專利名稱：Wnt2在制備抑制食管癌的藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及Wnt2在制備抑制食管癌的藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
諸多證據(jù)已經(jīng)揭示出由非癌細(xì)胞和它們的間質(zhì)所組成的腫瘤微環(huán)境，在癌癥的發(fā)展和進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用。我們以前的研究已經(jīng)闡明了許多基因在食管癌成纖維細(xì)胞中，與它們相鄰的癌旁組織成纖維細(xì)胞相比，會(huì)發(fā)生下調(diào)表達(dá)。大約43% (126/292)的下調(diào)基因與細(xì)胞增殖，細(xì)胞外基質(zhì)重塑和免疫應(yīng)答有關(guān)。很顯然，Wnt通路中的若干成員，包括 WNT2, WNT5A, LEFl以及WISP1，在腫瘤成纖維細(xì)胞中上調(diào)，意味著Wnt信號(hào)通路在食管癌中可能能參與腫瘤與間質(zhì)之間的相互作用。Wnt2蛋白是分泌性配體蛋白(大小約為40KDa)，通過在靶細(xì)胞內(nèi)激活多種信號(hào)級聯(lián)反應(yīng)，發(fā)揮旁分泌的作用。Wnt信號(hào)通路主要分成三大支路。研究最透徹的是經(jīng)典通路， 它通過穩(wěn)定細(xì)胞核中的β-catenin，以此來激活靶基因。Wnt蛋白能夠通過激活鈣調(diào)蛋白激酶II和蛋白激酶C(被稱作Wnt/Ca2+通路)，以此來發(fā)揮傳導(dǎo)作用，它還能夠參與增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，或者Jun N-terminal激酶(被稱作平面細(xì)胞極性通路)，它能夠控制細(xì)胞骨架重排和細(xì)胞極性。經(jīng)典的Wnt通路在癌癥的發(fā)展中是最常見的Wnt信號(hào)通路。Wnt2 基因位于染色體7q31. 3位置上，，在胎兒肺中高表達(dá)，胎盤中低表達(dá)。Blasband et al.已經(jīng)證明了 Wnt2的高表達(dá)能夠通過β -catenin通路，促進(jìn)鼠細(xì)胞系C57MG的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化， 表現(xiàn)了 Wnt2的促癌功能。當(dāng)一些由間質(zhì)分泌的Wnt配體和由上皮表達(dá)的同源受體共同存在時(shí)，Wnt蛋白是介導(dǎo)腫瘤與間質(zhì)之間相互作用的良好中間體。我們以前的研究也已經(jīng)證實(shí)了 Wnt2是來源于原發(fā)性食管癌的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞高表達(dá)的WNT基因中的一員。但目前還沒有報(bào)道腫瘤成纖維細(xì)胞分泌的Wnt2在食管癌的腫瘤發(fā)展中的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用Wnt2能夠通過激活Wnt2/ β -catenin信號(hào)通路，對食管癌細(xì)胞發(fā)揮著促進(jìn)生長和侵襲的作用，而提供Wnt2基因在制備抑制食管癌的藥物的應(yīng)用，達(dá)到抑制腫瘤生長的治療作用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，采用如下的技術(shù)方案本發(fā)明提供了 Wnt2基因在制備抑制食管癌的藥物的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種抑制食管癌發(fā)生發(fā)展的藥物，所述藥物包含抑制Wnt2基因或/ 和Wnt2蛋白的作用的成分。所述成分包含能封閉Wnt2基因的多肽類物質(zhì)、能封閉Wnt2的抗體/配體、能阻抑或殺傷Wnt2的抗體/配體攜帶的殺傷性藥物或核酸物質(zhì)、能干擾/阻斷Wnt2基因的小干擾核糖核酸siRNA或miRNA或者shRNA中的一種或多種。本發(fā)明的有益效果是提供了 Wnt2基因在制備抑制食管癌的藥物的應(yīng)用，通過沉默或者抗體中和作用，阻斷WNT2激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)WNT信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而達(dá)到抑制腫瘤生長的治療作用。


圖1是用定量PCR(qPCR)比較10例食管癌腫瘤成纖維細(xì)胞和癌旁正常成纖維細(xì)胞之間的Wnt2表達(dá)水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖IA是WNT2的表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)分析；圖IB是Wnt2 蛋白在腫瘤成纖維細(xì)胞中與正常成纖維細(xì)胞表達(dá)量比較的免疫印跡圖；圖IC是在所有已試驗(yàn)的食管癌細(xì)胞系中檢測Wnt2蛋白的表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖2是應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測51例原發(fā)性食管癌標(biāo)本中Wnt2的表達(dá)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖2A是Wnt2表達(dá)陽性的細(xì)胞在原發(fā)性食管癌中的分布的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖 2B和2C是免疫熒光染色證明Wnt2和Vimentin在同一細(xì)胞中共同表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖3是應(yīng)用Log-rank檢驗(yàn)，比較Wnt2表達(dá)陰性的患者與Wnt2表達(dá)陽性的食管癌患者的生存時(shí)間結(jié)果分析圖；圖4是Wnt2條件培養(yǎng)基的建立及Wnt2對細(xì)胞生長的作用的相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖 4A為Wnt2條件培養(yǎng)基的建立的過程示意圖；圖4B為mRNA和蛋白質(zhì)水平證明Wnt2表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖4C是食管癌細(xì)胞系KYSE30在含有Wnt2的條件培養(yǎng)基及不含Wnt2的條件培養(yǎng)基中的生長速率比較圖；圖4D是食管癌細(xì)胞系EC109在含有Wnt2的條件培養(yǎng)基及不含Wnt2的條件培養(yǎng)基中的生長速率比較圖；圖5是KYSE30細(xì)胞β-catenin的核易位觀察相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖5A是KYSE30細(xì)胞β -catenin的核易位觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖5B是應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR方法研究β -catenin 的核易位能否上調(diào)下游靶基因的表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖5C是應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡方法檢測eyeIin Dl和c-myc的蛋白表達(dá)水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖6是EC109細(xì)胞β-catenin的核易位相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖6A是EC109細(xì)胞 β -catenin的核易位觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，圖6B是cyclin Dl和c-myc的蛋白質(zhì)表達(dá)水平檢測的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，圖6C是cyclin Dl和c-myc的mRNA表達(dá)水平檢測的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖7是細(xì)胞遷移和侵襲檢測相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖7A是有/無Wnt2時(shí)，食管癌細(xì)胞的動(dòng)運(yùn)遷移性比較結(jié)果圖；圖7B是每視野侵襲細(xì)胞數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖7C是有/無Wnt2時(shí)的蛋白表達(dá)量比較結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。除非另外指明，本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)將使用分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)和重組DNA的傳統(tǒng)技術(shù)，其屬于本領(lǐng)域技術(shù)范圍。除非另外說明，本發(fā)明中所用的術(shù)語均具有本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)理解的含義。實(shí)施例1 定量PCR(qPCR)用來比較10例食管癌腫瘤成纖維細(xì)胞和癌旁正常成纖維細(xì)胞之間的Wnt2表達(dá)水平本實(shí)施例中所用到的細(xì)胞系與原發(fā)性食管癌標(biāo)本的來源等情況如下所述兩株中國食管癌細(xì)胞系(EC18和EC109)由Tsao GS教授(香港大學(xué)解剖系)慷慨提供。五株日本食管癌細(xì)胞系(KYSE30, KYSE140, KYSE180, KYSE410, KYSE510)從 DSMZ (Braunschweig， Germany)，德國生物材料資源中心獲得。中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO-Kl)從美國Type Culture Collection (Manassas, VA)購買。原發(fā)性食管癌組織和它們相應(yīng)的癌旁食管組織在中山大學(xué)腫瘤防治中心，經(jīng)外科手術(shù)切除后立即收集?？偣?1例經(jīng)福爾馬林固定和石蠟包埋的食管癌組織由中山大學(xué)腫瘤防治中心慷慨提供。所有患者均未接受過術(shù)前治療。本次研究中所使用的臨床標(biāo)本已經(jīng)獲得中山大學(xué)研究倫理審核委員會(huì)的批準(zhǔn)。實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)和半定量RT-PCR的操作方法及條件如下用 Trizol(Invitrogen)試劑提取總RNA。按照制造商提供的標(biāo)準(zhǔn)說明，應(yīng)用Advantage RT-for-PCR 試劑盒(Clontech Laboratories, Inc. ,Mountain View, CA)合成 cDNA，總 RNA 用量為 2 μ g。AmpliTaq (Applied Biosystems, Foster City, CA)進(jìn)行半定量 RT-PCR。GAPDH 作為對照。對于qPCR應(yīng)用，使用SYBR Green PCR試劑盒(Applied Biosystems)擴(kuò)增cDNA 產(chǎn)物。擴(kuò)增反應(yīng)包括95°C孵育15秒，60°C 1分鐘，72°C 1分鐘，共40個(gè)循環(huán)反應(yīng)。應(yīng)用 ABI PRISM 7900HT序列檢測系統(tǒng)對反產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測。以CT法(Δ Δ CT法)計(jì)算基因的相對表達(dá)水平。管家基因GAPDH作為內(nèi)參照。免疫印跡分析的步驟和條件如下按照標(biāo)準(zhǔn)說明進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡，抗體分另Ij 為兔抗 Wnt2 (R&D Systems, Minneapolis, MN ；1 400)，兔抗 cyclin Dl, c-myc, α -catenin, β-catenin(Cell Signaling Technology ； 1 : 1000)禾口鼠抗 E-cadherin, α -SMA, Vimentin, β-actin(Santa Cruz Biotechnology ； 1 : 2000)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法如下應(yīng)用SPSS13. 0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以至少三次獨(dú)立平行實(shí)驗(yàn)的均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示。t檢驗(yàn)檢測不同數(shù)據(jù)的組間差異，應(yīng)用Fisher’ s精確檢驗(yàn)分析Wnt2的表達(dá)與臨床病理數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性。特殊疾病生存從診斷之日一直到與癌癥有關(guān)的死亡或者是最后隨訪日期。應(yīng)用Kaplan-Meier和 Log-rank檢驗(yàn)比較生存差異，以P < 0. 05判定顯著性差異。結(jié)果見圖1，圖1是用定量PCR(qPCR)比較10例食管癌腫瘤成纖維細(xì)胞和癌旁正常成纖維細(xì)胞之間的Wnt2表達(dá)水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖IA是WNT2的表達(dá)水平的統(tǒng)計(jì)分析， 結(jié)果表明統(tǒng)計(jì)分析WNT2的表達(dá)水平有顯著性差異(P <0.05，獨(dú)立student's t檢驗(yàn))，結(jié)果表明，Wnt2在腫瘤成纖維細(xì)胞中比正常成纖維細(xì)胞表達(dá)水平高4倍。圖IB是Wnt2蛋白在腫瘤成纖維細(xì)胞中與正常成纖維細(xì)胞表達(dá)量比較的免疫印跡圖；免疫印跡證明Wnt2蛋白在腫瘤成纖維細(xì)胞中比正常成纖維細(xì)胞表達(dá)量高。圖IC是在所有已試驗(yàn)的食管癌細(xì)胞系中檢測Wnt2蛋白的表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，該圖顯示，在所有已試驗(yàn)的食管癌細(xì)胞系中均未檢測到Wnt2蛋白的表達(dá)。實(shí)施例2 免疫組織化學(xué)方法檢測Wnt2表達(dá)陽性的細(xì)胞在原發(fā)性食管癌中的分布為了進(jìn)一步研究Wnt2 (+)細(xì)胞在食管癌中的分布，應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法來檢測51例原發(fā)性食管癌標(biāo)本中Wnt2的表達(dá)細(xì)胞。免疫組織化學(xué)的步驟如下使用標(biāo)準(zhǔn)的鏈霉親和素-生物素-過氧化酶方法進(jìn)行免疫組織化學(xué)。簡略地說，將石蠟包埋的食管癌組織標(biāo)本進(jìn)行脫蠟，10%的正常兔血清封閉10分鐘，兔抗人Wnt2多克隆抗體(MBL，1 150稀釋)4°C孵育過夜。玻片應(yīng)用生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白，按照1 100的濃度，37°C孵育30分鐘。三名事先并不知悉患者臨床病理數(shù)據(jù)的獨(dú)立研究員對胞漿分泌的Wnt2的染色狀態(tài)進(jìn)行評估。腫瘤組織的間質(zhì)部分能夠檢測到Wnt2的陽性表達(dá)，而且主要位于胞漿中。本次研究中，在20X放大倍數(shù)下，單個(gè)視野有5個(gè)或5個(gè)以上Wnt2表達(dá)陽性的細(xì)胞定義為
陽性結(jié)果。免疫熒光染色的步驟如下將細(xì)胞接種在事先預(yù)鋪有明膠的蓋玻片上，置于條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)若干個(gè)時(shí)間點(diǎn)，接著用4%的多聚甲醛室溫固定20分鐘。加入PBS-B溶液， 37°C封閉細(xì)胞30分鐘以去除非特異性染色，加入抗β-catenin鼠單抗隆抗體染色，4°C 孵育過夜。PBS洗滌若干次，按照最適濃度，加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗(eBioscience， San Diego，CA)，室溫孵育1小時(shí)。最后加入DAPI復(fù)染，置于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。對于免疫熒光雙染，石蠟包埋的食管癌組織同時(shí)用鼠抗Vimentin和兔抗Wnt2，37°C孵育過夜。簡單地洗滌后，玻片用FITC標(biāo)記的羊抗鼠(eBioscience)和Texas-red羊抗兔 (eBioscience) 二抗室溫孵育1小時(shí)。簡單地洗滌后，最后加入DAPI復(fù)染。結(jié)果見圖2，圖2是應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測51例原發(fā)性食管癌標(biāo)本中Wnt2 的表達(dá)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖2A是Wnt2表達(dá)陽性的細(xì)胞在原發(fā)性食管癌中的分布的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；由圖2A可見，Wnt2(+)細(xì)胞在癌旁組織中幾乎未檢測到，在51例食管癌組織標(biāo)本中，Wnt2 (+)細(xì)胞能夠在42例中檢測到，陽性率為82.4%。Wnt2 (+)細(xì)胞主要位于間質(zhì)與腫瘤組織之間的交界部分，癌巢之間的間質(zhì)，分散在腫瘤組織中。圖2B和2C是免疫熒光染色證明Wnt2和Vimentin在同一細(xì)胞中共同表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；其中，綠色=Vimentin ；紅 Wnt2，該圖顯示，表達(dá)Wnt2(+)細(xì)胞的是成纖維細(xì)胞(圖2B和C)。200倍的放大倍數(shù)下，5 個(gè)或5個(gè)以上Wnt2(+)細(xì)胞定義為食管癌組織Wnt2表達(dá)陽性。本次研究中，51例食管癌標(biāo)本可檢測到22例陽性結(jié)果，陽性率為43. 1%。實(shí)施例3 食管癌患者預(yù)后與Wnt2表達(dá)陽性之間的相關(guān)性本實(shí)施例進(jìn)行了 51例食管癌患者臨床病理特征與Wnt2陽性表達(dá)之間的相關(guān)性研究。結(jié)果顯示，食管癌患者Wnt2(+)與 !分期(P = 0. OOLFisher' s精確檢驗(yàn))和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P = 0. 001, Fisher' s精確檢驗(yàn))顯著相關(guān)；具體見表1，表1為51例食管癌標(biāo)本 Wnt2表達(dá)陽性與臨床病理特征之間的相關(guān)性分析數(shù)據(jù)。進(jìn)一步地分析，應(yīng)用Log-rank檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與Wnt2表達(dá)陰性的患者相比，Wnt2表達(dá)陽性的食管癌患者的生存時(shí)間縮短。(中位生存時(shí)間為51月；P < 0. 0001 ；)，結(jié)果分析圖見圖3，圖3是應(yīng)用Log-rank檢驗(yàn)，比較Wnt2 表達(dá)陰性的患者與Wnt2表達(dá)陽性的食管癌患者的生存時(shí)間結(jié)果分析圖。表 權(quán)利要求
1.Wnt2基因在制備抑制食管癌的藥物的應(yīng)用。
2.一種抑制食管癌發(fā)生發(fā)展的藥物，其特征在于，所述藥物包含抑制Wnt2基因或/和 Wnt2蛋白的作用的成分。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種抑制食管癌發(fā)生發(fā)展的藥物，其特征在于，所述成分包含能封閉Wnt2基因的多肽類物質(zhì)、能封閉Wnt2的抗體/配體、能阻抑或殺傷Wnt2的抗體 /配體攜帶的殺傷性藥物或核酸物質(zhì)、能干擾/阻斷Wnt2基因的小干擾核糖核酸siRNA或 miRNA或者shRNA中的一種或多種。
全文摘要
本發(fā)明提供了Wnt2基因在制備抑制食管癌的藥物的應(yīng)用，并提供了一種抑制食管癌發(fā)生發(fā)展的藥物，所述藥物包含抑制Wnt2基因或/和Wnt2蛋白的作用的成分。所述成分包含能封閉Wnt2基因的多肽類物質(zhì)、能封閉Wnt2的抗體/配體、能阻抑或殺傷Wnt2的抗體/配體攜帶的殺傷性藥物或核酸物質(zhì)、能干擾/阻斷Wnt2基因的小干擾核糖核酸siRNA或miRNA或者shRNA中的一種或多種。本發(fā)明的有益效果是提供了Wnt2基因在制備抑制食管癌的藥物的應(yīng)用，通過沉默或者抗體中和作用，阻斷WNT2激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)WNT信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而達(dá)到抑制腫瘤生長的治療作用。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102380099SQ20111016118
公開日2012年3月21日 申請日期2011年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月15日
發(fā)明者付利, 關(guān)新元, 張春玉, 李焱 申請人:中山大學(xué)腫瘤防治中心