本發(fā)明涉及苦參堿衍生物的新用途，具體涉及苦參堿衍生物作為胰島素增敏劑的用途，還涉及苦參堿衍生物在制備用于治療或預(yù)防糖尿病或糖尿病并發(fā)癥的藥物中的用途。

背景技術(shù)：

糖尿病(diabetes mellitus)是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，分為1型和2型糖尿病。長期血糖增高，大血管、微血管受損并危及心、腦、腎、周圍神經(jīng)、眼睛、足等，將會(huì)引發(fā)如糖尿病腎病、糖尿病眼病、糖尿病心血管并發(fā)癥、糖尿病神經(jīng)病變等一系列并發(fā)癥。并發(fā)癥一旦產(chǎn)生，藥物治療很難逆轉(zhuǎn)，因此強(qiáng)調(diào)盡早預(yù)防糖尿病并發(fā)癥。

目前用于治療糖尿病的藥物主要有胰島素及其類似物、口服降糖藥等?？诜堤撬幹饕嘶酋ｋ孱惔僖葝u素分泌劑、非磺酰脲類促胰島素分泌劑、噻唑烷二酮類、雙胍類、胰高血糖素樣肽1類似物、DPP-4抑制劑、α-葡萄糖苷酶抑制劑等。臨床上常用的這些口服降糖藥都存在一定得副作用。例如，有報(bào)道顯示使用磺酰脲類降糖藥可能產(chǎn)生低血糖，主要不良心血管事件，胃腸道損傷等副作用。非磺酰脲類促胰島素分泌劑可能產(chǎn)生惡心，腹痛，腹瀉等胃腸道不良反應(yīng)。噻唑烷二酮類藥物被報(bào)道可能與動(dòng)脈粥樣硬化的產(chǎn)生有關(guān)，羅格列酮可能導(dǎo)致心血管風(fēng)險(xiǎn)，匹格列酮可能導(dǎo)致膀胱癌的產(chǎn)生。雙胍類藥物臨床不良反應(yīng)主要為消化道癥狀，如腹瀉、腹脹、惡心、食欲減退、上腹不適，另可見乳酸性酸中毒等不良反應(yīng)。有嚴(yán)重肝、腎、心、肺功能不全的糖尿病患者不宜使用雙胍類藥物。DPP-4抑制劑可能產(chǎn)生低血糖反應(yīng)。α-葡萄糖苷酶抑制劑可能產(chǎn)生胃腸脹氣等副作用。

因此研究開發(fā)更加安全有效的新型口服降糖藥就顯得至關(guān)重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明人通過體外篩選以及動(dòng)物體內(nèi)藥學(xué)驗(yàn)證，意外地發(fā)現(xiàn)苦參堿衍生物能夠降低2型糖尿病小鼠的空腹血糖，改善口服葡萄糖耐量，改善胰島素耐量以及改善小鼠尿液相關(guān)指標(biāo)，并且不會(huì)增加血清ALT含量，同時(shí)還降低了肝臟系數(shù)，降低肝臟甘油三脂含量，降低肝臟AGEs含量。這表明苦參堿衍生物可以作為胰島素增敏劑，和/或用于預(yù)防和/或治療糖尿病或糖尿病并發(fā)癥，例如糖尿病腎病。本發(fā)明基于上述發(fā)現(xiàn)而得以完成。

本發(fā)明涉及式I所示化合物、其立體異構(gòu)體、或其可藥用鹽在制備用于治療糖尿病的藥物中的用途。

本發(fā)明還涉及式I所示化合物、其立體異構(gòu)體、或其可藥用鹽在制備用于預(yù)防和/或治療糖尿病并發(fā)癥的藥物中的用途。

本發(fā)明還涉及式I所示化合物、其立體異構(gòu)體、或其可藥用鹽在制備作為胰島素增敏劑的藥物中的用途。

本發(fā)明還涉及一種藥物組合物在制備用于治療糖尿病的藥物中的用途，或在制備用于預(yù)防或治療糖尿病并發(fā)癥的藥物中的用途，或在制備作為胰島素增敏劑的藥物中的用途，其中所述藥物組合物含有式I所示化合物、其立體異構(gòu)體、或其可藥用鹽，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。

本發(fā)明還涉及式I所示化合物、其立體異構(gòu)體、或其可藥用鹽，其用于治療糖尿病。

本發(fā)明還涉及式I所示化合物、其立體異構(gòu)體、或其可藥用鹽，其用于預(yù)防和/或治療糖尿病并發(fā)癥。

本發(fā)明還涉及式I所示化合物、其立體異構(gòu)體、或其可藥用鹽，其作為胰島素增敏劑。

本發(fā)明一種治療糖尿病的方法，其包括，給有此需要的受試者施用有效量的式I所示化合物、其立體異構(gòu)體、或其可藥用鹽。

本發(fā)明還涉及一種預(yù)防和/或治療糖尿病并發(fā)癥的方法，其包括，給有此需要的受試者施用有效量的式I所示化合物、其立體異構(gòu)體、或其可藥用鹽。

本發(fā)明所述的式I所示化合物的結(jié)構(gòu)如下：

其中，

R₁代表芳基或雜環(huán)基，所述芳基或雜環(huán)基任選地被R₄單取代或多取代，R₄選自：C_1-4烷?；⑶杌?、C_1-4烷氧基、鹵代C_1-4烷氧基、羧基、磺酸基、C_1-4烷氧羰基、C_1-4烷酰氨基、硝基、鹵素、羥基、巰基、氨基、C_1-4烷基磺?；?、C_1-4烷基和鹵代C_1-4烷基；

R₂代表-(CH₂)_nR₃；其中，

n＝0、1、2、3或4；

R₃選自氫、氨基、巰基、鹵素和C_1-6烷氧基。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的式I所示化合物中，所述的雜環(huán)基為5-6元單雜芳基。

在以上任意一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的式I所示化合物中，所述雜環(huán)基選自咪唑基、噻唑基、吡啶基、噻吩基。

在以上任意一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的式I所示化合物中，所述芳基為苯基。

在以上任意一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的式I所示化合物中，R₄選自鹵代甲氧基、鹵代乙氧基、鹵代丙氧基、乙?；Ⅺu代甲基、鹵代乙基、鹵代丙基、氰基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、羧基、甲氧羰基、乙酰氨基、硝基、氨基、甲磺?；?、甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基和叔丁基。優(yōu)選地，R₄選自三氟甲氧基、三氟甲基、氰基、甲氧基、羧基、硝基、氨基、甲磺?；?、甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基和叔丁基。進(jìn)一步優(yōu)選地，R₄為三氟甲基。

在以上任意一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的式I所示化合物中，R₂代表-(CH₂)_nR₃，其中，n＝1、2或3；R₃選自氫、氨基、甲氧基、乙氧基。

在以上任意一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的式I所示化合物中，R₂代表甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基。

在以上任意一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的式I所示化合物中，R₂代表甲基、乙基、正丙基或異丙基。

在以上任意一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的式I所示化合物選自：

本發(fā)明所述的式I所示化合物的合成方法可參見CN106279167A。

本發(fā)明使用的各種術(shù)語和短語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一般含義，提及的術(shù)語和短語如有與公知含義不一致的，以本發(fā)明所表述的含義為準(zhǔn)。

本發(fā)明所述的糖尿病為1型糖尿病或2型糖尿病。

本發(fā)明所述的糖尿病并發(fā)癥為糖尿病腎病、糖尿病眼病、糖尿病心血管并發(fā)癥或糖尿病神經(jīng)病變，優(yōu)選為糖尿病腎病。

本發(fā)明所述的胰島素增敏劑又稱“胰島素增敏因子”，它是一類能增強(qiáng)人體內(nèi)胰島素敏感性，促進(jìn)胰島素充分利用的物質(zhì)。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“芳基”是指包含至少一個(gè)不飽和芳環(huán)的單環(huán)或雙環(huán)芳香系統(tǒng)，優(yōu)選具有6-10，即6，7，8，9或10個(gè)碳原子的芳基。具體的例子包括但不限于苯基、萘基等。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“雜環(huán)基”是指任選地被至少一個(gè)和最多四個(gè)獨(dú)立的選自N、O或S的雜原子取代的單環(huán)或雙環(huán)飽和、部分飽和或不飽和的芳香或脂肪環(huán)狀系統(tǒng)，優(yōu)選具有4-7個(gè)原子(包含4、5、6或7個(gè)原子)的單雜環(huán)基或7-11個(gè)原子(包含7、8、9、10或11個(gè)原子)的雙雜環(huán)基，例如5-6元單雜芳基、7-11元雙雜芳基、氮雜環(huán)或4-6元脂肪氮雜環(huán)。具體的例子包括但不限于咪唑基、噻唑基、吡啶基、噻吩基。

本發(fā)明中使用的術(shù)語所述“C_1-4烷基”是指具有1-4個(gè)碳原子，如1、2、3或4個(gè)碳原子的直鏈或支鏈烷基。具體的例子包括但不限于甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“C_1-6烷氧基”是指如前述的C_1-6烷基上的碳原子與氧原子連接后得到的基團(tuán)，優(yōu)選為“C_1-4烷氧基”，具體的例子包括但不限于甲氧基、乙氧基或丙氧基等。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“C_1-4烷?；笔侵隔驶荚右欢伺c前述定義的C_1-4烷基連接后得到的基團(tuán)，具體的例子包括但不限于甲?；?、乙?；?、丙酰基等。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“C_1-4烷氧羰基”是指羰基碳原子一端與前述定義的C_1-4烷氧基連接后得到的基團(tuán)。具體的例子包括但不限于甲氧羰基、乙氧羰基等。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“C_1-4烷酰氨基”是指氨基氮原子一端與前述定義的C_1-4烷?；B接后得到的基團(tuán)。具體的例子包括但不限于甲酰氨基、乙酰氨基等。

本發(fā)明中使用的術(shù)語C_1-4烷基磺?；笔侵富酋；蛟右欢伺c前述定義的C_1-4烷基連接后得到的基團(tuán)。具體的例子包括但不限于甲磺?；?、乙磺酰基等。

如本發(fā)明中所使用的術(shù)語“鹵素”是指氟、氯、溴、碘。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“受試者”包括哺乳動(dòng)物和人，優(yōu)選為人。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“可藥用鹽”意指在制藥上可接受的并且具有母體化合物的所需藥理學(xué)活性的本發(fā)明化合物的鹽。這類鹽包括：與無機(jī)酸或與有機(jī)酸形成的酸加成的鹽，所述的無機(jī)酸諸如鹽酸，氫溴酸，硫酸，硝酸，磷酸等；所述的有機(jī)酸諸如乙酸，丙酸，己酸，環(huán)戊丙酸，乙醇酸，丙酮酸，乳酸，丙二酸，琥珀酸，蘋果酸，馬來酸，富馬酸，酒石酸，檸檬酸，苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙磺酸，苯磺酸，萘磺酸，樟腦磺酸，葡庚糖酸，葡糖酸，谷氨酸，羥基萘甲酸，水楊酸，硬脂酸，粘康酸等；或在母體化合物上存在的酸性質(zhì)子被金屬離子，例如堿金屬離子或堿土金屬離子取代時(shí)形成的鹽；或與有機(jī)堿形成的配位化合物，所述的有機(jī)堿諸如乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，N-甲基葡糖胺等。

本發(fā)明所述的藥物組合物中含有式I所示化合物、其立體異構(gòu)體、或其可藥用鹽，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。所述的載體包括但不限于：離子交換劑，氧化鋁，硬脂酸鋁，卵磷脂，血清蛋白如人血白蛋白，緩沖物質(zhì)如磷酸鹽，甘油，山梨酸，山梨酸鉀，飽和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，鹽或電解質(zhì)，如硫酸魚精蛋白，磷酸氫二鈉，磷酸氫鉀，氯化鈉，鋅鹽，膠態(tài)氧化硅，三硅酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮，纖維素物質(zhì)，聚乙二醇，羧甲基纖維素鈉，聚丙烯酸酯，蜂蠟，羊毛脂。所述賦形劑是指在藥物制劑中除主藥以外的附加物。其性質(zhì)穩(wěn)定，與主藥無配伍禁忌，不產(chǎn)生副作用，不影響療效，在常溫下不易變形、干裂、霉變、蟲蛀、對(duì)人體無害、無生理作用，不與主藥產(chǎn)生化學(xué)或物理作用，不影響主藥的含量測定等。如片劑中的黏合劑、填充劑、崩解劑、潤滑劑；中藥丸劑中的酒、醋、藥汁等；半固體制劑軟膏劑、霜?jiǎng)┲械幕|(zhì)部分；液體制劑中的防腐劑、抗氧劑、矯味劑、芳香劑、助溶劑、乳化劑、增溶劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、著色劑等均可稱為賦形劑，等等。

本發(fā)明化合物的藥物組合物可以以下面的任意方式施用：口服，噴霧吸入，直腸用藥，鼻腔用藥，頰部用藥，局部用藥，非腸道用藥，如皮下，靜脈，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)，鞘內(nèi)，心室內(nèi)，胸骨內(nèi)和顱內(nèi)注射或輸入，或借助一種外植儲(chǔ)器用藥。其中優(yōu)選口服、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥方式。

本發(fā)明中所使用的術(shù)語“有效量”是指，足以獲得或至少部分獲得期望的效果的量。例如，預(yù)防有效量是指，足以預(yù)防，阻止，或延遲疾病的發(fā)生的量；治療有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并發(fā)癥的量。測定這樣的有效量完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。例如，對(duì)于治療用途有效的量將取決于待治療的疾病的嚴(yán)重度，患者自己的免疫系統(tǒng)的總體狀態(tài)，患者的一般情況例如年齡、體重和性別，藥物的施用方式，以及同時(shí)施用的其他治療等等。

對(duì)受試者給予的本發(fā)明化合物的量取決于所述疾病或病況的類型和嚴(yán)重程度以及受試者的特征，如一般健康狀況、年齡、性別、體重和對(duì)藥物的耐受度，還取決于制劑的類型和藥物的給藥方式，以及給藥周期或時(shí)間間隔等因素。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)這些因素和其它因素來確定適當(dāng)?shù)膭┝?。一般而言，本發(fā)明的化合物用于治療日劑量可為大約1～800毫克，該日劑量可以視情況一次或分多次給予。本發(fā)明化合物可以在劑量單位中提供，在劑量單位中的含量可以為0.1～200毫克，例如1～100毫克。

本發(fā)明的有益技術(shù)效果

本發(fā)明所述的式I所示化合物能夠降低2型糖尿病小鼠的空腹血糖，改善口服葡萄糖耐量，改善胰島素耐量以及改善小鼠尿液相關(guān)指標(biāo)，并且不會(huì)增加血清ALT含量，同時(shí)還降低了肝臟系數(shù)，降低肝臟甘油三脂含量，降低肝臟AGEs含量。本發(fā)明所述的式I所示化合物可以作為胰島素增敏劑，和/或用于預(yù)防和/或治療糖尿病或糖尿病并發(fā)癥，例如糖尿病腎病。

附圖說明

圖1 HepG2細(xì)胞糖消耗情況柱狀圖；

圖2 L6細(xì)胞糖消耗情況柱狀圖；

圖3 3T3-L2細(xì)胞糖消耗情況柱狀圖；

圖4小鼠空腹血糖變化情況柱狀圖；

圖5口服葡萄糖耐量(OGTT)曲線；

圖6 OGTT曲線下面積柱狀圖；

圖7胰島素耐量(ITT)曲線；

圖8 ITT曲線下面積柱狀圖；

圖9給藥前和給藥49天后，小鼠24小時(shí)尿量變化柱狀圖；

圖10給藥前和給藥49天后，小鼠尿液葡萄糖濃度變化柱狀圖；

圖11給藥前和給藥49天后，小鼠尿微量白蛋白產(chǎn)生量變化柱狀圖；

圖12給藥前和給藥49天后，小鼠尿總蛋白產(chǎn)生量變化柱狀圖；

圖13給藥第50天后，小鼠血清中ALT含量柱狀圖；

圖14給藥第50天后，小鼠血清中AST含量柱狀圖；

圖15給藥第50天后，小鼠血清中CHO含量柱狀圖；

圖16給藥第50天后，小鼠血清中LDL-c含量柱狀圖；

圖17給藥第50天后，小鼠血清中TG含量柱狀圖；

圖18給藥50天后，小鼠血清中胰島素濃度柱狀圖；

圖19給藥50天后，小鼠血清中晚期糖基化終末產(chǎn)物含量柱狀圖；

圖20給藥50天后，小鼠肝臟系數(shù)柱狀圖；

圖21給藥50天后，肝臟組織甘油三酯含量柱狀圖；

圖22給藥50天后，肝臟組織總膽固醇含量柱狀圖；

圖23給藥50天后，肝臟組織AGEs含量柱狀圖；

圖24給藥50天后，肝臟組織SOD活力柱狀圖；

圖25給藥50天后，肝臟組織MDA含量柱狀圖。

圖1至圖25中，橫坐標(biāo)標(biāo)記，“DB-1,10”表示10μM的化合物DB-1，“DB-1,10+I”表示10μM的化合物DB-1+0.05nM胰島素，“DB-1,20”表示20μM的化合物DB-1，“DB-1,20+I”表示20μM的化合物DB-1+0.05nM胰島素，其他的橫坐標(biāo)標(biāo)記的含義與之類似。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

下面實(shí)施例中涉及的實(shí)驗(yàn)材料及試劑如下：

HepG2細(xì)胞、L6細(xì)胞、3T3-L1細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection，ATCC)。

DMEM培養(yǎng)基、EDTA-胰酶、胎牛血清FBS購自美國gibco公司。

葡萄糖檢測試劑盒(葡萄糖氧化酶法)購自朗道實(shí)驗(yàn)診斷有限公司(Randox)。

雄性C57BL/6J小鼠和雄性KK/upj-Ay/J小鼠，維持飼料，高脂高糖飼料購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

化合物DB-1和DB-1-3由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所化學(xué)室合成(合成方法參見CN106279167A的實(shí)施例28和實(shí)施例30)，小檗堿(BBR)由東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥廠提供，羅格列酮(RGZ)購自sigma公司。

血糖儀和血糖試紙購自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。

D-葡萄糖、SOD試劑盒、MDA試劑盒、己糖激酶試劑盒、糖原檢測試劑盒購自sigma公司。

0.22μm濾膜、小鼠胰島素ELISA試劑盒購自Millpore公司。

重組人胰島素注射液購自禮來公司。

EDTA-K2抗凝采血管購自美國BD公司。

晚期糖基化終末產(chǎn)物AGE含量利用ELISA試劑盒購自cell biolabs公司。

蛋白濃度測定試劑盒購自Thermo公司。

RNA提取試劑盒購自Qiagen公司。

反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自Promega公司。

下面實(shí)驗(yàn)中所用濃度單位“M”表示mol/L。

實(shí)施例1體外HepG2細(xì)胞系/L6細(xì)胞系/3T3-L1細(xì)胞系糖消耗及胰島素刺激的糖消耗實(shí)驗(yàn)

1.1實(shí)驗(yàn)方法如下：

①細(xì)胞培養(yǎng)：HepG2細(xì)胞用10％FBS+DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37℃，5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

L6細(xì)胞用10％FBS+DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37℃，5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，L6細(xì)胞接種培養(yǎng)板后，在細(xì)胞密度長至80％-90％后繼續(xù)用10％FBS+DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化5-7天。

3T3-L1細(xì)胞使用10％FBS+DMEM高糖培養(yǎng)，于37℃，5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行生長培養(yǎng)。然后置于37℃，5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基為：10％FBS+DMEM高糖培養(yǎng)基，其中添加了1μM地塞米松，0.5mM的3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)和1μg/ml胰島素。

②糖消耗測定：

待測化合物為：化合物DB-1、DB-1-3、小檗堿(BBR)和羅格列酮(RGZ)，其中小檗堿和羅格列酮作為陽性對(duì)照藥。各待測化合物均使用DMSO配制成溶液。

將HepG2細(xì)胞、L6細(xì)胞、3T3-L1細(xì)胞分別接種至96孔板中。其中：

HepG2細(xì)胞每孔接種2*10⁴個(gè)，培養(yǎng)24小時(shí)后，進(jìn)行加藥處理，進(jìn)行進(jìn)行基礎(chǔ)糖消耗和胰島素刺激的糖消耗實(shí)驗(yàn)；

L6細(xì)胞每孔接種5*10³個(gè)，培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化后作加藥處理，進(jìn)行基礎(chǔ)糖消耗和胰島素刺激的糖消耗實(shí)驗(yàn)；

同樣的3T3-L1細(xì)胞每孔接種2*10³個(gè)，生長培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時(shí)，更換新鮮生長培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，然后更換分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化48小時(shí)后進(jìn)行加藥處理，進(jìn)行基礎(chǔ)糖消耗和胰島素刺激的糖消耗實(shí)驗(yàn)。

基礎(chǔ)糖消耗實(shí)驗(yàn)，向孔中加入0.5％FBS+DMEM培養(yǎng)基和待測化合物，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組。對(duì)照組向孔中加入相同量的0.5％FBS+DMEM培養(yǎng)基和DMSO。每孔中待測化合物的終濃度分別設(shè)置為10μM、20μM、40μM。加藥后培養(yǎng)24小時(shí)，吸取一定量上清液測定培養(yǎng)基中葡萄糖剩余量，計(jì)算葡萄糖消耗量。其中葡萄糖消耗量＝培養(yǎng)基中葡萄糖初始含量－培養(yǎng)基中葡萄糖剩余含量。

胰島素刺激的糖消耗實(shí)驗(yàn)，向孔中加入胰島素和待測化合物，同時(shí)設(shè)置胰島素對(duì)照組。胰島素對(duì)照組向孔中加入相同量胰島素和DMSO。每孔中待測化合物的終濃度分別設(shè)置為10μM、20μM、40μM，胰島素的終濃度設(shè)置為0.05nM。加藥后培養(yǎng)24小時(shí)，吸取一定量上清液測定培養(yǎng)基中葡萄糖剩余量，計(jì)算葡萄糖消耗量。

1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次，得到平均糖消耗量。分別繪制不同細(xì)胞的糖消耗柱狀圖，如圖1至圖3所示。結(jié)果顯示，在HepG2細(xì)胞系、L6細(xì)胞系、3T3-L1細(xì)胞系中，在相同測定條件下，化合物DB-1和化合物DB-1-3在促進(jìn)細(xì)胞基礎(chǔ)水平的糖消耗以及促進(jìn)胰島素刺激的細(xì)胞糖消耗方面具有與陽性對(duì)照藥小檗堿和羅格列酮相當(dāng)或更加顯著的效果，表明化合物DB-1和化合物DB-1-3在細(xì)胞水平具有較好的降糖作用以及增加胰島素敏感性的作用。

實(shí)施例2降低2型糖尿病小鼠空腹血糖、增加胰島素敏感性以及治療糖尿病腎病的藥理作用實(shí)驗(yàn)

2.1實(shí)驗(yàn)方法

①動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：8只10周齡雄性C57BL/6J小鼠，63只10周齡雄性KK/upj-Ay/J小鼠，其中：C57BL/6J小鼠給予維持飼料，KK/upj-Ay/J小鼠給予高脂高糖飼料，飼養(yǎng)兩周后測定空腹血糖，并隨機(jī)分組。C57BL/6J小鼠作為正常對(duì)照組，KK/upj-Ay/J小鼠為5組，每組9只，其中1組為模型對(duì)照組，4組為給藥組，給藥量分別為DB-1 50mg/kg，DB-1 100mg/kg，BBR 100mg/kg，RZG 5mg/kg。

高脂高糖飼料配方為：蛋白質(zhì)16.46％，脂肪45.65％，碳水化合物37.89％。

②空腹血糖測定：于給藥前測定不禁食情況下體重作為初始值，給藥之后每3天測定一次體重。測定初始空腹血糖之后，稱取一定量飼料給予每只小鼠，每5天稱量剩余食物量，重新給予一定量飼料，給藥結(jié)束后計(jì)算每只小鼠每天進(jìn)食量。于前一日晚8:30禁食12小時(shí)，次日早上8:30測定空腹血糖，剪尾尖，用羅氏血糖儀活力型測定，給藥前測定空腹血糖作為初始值，給藥之后每10天測定空腹血糖。繪制小鼠空腹血糖變化情況柱狀圖，如圖4所示。

③口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(OGTT)：給藥30天后，晚8:30禁食12小時(shí)，次日早上8:30進(jìn)行OGTT實(shí)驗(yàn)，稱取4g葡萄糖溶于20ml水中，0.22μm濾膜過濾除菌，配置成20％葡萄糖溶液，稱體重，測定空腹血糖作為0點(diǎn)血糖值，灌胃給予小鼠20％葡萄糖溶液，最終給予葡萄糖量2g/kg，然后在30min，60min，120min，180min分別測定血糖值，統(tǒng)計(jì)血糖值，繪制OGTT曲線，并計(jì)算OGTT曲線下面積。

④胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(ITT)：給藥35天后，早上8:30小鼠禁食6小時(shí)，測定小鼠禁食6小時(shí)后血糖值作為ITT實(shí)驗(yàn)0點(diǎn)血糖值，同時(shí)稱量小鼠禁食6小時(shí)后的體重，按體重給予禮來常規(guī)性重組人胰島素注射液，腹腔注射給予，最終給予胰島素濃度為0.5U/kg體重，分別在注射胰島素后15min，30min，60min，90min，120min測定血糖，以0點(diǎn)血糖值為1，其余各時(shí)間點(diǎn)計(jì)算相對(duì)血糖濃度，繪制ITT曲線，并計(jì)算ITT曲線下面積。

⑤尿液收集和測定：用代謝籠分別收集小鼠給藥前和給藥49天后的24小時(shí)尿液，將小鼠單獨(dú)放入代謝籠中，自由飲食飲水，收集每只小鼠24小時(shí)尿液，12000rpm，4℃離心10min去除雜質(zhì)，測量尿液體積，用試劑盒測定尿液總蛋白濃度，尿液微量白蛋白濃度，尿液葡萄糖濃度，根據(jù)尿量計(jì)算小鼠24小時(shí)尿總蛋白，尿微量白蛋白產(chǎn)生量，試劑盒購自北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司。

⑥血液指標(biāo)測定：動(dòng)物給藥48天后，禁食12小時(shí)，斷尾取全血于EDTA-K2抗凝采血管中(購自BD)，取10μL抗凝全血測定糖化血紅蛋白濃度和血紅蛋白濃度，二者比值作為糖化血紅蛋白含量(試劑盒購自RNADOX)。

給藥50天后，小鼠摘眼球取血，室溫靜置2小時(shí)后，于15℃，3000rpm，離心10min，分離血清，用全自動(dòng)生化儀(日立7100)和生化檢測試劑盒(購自中生北控)測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，甘油三酯(TG)，總膽固醇(CHO)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，尿素(UREA)。肌酐(CRE)利用全波長酶標(biāo)儀進(jìn)行手工測定，利用全波長酶標(biāo)儀測定總膽汁酸(TBA)，總膽紅素(T-Bil)，直接膽紅素(D-Bil)，手工測定所用試劑盒購自北京九強(qiáng)生物。血清胰島素含量利用ELISA試劑盒(購自Merck Millipore)測定。血清晚期糖基化終末產(chǎn)物AGEs含量利用ELISA試劑盒(購自cell biolabs)。

⑦動(dòng)物組織器官的處理：給藥50天后處死動(dòng)物。動(dòng)物處理前禁食12小時(shí)，稱量禁食后體重，取血后，脫頸椎處死動(dòng)物，取肝臟，腎臟，胰腺，附睪脂肪，腎周脂肪分別稱重。分別取肝臟大葉的一半，取小鼠左側(cè)腎臟，胰腺一半用10％福爾馬林溶液固定過夜，進(jìn)行病理HE染色，剩余肝臟大葉，右側(cè)腎臟，剩余胰腺即刻凍存于液氮中，以備后續(xù)處理。

⑧肝臟甘油三脂及總膽固醇測定：切取50mg左右肝臟組織，按比例每毫克組織加入20μL裂解液，后續(xù)步驟按照說明書進(jìn)行，測定組織TG和CHO，所用試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

⑨肝臟AGE和SOD活力測定:切取約30mg肝臟組織，按每毫克組織加入20μL T-PER組織蛋白提取試劑(購自thermo scientific)，后用組織勻漿器(購自Qiagen)裂解，12000g，4℃，離心15min取上清，利用試劑盒測定肝臟晚期糖基化終末產(chǎn)物AGE含量(AGE測定試劑盒購自cell biolabs)和SOD活力(SOD活力測定試劑盒購自sigma)，測得結(jié)果用蛋白濃度校準(zhǔn)(蛋白濃度測定試劑盒購自Thermo)。

⑩丙二醛(MDA)含量，己糖激酶活力，糖原含量測定：同樣的切取一定量的肝臟組織加入試劑盒提供的裂解液，用組織勻漿器裂解，后續(xù)步驟均按照試劑盒說明書進(jìn)行，相關(guān)結(jié)果均用蛋白濃度校準(zhǔn)(蛋白濃度測定試劑盒購自Thermo)。

2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

①空腹血糖變化情況

小鼠空腹血糖變化情況如圖4所示。結(jié)果顯示，在KK/upj-Ay/J 2型糖尿病小鼠體內(nèi)，按體重50mg/kg、100mg/kg的給藥量，化合物DB-1和化合物DB-1-3經(jīng)口給藥20天、30天、40天、48天后，給藥組動(dòng)物空腹血糖均出現(xiàn)顯著性降低，且化合物DB-1和化合物DB-1-3的降糖效果與100mg/kg劑量的小檗堿以及5mg/kg的羅格列酮相當(dāng)。

②口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(OGTT)結(jié)果

OGTT曲線如圖5所示，OGTT曲線下面積如圖6所示。結(jié)果顯示，在KK/upj-Ay/J 2型糖尿病小鼠體內(nèi)，經(jīng)口給藥30天后，給藥量為50mg/kg、100mg/kg的化合物DB-1給藥組以及給藥量為100mg/kg的化合物DB-1-3給藥組口服葡萄糖耐量具有不同程度的改善，100mg/kg的DB-1給藥組以及100mg/kg的DB-1-3給藥組改善口服葡萄糖耐量的程度與100mg/kg的小檗堿或5mg/kg的羅格列酮相當(dāng)。

③胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(ITT)結(jié)果

ITT曲線如圖7所示，ITT曲線下面積如圖8所示。結(jié)果顯示，在KK/upj-Ay/J 2型糖尿病小鼠體內(nèi)，經(jīng)口給予35天后，給藥量為50mg/kg、100mg/kg的化合物DB-1、化合物DB-1-3給藥組的胰島素耐量均有不同程度的改善。給藥量為100mg/kg的DB-1給藥組以及DB-1-3給藥組改善胰島素耐量的程度與給藥量為100mg/kg的小檗堿或給藥量為5mg/kg的羅格列酮相當(dāng)。

④尿液指標(biāo)測定結(jié)果

給藥前后，各組動(dòng)物24小時(shí)尿量、尿液葡萄糖濃度、尿微量白蛋白產(chǎn)生量以及尿總蛋白產(chǎn)生量變化情況如圖9至圖12所示。從圖中可以看出，在KK/upj-Ay/J 2型糖尿病動(dòng)物模型中，給藥前，各組動(dòng)物24小時(shí)尿量、尿液葡萄糖濃度、尿微量白蛋白產(chǎn)生量以及尿總蛋白產(chǎn)生量與C57BL/6J小鼠比較具有極顯著的升高，KK/upj-Ay/J小鼠各組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；給藥后，模型組較給藥前具有不同程度的升高，與正常對(duì)照組相比有極顯著差異，而各給藥組較模型組均有不同程度的降低，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果表明，給藥量為50mg/kg以及100mg/kg的化合物DB-1、化合物DB-1-3均能抑制KK/upj-Ay/J 2型糖尿病小鼠糖尿病腎病的發(fā)展惡化，效果與給藥量為100mg/kg的小檗堿以及給藥量為5mg/kg的羅格列酮相當(dāng)。結(jié)果預(yù)示著化合物DB-1和DB-1-3有望制備用于治療糖尿病腎病。

⑤血清生化指標(biāo)測定結(jié)果

給藥50天后，各組動(dòng)物血清生化指標(biāo)如圖13至17所示。從圖中可以看出，在KK/upj-Ay/J 2型糖尿病小鼠動(dòng)物模型中，給藥50天后，模型組與正常對(duì)照組相比，ALT、AST、CHO、TG、LDL-c均有升高，有極顯著差異。而各給藥組與模型組相比，給藥量為100mg/kg的化合物DB-1-3和給藥量為100mg/kg的BBR均能降低血清ALT，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而給藥量為5mg/kg的羅格列酮導(dǎo)致血清ALT有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的升高，考慮是羅格列酮副作用所致；給藥量為100mg/kg的化合物DB-1-3還能顯著降低血清AST；給藥量為100mg/kg的化合物DB-1能夠顯著降低血清CHO和LDL-c；給藥量為100mg/kg的化合物DB-1，50mg/kg的化合物DB-1-3，100mg/kg的化合物DB-1-3，100mg/kg的BBR，5mg/kg的羅格列酮均能顯著降低血清TG。

⑥血清胰島素含量測定結(jié)果

給藥50天后，各組動(dòng)物血清胰島素含量情況如圖18所示。從圖中可以看出，在KK/upj-Ay/J 2型糖尿病小鼠動(dòng)物模型中，給藥50天后，模型組動(dòng)物與正常組動(dòng)物相比胰島素含量顯著升高，有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，各給藥組與模型組相比均有不同程度的降低，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這說明，化合物DB-1和化合物DB-1-3能夠改善動(dòng)物體內(nèi)高胰島素狀態(tài)，增加體內(nèi)胰島素的敏感性，有望制備用于胰島素增敏劑。

⑦血清AGEs測定結(jié)果

給藥50天后，各組動(dòng)物血清中晚期糖基化終末產(chǎn)物含量情況如圖19所示。在KK/upj-Ay/J 2型糖尿病小鼠動(dòng)物模型中，給藥50天后，取血測定血清中晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)。AGEs是一組在蛋白質(zhì)、脂肪酸或核酸的氨基基團(tuán)與還原糖的醛基之間發(fā)生非酶糖基化反應(yīng)所形成的一系列具有高度活性終產(chǎn)物的總稱，AGEs在體內(nèi)的積聚將會(huì)引發(fā)如糖尿病腎病等各種并發(fā)癥。結(jié)果表明，模型組動(dòng)物血清AGEs含量顯著高于正常組動(dòng)物，有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，各給藥組動(dòng)物血清AGEs含量與模型組比均有不同程度的降低，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這說明，化合物DB-1和化合物DB-1-3均能夠顯著降低血清AGEs含量，從而達(dá)到預(yù)防如糖尿病腎病等糖尿病并發(fā)癥。

⑧臟器系數(shù)測定結(jié)果

在KK/upj-Ay/J 2型糖尿病小鼠動(dòng)物模型中，給藥50天后，取動(dòng)物肝臟，腎臟，胰腺，附睪脂肪，腎周脂肪稱重。各臟器重量與動(dòng)物體重的比值即為各臟器系數(shù)。

給藥50天后，各組動(dòng)物的肝臟系數(shù)情況如圖20所示。結(jié)果表明，各組動(dòng)物的肝臟系數(shù)均有明顯的變化，模型組與對(duì)照組相比肝臟系數(shù)顯著增高，有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，化合物DB-1、化合物DB-1-3以及BBR均能顯著降低肝臟系數(shù)，改善肝臟功能。而給予羅格列酮后，肝臟系數(shù)卻有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的升高，我們推測這是羅格列酮產(chǎn)生的副作用導(dǎo)致。

⑨肝臟組織甘油三酯和總膽固醇含量測定結(jié)果

給藥50天后，肝臟組織甘油三酯含量，總膽固醇含量的柱狀圖如圖21和圖22所示。結(jié)果表明，模型組動(dòng)物肝臟甘油三酯含量和總膽固醇含量相比正常對(duì)照組有顯著升高，有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，給藥量為100mg/kg的化合物DB-1給藥組，給藥量為50mg/kg以及100mg/kg的化合物DB-1-3的給藥組，給藥量為100mg/kg的BBR對(duì)照組能不同程度的降低肝臟甘油三脂含量，而給藥量為5mg/kg的羅格列酮對(duì)照組，肝臟甘油三酯含量反而有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的升高，推測是由羅格列酮產(chǎn)生的副作用導(dǎo)致。給予50mg/kg以及100mg/kg的化合物DB-1和DB-1-3，100mg/kg的BBR以及5mg/kg的羅格列酮均能不同程度降低肝臟總膽固醇含量。

⑩肝臟組織AGEs含量、SOD活力、MDA含量測定結(jié)果

肝臟中AGEs含量的升高將會(huì)導(dǎo)致肝臟損傷，肝臟中SOD活力和MDA含量反應(yīng)了肝臟氧化應(yīng)激水平。

給藥50天后，肝臟組織AGEs含量，SOD活力，MDA含量的柱狀圖如圖23至圖25所示。肝臟組織中AGEs含量的測定結(jié)果表明，模型組動(dòng)物相比正常對(duì)照組動(dòng)物，肝臟AGEs含量有顯著升高，有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，化合物DB-1、DB-1-3和BBR均能不同程度的降低肝臟AGEs含量，而羅格列酮并不能降低肝臟AGEs含量，這表明化合物DB-1和DB-1-3相比羅格列酮具有優(yōu)越性。肝臟SOD活力以及MDA含量的測定結(jié)果表明，模型組動(dòng)物相比正常對(duì)照組動(dòng)物，SOD活力顯著降低，MDA含量顯著升高，而各給藥組動(dòng)物肝臟SOD活力均有不同程度的升高，MDA含量均與不同程度的降低，表明化合物DB-1和DB-1-3能夠改善肝臟氧化應(yīng)激水平。

在結(jié)果①②③④中，本發(fā)明涉及的化合物DB-1和DB-1-3在降低KK/upj-Ay/J 2型糖尿病小鼠空腹血糖，改善口服葡萄糖耐量，改善胰島素耐量以及改善小鼠尿液相關(guān)指標(biāo)方面表現(xiàn)出良好效果，100mg/kg的DB-1以及DB-1-3與100mg/kg的BBR以及5mg/kg的羅格列酮效果相當(dāng)，表明了本發(fā)明的兩個(gè)化合物可用于治療2型糖尿病以及預(yù)防糖尿病腎病。

在結(jié)果⑤⑧⑨⑩中，5mg/kg的羅格列酮表現(xiàn)出了一定的副作用，如顯著增加了血清ALT含量，顯著增加了肝臟系數(shù)，顯著增加了肝臟組織的甘油三酯含量，而且不能降低肝臟AGEs含量，而本發(fā)明涉及的化合物DB-1以及DB-1-3并不會(huì)增加血清ALT含量，并且降低了肝臟系數(shù)，降低肝臟甘油三脂含量，同時(shí)能夠降低肝臟AGEs含量，這些結(jié)果表明了本發(fā)明涉及的化合物DB-1,DB-1-3在制備用于治療2型糖尿病，制備作為胰島素增敏劑以及制備用于預(yù)防糖尿病腎病方面的優(yōu)越性。