本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種治療食管癌的藥物組合物及用途。

背景技術(shù)：

食管癌(esophagealcarcinoma，ec)是人類(lèi)最常見(jiàn)的致死性腫瘤之一，我國(guó)是世界上食管癌發(fā)病率和病死率較高的國(guó)家之一，每年因食管癌死亡者約15萬(wàn)人。在我國(guó)，ec的病例組織學(xué)類(lèi)型主要是食管鱗狀細(xì)胞癌，大部分食管癌發(fā)現(xiàn)時(shí)都已進(jìn)入中晚期，其預(yù)后較差。浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移是其主要的致死性原因。癌細(xì)胞侵襲是腫瘤轉(zhuǎn)移的前奏，轉(zhuǎn)移是侵襲的繼續(xù)和結(jié)果。因此，抑制癌細(xì)胞的侵襲能一定程度上抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，尋求一種能夠抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的藥物已成為當(dāng)前抗腫瘤治療的關(guān)鍵。

順鉑[cis-dichlorodiammineplatinum(ii)，cddp]為重金屬絡(luò)合物，在臨床上廣泛用于多種惡性腫瘤的治療，是治療癌癥的首選藥物之一，屬周期非特異性抗癌藥，抗癌譜廣。順鉑殺傷腫瘤細(xì)胞的作用原理是：與dna交聯(lián)連接形成相當(dāng)穩(wěn)定的復(fù)合物鎖住dna，造成dna的損傷，破壞dna的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，從而抑制dna和rna的合成。已有研究指出，cddp具有一定的抑制癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力，但效果并不確切，且cddp的劑量與療效相關(guān)，劑量過(guò)低時(shí)影響療效，大劑量應(yīng)用ddp時(shí)，容易惡心、嘔吐、腹瀉等不良反應(yīng)，嚴(yán)重的可導(dǎo)致血尿、腎功能損傷、肝功能損害等，因此在臨床應(yīng)用上仍受到很大限制。如何進(jìn)一步提高順鉑的療效和抑制癌細(xì)胞侵襲能力同時(shí)降低順鉑的毒副作用無(wú)疑是目前臨床試驗(yàn)急待研究解決的問(wèn)題。

fty720是近幾年新開(kāi)發(fā)的一種免疫抑制劑，它是由中藥冬蟲(chóng)夏草提取物中具有免疫抑制作用的成分isp-i改造而成的。它作為sphk1和s1pr1的拮抗劑，已用于三期臨床試驗(yàn)，通過(guò)異位降解s1p作用阻斷s1p的信號(hào)傳導(dǎo)，從而阻斷stat3的持續(xù)激活發(fā)揮抗腫瘤作用。

目前，fty720和順鉑的聯(lián)合還未見(jiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種含有順鉑和fty720的治療食管癌的藥物組合物及其用途，組合用藥后使藥效產(chǎn)生了協(xié)同增效的作用，促進(jìn)了順鉑誘導(dǎo)的食管癌細(xì)胞的凋亡，并增強(qiáng)了順鉑抑制食管癌細(xì)胞侵襲的效果和降低了順鉑對(duì)人體的毒性。

本發(fā)明提供了一種治療食管癌的藥物組合物，包含有效量的fty720、順鉑以及藥學(xué)上可接受的載體，fty720cas號(hào)為162359-56-0。

進(jìn)一步地，所述藥物組合物中fty720和順鉑的質(zhì)量濃度比為(0.5～5)：1。

進(jìn)一步地，所述藥物組合物中fty720和順鉑的質(zhì)量濃度比為1.6：1。

進(jìn)一步地，可將本發(fā)明中所述藥物組合物按照本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)制備成注射制劑或口服制劑，本發(fā)明優(yōu)選將本發(fā)明中所述藥物組合物制備成注射制劑，所述注射制劑優(yōu)選為靜脈注射制劑。根據(jù)制劑形式，本發(fā)明所述fty720和順鉑在制劑中的含量可以以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)為0.01～10％，優(yōu)選為0.5～2％；制劑使用的輔料可采用本領(lǐng)域常規(guī)的輔料，以不和本發(fā)明藥物組合物發(fā)生反應(yīng)或不影響本發(fā)明藥物的療效為前提；制劑的制備方法可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的制備方法進(jìn)行制備。

本發(fā)明中的藥物組合物的給藥劑量根據(jù)給藥對(duì)象、給藥途徑或藥物的制劑形式不同可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兓?，但以保證該藥物組合物在哺乳動(dòng)物體內(nèi)能夠達(dá)到有效的血藥濃度為前提。

本發(fā)明另一個(gè)目的是提供上述藥物組合物在制備抑制食管癌細(xì)胞增殖、侵襲和促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡藥物或保健品中的用途。

進(jìn)一步地，所述述藥物組合物在制備抑制食管癌細(xì)胞增殖、侵襲和促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡藥物或保健品中的用途，所述的藥物或保健品抑制抗凋亡蛋白bcl-2的表達(dá)，增強(qiáng)促凋亡蛋白bax及凋亡指示蛋白c-parp的表達(dá)。

進(jìn)一步地，所述述藥物組合物在制備抑制食管癌細(xì)胞增殖、侵襲和促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡藥物或保健品中的用途，所述食管癌細(xì)胞為eca-109細(xì)胞、ec9706細(xì)胞、te-1細(xì)胞、kyse450細(xì)胞或kyse510細(xì)胞。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明藥物組合物具有以下優(yōu)勢(shì)：

1)本發(fā)明藥物組合物組分簡(jiǎn)單，毒性低，療效確切，符合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究理論。

2)在抗腫瘤作用和試驗(yàn)中，順鉑和fty720聯(lián)合用藥在eca-109，ec9706，te-1，kyse450，kyse510細(xì)胞中的q值分別為2.57，1.16，1.10，1.16，1.13，表明順鉑和fty720聯(lián)合用藥在抑制食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)中具有明顯的協(xié)同增效作用。

3)在食管癌細(xì)胞侵襲試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，順鉑和fty720共同處理的eca-109和ec-9706細(xì)胞的穿膜細(xì)胞顯著少于對(duì)照組及兩者的單獨(dú)用藥組。這表明，本發(fā)明藥物組合物能夠顯著增強(qiáng)順鉑抑制食管癌細(xì)胞的侵襲能力。

4)在食管癌細(xì)胞凋亡試驗(yàn)中，eca-109和ec9706細(xì)胞經(jīng)順鉑(0.5μg/ml)單獨(dú)用藥后的細(xì)胞凋亡率分別為46％和42％；eca-109和ec-9706細(xì)胞經(jīng)fty720(0.8μg/ml)單獨(dú)用藥后的細(xì)胞凋亡率分別為38％和6％；然而用上述用量的順鉑和fty720聯(lián)合處理eca-109和ec-9706細(xì)胞后的細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率分別上升至72％和53％。這表明，本發(fā)明藥物組合物能夠顯著引起食管癌細(xì)胞的凋亡，且與單獨(dú)用藥相比具有顯著差異。

4)在裸鼠食管癌皮下移植瘤效果試驗(yàn)中，本發(fā)明藥物組合物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，且能有效降低順鉑對(duì)整體動(dòng)物的毒副作用。

附圖說(shuō)明

圖1顯示了順鉑和fty720單獨(dú)用藥對(duì)食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；

圖2顯示了順鉑和fty720聯(lián)合作用對(duì)食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；

圖3顯示了順鉑和fty720聯(lián)合作用對(duì)食管癌細(xì)胞侵襲的影響；

圖4顯示了順鉑和fty720聯(lián)合作用對(duì)食管癌細(xì)胞凋亡的影響；

圖5顯示了順鉑和fty720聯(lián)合作用對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響；

圖6顯示了順鉑和fty720聯(lián)合作用對(duì)裸鼠食管癌移植瘤生長(zhǎng)的影響；

圖7顯示了順鉑和fty720聯(lián)合作用對(duì)食管癌裸鼠體重的影響；

圖8顯示了順鉑和fty720聯(lián)合作用對(duì)裸鼠食管癌移植瘤的病理特征及蛋白的影響。

具體實(shí)施方式：

以下通過(guò)具體實(shí)施方式的描述對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但這并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

實(shí)施例1、本發(fā)明藥物組合物的原料配方

組合物1：fty720和順鉑，fty720和順鉑的質(zhì)量濃度比為0.5:1。

組合物2：fty720和順鉑，fty720和順鉑的質(zhì)量濃度比為1.6:1。

組合物3：fty720和順鉑，fty720和順鉑的質(zhì)量濃度比為5:1。

實(shí)施例2、抗腫瘤作用及實(shí)驗(yàn)

研究1：順鉑和fty720單獨(dú)用藥對(duì)食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(圖1)

檢測(cè)兩種食管癌細(xì)胞eca-109，ec9706對(duì)順鉑和fty720單獨(dú)用藥的藥物敏感性。

1.1實(shí)驗(yàn)方法

將食管癌細(xì)胞eca-109、ec9706以每孔4000-6000個(gè)細(xì)胞的數(shù)量接種到96孔板，待細(xì)胞貼壁(24h)后，將順鉑和fty720藥物分別稀釋成一定的梯度濃度，每濃度設(shè)5復(fù)孔，分實(shí)驗(yàn)組及調(diào)零組加藥。48h后采用mtt法進(jìn)行細(xì)胞活力檢測(cè)，每孔加入10μlmtt溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸除孔內(nèi)液體，避免接觸孔內(nèi)結(jié)晶物，每孔加入100μl的dmso，于恒速搖床上避光搖晃。待結(jié)晶物充分溶解后，在酶標(biāo)儀上讀取od值(波長(zhǎng)570nm，參考波長(zhǎng)630nm)，測(cè)得吸光度a值。

生長(zhǎng)抑制率的計(jì)算公式為：生長(zhǎng)抑制率(％)＝(1－od實(shí)驗(yàn)組/od對(duì)照組)×100％。根據(jù)各濃度的抑制率可作圖得到劑量反應(yīng)曲線，作圖軟件為graphpad，采用logit法精確計(jì)算藥物的ic50(halfmaximalinhibitoryconcentration)值，具體結(jié)果見(jiàn)圖1。

從圖1可以看出，順鉑和fty720對(duì)食管癌細(xì)胞eca-109及ec-9706的ic50值都處在一個(gè)比較低的范圍內(nèi)，其中順鉑對(duì)六株食管癌細(xì)胞eca-109，ec9706，kyse140，kyse450，kyse510，te-1的ic50分別為0.6546，1.407，0.4237，2.719，0.8268，1.145μg/ml，而fty720的ic50分別為1.417，1.066，0.9783，0.9949，1.365，0.7146μg/ml。結(jié)果表明，順鉑和fty720對(duì)兩株食管癌細(xì)胞都具有良好的抑制增殖作用。

研究2：順鉑和fty720聯(lián)合用藥對(duì)食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響(圖2)

將人食管癌細(xì)胞eca-109和ec9706細(xì)胞以每孔4000-6000個(gè)細(xì)胞的數(shù)量接種到96孔板，待細(xì)胞貼壁后，加入0.5μg/ml濃度順鉑和0.8μg/mlfty720，培養(yǎng)48h后，每孔加入10μl濃度為5mg/ml的mtt溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后棄去培養(yǎng)液每孔加入100μl的dmso，于恒速搖床上避光搖晃。待結(jié)晶物充分溶解后，在酶標(biāo)儀上讀取od值(波長(zhǎng)570nm，參考波長(zhǎng)630nm)，讀取每孔的吸光值，計(jì)算兩藥合用后細(xì)胞存活率。

采用金氏修正式評(píng)價(jià)兩種藥物聯(lián)合用藥時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞的聯(lián)用效果，具體步驟為，計(jì)算出a藥在某種條件下對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率為ea，計(jì)算出b藥在某種條件下對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率為eb，再計(jì)算出兩者聯(lián)合給藥的抑制率為ec，通過(guò)以下公式計(jì)算聯(lián)合用藥指數(shù)q值，q＝ec/(eb+ea-eb*ea)，當(dāng)q值>1.15為協(xié)同效應(yīng)，0.85<q<1.15為相加效應(yīng)，q<0.85為拮抗效應(yīng)。通過(guò)上述聯(lián)合用藥指數(shù)的計(jì)算進(jìn)一步判斷兩種藥物聯(lián)合用藥的最終藥效。經(jīng)過(guò)計(jì)算順鉑和fty720聯(lián)合用藥在eca-109，ec9706，te-1，kyse450，kyse510細(xì)胞中的q值分別為2.57，1.16，1.10，1.16，1.13，這些表明0.5μg/ml濃度順鉑和0.8μg/mlfty720聯(lián)合用藥對(duì)抑制食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯的協(xié)同聯(lián)用效果(圖2)。

研究3：食管癌細(xì)胞侵襲試驗(yàn)(圖3)

實(shí)驗(yàn)前先從-20℃冰箱中取出matrigel基質(zhì)膠，置于4℃冰箱中過(guò)夜。首先將matrigel基質(zhì)膠稀釋至200ng/ml，加入4℃的1640培養(yǎng)液，將稀釋好的液化基質(zhì)膠鋪于transwell聚碳酸酯膜上，置于37℃恒溫箱中干燥6小時(shí)使其凝固形成基質(zhì)屏障膠。將準(zhǔn)備好的transwell聚碳酸酯膜此外光照射2h，使用前加入少量滅菌無(wú)血清的1640培養(yǎng)基水化transwell聚碳酸酯膜。將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的eca-109和ec9706細(xì)胞，pbs洗2次后，常規(guī)消化，離心并棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用pbs緩沖液輕輕漂洗細(xì)胞3次，將細(xì)胞重懸于用含bsa的無(wú)血清培養(yǎng)基中。調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至1×10⁵/ml，再于每個(gè)小室加入1ml細(xì)胞懸液，放置于配套的24孔板上，下室加入含10％fbs的培養(yǎng)基。放置于37℃、5％co2濃度的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24h。將下室培養(yǎng)基換成含藥培養(yǎng)基，分組如下：對(duì)照組、cddp組、fty720組及fty720+cddp組。48h后從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出transwell小室，將小室上室面的matrigel膠和細(xì)胞用棉簽擦盡，放入4％多聚甲醛中固定20min，用配制好的結(jié)晶紫染色20min，流水浸洗3次，在倒置顯微鏡下觀察染色的細(xì)胞，在200倍視野下計(jì)數(shù)取景框中移至下層微孔膜的細(xì)胞。(圖3)

顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)色穿膜細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，順鉑和fty720共同處理的eca-109和ec9706細(xì)胞的穿膜細(xì)胞顯著少于對(duì)照組及單獨(dú)用藥組，這說(shuō)明，順鉑和fty720用藥能顯著增強(qiáng)順鉑抑制食管癌細(xì)胞侵襲的能力。

研究4：順鉑和fty720聯(lián)合用藥對(duì)食管癌細(xì)胞凋亡的影響(圖4)

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)順鉑和fty720單獨(dú)使用及兩藥聯(lián)合后誘導(dǎo)eca-109和ec9706的細(xì)胞凋亡情況。將eca-109和ec-9706細(xì)胞分別以每孔2×10⁵個(gè)細(xì)胞的密度接種至6孔板。待細(xì)胞貼壁后，按研究3分組給藥。共同處理48h后，采用不加edta的胰酶消化收取細(xì)胞，加入10μlfitc染色液室溫避光反應(yīng)10min，后再加入5μlpi染色液室溫避光反應(yīng)10min，樣品隨后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

結(jié)果如圖4所示，eca-109和ec9706細(xì)胞經(jīng)順鉑(0.5μg/ml)單獨(dú)處理后的細(xì)胞凋亡率分別為46％和42％；eca-109和ec9706細(xì)胞經(jīng)fty720(0.8μg/ml)單獨(dú)處理后的細(xì)胞凋亡率分別為38％和6％；用上述用量的順鉑和fty720聯(lián)合處理eca-109和ec-9706細(xì)胞后的細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率分別上升至72％和53％。這些結(jié)果表明，順鉑和fty720的聯(lián)合使用可顯著引起食管癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

研究5：順鉑和fty720聯(lián)合用藥對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響(圖5)

利用westernblot方法檢測(cè)經(jīng)順鉑和fty720分別單獨(dú)用藥及聯(lián)合用藥后食管癌細(xì)胞eca-109和ec9706細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。先將eca-109和ec9706細(xì)胞分別以每孔2×10⁵個(gè)細(xì)胞的密度接種至6孔板。待細(xì)胞貼壁后，按研究2分組給藥。共同處理48h后，分別收取各組細(xì)胞全蛋白。先經(jīng)sds電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至pvdf膜上，5％脫脂奶粉室溫封閉1h，孵育所需檢測(cè)的蛋白相對(duì)應(yīng)的一抗，4℃孵育過(guò)夜。24h回收一抗，用tbst清洗3次，每次5min，之后孵育二抗，室溫孵育1h。后用tbst清洗3次，每次5min，之后ecl顯影。

結(jié)果如圖5所示，在eca-109和ec9706細(xì)胞中，當(dāng)用順鉑和fty720單獨(dú)及聯(lián)合用藥處理時(shí)，抗凋亡蛋白bcl-2的表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)，并且聯(lián)合組與各個(gè)單藥組相比表達(dá)具有明顯的差異；促凋亡蛋白bax及凋亡指示蛋白c-parp表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)，并且聯(lián)合用藥組與單藥組相比表達(dá)具有明顯的差異。這些凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，與流式細(xì)胞相一致，說(shuō)明順鉑和fty720聯(lián)合用藥能夠顯著引起食管癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

研究6：順鉑和fty720聯(lián)合用藥后對(duì)裸鼠食管癌皮下移植瘤的效果

用eca-109及ec-9706細(xì)胞通過(guò)皮下接種構(gòu)建裸鼠皮下成瘤模型，接種細(xì)胞量為5×10⁶個(gè)每只裸鼠，模型構(gòu)建成功之后，將小鼠分為四組，即對(duì)照組，順鉑單用組，fty720單用組，以及順鉑和fty720藥物聯(lián)合用藥組，并進(jìn)行給藥處理，對(duì)照組給藥方式為：腹腔注射；順鉑給藥方式為：腹腔注射；fty720的給藥方式為：腹腔注射；聯(lián)合用藥組的給藥方式為：腹腔注射。共給藥16天，觀察并記錄小鼠腫瘤的生長(zhǎng)情況，給藥結(jié)束后，處死小鼠，取小鼠皮下瘤組織進(jìn)行稱(chēng)重及免疫組化染色。

(1)結(jié)果如圖6所示，與對(duì)照組及單藥組相比，聯(lián)合用藥對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，聯(lián)合用藥組腫瘤生長(zhǎng)速度最慢，最終剝?nèi)〉哪[瘤體積最小，腫瘤重量最輕，并且在兩株食管癌細(xì)胞中都有同樣的效果。

(2)結(jié)果如圖7所示，聯(lián)合用藥對(duì)裸鼠體重減輕的影響，小于順鉑單獨(dú)使用組，表明fty720聯(lián)用后可降低順鉑對(duì)整體動(dòng)物的毒副作用。

(3)圖8為各組小鼠皮下瘤組織切片的he染色圖、pcna、sphk1、p-stat3、p-chk1及γ-h2ax染色圖。結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥明顯抑制了腫瘤增殖。通過(guò)下調(diào)sphk1、p-stat3表達(dá)，增強(qiáng)dna損傷蛋白γ-h2ax表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這是聯(lián)合用藥能夠產(chǎn)生協(xié)同作用的分子機(jī)制。