或特征。該術(shù)語并不一定要求接受治療的患者痊愈或者疾病從患者中完全根除。治療乳腺癌的藥劑可以是減輕疾病的一種或多種癥狀或特征的嚴(yán)重性的藥劑。應(yīng)注意，腫瘤生長(zhǎng)與進(jìn)展受各種因素影響，包括細(xì)胞周期進(jìn)展與細(xì)胞分裂的介體、以及細(xì)胞死亡或凋亡的調(diào)節(jié)因子。因此，治療乳腺癌可涉及減少癌細(xì)胞增殖或減少細(xì)胞分裂速率。或者或另外地，治療乳腺癌可涉及減少癌細(xì)胞存活、增加凋亡、或者減少轉(zhuǎn)移性乳腺癌(尤其是向骨骼轉(zhuǎn)移的乳腺癌)發(fā)生或嚴(yán)重性。因此，在某些實(shí)施方案中，治療乳腺癌可涉及既減少細(xì)胞分裂又增加細(xì)胞死亡。與機(jī)制無關(guān)，藥劑治療乳腺癌的有效性可通過可觀察的標(biāo)準(zhǔn)(metrics)確定，例如癌細(xì)胞數(shù)量比對(duì)照少(由于減少增殖、增加凋亡、或兩者)、或腫瘤尺寸比對(duì)照減小。所以治療乳腺癌或者抑制腫瘤或癌細(xì)胞生長(zhǎng)預(yù)期與導(dǎo)致如此變化發(fā)生的機(jī)制無關(guān)。預(yù)防和治療都可在醫(yī)生或其他衛(wèi)生保健提供者所提供的診斷和給予治療藥劑預(yù)期效果的分析中得到闡明。

當(dāng)觀察目標(biāo)拮抗劑對(duì)人類乳腺癌進(jìn)展的影響時(shí)，可通過可測(cè)量疾病的減少或消失、和/或沒有新病變、或防止轉(zhuǎn)移來評(píng)估影響。例如，活化素-actriia拮抗劑可顯著地減少或延遲患有非侵襲性和侵襲性乳腺癌的患者的乳腺癌進(jìn)展。此外，該拮抗劑可在具有該疾病風(fēng)險(xiǎn)因素的健康女性中預(yù)防或降低發(fā)展乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。該拮抗劑還可在具有該疾病史的患者中降低乳腺癌復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。

因此，活化素-actriia拮抗劑可用于在被認(rèn)為處于發(fā)展該疾病的風(fēng)險(xiǎn)中的個(gè)體中預(yù)防或遲延乳腺癌的發(fā)作，并且此類拮抗劑可用于選則的患者人群。合適的患者人群的實(shí)例包括具有乳腺或卵巢癌家族史的患者，例如其中母親或姐妹已被診斷患有該疾病的女性患者。還包括brca1/2基因或其它被證明使女性易患乳腺或卵巢癌癥的基因發(fā)生突變的患者。在一種實(shí)施方案中，用活化素-actriia拮抗劑治療被認(rèn)為處于發(fā)展乳腺癌的高度風(fēng)險(xiǎn)中，但尚未診斷患有該疾病的患者。此類治療可開始于該患者年齡達(dá)到30、35或40歲時(shí)，或者女性患者不試圖懷孕(例如該患者不計(jì)劃養(yǎng)育嬰兒)或已達(dá)到絕經(jīng)期時(shí)。具體來說，本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)顯示活化素-actriia拮抗劑抑制被引入體循環(huán)(generalcirculation)的乳腺癌細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散，這顯示此類拮抗劑可用于預(yù)防乳腺腫瘤的轉(zhuǎn)移。此類化合物可用于治療已診斷患有乳腺癌或懷疑患有乳腺癌的任何患者。此外，因發(fā)展乳腺腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)升高而考慮進(jìn)行預(yù)防性或選擇性乳房切除術(shù)的患者可替代選擇或另外使用活化素-actriia拮抗劑來減少未檢測(cè)的腫瘤轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。

本文公開的活化素-actriia拮抗劑(尤其是actriia-fc蛋白)可用于治療或預(yù)防患者(包括患有實(shí)體腫瘤的患者以及患有轉(zhuǎn)移性癌癥的患者)的乳腺癌。活化素-actriia拮抗劑也可給予具有下列癥狀的人類對(duì)象：乳腺癌前病變或良性病變；或者任何異常增殖性病變，包括典型增生、非典型增生；以及非侵襲性或原位癌。本發(fā)明所公開的拮抗劑還可用于治療或預(yù)防激素依賴性或激素應(yīng)答性癌癥(例如雌激素受體陽性癌癥)和非激素依賴性癌癥(例如雌激素受體陰性或雌激素受體突變癌癥)。活化素-actriia拮抗劑還用作其中生長(zhǎng)因子或癌基因被激活的癌癥(例如，其中已表達(dá)c-erbb-2(又稱為her-2/neu)酪氨酸激酶的乳腺癌)的治療劑。活化素-actriia拮抗劑可證實(shí)在表達(dá)升高水平(相對(duì)于來源于正常乳腺組織的細(xì)胞)的活化素(例如a、ab或b)或者升高水平actriia或actriib的腫瘤中尤其有用。

本發(fā)明意識(shí)到通過使用目標(biāo)拮抗劑可增強(qiáng)傳統(tǒng)癌癥療法(化療、放射療法、光療法(phototherapy)、免疫療法、和手術(shù))的有效性。因此，活化素-actriia拮抗劑可用于治療、預(yù)防、或控制乳腺癌的聯(lián)合療法中。該拮抗劑可聯(lián)合放射和/或手術(shù)治療，以及細(xì)胞毒化療和/或內(nèi)分泌療法給予患者。這樣的聯(lián)合治療可協(xié)同作用并允許減少每個(gè)單獨(dú)療法的劑量，由此減少每個(gè)療法在較高劑量時(shí)出現(xiàn)的有害副作用。在其它情況下，某一療法難以治療的惡性腫瘤可對(duì)兩種或多種不同療法的聯(lián)合療法有應(yīng)答。因此，本公開內(nèi)容涉及同時(shí)或按序聯(lián)合給予活化素-actriia拮抗劑與另一種常規(guī)抗腫瘤藥劑，以便增強(qiáng)該抗腫瘤藥劑的療效或克服對(duì)該抗腫瘤藥劑的細(xì)胞抗性。

僅為闡述目的，可用于聯(lián)合抗腫瘤療法的藥物化合物包括：氨魯米特、安吖啶、阿那曲唑、天冬酰胺酶、卡介苗、比卡魯胺、博來霉素、布舍瑞林(buserelin)、白消安、喜樹堿(campothecin)、卡培他濱、卡鉑、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉑、克拉屈濱、氯膦酸鹽、秋水仙堿、環(huán)磷酰胺、環(huán)丙孕酮、阿糖胞苷、達(dá)卡巴嗪、更生霉素(dactinomycin)、柔紅霉素、己二烯雌酚、己烯雌酚、多西他賽(docetaxel)、多柔比星、表柔比星、雌二醇、雌莫司汀、依托泊苷、依西美坦、非格司亭(filgrastim)、氟達(dá)拉濱、氟氫可的松、氟尿嘧啶、氟甲睪酮、氟他胺(flutamide)、吉西他濱、染料木黃酮、戈舍瑞林(goserelin)、羥基脲、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺、伊馬替尼、干擾素、依立替康、依羅替康、來曲唑、亞葉酸、亮丙瑞林(leuprolide)、左旋咪唑、洛莫司汀(lomustine)、氮芥、甲羥孕酮、甲地孕酮、美法侖、巰基嘌呤、美斯納、甲氨喋呤、絲裂霉素、米托擔(dān)、米托蒽醌、尼魯米特(nilutamide)、諾考達(dá)唑、奧曲肽、奧沙利鉑、紫杉醇、帕米磷酸鹽、噴司他丁、普卡霉素、卟吩姆鈉(porfimer)、丙卡巴肼、雷替曲塞、利妥昔單抗、鏈佐星、蘇拉明、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、睪酮、硫鳥嘌呤、塞替派、二氯化二茂鈦(titanocenedichloride)、托泊替康、曲妥珠單抗、維a酸(tretinoin)、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春地辛和長(zhǎng)春瑞濱。

這些化療抗腫瘤化合物可基于其作用機(jī)制分為例如如下各組：抗代謝物/抗癌劑，例如嘧啶類似物(5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他濱、吉西他濱和阿糖胞苷)和嘌呤類似物、葉酸鹽(folate)拮抗劑和相關(guān)抑制劑(巰基嘌呤、硫代鳥嘌呤、噴司他丁和2-氯脫氧腺苷(克拉屈濱))；抗增殖/抗有絲分裂藥劑，包括天然產(chǎn)物，例如長(zhǎng)春花生物堿(長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春瑞濱)，微管破壞劑例如紫杉烷(紫杉醇、多西他賽)、長(zhǎng)春新堿(vencristin)、長(zhǎng)春堿(vinblastin)、諾考達(dá)唑、埃坡霉素和諾維本、表二鬼臼毒素(epidipodophyllotoxins)(依托泊苷、替尼泊苷)、dna損傷劑(放線菌素、安吖啶、蒽環(huán)類、博來霉素、白消安、喜樹堿、卡鉑、苯丁酸氮芥、順鉑、環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺(cytoxan)、更生霉素、柔紅霉素、多柔比星、表柔比星、六甲三聚氰胺奧沙利鉑、異環(huán)磷酰胺、美法侖、美錄瑞塔明(merchlorehtamine)、絲裂霉素、米托蒽醌、亞硝基脲、普卡霉素、丙卡巴肼、紫杉醇、泰索帝、替尼泊苷、三亞乙基硫代磷酰胺和依托泊苷(vp16))；抗生素，例如更生霉素(放線菌素dactinomycind)、柔紅霉素、多柔比星(阿霉素)、伊達(dá)比星、蒽環(huán)類、米托蒽醌、博來霉素、普卡霉素(光神霉素)和絲裂霉素；酶類(l-天冬酰胺酶，其全身性代謝l-天冬酰胺，抑制不能自己合成天冬酰胺的細(xì)胞)；抗血小板劑；抗增殖/抗有絲分裂烷化劑，例如氮芥類(氮芥、環(huán)磷酰胺及其類似物、美法侖、苯丁酸氮芥)、亞乙基亞胺類和甲基三聚氰胺類(六甲三聚氰胺和塞替派)、烷基磺酸鹽-白消安、亞硝基脲類(卡莫司汀(bcnu)及其類似物、鏈佐星)、曲嗪類(trazenes)-達(dá)卡巴嗪(dtic)；抗增殖/抗有絲分裂抗代謝物，例如葉酸類似物(甲氨喋呤)；鉑絡(luò)合復(fù)合物(順鉑、卡鉑)、丙卡巴肼、羥基脲、米托擔(dān)、氨魯米特；激素類、激素類似物(雌激素、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡魯胺、尼魯米特)和芳化酶抑制劑(來曲唑、阿那曲唑)；抗凝血?jiǎng)?肝素、合成肝素鹽和其它凝血酶抑制劑)；纖維蛋白溶解劑(例如組織纖溶酶原激活物、鏈球菌激酶和尿激酶)、阿司匹林、潘生丁、噻氯匹定、氯吡格雷、阿昔單抗；抗轉(zhuǎn)移藥；抗分泌藥(布雷韋林(breveldin))；免疫抑制劑(環(huán)孢霉素、他克莫司(fk-506)、西羅莫司(雷帕霉素)、硫唑嘌呤、麥考酚酸嗎乙酯)；抗血管形成化合物(tnp-470、染料木黃酮)和生長(zhǎng)因子抑制劑(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)抑制劑、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fgf)抑制劑)；血管緊張素受體阻斷劑；一氧化氮供體；反義寡核苷酸；抗體(曲妥珠單抗)；細(xì)胞周期抑制劑和分化誘導(dǎo)劑(維a酸)；mtor抑制劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(多柔比星(阿霉素)、安吖啶、喜樹堿、柔紅霉素、更生霉素、恩尼泊苷(eniposide)、表柔比星、依托泊苷、伊達(dá)比星和米托蒽醌、托泊替康、依立替康)、皮質(zhì)類固醇(可的松、地塞米松、氫化可的松、甲基強(qiáng)的松龍、潑尼松和潑尼松龍)；生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶抑制劑；線粒體機(jī)能障礙誘導(dǎo)劑和胱冬酶激活劑；以及染色質(zhì)破壞劑。

在某些實(shí)施方案中，可用于聯(lián)合療法的藥物化合物包括抗血管生成劑，例如(1)“血管生成分子”的釋放抑制劑，例如bfgf(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)；(2)血管生成分子的中和劑，例如抗βbfgf抗體；以及(3)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)血管生成刺激應(yīng)答的抑制劑，包括膠原酶抑制劑、基膜更新(basementmemberturnover)抑制劑、血管生成抑制類固醇(angiostaticsteroids)、源于真菌的血管生成抑制劑、血小板因子4、血小板反應(yīng)蛋白、關(guān)節(jié)炎藥物(例如d-青霉胺和硫代蘋果酸金)、維生素d3類似物、α干擾素等等。另外提議的血管生成抑制劑參見blood等人，bioch.biophys.acta.，1032：89-118(1990)，moses等人，science，248：1408-1410(1990)，ingber等人，lab.invest.，59：44-51(1988)，以及美國(guó)專利5,092,885、5,112,946、5,192,744、5,202,352和6573256。此外，有多種化合物可用于抑制血管生成，例如，阻斷vegf介導(dǎo)的血管生成途徑的肽或試劑、內(nèi)皮抑素蛋白或其衍生物、血管新生抑制素的賴氨酸結(jié)合片段、黑色素或促黑色素化合物、纖維蛋白溶酶原片段(例如纖維蛋白溶酶原的kringles1-3)、肌鈣蛋白(tropoin)亞基、玻連蛋白αvβ3的拮抗劑、源自saposinb的肽、抗生素或其類似物(例如四環(huán)素或新霉素)、包含地諾孕素的組合物、包含偶聯(lián)至肽的metap-2抑制核心的化合物、化合物em-138、查耳酮及其類似物、n-乙酰α連接的酸性二肽酶(naaladase)抑制劑。參見，例如，美國(guó)專利6,395,718、6,462,075、6,465,431、6,475,784、6,482,802、6,482,810、6,500,431、6,500,924、6,518,298、6,521,439、6,525,019、6,538,103、6,544,758、6,544,947、6,548,477、6,559,126和6,569,845。

取決于聯(lián)合療法的性質(zhì)，可在其它療法正在施用時(shí)和/或之后繼續(xù)給予本發(fā)明的治療性拮抗劑。本文所述的拮抗劑可以單劑量或多劑量給予。在一些情況下，在傳統(tǒng)療法之前至少數(shù)天開始給予拮抗劑，而在另外的情況下，緊鄰施用傳統(tǒng)療法之前或施用傳統(tǒng)療法時(shí)開始給予。

7.藥物組合物

在某些實(shí)施方案中，本文所述的活化素actriia拮抗劑與藥學(xué)上可接受的載體一起配制。例如，actriia多肽可以單獨(dú)給予或作為藥物制劑(治療組合物)的組分給予?？梢耘渲扑瞿繕?biāo)拮抗劑(subjectantagonists)，供以任何方便的方式用于人藥或獸藥中。

在某些實(shí)施方案中，本文所述的治療或預(yù)防乳腺癌的方法包括全身給予所述的組合物，或者作為植入物或儀器進(jìn)行局部給藥。給藥時(shí)，用于本發(fā)明的治療組合物當(dāng)然是沒有熱原的生理學(xué)上可接受的形式。在本發(fā)明的方法中，除也可以任選包含在上述組合物中的活化素-actriia拮抗劑之外的治療上有用的藥劑也可以與目標(biāo)拮抗劑同時(shí)給予或按序給予。

一般地，將腸胃外給予活化素-actriia拮抗劑。適合腸胃外給藥的藥物組合物可包含一種或多種actriia多肽，以及與之組合的：一種或多種藥學(xué)上可接受的無菌等滲水溶液或非水溶液、分散液、混懸液或乳液；或者可緊鄰使用之前重構(gòu)成無菌的可注射溶液或分散液的無菌粉末，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使制劑與有意接受者的血液等滲的溶質(zhì)、或者懸浮劑或增稠劑?？稍诒景l(fā)明藥物組合物中采用的合適的水性和非水性載體包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合適的混合物；植物油，如橄欖油；以及可注射的有機(jī)酯，如油酸乙酯?？杀３诌m當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性，例如，通過使用包覆材料如卵磷脂，在分散液的情況下通過維持所需要的粒度，以及通過使用表面活性劑來維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。

此外，可以遞送到靶組織部位(如乳腺上皮細(xì)胞)的形式將組合物包膠囊或注射。在某些實(shí)施方案中，本文所述的組合物可包含能夠?qū)⒁环N或多種治療化合物(如actriia多肽)遞送到靶組織部位(如乳腺上皮細(xì)胞)的基質(zhì)，為發(fā)育著的組織提供結(jié)構(gòu)且最好能夠被吸收進(jìn)入體內(nèi)。例如，所述基質(zhì)可提供緩慢釋放的actriia多肽。此類基質(zhì)可由當(dāng)前用在其它植入醫(yī)療應(yīng)用中的材料形成。

基質(zhì)材料的選擇基于生物相容性、生物可降解性、機(jī)械性質(zhì)、外觀和界面性質(zhì)。目標(biāo)組合物的具體應(yīng)用將限定合適的制劑。用于組合物的可能的基質(zhì)可以是生物可降解的和在化學(xué)上定義的硫酸鈣、磷酸三鈣、羥磷灰石、聚乳酸和聚酸酐。其它可能的材料是生物可降解的且在生物學(xué)上充分定義的，例如骨或真皮膠原。進(jìn)一步的基質(zhì)由純蛋白或細(xì)胞外基質(zhì)組分組成。其它可能的基質(zhì)是非生物降解且經(jīng)化學(xué)定義的，例如燒結(jié)的羥磷灰石、生物玻璃、鋁酸鹽(aluminates)或其它陶瓷。基質(zhì)可由任意上述類型的材料的組合構(gòu)成，例如聚乳酸與羥磷灰石或者膠原蛋白與磷酸三鈣的組合?？梢栽诮M合物(如鈣-鋁酸鹽-磷酸鹽)中改變生物陶瓷，并進(jìn)行加工，以改變它的孔徑、粒度、粒子形狀和生物可降解性。

在某些實(shí)施方案中，本文所述的拮抗劑可口服給藥，例如為以下的形式：膠囊、扁囊劑、丸劑、片劑、糖錠(使用矯味基料(flavoredbasis)，通常是蔗糖和阿拉伯樹膠或黃芪膠)、散劑、顆粒或作為在水或非水液體中的溶液或混懸液、或者作為水包油或油包水的液體乳液、或作為酏劑或糖漿、錠劑(采用惰性基質(zhì)，如明膠和甘油或者蔗糖和阿拉伯樹膠)和/或漱口劑等等，每種形式含有預(yù)定量的藥劑作為有效成分。拮抗劑也可以以大藥丸、藥糖劑或糊劑的形式給予。

用于口服給藥的固體劑型(膠囊、片劑、丸劑、糖衣劑、散劑、顆粒等等)中，一種或多種治療拮抗劑可與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體(例如檸檬酸鈉或磷酸氫鈣)和/或以下物質(zhì)中的任意種混合：(1)填充劑或增量劑，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘結(jié)劑，如羥甲基纖維素、褐藻酸鹽、明膠、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和/阿拉伯樹膠；(3)保濕劑如甘油；(4)崩解劑，如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸鹽以及碳酸鈉；(5)溶液阻滯劑，如石蠟；(6)吸收促進(jìn)劑，如季銨化合物；(7)濕潤(rùn)劑，如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酯；(8)吸收劑，如高嶺土和膨潤(rùn)土；(9)潤(rùn)滑劑，如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉及其混合物；以及(10)著色劑。在膠囊、片劑和丸劑的情況下，藥物組合物還可以包含緩沖劑。相似類型的固體組合物也可以在軟和硬填充明膠膠囊中用作填充劑，其使用諸如以下的賦形劑：乳糖或奶糖，以及高分子量聚乙二醇等等。

用于口服給藥的液體劑型包括藥學(xué)上可接受的乳液、微乳液、溶液、混懸液、糖漿和酏劑。除了活性成分之外，液體劑型可包含本領(lǐng)域通常使用的惰性稀釋劑(如水或其它溶劑)、增溶劑和乳化劑(如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3-丁二醇)、油(尤其是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇和失水山梨糖醇的脂肪酸酯，及其混合物。除了惰性稀釋劑，口服組合物也可以包含佐劑，如濕潤(rùn)劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、矯味劑、著色劑、香料和防腐劑。

除了活性化合物，混懸液可包含懸浮劑，如乙氧基化異十八醇、聚氧乙烯山梨醇、失水山梨糖醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤(rùn)土、瓊脂和黃芪膠，及其混合物。

有用于本文所述的方法中的組合物也可以含有佐劑，如防腐劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑和分散劑。通過包含各種抗菌劑和殺真菌劑(例如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等)來保證防止微生物的作用。也可希望將等滲劑(如糖、氯化鈉等)包含入組合物中。此外，可通過包含延遲吸收的試劑(如單硬脂酸鋁和明膠)來延長(zhǎng)可注射藥物形式的吸收。

應(yīng)該理解，適合于治療或預(yù)防乳腺癌的給藥方案將由主治醫(yī)師考慮各種因素來確定，所述因素改變本發(fā)明的目標(biāo)化合物(如actriia多肽)的作用。所述各種因素包括但不限于：患者的年齡、性別、飲食、疾病的嚴(yán)重性、給藥時(shí)間、以及其它的臨床因素。將其它已知的生長(zhǎng)因子加入到最終的組合物中也可影響劑量。通過周期性地對(duì)各種因素進(jìn)行評(píng)估來對(duì)病程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，所述因素包括但不限于：腫瘤的大小、階段或組織學(xué)分級(jí)、雌激素或孕酮受體狀態(tài)、血管浸潤(rùn)以及區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。臨床醫(yī)師也可以監(jiān)測(cè)諸如以下的標(biāo)志：蛋白u(yù)pa/pai1的水平(高水平的upa和pai1與轉(zhuǎn)移的高風(fēng)險(xiǎn)有關(guān))以及her-2基因擴(kuò)增和/或蛋白表達(dá)(其也與轉(zhuǎn)移相關(guān))(weigelt等人2005nat.rev.cancer5：591-602)?？勺C明基因表達(dá)譜也有助于監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)展(van‘tveer等人2002nature415：530-536和vandevijvet等人2002n.engl.j.med.347：1999-2009)。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供治療或預(yù)防乳腺癌的方法，該方法涉及用于在體內(nèi)產(chǎn)生actriia多肽的基因治療。此類治療通過將actriia多核苷酸序列引入牽涉乳腺癌的細(xì)胞或組織(如乳腺上皮細(xì)胞)中，而達(dá)到其治療效果。使用重組表達(dá)載體(如嵌合病毒或膠體分散系統(tǒng))可實(shí)現(xiàn)遞送actriia多核苷酸序列。優(yōu)選地，actriia多核苷酸序列的治療性遞送使用靶向脂質(zhì)體。

本文所教導(dǎo)的能用于基因治療的各種病毒載體包括腺病毒、皰疹病毒、痘苗病毒或rna病毒(如逆轉(zhuǎn)錄病毒)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以是鼠類或禽類逆轉(zhuǎn)錄病毒的衍生物。其中可插入單個(gè)外源基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的例子包括但不限于：莫洛尼小鼠白血病病毒(momulv)、哈維鼠肉瘤病毒(hamusv)、鼠類乳腺腫瘤病毒(mumtv)和勞氏肉瘤病毒(rsv)。多種其它的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以合并(incorporate)多個(gè)基因。所有這些載體可以轉(zhuǎn)移或合并用于可選擇標(biāo)志的基因，以致可識(shí)別和產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞?？赏ㄟ^附加例如糖、糖脂或蛋白質(zhì)使逆轉(zhuǎn)錄病毒載體具有靶向特異性。通過使用抗體來實(shí)現(xiàn)優(yōu)選的靶向性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，可將特異性的多核苷酸序列插入逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中或附加到病毒包膜，以允許靶向特異性遞送含有actriia多核苷酸的逆轉(zhuǎn)錄病毒。

或者，組織培養(yǎng)細(xì)胞可用編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因gag、pol和env的質(zhì)粒通過常規(guī)的磷酸鈣轉(zhuǎn)染進(jìn)行直接轉(zhuǎn)染。然后這些細(xì)胞用含有感興趣基因的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。所得的細(xì)胞將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體釋放入培養(yǎng)基中。

用于actriia多核苷酸的另一種靶向遞送系統(tǒng)是膠體分散系統(tǒng)。膠體分散系統(tǒng)包括大分子復(fù)合物、納米膠囊、微球體、珠粒和脂質(zhì)基(1ipid-based)系統(tǒng)，脂質(zhì)基系統(tǒng)包括水包油乳液、膠束、混合膠束以及脂質(zhì)體。本發(fā)明優(yōu)選的膠體系統(tǒng)是脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是人工膜囊泡，其用作體內(nèi)和體外的遞送工具。rna、dna和完整的病毒粒子可包裹在水性內(nèi)部，并以生物學(xué)活性形式遞送到細(xì)胞(參見例如fraley等人trendsbiochem.sci.，6：77，1981)。使用脂質(zhì)體載體進(jìn)行有效基因轉(zhuǎn)移的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的，參見例如mannino等人biotechniques，6：682，1988。脂質(zhì)體組合物通常是磷脂的組合，其通常與類固醇，尤其是膽固醇組合。也可使用其它的磷脂或其他的脂類。脂質(zhì)體的物理特征取決于ph值、離子強(qiáng)度和二價(jià)陽離子的存在。

用于產(chǎn)生脂質(zhì)體的脂類的例子包括磷脂?；衔铮缌字８视?、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、腦苷脂以及神經(jīng)節(jié)苷脂。例示性的磷脂包括卵磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿和二硬脂酰磷脂酰膽堿。脂質(zhì)體的標(biāo)靶也可能基于，例如器官特異性、細(xì)胞特異性和細(xì)胞器特異性，這在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。

實(shí)施例

以上對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了概述，參考以下的實(shí)施例將更容易理解本發(fā)明，所包括的實(shí)施例僅僅是闡述本發(fā)明的某些方面和實(shí)施方案，并不意欲限制本發(fā)明。

實(shí)施例1：actriia-fc融合蛋白

申請(qǐng)人構(gòu)建了一種具有人actriia胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性actriia融合蛋白，其用最少的接頭融合于人或小鼠的fc結(jié)構(gòu)域。所述構(gòu)建體分別稱為actriia-hfc和actriia-mfc。

actriia-hfc(seqidno：7)如下所示，其純化自cho細(xì)胞系：

ilgrsetqeclffnanwekdrtnqtgvepcygdkdkrrhcfatwknisgsieivkqgcwlddincydrtdcvekkdspevyfcccegnmcnekfsyfpemevtqptsnpvtpkpptgggthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpvpiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

actriia-hfc和actriia-mfc蛋白在cho細(xì)胞系中表達(dá)?？紤]三種不同的前導(dǎo)序列：

(i)蜜蜂蜂毒肽(hbml)：mkflvnvalvfmvvyisyiya(seqidno：8)；

(ii)組織纖溶酶原激活物(tpa)：mdamkrglccvlllcgavfvsp(seqidno：9)；以及

(iii)天然的序列：mgaaaklafavfliscssga(seqidno：10)。

選擇的形式采用tpa前導(dǎo)序列，且具有以下的未加工的氨基酸序列：

mdamkrglccvlllcgavfvspgaailgrsetqeclffnanwekdrtnqtgvepcygdkdkrrhcfatwknisgsieivkqgcwlddincydrtdcvekkdspevyfcccegnmcnekfsyfpemevtqptsnpvtpkpptgggthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpvpiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno：13)

這種多肽用以下的核酸序列編碼：

atggatgcaatgaagagagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtggagcagtcttcgtttcgcccggcgccgctatacttggtagatcagaaactcaggagtgtctttttttaatgctaattgggaaaaagacagaaccaatcaaactggtgttgaaccgtgttatggtgacaaagataaacggcggcattgttttgctacctggaagaatatttctggttccattgaatagtgaaacaaggttgttggctggatgatatcaactgctatgacaggactgattgtgtagaaaaaaaagacagccctgaagtatatttctgttgctgtgagggcaatatgtgtaatgaaaagttttcttattttccggagatggaagtcacacagcccacttcaaatccagttacacctaagccacccaccggtggtggaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagtccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgagaattc(seqidno：14)

actriia-hfc和actriia-mfc都明顯易于重組表達(dá)。如圖1中所示，所述蛋白被純化為單一、充分確定的蛋白峰。n-末端排序揭示單一序列-ilgrsetqe(seqidno：11)。純化可通過一系列的柱色譜步驟來實(shí)現(xiàn)，包括例如任意順序的以下方法中的三種或更多種：蛋白質(zhì)a色譜，q瓊脂糖色譜，苯基瓊脂糖色譜、尺寸排阻色譜以及陽離子交換色譜。所述純化可用病毒過濾和緩沖液交換來完成。如尺寸排阻色譜測(cè)得的，actriia-hfc蛋白純化至純度＞98％，而通過sdspage測(cè)得的純度＞95％。

actriia-hfc和actriia-mfc對(duì)配體表現(xiàn)出高的親和性，尤其對(duì)活化素a。使用標(biāo)準(zhǔn)的胺偶聯(lián)程序?qū)df-11或活化素a(“acta”)固定在biacorecm5芯片上。將actriia-hfc和actriia-mfc蛋白載入到系統(tǒng)中，對(duì)結(jié)合進(jìn)行測(cè)定。actriia-hfc以5x10^-12的解離常數(shù)(kd)與活化素結(jié)合，蛋白以9.96x10^-9的kd與gdf11結(jié)合(參見圖2)。actriia-mfc的行為類似。

在藥代動(dòng)力學(xué)中研究中，actriia-hfc非常穩(wěn)定。分別給予大鼠1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg的actriia-hfc蛋白，并分別在24、48、72、144和168小時(shí)測(cè)量蛋白的血漿濃度。在分開的研究中，大鼠的給予劑量為1mg/kg、10mg/kg或30mg/kg。在大鼠中，actriia-hfc的血清半衰期為11-14天，兩周以后，藥物的循環(huán)水平相當(dāng)高(對(duì)于開始的給藥劑量為1mg/kg、10mg/kg或30mg/kg，分別為11μg/ml、110μg/ml或304μg/ml)。在獼猴中，血清的半衰期基本上大于14天，其在開始的給藥劑量為1mg/kg、10mg/kg或30mg/kg時(shí)的藥物循環(huán)水平分別為25μg/ml、304μg/ml或1440μg/ml。

實(shí)施例2：actriia-hfc蛋白的表征

使用組織纖溶酶原前導(dǎo)序列seqidno：9，使actriia-hfc融合蛋白在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的cho-dukxb11細(xì)胞中從paid4載體(sv40ori/增強(qiáng)子，cmv啟動(dòng)子)表達(dá)。按以上實(shí)施例1中所述純化的蛋白的序列為seqidno：7。fc部分是如序列seqidno：7中所示的人igg1fc序列。唾液酸分析結(jié)果表明蛋白中平均含有約1.5-2.5摩爾的唾液酸/摩爾actriia-hfc融合蛋白。

這種純化的蛋白在所有測(cè)試的動(dòng)物中表現(xiàn)出顯著長(zhǎng)的血清半衰期，包括病人中的25-32天的半衰期(見以下的實(shí)施例3)。與報(bào)道的在人293細(xì)胞中表達(dá)的actriia-hfc融合蛋白(delre等人jbiolchem.2004.1217；279(51)：53126-35)相比，cho細(xì)胞表達(dá)的物質(zhì)對(duì)活化素b配體具有更高的親和性。此外，使用tpa前導(dǎo)序列比使用其它的前導(dǎo)序列提供更大的產(chǎn)量，并且與天然的前導(dǎo)序列表達(dá)的actriia-fc不同，使用tpa前導(dǎo)序列提供了高純度的n-末端序列。使用天然的前導(dǎo)序列產(chǎn)生兩種主要的actriia-fc，每種都具有不同的n-末端序列。

實(shí)施例3：人類臨床試驗(yàn)

在隨機(jī)雙盲安慰劑對(duì)照研究中，將實(shí)施例2中所述的蛋白給予病人。該研究的主要目的在于評(píng)價(jià)蛋白在健康的絕經(jīng)后的女性中的安全性。將48位對(duì)象隨機(jī)分成6組，接受單劑量的actriia-hfc或安慰劑(5組活性劑：1組安慰劑)。靜脈給予(iv)的劑量范圍為0.01-3.0mg/kg，皮下給予(sc)的劑量范圍為0.03-0.1mg/kg。給所有的對(duì)象給藥120天。如果在進(jìn)入研究的6個(gè)月內(nèi)，有對(duì)象服藥后影響骨代謝，那么將其從研究中排除。給每個(gè)組作安全性評(píng)價(jià)以確定劑量的遞增量。除了藥代動(dòng)力學(xué)(pk)分析之外，還通過測(cè)量骨形成和吸收的生物化學(xué)標(biāo)記以及fsh水平，評(píng)價(jià)actriia-hfc的生物活性。

該研究中沒有報(bào)道嚴(yán)重的不良事件(adverseevents)。不良事件(aes)一般輕微且短暫。aes的初步分析包括頭痛、升高的實(shí)驗(yàn)室數(shù)值、發(fā)冷的癥狀、嘔吐、靜脈滲透以及注射部位的血腫。

actriia-hfc的pk分析顯示劑量的線性分布，且平均半衰期為約25-32天。actriia-hfc的曲線下面積(auc)與劑量線性相關(guān)，sc劑量給藥之后，吸收基本上完成。這些數(shù)據(jù)表明sc是劑量給藥的合意方式，因?yàn)樗鼮樗幬锾峁┫喈?dāng)?shù)纳锢枚群脱灏胨テ?，同時(shí)避免在iv劑量給藥的頭幾天伴有的藥物血清濃度峰值。actriia-hfc導(dǎo)致快速、持續(xù)地劑量依賴性增加骨特異性堿性磷酸酶(bap)的血清水平，bap是合成代謝性骨生長(zhǎng)的標(biāo)志，以及導(dǎo)致劑量依賴性降低c-末端1型膠原蛋白端肽和抗酒石酸酸性磷酸酶5b水平，c-末端1型膠原蛋白端肽和抗酒石酸酸性磷酸酶5b是骨吸收的標(biāo)志。其它的標(biāo)志(例如p1np)顯示非決定性的結(jié)果。bap水平在最高藥物劑量處顯示接近最大的效果，這表明在劑量為0.3mg/kg時(shí)，增加到高達(dá)3mg/kg時(shí)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)該合成代謝性骨的生物標(biāo)志的半最大效應(yīng)。作為藥效效果與藥物的auc的關(guān)系計(jì)算，ec50為51465(天^＊ng/ml)。在最高的測(cè)試劑量水平下，這些骨的生物標(biāo)志變化大約持續(xù)120天。與活化素的抑制一致的血清fsh水平也存在劑量依賴性降低。

對(duì)健康的絕經(jīng)后女性給予單劑量的actriia-hfc是安全的，且對(duì)測(cè)試的劑量水平范圍有良好的耐受性。延長(zhǎng)的pk和藥效效果表明間斷性的劑量給藥對(duì)未來的研究將是合適的。例如，基于血清半衰期的劑量給藥可以按月進(jìn)行，或者按照每2、3、4、5或6周一次的順序進(jìn)行。此外，由于藥效效果延續(xù)遠(yuǎn)超出藥物在血清的停留時(shí)間，可基于藥效效果進(jìn)行劑量給藥，意思是每3個(gè)月或者每2、3、4、5、6或甚至12個(gè)月劑量給藥，也可對(duì)病人有效產(chǎn)生所需要的效果。這種臨床試驗(yàn)表明actriia-hfc在人中是一種骨合成代謝劑(osteoanabolicagent)，其生物學(xué)證據(jù)是骨形成的增加和骨吸收的減少。

實(shí)施例4：actriia-fc改善或預(yù)防由乳腺癌轉(zhuǎn)移引起的骨質(zhì)流失

據(jù)估計(jì)65-75％的乳腺癌轉(zhuǎn)移到骨，使得骨結(jié)構(gòu)發(fā)生實(shí)質(zhì)性損壞，增加骨折的風(fēng)險(xiǎn)，并引起疼痛和其它的副作用。我們?cè)谝呀?jīng)轉(zhuǎn)移到骨的乳腺癌的小鼠模型中測(cè)試了actriia-fc的效果。

將人乳腺癌細(xì)胞系mda-mb-231的亞系(克隆2287，kang等人cancercell2003，第3卷：537-549)在體外培養(yǎng)，并在密度為5x10⁶細(xì)胞/ml時(shí)收獲細(xì)胞。mda-mb-231是一種高度有能力種入(seedinginto)骨并引起骨損害的細(xì)胞系，，所述損害與骨轉(zhuǎn)移所導(dǎo)致的損害類似。在研究的第0天將10μl細(xì)胞注射入6周齡的雌性無胸腺裸鼠的脛骨中。在研究的第10天，小鼠接受actriia-mfc(10mg/kg/每周2次/皮下)(n＝8)或者pbs載體(n＝7)。采用雙能量x線吸收測(cè)量法(piximus)以每周的間隔測(cè)試骨礦物質(zhì)密度的變化，以評(píng)價(jià)疾病的進(jìn)展。小鼠用actriia-mfc治療4周，然后被處死，收集每只動(dòng)物的脛骨(注射腫瘤和未腫瘤化的脛骨兩者)。然后對(duì)脛骨進(jìn)行處理并準(zhǔn)備用于顯微計(jì)算機(jī)輔助斷層造影(microct)和組織學(xué)分析。

與相對(duì)側(cè)的腿部相比，給無胸腺裸鼠脛骨內(nèi)注射mda-mb-231細(xì)胞促進(jìn)經(jīng)注射的脛骨中的骨溶性損害的發(fā)展。近端的脛骨的microct分析表明，與用pbs載體治療的小鼠的未腫瘤化的脛骨相比，帶有mda-mb-231的脛骨中的骨松質(zhì)的量減少62％。與載體治療相比，actriia-mfc治療導(dǎo)致未處理(naive)脛骨或帶有腫瘤的脛骨分別增加70％或147％(兩個(gè)均p＜0.01)。actriia-mfc治療的小鼠的帶有腫瘤脛骨的骨松質(zhì)密度與用veh治療的小鼠的未處理脛骨相似(p＝0.39)。

因此，actriia-mfc能夠消除骨中與有乳腺腫瘤細(xì)胞的存在相關(guān)的骨損害。

實(shí)施例5：actriia-fc減少乳腺癌轉(zhuǎn)移并促進(jìn)存活

作為轉(zhuǎn)移性疾病的模型，可以通過心內(nèi)注射將mda-mb-231細(xì)胞引入小鼠中。注射入左心室的細(xì)胞將通過血流遷移，并在遠(yuǎn)端部位形成轉(zhuǎn)移性病變。衍生的細(xì)胞系mda-mb-231-1uc-d3h2ln(caliperlifesciences)是表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞系，其允許使用生物光子成像技術(shù)(caliperlifesciences)非侵入性地監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)移性腫瘤的形成。這種模型用于評(píng)價(jià)actriia-mfc對(duì)減少轉(zhuǎn)移性乳腺癌病變的形成的潛力。

通過心內(nèi)注射將mda-mb-231-luc-d3h2ln細(xì)胞引入到26只無胸腺的裸鼠中。所述裸鼠中的14只用載體(磷酸鹽緩沖鹽水-pbs)治療，12只用actriia-mfc(10mg/kg，每周2次，皮下注射)治療，在對(duì)腫瘤給藥前2周開始注射，并持續(xù)整個(gè)研究過程。對(duì)另外9只小鼠模擬注射細(xì)胞并用actriia-mfc治療。周期性地麻醉小鼠，并使發(fā)射的生物熒光顯現(xiàn)，以檢測(cè)轉(zhuǎn)移進(jìn)展的形成。

actriia-mfc治療組表明實(shí)質(zhì)性減少轉(zhuǎn)移性損害的發(fā)展。到第5周，14只用載體治療的小鼠中的12只表現(xiàn)出指示有轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的多個(gè)強(qiáng)烈熒光信號(hào)，而12只用actriia-mfc治療的小鼠中只有4只表現(xiàn)出相似的損害(圖3)。熒光強(qiáng)度的定量表明治療的小鼠中的熒光信號(hào)大約降低10倍。

此外，actriia-mfc治療顯著地增加小鼠的存活。到研究的第40天，用載體治療的所有(14/14)小鼠都已經(jīng)死亡或者安樂死(按照用于人道處理研究動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)程序)，而用actriia-mfc治療的小鼠中只有2只(2/12)死亡或安樂死。到第45天，12只用actriia-mfc治療的小鼠中的3只死亡或安樂死，模擬注射的小鼠無一死亡。因此，在這種轉(zhuǎn)移性乳腺癌的模型中，actriia-mfc治療導(dǎo)致實(shí)質(zhì)性減少轉(zhuǎn)移性損害的形成，并促進(jìn)存活。這些數(shù)據(jù)表明，actriia-fc可用于治療病人的乳腺癌，尤其是與其它療法結(jié)合治療，所述其它療法例如為針對(duì)原發(fā)性腫瘤的手術(shù)、激素治療或者傳統(tǒng)的化療。

實(shí)施例6：替代性actriia-fc蛋白

公開號(hào)為wo2006/012627的國(guó)際專利申請(qǐng)中(參見第55-60頁)(將其整體納入本文中作為參考)描述了根據(jù)本文所描述的方法可以采用的各種actriia變體。替代的構(gòu)建體可以將c-末端尾部(actriia的胞外結(jié)構(gòu)域的最后15個(gè)氨基酸)刪除。以下表示此類構(gòu)建體的序列(加下劃線的部分為fc部分)(seqidno：12)：

ilgrsetqeclffnanwekdrtnqtgvepcygdkdkrrhcfatwknisgsieivkqgcwlddincydrtdcvekkdspevyfcccegnmcnekfsyfpemtgggthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpvpiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

并入作為參考

本文所提及的所有出版物和專利都整體地納入本文中作為參考，猶如每一個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠唧w且單獨(dú)地納入本文中作為參考一樣。如果出現(xiàn)抵觸，以本發(fā)明，包括本文中的任何定義為準(zhǔn)。

雖然討論了本主題的具體實(shí)施方案，但以上的說明書只是作為說明之用，并非作限制。顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在讀完本說明書和以下權(quán)利要求書之后可作出很多的變化。本發(fā)明的完整的范圍應(yīng)當(dāng)通過參考權(quán)利要求書及其等同物的全部范圍，以及說明書連同此類變化來確定。