本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病防治領(lǐng)域，具體涉及一種組合物殺菌劑及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水霉病是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的疾病，是由多種水生真菌引起的一種常見繼發(fā)性疾病，對水產(chǎn)動(dòng)物的種類沒有嚴(yán)格的選擇，且難以治愈，是一種世界性分布且對養(yǎng)殖魚類危害較大的疾病，也是魚類病害防治中最棘手的一個(gè)難題。
過去針對水霉病較為有效的防治藥物是孔雀石綠，然而，因孔雀石綠對動(dòng)物細(xì)胞具有致畸變作用，為此2002年5月中國已將孔雀石綠列入水產(chǎn)養(yǎng)殖(食用動(dòng)物)禁用藥物。但自孔雀石綠開始禁用以來，一直沒有研發(fā)出能夠取代孔雀石綠的有效防治藥物，不僅導(dǎo)致水霉病的防治遇到了極大的困難，也使得孔雀石綠屢禁不止，給水產(chǎn)食品安全帶來了極大的隱患。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種組合物殺菌劑及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用，能夠有效防治水霉病，提高水產(chǎn)食品安全。
為達(dá)到以上目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
一種組合物殺菌劑，所述組合物殺菌劑包括鄰苯二甲醛和溴菌清，所述鄰苯二甲醛和溴菌清的質(zhì)量份之比為1∶8～20∶1。
在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述鄰苯二甲醛和溴菌清的質(zhì)量份之比為1：1～10：1。
在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述鄰苯二甲醛和溴菌清的質(zhì)量份之比為4：1。
在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述組合物殺菌劑還包括無水乙醇和OP-10，按質(zhì)量份之比，所述組合物殺菌劑為：
一種組合物殺菌劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用，所述組合物殺菌劑用于防治水產(chǎn)養(yǎng)殖的水霉真菌性疾病或/和車輪蟲寄生原生動(dòng)物疾病。
在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，當(dāng)所述組合物殺菌劑用于防治水產(chǎn)養(yǎng)殖的水霉真菌性疾病時(shí)，其使用量為0.4mg/L—0.8mg/L。
在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，當(dāng)所述組合物殺菌劑用于防治水產(chǎn)養(yǎng)殖的車輪蟲寄生原生動(dòng)物疾病時(shí)，其使用量為0.3mg/L—0.6mg/L。
在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，當(dāng)所述組合物殺菌劑用于防治水霉真菌性疾病和車輪蟲寄生原生動(dòng)物疾病時(shí)，其使用量為0.5mg/L—1.0mg/L。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
(1)本發(fā)明的組合物殺菌劑的殺菌作用較強(qiáng)，對水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物真菌性病害有很好的防治效果；同時(shí)，還可防治養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌性疾病及由寄生原生動(dòng)物引起的疾病。
(2)本發(fā)明的組合物殺菌劑的兩種成分無明顯的交互抗性，復(fù)配制劑具有明顯的增效作用，有效降低了使用成本；
(3)本發(fā)明的組合物殺菌劑的毒副作用小，對環(huán)境友好，對養(yǎng)殖動(dòng)物安全。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
本發(fā)明實(shí)施例提供一種組合物殺菌劑，該組合物殺菌劑包括鄰苯二甲醛和溴菌清，其中，鄰苯二甲醛和溴菌清(1,2-二溴-2,4-二氰基丁烷)的質(zhì)量份之比為1∶8～20∶1，該組合物殺菌劑可以為液體制劑、固體粉劑或其他狀態(tài)。
在實(shí)際生產(chǎn)中，鄰苯二甲醛和溴菌清的質(zhì)量份之比可以根據(jù)實(shí)際需要確定，本實(shí)施例中，鄰苯二甲醛和溴菌清的質(zhì)量份之比可以為1：1～10：1，最優(yōu)為鄰苯二甲醛和溴菌清的質(zhì)量份之比為4：1。
本實(shí)施例中，當(dāng)組合物殺菌劑為液體制劑時(shí)，可以使用無水乙醇和OP-10(一種化工原料，成分是烷基酚聚氧乙烯醚)作為溶劑和乳化劑，此時(shí)，組合物殺菌劑的具體組成為：
本發(fā)明還提供一種組合物殺菌劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用，組合物殺菌劑用于防治水產(chǎn)養(yǎng)殖的水霉真菌性疾病或/和車輪蟲寄生原生動(dòng)物疾病。
當(dāng)組合物殺菌劑用于防治水產(chǎn)養(yǎng)殖的水霉真菌性疾病時(shí)，其使用量為0.4mg/L—0.8mg/。
當(dāng)組合物殺菌劑用于防治水產(chǎn)養(yǎng)殖的車輪蟲寄生原生動(dòng)物疾病時(shí)，其使用量為0.3mg/L—0.6mg/L。
當(dāng)組合物殺菌劑用于防治水霉真菌性疾病和車輪蟲寄生原生動(dòng)物疾病時(shí)，其使用量為0.5mg/L—1.0mg/L。
下面，通過15個(gè)實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
本發(fā)明實(shí)施例采用的水霉為常規(guī)水霉菌，按照本領(lǐng)域的常規(guī)方式進(jìn)行培養(yǎng)。
實(shí)施例1
具體的實(shí)驗(yàn)方法為：
S1、試驗(yàn)濃度設(shè)計(jì)：先對不同殺菌劑進(jìn)行預(yù)試，預(yù)試濃度設(shè)計(jì)參考該殺菌劑有關(guān)殺菌效力資料，然后按等10倍關(guān)系稀釋成不同濃度梯度，根據(jù)預(yù)試結(jié)果從各藥劑對病菌菌絲生長抑制率達(dá)10％～90％的范圍內(nèi)設(shè)計(jì)5個(gè)濃度梯度，作為藥劑母液，進(jìn)行精確試驗(yàn)。
S2、對各藥劑母液用定量無菌水稀釋至10倍于各試驗(yàn)濃度，然后與PDA(Potato DextroseAgar，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)培養(yǎng)基按1+9比例加入到已冷至50℃～60℃的PDA培養(yǎng)基中，充分?jǐn)噭?，倒皿，制成含不同濃度藥劑的含藥培養(yǎng)皿，每質(zhì)量濃度3皿；同時(shí)，以加入等體積無菌水的PDA平板作為對照組(藥劑的配比及濃度參見表1)。
S3、待培養(yǎng)基凝固后，用滅菌打孔器(Φ5mm)制取已培養(yǎng)好的菌餅，菌絲面朝下，接種于含藥培養(yǎng)基中央，置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72h后，用十字交叉法測量供試病菌在含不同藥劑濃度的培養(yǎng)基上菌落直徑與對照比較，計(jì)算各藥劑處理對菌落擴(kuò)展的生長抑制率，并以質(zhì)量濃度的對數(shù)值x及平均抑菌率的機(jī)率值(y)求毒力回歸方程，計(jì)算相關(guān)系數(shù)(r)、中濃度EC50。
抑菌率％＝[(對照菌落直徑-菌碟直徑)-(處理菌落直徑–菌碟直徑)]×100/(對照菌落直徑-菌碟直徑)
S4、計(jì)算混配制劑共毒系數(shù)：混配制劑的聯(lián)合毒力采用孫云沛的共毒系數(shù)方法表示。
根據(jù)上述方法測出各單劑及混劑對水霉菌菌絲的EC50，并按照下述公式計(jì)算毒力指數(shù)，將A的毒力指數(shù)(TIA)設(shè)為100，然后按下述公式分別求出B的毒力指數(shù)(TIB)、混劑的實(shí)際毒力指數(shù)(ATI)和理論毒力指數(shù)(TTI)，再計(jì)算共毒系數(shù)(CTC)。
B的毒力指數(shù)(TIB)＝A的EC50/B的EC50×l00
混配制劑的實(shí)測毒力指數(shù)ATI＝標(biāo)準(zhǔn)藥劑A的EC50/供試藥劑EC50×100。
混配制劑的理論毒力指數(shù)TTI＝Σ(某藥的毒力指數(shù)ATI×在混劑中該藥有效成分的百分率)。
混配制劑的共毒系數(shù)CTC＝混配制劑實(shí)際毒力指數(shù)ATI/混配制劑的理論毒力指數(shù)TTI×100。
共毒系數(shù)CTC大于120時(shí)為增效作用，小于80時(shí)為拮抗作用，介于80～120之間時(shí)為加和作用。
上述測試濃度和相關(guān)結(jié)果見表1。
表1不同配比的鄰苯二甲醛和/或溴菌清及對水霉菌絲抑制作用共毒系數(shù)的測定結(jié)果。
從上述數(shù)據(jù)可以看出，當(dāng)鄰苯二甲醛與溴菌清以不同比例復(fù)配時(shí)，配方的共毒系數(shù)(CTC)均大于120，表明復(fù)配制劑對水霉病的防治具有明顯的增效作用，其中鄰苯二甲醛與溴菌清在10:1～1:1之間的增效最為顯著，最優(yōu)配比為4:1；可見鄰苯二甲醛與溴菌清復(fù)配制劑可成為防治水霉病的理想藥劑。
通過室內(nèi)生測試驗(yàn)確定鄰苯二甲醛與溴菌清兩種有效成分復(fù)配有很好的增效作用，能有效防治水霉病。
實(shí)施例2～12
實(shí)施例2至12中的任一配方作為殺菌劑殺滅水霉病時(shí)，均具有明顯的增效作用和防治效果。
實(shí)施例13：
A、選擇實(shí)施例5制備的試劑進(jìn)行防治水霉病的應(yīng)用試驗(yàn)，檢驗(yàn)其防治效果；同時(shí)通過與鄰苯二甲醛、溴菌清單劑進(jìn)行效果對比，驗(yàn)證復(fù)配后的增效作用。
活性成分重量百分比為25％；對照單劑的重量百分比濃度根據(jù)實(shí)施例5及單劑EC50確定。
鄰苯二甲醛單劑重量百分比濃度＝實(shí)例5中鄰苯二甲醛重量百分比20％+實(shí)例5中溴菌清重量百分比5％×鄰苯二甲醛的EC50/溴菌清的EC50＝20％+5％×0.83/0.3＝33.8％；
溴菌清單劑重量百分比濃度＝實(shí)例5中鄰苯二甲醛重量百分比20％×溴菌清的EC50/鄰苯二甲醛的EC50+實(shí)例5中溴菌清重量百分比5％＝20％×0.3/0.83+5％＝12.2％。
上述單劑中的其余組分為常規(guī)助劑，最終重量百分比之和為100％。
B、選擇試驗(yàn)用草魚、鯽魚，均購自市場，規(guī)格為鯽魚：體重24—29g/尾、體長12—13cm；草魚：體重30—37g/尾、體長14—16cm/尾，體表和解剖觀察健康，暫養(yǎng)一周后試驗(yàn)。
水霉為常規(guī)水霉菌，按照本領(lǐng)域的常規(guī)方式進(jìn)行培養(yǎng)。
用玻璃水族箱(60×30×50cm)飼養(yǎng)，增氧器24h增氧；水源為經(jīng)曝氣、消毒和去氯處理后的自來水，pH值為6.5～6.8，平均水溫25℃，溶氧9～12mg/L，其它指標(biāo)符合漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。
C、草魚、鯽魚水霉病的人工感染：
挑取保藏于試管內(nèi)的水霉菌絲轉(zhuǎn)接于霉菌培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)96h使其鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿。取適量培養(yǎng)好的水霉用研缽研碎倒入用于感染的玻璃缸水中。將若干事先用水煮開裂的玉米粒放入該玻璃缸水體內(nèi)觀察72h，觀察到90％玉米粒有水霉生長，即判斷玻璃缸水體中有水霉存在，待用于感染試驗(yàn)。
感染魚的人工處理：用手術(shù)刀片將草魚、鯽魚背鰭下方兩側(cè)鱗片去掉，在肌肉處刮開1cm左右的小口，將刮傷后的草魚、鯽魚分別放入有水霉存在的玻璃缸中，每個(gè)感染缸放入10尾草魚或鯽魚。養(yǎng)殖水溫由25℃下降到18±1℃，進(jìn)行水霉病的人工感染。
C、草魚、鯽魚水霉病的預(yù)防試驗(yàn)
C1、潑灑方式用藥(試驗(yàn)魚長時(shí)間生活在含藥養(yǎng)殖水體中)預(yù)防水霉病
對實(shí)施例5及各單劑設(shè)置2個(gè)試驗(yàn)濃度：0.8mg/L、1.6mg/L，每個(gè)藥物濃度設(shè)三個(gè)平行組，同時(shí)設(shè)置三個(gè)空白平行組。每個(gè)組放養(yǎng)用于感染的草魚或鯽魚l0尾，觀察一周。
C2、浸泡方式用藥(對試驗(yàn)魚進(jìn)行短時(shí)間高濃度藥物浸泡后再轉(zhuǎn)入不含藥的養(yǎng)殖水體)預(yù)防水霉病
對實(shí)施例5及各單劑設(shè)置2個(gè)浸泡試驗(yàn)濃度：4mg/L、8mg/L，每次浸泡1h，每天浸泡兩次，每個(gè)藥物濃度設(shè)三個(gè)平行組，同時(shí)設(shè)置三個(gè)空白平行組。每組放養(yǎng)用于感染的草魚或鯽10尾，觀察一周。
D、草魚、鯽魚水霉病治療效果試驗(yàn)
D1、潑灑方式用藥治療水霉病
選取感染有水霉病的草魚、鯽魚分別進(jìn)行潑酒用藥治療試驗(yàn)。對實(shí)施例5及各單劑設(shè)置2個(gè)試驗(yàn)濃度：0.8mg/L、1.6mg/L，每個(gè)藥物濃度設(shè)三個(gè)平行組，同時(shí)設(shè)置三個(gè)空白平行組。每個(gè)組放養(yǎng)感染成功的草魚或鯽魚l0尾，觀察一周。
D2、選取感染有水霉病的草魚、鯽魚分別進(jìn)行藥物浸泡治療試驗(yàn)。對實(shí)施例5及各單劑設(shè)置2個(gè)試驗(yàn)濃度：4mg/L、8mg/L，每次浸泡1h，每天浸泡兩次。每個(gè)藥物濃度設(shè)三個(gè)平行組，同時(shí)設(shè)置三個(gè)空白平行組。每組放養(yǎng)感染成功的草魚或鯽10尾，觀察一周。
E、數(shù)據(jù)分析
根據(jù)農(nóng)業(yè)部《漁藥臨床實(shí)驗(yàn)技術(shù)規(guī)范》進(jìn)行藥效(保護(hù)率或治愈率)評價(jià)，保護(hù)率公式如下：
保護(hù)率＝(陽性對照組發(fā)病死亡數(shù)—試驗(yàn)藥物組發(fā)病死亡數(shù))/陽性對照組發(fā)病死亡數(shù)×100％。
表3：實(shí)施例5與各單劑潑灑方式用藥對草魚、鯽魚水霉病的預(yù)防效果
表4：實(shí)施例5與各單劑浸泡方式用藥對草魚、鯽魚水霉病的預(yù)防效果
表5：實(shí)施例5與各單劑潑灑方式用藥對草魚、鯽水霉病的治療效果
表6：實(shí)施例5與各單劑浸泡方式用藥對草魚、鯽水霉病的治療效果
從表3潑灑方式用藥的結(jié)果可看出，實(shí)施例5中制備的殺菌組合物在用藥濃度為0.8mg/L對草魚、鯽魚的水霉病平均保護(hù)率分別為93％、86.7％，對照單劑33.8％鄰苯二甲醛在用藥濃度為0.8mg/L對草魚、鯽魚的水霉病平均保護(hù)率分別為43.3％、36.7％，對照單劑12.2％溴菌清在用藥濃度為0.8mg/L對草魚、鯽魚的水霉病平均保護(hù)率分別為36.7％、33.3％。
從表4浸泡方式用藥的結(jié)果可看出，實(shí)施例5中制備的殺菌組合物在用藥濃度為4mg/L對草魚、鯽魚的水霉病平均保護(hù)率分別為100％、96.7％，對照單劑33.8％鄰苯二甲醛在用藥濃度為4mg/L對草魚、鯽魚的水霉病平均保護(hù)率分別為67.7％、60％，對照單劑12.2％溴菌清在用藥濃度為4mg/L對草魚、鯽魚的水霉病平均保護(hù)率分別為63.3％、53.3％。
從表5潑灑方式用藥的結(jié)果可看出，實(shí)施例5中制備的殺菌組合物在用藥濃度為0.8mg/L對草魚、鯽魚的水霉病平均治愈率分別為70％、63,3％，對照單劑33.8％鄰苯二甲醛在用藥濃度為0.8mg/L對草魚、鯽魚的水霉病平均治愈率分別為36.7％、33.3％，對照單劑12.2％溴菌清在用藥濃度為0.8mg/L對草魚、鯽魚的水霉病平均治愈率分別為33.3％、26.7％。
從表6浸泡方式用藥的結(jié)果可看出，實(shí)施例5中制備的殺菌組合物在用藥濃度為4mg/L對草魚、鯽魚的水霉病平均治愈率分別為86.7％、83.3％，對照單劑33.8％鄰苯二甲醛在用藥濃度為4mg/L對草魚、鯽魚的水霉病平均治愈率分別為43.3％、40％，對照單劑12.2％溴菌清在用藥濃度為4mg/L對草魚、鯽魚的水霉病平均治愈率分別為36.7％、33.3％。
綜合上述預(yù)防和治療試驗(yàn)結(jié)果表明：實(shí)施例5中制備的殺菌組合物無論是潑灑還是浸泡方式用藥對草魚、鯽魚的水霉病均有較好的預(yù)防和治療作用，與單劑鄰苯二甲醛和溴菌清(1,2-二溴-2,4-二氰基丁烷)的用藥效果比較，無論是潑灑還是浸泡用藥對草魚、鯽魚的水霉病的預(yù)防與治療都具有明顯的增效作用。
實(shí)施例14：
對車輪蟲等寄生原生動(dòng)物疾病防治效果的試驗(yàn)：試驗(yàn)藥物的制備同實(shí)施例5。
將普遍感染有車輪蟲的黃顙魚放入盛有池塘水的塑料桶中，然后加入不同濃度的實(shí)施例5中制備的殺菌組合物，分別在加藥后4h、8h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，顯微鏡下觀察魚鰓上的車輪蟲數(shù)量、死亡情況及活力并與空白組作對比來判斷藥物作用效果。
結(jié)果表明：試驗(yàn)8h結(jié)束時(shí)，該殺菌組合物在濃度0.2ppm時(shí)，對寄生車輪蟲的殺滅效果可達(dá)到62％；在濃度0.4ppm時(shí)，對寄生車輪蟲的殺滅效果可達(dá)到96％；通過在湖北、安徽等地大塘應(yīng)用試驗(yàn)，該殺菌組合物在濃度0.4ppm時(shí)，對車輪蟲等寄生原生動(dòng)物疾病的防治效果可達(dá)到90％。
實(shí)施例15：
安全性試驗(yàn)：
根據(jù)農(nóng)業(yè)部《漁藥臨床試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范》的要求和技術(shù)方法，選擇以上實(shí)施例5中制備的殺菌組合物進(jìn)行安全性試驗(yàn)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
安全性試驗(yàn)：選擇了草魚、白鰱、鯽魚、鳊魚、鯉魚、羅非魚、鱖魚、鱸魚、黃顙魚、鮰魚等目前主要養(yǎng)殖魚類作為受試魚，進(jìn)行一般毒性安全試驗(yàn)。在水體中投入實(shí)施例5中制備的殺菌組合物，當(dāng)水體中本產(chǎn)品的濃度在4ppm時(shí)(高于實(shí)施例5中制備的殺菌組合物實(shí)際大塘應(yīng)用濃度0.8ppm的5倍，48h內(nèi)受試魚活動(dòng)正常，沒有出現(xiàn)應(yīng)激現(xiàn)象(如抽搐、浮游等)，無中毒死亡現(xiàn)象發(fā)生，且不會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物細(xì)胞畸變，比較安全。
本發(fā)明不局限于上述實(shí)施方式，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本說明書中未作詳細(xì)描述的內(nèi)容屬于本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員公知的現(xiàn)有技術(shù)。