本發(fā)明涉及甘露聚糖結(jié)合凝集素的新用途
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及mbl在制備預(yù)防或治療以tregs為靶點的疾病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：甘露糖結(jié)合凝集素(mannan-bindinglectin，mbl)是主要由肝細胞分泌的高度保守的血漿蛋白，為c型凝集素超家族中膠凝素(collectins)家族成員。mbl也是一種急性期反應(yīng)蛋白，在應(yīng)激(如病原體感染、外科手術(shù)等)時，其血漿濃度可升高2-3倍。具有前抗體(ante-antibody)之稱的mbl通過其糖識別域(carbohydraterecongnitiondomain，crd)廣泛識別分布于多種病原體如細菌、病毒、寄生蟲、真菌等表面的糖結(jié)構(gòu)，包括d-甘露糖、l-巖藻糖、n-乙酰葡萄糖胺、n-乙酰甘露糖胺等。其膠原樣區(qū)(collagen-likeregion，clr)結(jié)合甘露聚糖相關(guān)絲氨酸蛋白酶(mbl-associatedserineprotease，mbl-masp)，激活補體凝集素途徑而發(fā)揮溶破和間接調(diào)理功能；或者與吞噬細胞膠凝素受體結(jié)合，以不依賴補體的方式啟動調(diào)理吞噬。science曾刊文(thompsonc.proteinprovestobeakeylinkininnateimmunity[j].science,1995,269(5222):301-302.)稱其為“天然免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵分子”。現(xiàn)有資料已表明，mbl是未免疫宿主體內(nèi)最重要的抗感染天然免疫分子。目前已發(fā)現(xiàn)mbl結(jié)構(gòu)基因的3個點突變(cgt52tgg、ggc54gac和gga57gaa)以及啟動子和5′非翻譯區(qū)突變所致血漿mbl低下而引起的調(diào)理吞噬缺損為迄今所發(fā)現(xiàn)的最常見的遺傳性免疫缺損病。mbl缺損者終生處于高度的感染風(fēng)險之中，隨時可患各種感染甚至威脅生命的感染。近些年研究表明，mbl的抗病機制與其血清濃度水平相關(guān)，低水平的mbl容易導(dǎo)致機體的防御功能明顯減弱，容易感染克羅恩病、自身免疫性神經(jīng)障礙、原發(fā)性免疫缺陷以及侵襲性真菌感染；相反，最新研究表明高水平的mbl能夠提高慢性阻塞性肺疾病患者的存活率。隨著對mbl研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其除了可識別并清除病原體，還具備許多內(nèi)源性功能(endongenousfunctions)，如結(jié)合自身免疫球蛋白；識別缺血再灌注損傷中暴露的自身抗原或疾病狀態(tài)下修飾的自身抗原；參與對凋亡細胞的吞噬；能夠與單核細胞系thp1細胞相互作用，抑制c.albicans誘導(dǎo)的細胞因子分泌，同時對b淋巴細胞系raji細胞，及t細胞系jurkat細胞均具有免疫調(diào)節(jié)作用。因此，mbl作為天然免疫中具有多重功能的模式識別分子，不僅僅參與機體的天然免疫防御，亦在天然免疫與獲得性免疫之間發(fā)揮其作用。固研究mbl與獲得性免疫的關(guān)系，具有重要的科學(xué)意義和潛在的醫(yī)學(xué)實踐意義。t淋巴細胞是獲得性免疫的主要參與者，其中調(diào)節(jié)性t細胞(regulatorytcell，tregs)參與機體免疫能力的調(diào)節(jié)。作為人體自身免疫的重要防線，tregs細胞在維持機體免疫耐受方面有著不可忽視的作用。一方面，tregs細胞的缺失會導(dǎo)致x連鎖隱性遺傳性疾病的發(fā)生。這是一種嚴重的多發(fā)性自身免疫疾病，導(dǎo)致幼年發(fā)病的腸道和多個內(nèi)分泌腺的炎癥，顯著縮短患者壽命。另一方面，在多種自身免疫性疾病和炎癥性疾病的患者和動物模型中，均發(fā)現(xiàn)有tregs細胞數(shù)目的減少，包括多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、1型糖尿病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、牛皮鮮和動脈粥樣硬化等。這些研究成果都提示對tregs細胞數(shù)目的干預(yù)可能是治療多種自身免疫性疾病和炎癥性疾病的針對靶點。近年來研究發(fā)現(xiàn)，tregs細胞作為體內(nèi)具有免疫調(diào)節(jié)功能的cd4+t細胞亞群，其可以分為天然調(diào)節(jié)性t細胞(naturalregulatorytcell，ntreg)和誘導(dǎo)產(chǎn)生的適應(yīng)性調(diào)節(jié)性t細胞(inducedregulatorytcell，itreg)，ntreg細胞在胸腺中發(fā)育，在維持機體免疫耐受、移植免疫和自身免疫病等方面發(fā)揮著重要作用；itreg細胞是由cd4+t細胞在某些特定生理條件下在外周誘導(dǎo)分化而來，同樣具有ntreg細胞相似的功能特點。因此，尋找新的調(diào)節(jié)tregs細胞誘導(dǎo)分化因素，對于機體維持免疫耐受、治療多種自身免疫性疾病具有重要的科學(xué)意義和臨床實踐價值。已有文獻報道tgf-β、il-1β、il-2在tregs細胞的誘導(dǎo)分化中至關(guān)重要，聯(lián)合應(yīng)用cd3/cd28單抗和tgf-β1可提高tregs細胞的表達。但是，是否還有未知的的促進tregs細胞的誘導(dǎo)分化的因素亟待進一步深入開發(fā)研究。本課題組近年來一直從事mbl相關(guān)研究的工作。在mbl參與免疫調(diào)節(jié)方面，發(fā)現(xiàn)mbl能誘導(dǎo)單核細胞向樹突狀細胞分化并促進其功能成熟、高濃度mbl以劑量依賴方式抑制lps誘導(dǎo)的樹突狀細胞成熟以及l(fā)ps刺激的thp1/cd14細胞產(chǎn)生tnf-α和il-12，mbl還可與b淋巴細胞系raji細胞及t細胞系jurkat細胞相互作用，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。以上均說明mbl具有多種免疫調(diào)節(jié)作用。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提出了mbl在制備預(yù)防或治療以tregs為靶點的疾病藥物中的應(yīng)用，主要探討了mbl對cd4+cd25-t細胞向tregs細胞誘導(dǎo)分化的影響，結(jié)果表明mbl可以直接促進cd4+cd25-t細胞向tregs細胞誘導(dǎo)分化，這不僅是在理論上有顯著性突破(在此之前從未有關(guān)mbl誘導(dǎo)tregs細胞的文獻報道)，而且具有潛在的臨床醫(yī)學(xué)意義，為治療以tregs為靶點的感染性疾病、自身免疫性疾病及變態(tài)反應(yīng)性疾病等提供了一種新的治療途徑。本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的采用如下技術(shù)方案，mbl在制備預(yù)防或治療以tregs為靶點的感染性疾病、自身免疫性疾病或/和變態(tài)反應(yīng)性疾病藥物中的應(yīng)用，該mbl通過促進cd4+cd25-t細胞向tregs細胞誘導(dǎo)分化實現(xiàn)藥物的功效。進一步優(yōu)選，所述感染性疾病包括利什曼原蟲感染、瘧原蟲感染、李斯特菌感染、油門螺桿菌感染、單純皰疹病毒感染、人類免疫缺陷病毒感染、乙型肝炎病毒感染和丙型肝炎病毒感染。進一步優(yōu)選，所述自身免疫性疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、非肥胖糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、1型糖尿病、特應(yīng)性皮炎、graves病和斑禿。進一步優(yōu)選，所述變態(tài)反應(yīng)性疾病包括過敏性鼻炎和支氣管哮喘。進一步優(yōu)選，所述mbl為聯(lián)合應(yīng)用配體和單克隆抗體親和層析純化人血漿天然mbl蛋白。進一步優(yōu)選，所述mbl的濃度高于其在體內(nèi)的生理濃度。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用cd3/cd28單抗和tgf-β1可提高tregs細胞的數(shù)目相比，本發(fā)明具有以下有益效果：1、本發(fā)明通過探索得到了調(diào)節(jié)tregs細胞誘導(dǎo)分化的新因素，即mbl直接促進cd4+cd25-t細胞向tregs細胞誘導(dǎo)分化；2、本發(fā)明凸顯出mbl的一種新功能，不但在固有免疫中發(fā)揮重要的抗感染作用，而且在針對tregs細胞誘導(dǎo)分化的干預(yù)中可能是治療多種自身免疫性疾病和炎癥性疾病的針對靶點；3、本發(fā)明所用的免疫細胞來自于人臍帶血，區(qū)別于現(xiàn)有研究中用的外周血，鑒于臍帶來源豐富、富含優(yōu)質(zhì)的造血干細胞和免疫前體細胞及再生能力強等優(yōu)點，因此，臍帶血成為本發(fā)明實驗過程標本來源的首選。附圖說明圖1是流式細胞術(shù)檢測新鮮cbmc中foxp3的表達情況圖；圖2是流式細胞術(shù)檢測cbmc在不同條件下轉(zhuǎn)錄因子foxp3的表達情況圖；圖3是rt-pcr法檢測新鮮cbmc及cbmc在不同條件培養(yǎng)的foxp3mrna的表達情況圖；圖4是cck-8法檢測itreg對pbmcs的增殖影響圖；圖5是免疫磁珠分選cd4+cd25-t、cd4+cd25+t細胞的純度圖；圖6是流式細胞術(shù)檢測mbl對cd4+cd25-t細胞向itreg誘導(dǎo)分化圖；圖7是rt-pcr分析mbl對cd4+cd25-t細胞向itreg誘導(dǎo)分化圖；圖8是cck-8法檢測itreg對cd4+cd25-t細胞增殖的影響圖。具體實施方式以下通過實施例對本發(fā)明的上述內(nèi)容做進一步詳細說明，但不應(yīng)該將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。實施例1實驗材料1、實驗所用細胞來源新生兒臍帶血采自新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院和新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科足月健康新生兒，胎兒娩出后立即從胎盤臍靜脈穿刺采血放入含有28ml保存液的采血袋中。所有血樣標本均在采樣后4h內(nèi)送達實驗室。2、主要試劑培養(yǎng)基rpmi1640、胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)、10×pbs溶液均購自thermofisherscientific公司。淋巴細胞分離液(ficoll-paqueplus)，是ficolltmpm400和密度1.077g/ml的泛影酸鈉的無菌內(nèi)毒素(＜0.12eu/ml)測試溶液，購自gehealthcarelifesciences公司?？谷薱d3單克隆抗體(cd3mab)、抗人cd28單克隆抗體(cd28mab)、pe-cyanine7標記的cd3mab、fitc標記的cd4mab、pe標記的rorγtmab以及cellstimulationcocktail(plusproteintransportinhibitors)均購自ebioscience公司。cd4+cd25+tregs分選試劑盒、ld分選柱、ms分選柱、macs分選架均購自miltenyibiotec公司。重組人mbl購自r&dsystem公司。cellcountingkit-8(cck-8)購自同仁化學(xué)研究所。3、主要儀器和設(shè)備超凈工作臺，sw-cj-2fd型，蘇州凈化設(shè)備有限公司。水浴箱，ssw-420-2s型，上海博訊公司。co2培養(yǎng)箱，thermo，thermo公司。低速臺式離心機，tdl-5型，上海安享科學(xué)儀器廠。流式細胞儀，facscalibur型，美國bd公司。倒置顯微鏡，ts100-f型，日本nikon公司。低溫離心機，eppendorf5810r型，德國eppendorf公司。核酸蛋白分析儀，smartspectm3000型，美國bio-rad公司。pcr儀，tgradient型，biometra公司。電泳儀，dyc-31c型，北京市六一機器廠。gis凝膠成像系統(tǒng)，tanongis-3500型，上海天能科技有限公司。純水儀，nw型，healforece公司。4、常用試劑配制(1)1×pbs溶液1體積份10×pbs溶液+9體積份蒸餾水；(2)50×tae電泳液以上用ddh2o補至1000ml后，室溫保存，需要用的時候，稀釋為1×tae。例如：需要使用200ml的1×tae，則量取4ml的50×tae，196ml的ddh2o，混勻即可；(3)1×fix/perm溶液1體積份fix/permconcentrate+3體積份fix/permdiluent例如：需要使用4ml的1×fix/perm溶液，則量取1ml的fix/permconcentrate，3ml的fix/permdiluent，混勻即可；(4)1×permbuffer溶液1體積份10×permbuffer+9體積份deionizedwater例如：需要10ml的1×permbuffer溶液，則量取1ml的10×permbuffer，9ml的deionizedwater，混勻即可。實驗方法1、臍帶血單個核細胞(cordbloodmononuclearcell，cbmc)的制備acd抗凝的臍帶血，用等量的預(yù)冷pbs溶液稀釋，置于淋巴細胞分離液上，常規(guī)密度梯度離心法(400×g，30min)分離獲取單個核細胞(cbmc)，用無菌pbs洗三次(每次1500r/min，10min)，用含10wt％fbs的rpmi1640培養(yǎng)基重懸細胞，并計數(shù)。2、包被anti-cd3mab將1mg/ml的anti-cd3mab用無菌1×pbs分別稀釋至2μg/ml和5μg/ml，加入96孔板，50μl/孔，4℃過夜。3、不同濃度mbl對tregs細胞的誘導(dǎo)分化上述的cbmc懸液每106/ml細胞數(shù)植入預(yù)先包被anti-cd3mab(2μg/ml)的96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔200μl，各孔均加入anti-cd28mab(1μg/ml)、tgf-β1(5ng/ml)，實驗組分別加入不同濃度(1-10ng/ml)的mbl，對照組不加mbl，每種培養(yǎng)條件均設(shè)置5個復(fù)孔。將細胞置于37℃，體積分數(shù)為5％的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于培養(yǎng)的第3天收集細胞用于相關(guān)實驗。4、流式細胞術(shù)檢測新鮮cbmc及cbmc在不同條件下轉(zhuǎn)錄因子foxp3的表達(1)收集新鮮cbmc和cbmc在不同條件培養(yǎng)后的細胞懸液加入1.5mlep管，106個細胞/管(約100μl)；(2)于4℃離心機400×g，離心5min，棄上清；(3)加入400μl1×pbs重懸細胞，于4℃離心機400×g，離心5min，棄上清；(4)分別加入200μl1×pbs重懸細胞，分別加入pecyanine7-cd3(1μl)、fitc-cd4(2μl)、apc-cd25(2μl)，冰上避光孵育30min；(5)孵育完成后，于4℃離心機400×g，離心5min，棄上清；(6)加入400μl1×pbs，于4℃離心機400×g，離心5min，棄上清；(7)分別加入200μl1×fix/perm重懸細胞，冰上避光孵育30min；(8)孵育完成后，直接加入200μl1×permbuffer，于4℃離心機500×g，離心6min，棄上清；(9)分別加入400μl1×permbuffer重懸細胞，于4℃離心機500×g，離心6min，棄上清；(10)分別加入100μl1×permbuffer和2μlpe-foxp3，于冰上避光孵育30min，之后于4℃離心機500×g，離心6min，棄上清；(11)分別加入400μl1×permbuffer重懸細胞，于4℃離心機500×g，離心6min，棄上清；(12)分別加入400μl1×pbs重懸細胞，待上機檢測，倘若不能及時上機檢測可加入500μl4wt％多聚甲醛重懸細胞，于24-48h內(nèi)上機。結(jié)果：從圖1可以看出，新鮮cmbc低表達cd4+cd25+foxp3+t細胞，即cbmc低表達tregs細胞；從圖2可以看出，mbl提高cbmc中cd4+cd25+foxp3+t細胞的比例，由此表明高于生理濃度的mbl能夠顯著提高cbmc中cd4+cd25+foxp3+t細胞的比例。5、rt-pcr法檢測新鮮cbmc及cbmc在不同條件培養(yǎng)的foxp3mrna的表達(1)新鮮cbmc及培養(yǎng)后的cbmc總rna的提取細胞的裂解：收集新鮮cbmc及cbmc在不同條件下培養(yǎng)3天的細胞于1.5mlep管中，8000g4℃離心2min，棄上清。每管加入1ml的rnaisoplus，用移液槍反復(fù)吹吸直至裂解液中無明顯沉淀，室溫靜置5min。rna的分離：接著向勻漿裂解液中加入氯仿(200μl)，蓋緊離心管，用手劇烈震蕩15s(氯仿沸點低、易揮發(fā)，震蕩時應(yīng)小心離心管蓋突然彈開)。待溶液充分乳化(無分相現(xiàn)象)后，再室溫靜置5min，4℃12000g離心15min。離心后，從離心機中小心取出離心管，此時勻漿分為三層，即無色的上清液、中間的白色蛋白層及帶有顏色的下層有機相。沉淀：吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中(切忌吸出白色中間層)，向上清加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在15-30℃靜置10min，12000g4℃離心10min。一般在離心后，試管底部會出現(xiàn)沉淀。rna的洗滌：小心棄去上清，緩慢地沿離心管壁加入體積分數(shù)為75％的乙醇1ml(切勿觸及沉淀)，輕輕上下顛倒洗滌離心管壁，12000g4℃離心5min后小心棄去乙醇(為了更好地控制rna中的鹽離子含量，應(yīng)盡量除凈乙醇)。rna的溶解：室溫干燥沉淀2-5min(不可以離心或加熱干燥，否則rna將會很難溶解)，加人適量的rnase-free水溶解沉淀，必要時可用移液槍輕輕吹打沉淀，待rna沉淀完全溶解后于-80℃保存。(2)逆轉(zhuǎn)錄(rt)反應(yīng)按照寶生物工程(大連)有限公司提供的primescripttmrtregentkitwithgdnaeraser說明書進行操作。去除基因組dna反應(yīng)：按如下成分于冰上制反應(yīng)混合液，為了保證反應(yīng)液配制的準確性，進行各項反應(yīng)時，應(yīng)先按反應(yīng)數(shù)+2的量配制mastermix，然后再分裝到每個反應(yīng)管中，最后加入rna樣品。合成cdna反應(yīng)：反應(yīng)液配制請在冰上進行。為了保證反應(yīng)液配制的準確性，進行各項反應(yīng)時，應(yīng)先按反應(yīng)數(shù)+2的量配制mastermix，然后再分裝10μl到每個反應(yīng)管中。輕柔混勻立即進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。合成的cdna需要長期保存時，請于-20℃或更低溫度保存；(3)pcr引物的設(shè)計合成及稀釋foxp3、β-actin引物按照引物設(shè)計原則，根據(jù)人β-actin、foxp3的dna序列設(shè)計，并經(jīng)過ncbi提供的blast程序驗證其特異性，以上引物均由上海生工生物工程公司合成。加適量高壓滅菌超純水，配制引物貯存液，濃度為10μmol/l，分裝后-20℃貯存。引物序列及反應(yīng)條件見下表：引物序列及rt-pcr產(chǎn)物的大小pcr反應(yīng)體系：試劑使用量cdna0.8μlforwardprimer0.8μlreverseprimer0.8μl2×taqpluspcrmix10μlddh2o7.6μl反應(yīng)條件：簡單混勻低速離心后，梯度pcr儀上擴增。95℃預(yù)變性3min，隨后95℃30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)。pcr產(chǎn)物鑒定：取8μl各擴增產(chǎn)物在1wt％瓊脂糖(含eb)凝膠上電泳，結(jié)果在gis凝膠圖像處理系統(tǒng)中拍攝記錄并保存，并用imagej軟件測定各條帶凈光密度值，計算目的條帶與β-actin凈光密度值之比。結(jié)果：從圖3可以得出，mbl促進cbmc高表達foxp3mrna。6、用cck-8法檢測itreg對pbmcs的增殖影響將從實驗組中分選出的cd4+cd25+t細胞(即itreg)與新鮮提取的人外周血單個核細胞(peripheralbloodmononuclearcells，pbmcs)以1:8、1:4、1:2、1:1比例混合作為實驗組，pbmcs為對照組，分別加入包被抗cd3(2μg/ml)和cd28(1μg/ml)單克隆抗體，在37℃，體積分數(shù)為5％的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。培養(yǎng)終止前4h，每孔加入20μlcck-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4h，酶聯(lián)免疫分析儀上檢測波長450nm的光密度(od)值，按下列公式計算itreg細胞抑制率。抑制cd4+cd25-t細胞的增殖(％)＝[(未含有itreg細胞的孔中被刺激的cd4+cd25-t細胞-加入itreg細胞的孔中被刺激的cd4+cd25-t細胞)/(未含有itreg細胞的孔中被刺激的cd4+cd25-t細胞-只含有培養(yǎng)基的空白孔)]×100％。結(jié)果：從圖4可以得出，itreg細胞以濃度依賴方式抑制pbmcs的增殖，結(jié)果提示誘導(dǎo)的itreg細胞具有明顯的細胞免疫抑制功能，并且抑制率呈現(xiàn)濃度依賴性(如圖4b所示)。實施例2實驗材料1、實驗所用細胞來源參考實例12、主要試劑參考實例13、主要儀器和設(shè)備參考實例14、常用試劑配制參考實例1實驗方法1、臍帶血單個核細胞的制備參考實例12、包被anti-cd3mab參考實例13、cd4+cd25-t細胞及cd4+cd25+t細胞磁性分選樣品準備采用密度梯度離心分離外周單個核細胞，為去除血小板，用buffer重懸細胞并200×g離心10-15min，小心吸取上清，重復(fù)洗滌。磁性標記非cd4+t細胞整個過程要快速完成，并保持細胞處于預(yù)冷狀態(tài)，防止成帽現(xiàn)象出現(xiàn)。推薦孵育的溫度為2-8℃。ms柱磁性標記≤107細胞、ld柱磁性標記≤108細胞。采用帶有30μm的血液尼龍過濾網(wǎng)的過濾器處理細胞懸液，過濾器使用前用buffer濕潤一下。(1)計數(shù)細胞；(2)細胞懸液于300×g離心10min，完全去上清；(3)每107加入90μlbuffer重懸細胞；(4)每107加入10μlcd4+tcellbiotin-antibodycocktail；(5)混勻并在冰箱(2-8℃)孵育5min；(6)每107加入20μlanti-biotinmicrobeads；(7)混勻并在冰箱(2-8℃)孵育10min；(8)進入下一步磁性分選(所需細胞懸液至少500μl，如不夠可添加buffer)；cd4+t細胞的磁性負分選依據(jù)總細胞數(shù)目選擇適合的分選柱。總是要等到分離柱中的液體流盡時，再執(zhí)行下一步。用ld分離柱分選將ld分離柱放置于macs分選器中。加入2×1mlbuffer潤洗分離柱。將細胞懸液置于ld分離柱中。收集流出的液體，并用1mlbuffer沖洗分離柱2次。收集到的液體即是未標記的cd4+t細胞。磁性標記cd4+cd25+調(diào)節(jié)性t細胞(1)收集的細胞懸液于300×g離心10min，完全棄上清；(2)加入90μlbuffer重懸細胞；(3)加入10μlcd25microbeads；(4)混勻并在冰箱(2-8℃)避光孵育15min；(5)(可選項)加入染色抗體。比如，10μlcd25-pe、10μlcd4-fitc或cd4-apc，在冰箱(2-8℃)避光孵育5min；(6)加入1-2mlbuffer洗滌細胞，300×g離心10min，完全棄上清；(7)加入500μlbuffer重懸細胞。細胞數(shù)目應(yīng)小于108，大于108應(yīng)相應(yīng)增加buffer的體積；(8)進入下一步磁性分選。ms分離柱陽性分選cd4+cd25+調(diào)節(jié)性t細胞為使分選的細胞純度達到最高，需要使用兩個ms分離柱。(1)將ms分離柱置于macs分選器中；(2)加入500μlbuffer潤洗分離柱；(3)將500μl細胞懸液置于ms分離柱中，收集流出的液體(cd4+cd25-t細胞)；(4)加入500μlbuffer沖洗ms分離柱3次，完全收集流出的液體(cd4+cd25-t細胞)；(5)將ms分離柱移出macs分選器，放置合適的收集管上；(6)加入1mlbuffer置于ms分離柱中，立即推動活塞將標記的細胞置于收集管中；(7)為增加cd4+cd25+細胞的純度，上一步收集的cd4+cd25+細胞必須通過第二個ms分離柱，重復(fù)1-6；(8)cd4+cd25-t細胞1000rpm離心5min；(9)棄去上清，cd4+cd25-t細胞加入5ml10wt％fbs的rpmi-1640完全培養(yǎng)液并細胞計數(shù)。4、不同濃度mbl對tregs細胞的誘導(dǎo)分化上述的cbmc懸液每106/ml細胞數(shù)植入預(yù)先包被anti-cd3mab(2μg/ml)的96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔200μl，各孔均加入anti-cd28mab(1μg/ml)、tgf-β1(5ng/ml)，實驗組分別加入不同濃度(1-10ng/ml)的mbl，對照組不加mbl，每種培養(yǎng)條件均設(shè)置5個復(fù)孔。將細胞置于37℃，體積分數(shù)為5％的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于培養(yǎng)的第3天收集細胞用于相關(guān)實驗。5、流式細胞術(shù)檢測新鮮cd4+cd25-t、cd4+cd25+t及cd4+cd25-t細胞在不同條件下轉(zhuǎn)錄因子foxp3的表達，方法參考實例1。結(jié)果：從圖5可以看出，通過免疫磁珠分選可以得出高純度的cd4+cd25-t細胞及cd4+cd25+t細胞；從圖6可以得出，mbl促進cd4+cd25-t細胞向itreg細胞誘導(dǎo)分化，由此表明，高于生理濃度mbl能夠增加itreg細胞的誘導(dǎo)分化。6、rt-pcr法檢測新鮮cd4+cd25-t及cd4+cd25-t在不同條件培養(yǎng)的foxp3mrna的表達新鮮cd4+cd25-t及培養(yǎng)后的cd4+cd25-t總rna的提取，方法參考實例1。結(jié)果：從圖7可以得出，mbl促進cd4+cd25-t高表達foxp3mrna。7、用cck-8法檢測itreg對cd4+cd25-t的增殖影響方法參考實例1，結(jié)果：從圖8可以得出，itreg細胞以濃度依賴方式抑制cd4+cd25-t的增殖，結(jié)果表明誘導(dǎo)的itreg細胞具有明顯的細胞免疫抑制功能，并且抑制率呈現(xiàn)濃度依賴性。以上實施例描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及優(yōu)點，本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明原理的范圍下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進均落入本發(fā)明保護的范圍內(nèi)。當前第1頁12