本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及新烏頭堿在制備鈣通道、特別是L-型鈣通道Cav1.2亞型阻斷劑中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

烏頭類中藥屬于毛茛科植物，在我國使用已有2000多年的歷史。其植物主根為烏頭，側(cè)根為附子，獨(dú)根為天雄，均可入藥，是臨床常用的祛風(fēng)散寒、除痹止痛之品。附子為毛茛科植物烏頭子根的加工品，首次記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被譽(yù)為“回陽救逆第一要藥”。烏頭堿(ACO)是主根烏頭的重要成分，其在臨床上已引起心律失常和消化道副作用。新烏頭堿(MACO)是側(cè)根附子的生物堿類物質(zhì)，是ACO的結(jié)構(gòu)類似物，共同擁有C19母核結(jié)構(gòu)，文獻(xiàn)資料檢索結(jié)果分析表明，附子作為中醫(yī)的常用藥物，其藥理作用非常廣泛，具有抗炎鎮(zhèn)痛、強(qiáng)心、抗休克、抗心律失常等多種作用，臨床常用附子作為配伍藥用于治療厥逆亡陽、脈微欲絕；腎陽不足、畏寒肢冷；風(fēng)寒濕痹、周身骨節(jié)疼痛等癥獲得了較好的效果。但烏頭堿以及新烏頭堿是否作用于L-型鈣通道以及作用效果如何目前并無任何報(bào)道。

電壓門控型鈣通道按電生理特性可分為：高電壓門控型鈣通道及低電壓門控型鈣通道。前者分為：L-型、N-型、P/Q-型及R-型；后者又稱之為短暫T-型。L-型鈣通道是一種高電壓門控型鈣離子通道，普遍存在于體內(nèi)各型細(xì)胞膜上。按其藥理學(xué)特性及表達(dá)不同，可分為Cav1.1、Cav1.2、Cav1.3及Cav1.4四種。Cav1.2型鈣通道分布廣泛，介導(dǎo)的鈣離子(Ca²⁺)內(nèi)流誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生鈣依賴的鈣釋放機(jī)制，使細(xì)胞發(fā)生相應(yīng)的生理和生化反應(yīng)。在心肌細(xì)胞膜上，Cav1.2亞型是L-型鈣通道的主要亞型，也是心肌細(xì)胞興奮過程中鈣離子內(nèi)流的主要通道。Ca²⁺可通過L-型鈣通道的內(nèi)流構(gòu)成心室肌細(xì)胞動作電位平臺期。隨著Ca²⁺通過L-型鈣通道內(nèi)流，激活了Ca²⁺從肌漿網(wǎng)中釋放，對鈣穩(wěn)態(tài)和工作心肌細(xì)胞的興奮-收縮偶聯(lián)過程都起到重要作用。目前鈣通道、特別是L-型鈣通道阻斷劑，例如硝苯地平(Nifedipine)在臨床上廣泛用于高血壓、心絞痛以及心力衰竭等心血管疾病的預(yù)防或治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中針對鈣通道的阻斷劑較少，且現(xiàn)有烏頭堿副作用大的現(xiàn)狀，提供一種新烏頭堿在制備鈣通道、特別是L-型鈣通道Cav1.2亞型阻斷劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案之一是：新烏頭堿在制備鈣通道阻斷劑中的應(yīng)用。

其中，所述新烏頭堿可以作為唯一活性成分；新烏頭堿還可以與其他活性成分例如其他現(xiàn)有鈣通道阻斷劑共同起作用。

本發(fā)明所述鈣通道阻斷劑又稱鈣拮抗劑。L-型鈣通道，特別是Cav1.2亞型，其為心血管系統(tǒng)上的主要鈣通道之一，目前臨床上常用的鈣通道阻斷劑主要作用于L-型鈣通道。本發(fā)明中，較佳地，所述鈣通道為L-型鈣通道Cav1.2亞型。

由此，本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案之二是：新烏頭堿在制備預(yù)防和/或治療心血管疾病的藥物中的應(yīng)用。所述心血管疾病為本領(lǐng)域現(xiàn)有L-型鈣通道能作用的心血管病，包括但不僅限于高血壓病、心絞痛等。

新烏頭堿(MACO)的結(jié)構(gòu)式如下：

其中，新烏頭堿可以購買，也可以自行提取。

在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。

本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。

本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：新烏頭堿濃度依賴性對鈣通道，特別是L-型鈣通道Cav1.2亞型產(chǎn)生阻斷作用，可以將其作為鈣通道阻斷劑，用于治療高血壓等心血管疾病。不同于烏頭堿在臨床上引起的心律失常和消化道副作用，新烏頭堿的使用可以顯著避免上述副作用。

附圖說明

下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述：

圖1：Cav1.2轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，電生理驗(yàn)證其介導(dǎo)的L-型鈣通道電流。其中，HEK293細(xì)胞鉗制在-70mV，刺激方波采用-60mV至0mV，刺激時程為150ms。A，DMSO溶劑(0.1％)對HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染的Cav1.2電流無任何作用(n＝5)。B，硝苯地平(Nifedipine)(5μM)可顯著阻斷L-型Cav1.2電流(n＝5)。C，統(tǒng)計(jì)柱狀圖顯示DMSO溶劑及硝苯地平對Cav1.2電流的作用。***p<0.001vs.對照組(control)，“對照”組在檢測時沒有添加試劑。

圖2：新烏頭堿可劑量依賴性抑制Cav1.2通道電流。其中，A，不同濃度的新烏頭堿對Cav1.2電流的抑制示意圖。HEK293細(xì)胞鉗制在-70mV，刺激方波采用-60mV至0mV，刺激時程為150ms。B，新烏頭堿濃度依賴性抑制Cav1.2通道電流。濃度依賴曲線采用sigmoidal Hill方程(Y＝1/(1+10(log IC50-X)nH)擬合。括號內(nèi)數(shù)字為各濃度新烏頭堿的細(xì)胞記錄個數(shù)?！皩φ铡苯M在檢測時沒有添加試劑。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。

實(shí)施例1 HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染及Cav1.2電流驗(yàn)證

1.實(shí)驗(yàn)材料：

HEK293細(xì)胞購自美國ATCC公司，轉(zhuǎn)染用試劑組分購自美國SIGMA公司。

2.實(shí)驗(yàn)方案：

1)細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：

取一瓶培養(yǎng)良好的HEK293細(xì)胞(判斷標(biāo)準(zhǔn)：貼瓶壁70-80％，光鏡下細(xì)胞色澤較亮，無明顯的漂浮細(xì)胞)，棄培養(yǎng)液，加入HBSS(Hank's平衡鹽溶液)輕洗兩遍后加入約1mL的0.25％胰蛋白酶(trypsin)消化液消化，約3分鐘后加入DMEM高糖培養(yǎng)液(購自Hyclone公司)吹打，使細(xì)胞懸浮，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入一離心管中，離心，1000轉(zhuǎn)/分，約5分鐘，棄去上清液，加入DMEM高糖培養(yǎng)液，吹打使細(xì)胞懸浮。然后取1ml細(xì)胞懸液至已有DMEM高糖培養(yǎng)液的離心管中，緩慢吹打再取1ml細(xì)胞懸液至1ml的DMEM高糖培養(yǎng)基中，傳代至35mm的培養(yǎng)皿中。24小時后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法。具體如下，恒溫培養(yǎng)箱中取出24小時前放入的HEK293細(xì)胞，換液DMEM培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中待用。將Cav1.2鈣離子通道亞單位(質(zhì)粒)Cav1.2 1.5μg、α₂δ1.25μg(含eGFP綠色熒光基因)，β₂α1.25μg，TAG(Cav1.2，α2δ，β2α，TAG質(zhì)粒取自新加坡國立大學(xué)Soong Tuck Wah實(shí)驗(yàn)室)(Liao et al.,JBC,2015)0.25μg混合后，往其中加入75μl CaCl₂溶液，混合均勻后逐滴加入到75μl 2×HBS溶液中，緩慢吹打，靜置12分鐘后逐滴加入到已貼壁細(xì)胞，移入恒溫培養(yǎng)箱，48小時后運(yùn)用全細(xì)胞膜片鉗記錄。

2)電流記錄：

應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗記錄帶有熒光的HEK293細(xì)胞Cav1.2電流，每組記錄3-7個細(xì)胞。檢測時，待電流穩(wěn)定后(約2分鐘后)在培養(yǎng)液中分別加入DMSO溶劑(0.1％)、硝苯地平(5μM)。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

如圖1(A)-(C)所示，1‰DMSO作為陰性對照對L-型鈣電流無明顯作用，抑制率為0.32％(n＝5)；如圖1(B)-(C)所示，10μM硝苯地平作為陽性對照能夠顯著抑制L-型鈣電流，抑制率為86.6％(n＝5)。

HEK293細(xì)胞鉗制在-70mV，刺激方波采用-60mV至0mV，刺激時程為150ms。A，DMSO溶劑(0.1％)對HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染的Cav1.2電流無任何作用(n＝5)。B，硝苯地平(5μM)可顯著阻斷L-型Cav1.2電流(n＝5)。C，統(tǒng)計(jì)柱狀圖顯示DMSO溶劑及硝苯地平對Cav1.2電流的作用。***p<0.001vs.對照組(control)。

實(shí)施例2新烏頭堿劑量依賴性抑制Cav1.2通道電流。

1.實(shí)驗(yàn)材料：

新烏頭堿(CAS：2752-64-9)購自成都瑞芬思生物科技有限公司。

2.實(shí)驗(yàn)方案：

1)細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：

同實(shí)施例1。

2)電流記錄：

應(yīng)用全細(xì)胞電壓鉗模式記錄顯微鏡下帶有綠色熒光的HEK293細(xì)胞Cav1.2通道電流，每組記錄4-7個細(xì)胞。檢測時，待電流穩(wěn)定后(約2分鐘后)，在培養(yǎng)液中加入新烏頭堿，其中，新烏頭堿的終濃度分別為1μM，10μM，50μM和100μM。

檢測新烏頭堿對轉(zhuǎn)染Cav1.2通道質(zhì)粒后48小時的HEK293細(xì)胞L-型鈣通道電流的影響。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

結(jié)果如圖2所示，全細(xì)胞膜片鉗結(jié)果顯示，新烏頭堿能夠抑制Cav1.2通道電流，且該作用具有濃度依賴性。其最大抑制率為17.26±2.01％(n＝5，p<0.001)。

HEK293細(xì)胞鉗制在-70mV，刺激方波采用-60mV至0mV，刺激時程為150ms。A，不同濃度的新烏頭堿對Cav1.2電流的抑制示意圖。B，新烏頭堿濃度依賴性抑制Cav1.2通道電流。濃度依賴曲線采用sigmoidal Hill方程(Y＝1/(1+10(log IC50-X)nH)擬合。括號內(nèi)數(shù)字為各濃度新烏頭堿的細(xì)胞記錄個數(shù)。

上述實(shí)例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人是能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所做的等效變換或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。