本發(fā)明屬于藥學(xué)領(lǐng)域，具體而言涉及通佐溴銨在抗人巨細(xì)胞病毒感染中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

人類皰疹病毒是一種雙鏈DNA病毒，包括α、β、γ三個(gè)亞科。人類巨細(xì)胞病毒(HCMV)在分類上歸皰疹病毒β亞科。HCMV只感染人類，主要的靶細(xì)胞有上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、外周血白細(xì)胞，能在體內(nèi)進(jìn)行傳播。HCMV的母嬰傳播十分常見，先天性HCMV感染的新生兒可能會導(dǎo)致一系列的神經(jīng)系統(tǒng)損傷，例如失明、耳聾、智力障礙等。因此，HCMV檢測成為孕婦和新生兒保健的常規(guī)項(xiàng)目之一。當(dāng)先天性感染的可能性很高并危害較大時(shí)，應(yīng)及時(shí)對胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷，進(jìn)行必要的干預(yù)或者終止妊娠。免疫功能不全患者例如艾滋病患者、接受治療的癌癥患者以及接受器官移植的患者等在感染HCMV后可能會造成肺炎、肝炎等并發(fā)癥，很可能會對生命造成威脅，是導(dǎo)致器官移植患者移植失敗和死亡的重要原因。此外，一些研究表明HCMV感染與冠心病、冠狀血管成形術(shù)后再狹窄、動脈粥樣硬化、移植血管硬化等心血管疾病的形成有關(guān)系。

HCMV蛋白酶是由病毒開放閱讀框UL80編碼的蛋白酶，是病毒支架蛋白的一部分。UL80全長編碼一個(gè)大小為80KD的前體蛋白，其N端是具有全部酶活性的HCMV蛋白酶(HCMV protease，Pr)，大小約為29KD。C端是參與衣殼成熟的磷蛋白(Assembly protein，AP)，大小約為50KD。HCMV蛋白酶可對UL80編碼的前體蛋白進(jìn)行剪切，具有三種酶切位點(diǎn)：支架位點(diǎn)(Scaffold site)即成熟位點(diǎn)(Mature site，M位點(diǎn))、釋放位點(diǎn)(Release site，R位點(diǎn))、自剪切位點(diǎn)(Internal site，I位點(diǎn))。HCMV蛋白酶對M、R、I這三個(gè)酶切位點(diǎn)的催化活性不同。HCMV蛋白酶對M位點(diǎn)的催化活性最強(qiáng)，對自剪切位點(diǎn)I位點(diǎn)的催化活性最弱。抑制HCMV蛋白酶活性之后，能抑制病毒衣殼的成熟，使病毒支架不能相應(yīng)的解體進(jìn)而不能為DNA進(jìn)入殼體提供空間，從而達(dá)到抑制病毒復(fù)制的作用。因此，HCMV蛋白酶是抗HCMV病毒的理想靶點(diǎn)。我們通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法對HCMV蛋白酶抑制劑進(jìn)行篩選。

目前，對通佐溴銨抗HCMV病毒感染中的應(yīng)用未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供通佐溴銨在抗HCMV病毒感染中的應(yīng)用。

所述通佐溴銨為以下化合物：

本發(fā)明針對人巨細(xì)胞皰疹病毒蛋白酶的抑制劑，抑制劑為通佐溴胺。

本發(fā)明所涉及通佐溴銨CAS號為553-08-2，購買于TOP SCIENCE公司。通過對通佐溴銨進(jìn)行的針對HCMV蛋白酶的抑制活性測定，設(shè)立陰性對照，發(fā)現(xiàn)該類化合物對HCMV蛋白酶有很好的抑制活性，在通佐溴銨終濃度為40μM時(shí)其對HCMV蛋白酶的抑制活性達(dá)到85％，表明這類化合物能夠有效的抑制HCMV蛋白酶的活性。因此，這類化合物有望成為抑制HCMV病毒的潛在藥物。

本發(fā)明提供一種用于一種預(yù)防或治療含有人巨細(xì)胞病毒蛋白酶感染的藥物，其活性成分為通佐溴銨，該藥物包含上述含有通佐溴銨以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑、增效劑。該藥物可制成注射劑、片劑、丸劑、膠囊、懸浮劑或乳劑的形式使用。其給藥途徑可為口服、經(jīng)皮、靜脈或肌肉注射。

本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：HCMV蛋白酶是抗人巨細(xì)胞病毒藥物靶點(diǎn)，本化合物為HCMV蛋白酶的非擬肽類抑制劑，有成為新型的具有抗耐藥性藥物的潛能。

附圖說明

圖1是通佐溴銨對HCMV蛋白酶的抑制曲線。

具體實(shí)施方式

下面將詳細(xì)描述本發(fā)明的具體實(shí)施方式，這僅用于解釋本發(fā)明，而不能解釋為對本發(fā)明的限制。

下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述試驗(yàn)中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從普通商業(yè)途徑得到。

HCMV蛋白酶由本組表達(dá)純化，熒光底物MCA-RRVVNASSRLNK-DNP(大于95％)，購自上海吉爾生化有限公司。酶抑制劑活性測定用到的化學(xué)試劑及生化試劑二甲基亞砜(DMSO)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

測試酶活性采用的熒光酶標(biāo)儀(Spectra max GEMINI xps)，產(chǎn)自Molecular Devices公司。

(1)HCMV protease基因由蘇州泓迅生物科技有限公司全合成，全合成所在載體為pUC57-Amp；

(2)通過PCR將目的基因HCMV protease的第143位丙氨酸(A)突變?yōu)楣劝滨０?Q)命名為HCMV-A143Q，并將HCMV-A143Q片段用BamH I與Xho I酶切，用瓊脂糖凝膠回收大小為約為780bp的目的基因片段；

(3)將目標(biāo)載體pGEX-6P-1用BamH I與Xho I酶切，然后用瓊脂糖凝膠回收酶切片段；

(4)將(2)和(3)獲得的片段連接(將酶切回收后的基因片段和目標(biāo)載體片段按照摩爾比5：1～10：1的比率混合在16℃下連接10-18h)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB平板(含有100mg/ml氨芐青霉素)培養(yǎng)過夜，將篩選得到的陽性克隆進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定正確的載體送于金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明，HCMV-A143Q基因已被正確的克隆到pGEX-6P-1載體中；

(5)將含有編碼HCMV病毒蛋白酶基因的pGEX-6P-1載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，并用LB平板(含有100mg/ml氨芐青霉素)篩選陽性克??；

(6)在(5)所述的LB平板上挑取陽性克隆，培養(yǎng)過夜，然后轉(zhuǎn)入0.8L的LB培養(yǎng)基(含100mg/ml氨芐青霉素)，當(dāng)OD值達(dá)到0.6-0.8時(shí)加入1mM IPTG，在16℃培養(yǎng)16-18h；

(7)4200rpm離心20min收集細(xì)胞，高壓破菌5～6次；破菌液6000rpm離心1.5h后收集上清液；

(8)將上清液加入GST親和層析柱中，層析柱經(jīng)過含500mM NaCl 50mM Tris-HCl pH8.2 10％甘油的懸菌緩沖溶液預(yù)平衡，2h后用懸菌緩沖溶液沖結(jié)合目的蛋白的GST親和介質(zhì)至G250不變藍(lán)，最后加入400ul濃度為2mg/ml的人類鼻病毒3C蛋白酶，4℃過夜酶切后用懸菌緩沖液將目的蛋白洗下；

(9)將上一步驟得到的HCMV-A143Q蛋白酶再用HiTrap Q陰離子交換層析和superdex75 10/300凝膠過濾層析進(jìn)行純化，得到純度較高的HCMV-A143Q蛋白酶；

(10)HCMV-A143Q蛋白酶的活性測定是使用熒光底物MCA-RRVVNASSRLNK(DNP)(純度大于95％，上海吉爾生化有限公司)來完成的；

(11)用于熒光強(qiáng)度測定的儀器為Fluoraskan Ascent熒光儀(Thermo)，激發(fā)光和發(fā)射光的波長分別為320nm和405nm；

(12)用于酶反應(yīng)的緩沖體系是50mM Tris-HCl(pH8.2)30％甘油125uM EDTA，用緩沖液配置HCMV-A143Q蛋白酶(終濃度0.8193uM)，加入備選樣品溶解物(終濃度為50uM)，震蕩10s，25℃孵育3min，迅速加入熒光底物，底物終濃度為48.89uM，1200rpm震蕩10s，每4s記錄一次熒光度數(shù)，共測定200個(gè)點(diǎn)；

(13)通過酶標(biāo)儀記錄的酶反應(yīng)相關(guān)數(shù)據(jù)，根據(jù)熒光強(qiáng)度以及反應(yīng)時(shí)間，采用GraphPad Prism 6軟件分析前35s的酶促反應(yīng)速率，設(shè)定V0為不加抑制劑的酶促反應(yīng)初速度，Vi為加抑制劑的酶促反應(yīng)初速度，根據(jù)酶促反應(yīng)速率，計(jì)算出每個(gè)化合物的剩余活性Ra(Residual Activity，Ra)(Vi/V0)以及抑制率Ir(Inhibition Rate，Ir)(1-Vi/V0)；

(14)對于剩余活性<20％的化合物進(jìn)行復(fù)篩，排除假陽性的可能，對于剩余活性低于15％的化合物設(shè)計(jì)熒光淬滅實(shí)驗(yàn)，綜合考慮化合物的剩余活性百分率和熒光淬滅率可以判斷化合物對HCMV-A143Q蛋白酶的抑制作用；

(15)為了排除假陽性結(jié)果，設(shè)計(jì)熒光淬滅實(shí)驗(yàn)，將HCMV-A143Q蛋白酶與熒光底物反應(yīng)一段時(shí)間，讓體系熒光達(dá)到最大值Q1，再在體系中加入與實(shí)驗(yàn)組等量的化合物，并檢測體系的熒光值為Q2，將兩者的熒光值按照公式計(jì)算得出熒光淬滅率Qr(Qr＝(Q1-Q2)/Q2*100％)，當(dāng)熒光淬滅率高于20％為假陽性結(jié)果需排除，當(dāng)熒光淬滅率低于20％時(shí)為陽性結(jié)果可進(jìn)行下一步的研究。

本發(fā)明屬于藥學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種通佐溴銨在抗人巨細(xì)胞病毒感染中的應(yīng)用。本發(fā)明涉及的通佐溴銨在終濃度為40μM對人巨細(xì)胞病毒蛋白酶抑制活性達(dá)到85％，在制備人巨細(xì)胞病毒蛋白酶的小分子抑制劑方面有很大應(yīng)用潛力。