專利名稱：丹皮酚在制備抗食管癌藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術領域，更具體地說是涉及丹皮酚在治療食管癌中的應用。
背景技術：
食管癌是發(fā)生于食管上皮組織的惡性腫瘤，占所有惡性腫瘤的2％。最新的統(tǒng)計表明，全世界每年新發(fā)病例近40萬，而死亡高達34萬例。我國是食管癌發(fā)病率最高的國家，占世界食管癌的50％以上，其死亡率排在所有腫瘤中的第4位。我省是食管癌的高發(fā)省份，據(jù)安徽省1990-1992年腫瘤死亡原因抽樣調(diào)查報告食管癌居我省腫瘤死亡原因的第二位，男性腫瘤死亡原因的首位。食管癌患者確診時至少80％的患者已發(fā)生局部侵犯或遠處轉(zhuǎn)移，無法手術根治。發(fā)病年齡多在40歲以上，男性多于女性，但近年來40歲以下患者有增長趨勢，日漸成為我省勞動力人口的主要殺手。
目前，手術仍然是治療食管癌的首要手段，但是食管癌切除術后3年生存率僅30％～35％，5年生存率不到20％。放療對于不宜手術的食管癌也是一種重要的治療方法。早期食管癌往往癥狀不明顯，許多病例一經(jīng)診斷，已屬晚期，預后很差，5年生存率不超過10％。確診時至少80％的患者已發(fā)生局部侵犯或遠處轉(zhuǎn)移，無法手術根治。尸檢表明，臨床出現(xiàn)癥狀時70％已經(jīng)有遠處轉(zhuǎn)移，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為73％～74.5％，其它臟器轉(zhuǎn)移為50％～75％。因而，單純手術、放療或手術+放療亦較難達到滿意的根治效果，主要失敗原因是遠處轉(zhuǎn)移和局部腫瘤未控制及復發(fā)。對于防止和治療全身轉(zhuǎn)移，化療是目前唯一確切有效的方法，因此化療已逐步成為食管癌綜合治療的重要組成部分。至于晚期食管癌，由于腫瘤組織以及伴隨的炎性水腫所造成的進食梗阻和局部疼痛，嚴重的影響患者的生存期和生活質(zhì)量，一般認為，姑息性化療可以明顯地改善患者的生活質(zhì)量，適當延長其生存時間。
目前，以順鉑(cisplatin，CDDP)為基礎的輔助化療是治療食管癌的重要手段，其有效率僅在50％左右，但是化療有較大的毒副作用，部分患者難以耐受。尤其是出現(xiàn)CDDP耐藥時尚無理想的化療藥物替代。因此積極尋找一種低毒的化療藥物成為當前亟需解決的問題。食管癌的化療主要采用以PDD為主的聯(lián)合化療，因此，針對我省食管癌發(fā)病率高、病期晚、手術不能根治的特點，積極尋找高效低毒的藥物是目前面臨的亟待解決的難題。
丹皮酚(Paeonol)又稱牡丹酚，是毛茛科植物牡丹Paeonia Suffruticosa Andr.根皮和蘿摩科植物徐長卿Pycnostelma Paniculatum(Bunge)K.Schum干燥根或全草的主要有效成分。丹皮酚是一種小分子的酚類化合物，呈白色針狀結(jié)晶，具有熔點低(mp51℃±1℃)、易揮發(fā)及水溶性差的特性，其分子量(Mr)為166.18，分子式為C9H10O3，化學結(jié)構(gòu)是
2-羥基-4-甲氧基苯乙酮 。丹皮酚具有抗鎮(zhèn)靜、催眠、解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌等藥理作用。現(xiàn)代研究表明，丹皮酚還具有一定的抗腫瘤活性，體外實驗發(fā)現(xiàn)它對多種腫瘤細胞株有增殖抑制作用，灌胃給藥有抗小鼠肝腫瘤作用。但迄今未見丹皮酚對食管癌的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為避免上述現(xiàn)有技術所存在的不足之處，提供一種毒副作用小，長期應用無不良反應，標本兼治的丹皮酚在制備抗食管癌藥物中的應用。
發(fā)明人經(jīng)系統(tǒng)研究得出如下結(jié)論丹皮酚在0.047～1.504mmol·L-1濃度下對人食管癌細胞Eca-109具有明顯的生長抑制作用，藥物濃度越高，抑制作用越強，具有明顯的濃度依賴關系(r0.964，P＜0.01)，IC50為0.342 mmol·L-1。表明丹皮酚在體外具有良好的抗腫瘤活性以及抗瘤譜廣的特點。丹皮酚50mg.kg-1劑量下連續(xù)灌胃14天，可抑制裸鼠移植人食管癌Eca-109的生長，其抑制率達到23.54％，隨著劑量的增加抗腫瘤作用增強。尤其是，一定劑量下的丹皮酚(100mg·kg-1)與順鉑(5mg·kg-1)聯(lián)合應用時抑瘤率高達77.91％，較丹皮酚、順鉑單獨應用的抑瘤率的差異有顯著性，提示丹皮酚與順鉑具有協(xié)同作用。實驗過程中各組均無裸鼠死亡。實驗結(jié)果提示丹皮酚在食管癌的治療上可能具有良好的應用前景。
本發(fā)明丹皮酚在制備抗食管癌藥物中的應用可以是丹皮酚與藥用載體組合而成藥用組合物，所制備成的劑型包括干混懸劑、散劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、軟膠囊劑、注射劑、注射用凍干粉、栓劑、滴丸劑、糖漿劑、口服溶液劑等藥學上可接受的劑型。
本發(fā)明丹皮酚與藥用載體組合成的藥用組合物制備成藥物制劑，其用量用法為每日用藥1～5次，每次用量以丹皮酚計為50～250mg。
本發(fā)明丹皮酚藥用組合物最佳的劑型是以甘露醇等為藥用載體的干混懸劑。
本發(fā)明丹皮酚藥用組合物制成抗食管癌的干混懸劑，其藥用載體包括甘露醇、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素鈉、卡伯姆、聚維酮、蔗糖、木糖醇等。
與已有技術相比，本發(fā)明有益效果體現(xiàn)在其藥物用于治療食管癌的毒副作用小，長期應用無不良反應，標本兼治。
以下動物試驗對本發(fā)明有益效果作進一步說明藥物和試劑丹皮酚注射液購自上海第一制藥廠(規(guī)格5mg·ml-1)。丹皮酚原料由安徽醫(yī)科大學臨床藥理研究所植化室提供；順鉑注射液南京制藥廠有限公司(規(guī)格1mg·ml-1)；
RPMI1640培養(yǎng)粉購于美國Gibco公司；噻唑藍購于美國Sigma公司。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記(TUNEL)試劑盒購自美國promega公司。
細胞株和實驗動物人食管癌細胞株Eca-109購自中科院上海細胞庫。BALB/c裸鼠6～8周齡，SPF級，雌雄兼用，安徽醫(yī)科大學動物中心提供。
統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)以

表示，組間顯著性檢驗采用方差分析。
1、丹皮酚在體外對人食管癌細胞Eca-109生長的抑制作用1.1實驗方法采用MTT法，設不同濃度的丹皮酚組、細胞對照組和空白對照組，取對數(shù)生長期的細胞(1～5)×107·L-1接種于96孔板上，每組設6個復孔，每孔接種100μl，置37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時，棄上清，丹皮酚組每孔分別加入200μl不同濃度的丹皮酚(Pae的終濃度為0.047、0.094、0.188、0.376、0.752、1.504mmol·L-1)；細胞對照組和空白對照組只加入等量培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h，在終止培養(yǎng)前4h丹皮酚組及對照組每孔加入20μlMTT(5g·L-1)，再培養(yǎng)4h后，小心吸棄上清，并加入150μl DMSO溶解MTT沉淀，用振蕩器混勻后，在酶標儀用490nm測定吸光值(A)，按下列公式求出生長抑制率。生長抑制率＝(1-用藥組A值/對照組A值)×100％。以藥物濃度為橫軸，抑制率作縱軸，繪出生長曲線。以藥物濃度的對數(shù)與抑制率進行直線回歸并求出IC50。
1.2實驗結(jié)果丹皮酚0.047～1.504mmol·L-1對人食管癌細胞Eca-109的生長有抑制作用，抑制率隨著藥物的濃度升高而升高，Pae 0.047、0.094、0.188、0.376、0.752、1.504mmol·L-1對Eca-109細胞的抑制率依次為5.44％、12.28％、27.99％、39.53％、84.41％、89.98％。以濃度的對數(shù)與抑制率進行直線相關分析Paer＝0.964，P＜0.0l。IC50為0.342mmol·L-1。見表1。
表l丹皮酚在體外對人食管癌細胞Eca-109生長的抑制作用

*P＜0.05，**P＜0.01與對照組比較(丹皮酚＝0)2、丹皮酚對裸鼠移植人食管癌細胞Eca-109的抑制作用2.1實驗方法2.1.1體內(nèi)抑瘤試驗取對數(shù)生長期的人食管癌細胞Eca-109制成細胞懸液，加入培養(yǎng)基制成細胞濃度約為1×107·ml-1，接種于每只裸鼠左側(cè)腋窩皮下，隨機將裸鼠隨機分成對照組，順鉑5mg·kg-1組，丹皮酚不同劑量組，丹皮酚100mg·kg-1+順鉑5mg·kg-1組。每組6只裸鼠，接種24h后丹皮酚灌胃給藥，每日1次，連用14天。順鉑腹腔注射，1周2次，共2周。實驗結(jié)束時處死裸鼠稱體重，剝離瘤體稱瘤重。按下列公式計算抑瘤率。抑瘤率＝(對照組瘤重-用藥組瘤重)/對照組瘤重×100％。
2.1.2兩藥聯(lián)合作用評價 采用兩藥相互作用指數(shù)(CDI)評價兩藥相互作用性質(zhì)，CDI＝AB/(A×B)。根據(jù)瘤重進行計算，AB為兩藥聯(lián)用組與對照組瘤重的比值；A或B是各藥物單獨使用組與對照組瘤重的比值。當CDI＜1時兩藥作用性質(zhì)為協(xié)同；當CDI＜0.7時，協(xié)同作用非常顯著。
2.1.3HE染色標本制備 4％甲醛固定新鮮腫瘤組織，常規(guī)脫水，石蠟包埋切片，脫蠟至水HE染色封片，光鏡高倍視野下觀察腫瘤細胞形態(tài)。
2.1.4透射電鏡樣品制備 取1mm3腫瘤組織，按常規(guī)法2.5％戊二醛前固定，再用1％的鋨酸后固定，脫水，包埋后70nm連續(xù)超薄切片，醋酸鉛鈾染色，日立H-800型透射電鏡觀察腫瘤細胞的超微結(jié)構(gòu)并攝片。
2.1.5原位細胞凋亡檢測 采用TdT(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶)介導的dUTP缺口末端標記法-TUNEL法。組織切片常規(guī)脫蠟至水，20μg·ml-1蛋白酶K消化30分鐘，室溫；100μl平衡緩沖液5～10分鐘；100μlTdT反應液作用60分鐘，37℃；0.3％過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性；鏈酶親和素-辣根過氧化物酶(SP-HRP)作用30分鐘，室溫；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片。實驗設加DNase I的為陽性對照，加不含TdT反應液的為陰性對照。普通光學顯微鏡選取5個高倍視野(×400)，計數(shù)其中凋亡細胞數(shù)，并算出凋亡細胞占腫瘤細胞的百分比值，即凋亡指數(shù)AI(apoptosis index)。
2.2實驗結(jié)果2.2.1丹皮酚對裸鼠移植人食管癌細胞Eca-109的抑制作用丹皮酚在25mg·kg-1劑量時對裸鼠移植Eca-109抑瘤率為10.67％，與對照組相比無顯著性差異。丹皮酚在50mg·kg-1，100mg·kg-1及200mg·kg-1劑量時對裸鼠移植Eca-109的抑瘤率分別為23.54％，27.91％和34.46％；順鉑5mg·kg-1組抑瘤率為58.71％；丹皮酚100mg·kg-1+順鉑5mg·kg-1組的抑瘤率分別為77.91％。此5組與對照組相比，P＜0.05。丹皮酚100mg·kg-1+順鉑5mg·kg-1組分別與順鉑5mg·kg-1組及丹皮酚100mg·kg-1相比有顯著性差異(P＜0.05)，且計算CDI＝0.74，提示兩藥合用具有協(xié)同作用。實驗過程中各組均無裸鼠死亡。見表2。
表2丹皮酚對裸鼠移植人食管癌細胞Eca-109的抑制作用

*P＜0.05與對照組比較；Δp＜0.05與丹皮酚+順鉑組比較2.2.2光鏡形態(tài)學觀察對照組腫瘤細胞生長旺盛，細胞密度高；丹皮酚不同劑量組、順鉑組以及兩藥聯(lián)合(丹皮酚100mg·kg-1+順鉑5mg·kg-1)作用細胞密度減少并可見較多凋亡細胞，表現(xiàn)為細胞體積縮小，核固縮、碎裂、深染，部分形成凋亡小體。
2.2.3透射電鏡形態(tài)學觀察電鏡下檢測用藥組腫瘤組織，可見較多凋亡的腫瘤細胞。電鏡下表現(xiàn)出明顯的凋亡形態(tài)學改變，癌細胞胞膜較完整，細胞器基本完好，細胞核染色質(zhì)濃縮邊聚、胞漿濃縮、核碎裂以及大量凋亡小體形成。
2.2.4TUNEL檢測細胞凋亡光鏡下見，凋亡細胞明顯固縮，核致密，為棕褐色，多葉狀或新月狀顆粒，常聚集在核周邊，非凋亡細胞的核呈藍色。對照組有少許細胞核深染為棕褐色的凋亡細胞，在丹皮酚不同劑量組，順鉑5mg·kg-1組以及丹皮酚100mg·kg-1+順鉑5mg·kg-1組，凋亡細胞明顯多于對照組(見圖3)。用藥組凋亡指數(shù)與對照組相比有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)。見表3。
表3對細胞凋亡指數(shù)的檢測(n＝5，

)

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group
具體實施例方式丹皮酚，包括與藥用載體組合為藥學上可接受的劑型，包括干混懸劑、散劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、軟膠囊劑、注射劑、注射用凍干粉、栓劑、滴丸劑、糖漿劑、口服溶液劑，在食管癌治療中進行應用。
其用量用法為每日用藥1～5次，每次用量以丹皮酚計為50～250mg。
具體可以按下述組分和方法制成各種藥物制劑，但本發(fā)明的保護范圍，不局限于此。
實施例1組分 量(mg/袋)丹皮酚-β-環(huán)糊精包合物1850(相當于丹皮酚150mg)甘露醇2800羧甲基纖維素鈉250微晶纖維素100制備方法(1)稱取丹皮酚1g，加入適量無水乙醇，水浴加熱使溶解；另稱取10倍量β-環(huán)糊精置三頸燒瓶中，在一定溫度下加水溶解制成飽和溶液；將丹皮酚無水乙醇液以2滴/min的速度緩慢滴加至β-環(huán)糊精飽和溶液中，待無水乙醇揮干后將三頸燒瓶密封。繼續(xù)水浴加熱并攪拌一段時間，取出，置冰箱內(nèi)冷藏24h析晶，過濾得包合物，用少量蒸餾水洗滌，置真空干燥箱中50℃以下干燥，得白色疏松狀包合物粉末，再用適量石油醚洗滌，揮去石油醚，制得丹皮酚-β-環(huán)糊精包合物；(2)在GMP凈化車間，將上述丹皮酚-β-環(huán)糊精包合物與輔料按比例混合后，分裝成每袋5g的干混懸劑。每袋干混懸劑含丹皮酚量為150mg，用水沖服，每次服用1袋，每日服用1-5次。
實施例2組分 量(mg/片)丹皮酚50甘露醇175交聯(lián)羧甲基纖維素鈉23硬脂酸鎂 2PVP K30乙醇液 適量制備方法在GMP凈化車間，將丹皮酚與上述輔料按比例混合后，依中國藥典2005年版一部制備片劑標準，制粒，用自動壓片機壓片，制成片劑，每粒片劑含含丹皮酚量為50mg，患者每次服用3片，每日服用1-5次。
實施例3組分量(mg/丸)丹皮酚 50植物油 200制備方法在GMP凈化車間，將丹皮酚與植物油混合，用膠體磨研勻；另配明膠液(明膠100份、甘油55份、水120份)，備用；用自動壓丸機制丸，制成軟膠囊劑，每丸含丹皮酚量為50mg，患者每次服用3丸，每日服用1-5次。
權(quán)利要求
1.丹皮酚在制備抗食管癌藥物中的應用。
全文摘要
丹皮酚在制備抗食管癌藥物中的應用，是以丹皮酚為活性成分，包括丹皮酚－β－環(huán)糊精包合物與藥用載體制備成干混懸劑、散劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑、軟膠囊劑、注射劑、注射用凍干粉、栓劑、滴丸劑、糖漿劑、口服溶液劑等藥學上可接受的劑型的應用。其藥物用于治療食管癌的毒副作用小，長期應用無不良反應，標本兼治。
文檔編號A61P35/00GK1935129SQ20061009665
公開日2007年3月28日 申請日期2006年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月14日
發(fā)明者孫國平, 桂雙英, 王 華 申請人:孫國平, 桂雙英, 王 華