本發(fā)明屬于化學醫(yī)藥領域，具體涉及抗HIV整合酶抑制劑德特格韋與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合使用，增強糖皮質(zhì)激素抗炎效應及治療急性呼吸窘迫綜合癥治療中糖皮質(zhì)激素長期使用導致的耐受。
背景技術：
：糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid，GC)是由腎上腺皮質(zhì)分泌的一類甾體激素。糖皮質(zhì)激素有快速、強大而非特異性的抗炎作用。對各種炎癥均有效。在炎癥初期，GC抑制毛細血管擴張，減輕滲出和水腫，又抑制白血細胞的浸潤和吞噬，而減輕炎癥癥狀。在炎癥后期，抑制毛細血管和纖維母細胞的增生，延緩肉芽組織的生成。而減輕疤痕和粘連等炎癥后遺癥。糖皮質(zhì)激素為治療急性呼吸窘迫綜合癥和哮喘的常用藥物，但在長期使用或者大劑量應用時，出現(xiàn)糖皮質(zhì)激素的療效下降的現(xiàn)象，稱為糖皮質(zhì)激素耐受。糖皮質(zhì)激素結(jié)合糖皮質(zhì)激素受體(GR)，活化的GR迅速轉(zhuǎn)位到細胞核內(nèi)，轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制減少基因的表達。轉(zhuǎn)錄激活的GR結(jié)合糖皮質(zhì)激素反應元件(GRE)，誘導抗炎靶基因的轉(zhuǎn)錄，如lipocortin-1的合成。糖皮質(zhì)激素治療建議不超過14天[SteinbergKB,HudsonLD,GoodmanRB,etal.Efficacyandsafetyofcorticosteroidsforpersistentacuterespiratorydistresssyndrome.NEnglJMed2006；354:1671-1684]，原因是大劑量糖皮質(zhì)激素長期使用導致糖皮質(zhì)激素耐受，即糖皮質(zhì)激素不能有效地與其受體糖皮質(zhì)激素受體α(GRα)有效結(jié)合，即細胞漿中GRα下降。GRα的轉(zhuǎn)錄活性則被抑制，不能抑制炎癥相關基因的轉(zhuǎn)錄，導致抗炎效果減弱、耐受。急性呼吸窘迫綜合征(acuterespiratorydistresssyndrome,ARDS)是指非心源性的各種肺內(nèi)外致病因素導致嚴重的急性缺氧性呼吸衰竭，臨床上以呼吸窘迫、頑固性低氧血癥和非心源性肺水腫為特征。ARDS肺部的最基本病理改變是肺血管內(nèi)皮和肺上皮急性彌漫性損傷及透明膜。ARDS發(fā)病危險因素既可來自肺的直接損傷，亦可來自間接損傷[TheARDSDefinitionTaskForce,RanieriVM,RubenfeldGD,ThompsonBT,FergusonND,CaldwellE,FanE,CamporotaL,SlutskyAS:AcuteRespiratoryDistressSyndrome:TheBerlinDefinition2012,307:2526–2533]。在美國，成人ARDS患者發(fā)病率為每年10萬人中有7人發(fā)病，雖然ARDS的管理有了重大進展，根據(jù)近3年的臨床研究顯示28天內(nèi)有20-40％死亡，另外，還有15-20％的患者在12個月內(nèi)死亡[Rosuvastatinforsepsis-associatedacuterespiratorydistresssyndrome.NEnglJMed2014；370:2191–200.；SweeneyRM,McAuleyDF.Acuterespiratorydistresssyndrome.Lancet.2016,388(10058):2416–2430.]。尋找與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合使用的藥物以改善糖皮質(zhì)激素的耐受很有必要。德特格韋(dolutegravir，)是美國FDA批準的整合酶抑制劑，劑量為50mg，每日1次，能快速抑制HIV復制，是HIV整合酶抑制劑，旨在與其他抗逆轉(zhuǎn)錄病毒制劑聯(lián)合用于既往已治療過、或初治HIV-1成人和12歲及以上體重至少40千克兒童感染者?？笻IV整合酶抑制劑德特格韋與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合使用，預防或治療糖皮質(zhì)激素長期使用導致的耐受的藥理作用未見報道。本發(fā)明人通過大量的研究發(fā)現(xiàn)抗HIV整合酶抑制劑德特格韋與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合使用，可以明顯抑制靶細胞細胞漿中GRα的下降，減少糖皮質(zhì)激素長期使用導致的耐受，增強ARDS治療中糖皮質(zhì)激素的抗炎效應?；诖?，本發(fā)明人發(fā)明了抗HIV整合酶抑制劑德特格韋與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合使用，減少糖皮質(zhì)激素長期使用導致的耐受，從而增強糖皮質(zhì)激素的療效，延長糖皮質(zhì)激素的使用。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了抗HIV整合酶抑制劑德特格韋與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合使用，治療急性呼吸窘迫綜合癥治療中糖皮質(zhì)激素長期使用導致的耐受，增強糖皮質(zhì)激素的抗炎作用的藥物中的應用。本發(fā)明提供的抗HIV整合酶抑制劑德特格韋與糖皮質(zhì)激素聯(lián)合使用，抑制在急性呼吸窘迫綜合癥治療中靶細胞細胞漿中GRα的下降治療糖皮質(zhì)激素長期使用導致的耐受。本發(fā)明提供的糖皮質(zhì)激素包括中效糖皮質(zhì)激素和長效糖皮質(zhì)激素。本發(fā)明提供的長效糖皮質(zhì)激素包括可以為地塞米松、丙酸氟替卡松。本發(fā)明提供的中效糖皮質(zhì)激素可以為甲潑尼龍琥珀酸鈉(甲強龍)，潑尼松龍本發(fā)明提供的中效糖皮質(zhì)激素優(yōu)選甲潑尼龍琥珀酸鈉(甲強龍)。本發(fā)明提供的德特格韋的使用劑量范圍是25mg～500mg。具體實施例實驗例1抗HIV整合酶抑制劑德特格韋對LPS刺激肺微血管內(nèi)皮細胞的GRα和磷酸化NF-κB的影響1.1藥品與試劑DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品，新生牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品LPS(Sigma公司產(chǎn)品，購買于大連美侖生物技術有限公司)德特格韋(純度99.5％，購買于上海翰香生物科技有限公司)GRα抗體(GlucocorticoidReceptor(D8H2)RabbitmAb，cellsignal公司，貨號：3660s)人肺微血管內(nèi)皮細胞(中科院細胞庫)甲強龍(注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉，輝瑞制藥生產(chǎn)，500mg/瓶)1.2實驗方法與結(jié)果當肺微血管內(nèi)皮細胞生長融合至70％-80％，換新鮮培養(yǎng)液，將傳代的人肺微血管內(nèi)皮細胞分組包括：(1)陰性對照組；(2)甲強龍?zhí)幚斫M(30μM作用時間96h)；(3)甲強龍?zhí)幚斫M(30μM作用時間96h)+德特格韋(1μM作用時間96h)；(4)甲強龍?zhí)幚斫M(30μM作用時間96h)+德特格韋(3μM作用時間96h)；(5)甲強龍?zhí)幚斫M(30μM作用時間96h)+德特格韋(10μM作用時間96h)；培養(yǎng)的細胞裂解，以總蛋白提取試劑及細胞核提取試劑提取總蛋白和細胞核組分，BCA蛋白測定試劑盒(Pierce公司)測定蛋白濃度后，取50μg樣品蛋白進行10％的十二烷基磺酸鈉2聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠變性電泳、然后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，分別加入GRα抗體，β-actin作內(nèi)參，Westernblot檢測細胞胞漿中GRα蛋白表達。以LPS未刺激組作為對照，計為相應蛋白的100％，分析抗HIV整合酶抑制劑+甲強龍與單純甲強龍?zhí)幚斫M對GRα蛋白的表達差異，組間進行T檢驗。表1德特格韋對LPS刺激肺微血管內(nèi)皮細胞的GRα的影響(n＝5)組別GRα(％)正常對照組100±13LPS刺激組23±5LPS+甲強龍組16±4*LPS+甲強龍+德特格韋1μM組28±5**##LPS+甲強龍+德特格韋3μM組51±6**##LPS+甲強龍+德特格韋10μM組57±8**##*，p<0.05，**，p<0.01，與LPS刺激比較；#，p<0.05，##，p<0.01，與LPS+甲強龍組比較實驗例2抗HIV整合酶抑制劑德特格韋對LPS導致的急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ARDS)模型大鼠的影響2.1藥品與試劑LPS(Sigma公司產(chǎn)品，購買于大連美侖生物技術有限公司)德特格韋(純度99.5％，購買于上海翰香生物科技有限公司)甲強龍(注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉，輝瑞制藥生產(chǎn)，500mg/瓶)GRα抗體(GlucocorticoidReceptor(D8H2)RabbitmAb，cellsignal公司，貨號：3660s)實驗動物：SPF級SpragueDawley大鼠，雄性，體重150g-200g，山東綠葉制藥股份有限公司實驗動物中心提供，動物合格證號為：SYXK(魯)20030020。2.2實驗方法與結(jié)果2.2.1內(nèi)毒素二次打擊ARDS大鼠模型制備、分組及給藥雄性大鼠70只，體重180-220g，取60只腹腔注射LPS2mg/kg，16小時后10％水合氯醛麻醉，分離氣管，氣管內(nèi)滴入LPS生理鹽水溶液，體積0.2mL/只，劑量：5mg/kg。隨機分為6組，即模型組、甲強龍肌肉注射20mg/kg組，甲強龍肌肉注射20mg/kg+德特格韋灌胃給藥2.5mg/kg組、甲強龍肌肉注射20mg/kg+德特格韋灌胃給藥10mg/kg組、甲強龍肌肉注射20mg/kg+德特格韋灌胃給藥25mg/kg組、甲強龍肌肉注射20mg/kg+德特格韋灌胃給藥50mg/kg組。另外10只大鼠作為對照組。氣管內(nèi)滴入LPS24小時開始給藥，連續(xù)給藥5天，每日給藥1次，末次給藥結(jié)束24小時，處死動物，取肺，稱重，測定肺系數(shù)，取一葉肺，HE染色制備病理片，進行病理評分，病理評分根據(jù)參考文獻[Matute-Bello,G.etal.AcuteLungInjuryinAnimalsStudyGroup.AnofficialAmericanThoracicSocietyworkshopreport:featuresandmeasurementsofexperimentalacutelunginjuryinanimals.AmJRespirCellMolBiol44,725-738(2011).]進行評分。比較德特格韋加甲強龍組與模型組及單純甲強龍組的差異。組間進行T檢驗。2.2.2實驗結(jié)果表2結(jié)果顯示甲強龍肌肉注射20mg/kg組可明顯減少ARDS模型大鼠的肺系數(shù)，降低肺病理評分(與模型組比較，p<0.05或p<0.01)；甲強龍肌肉注射20mg/kg+德特格韋灌胃給藥2.5mg/kg組、甲強龍肌肉注射20mg/kg+德特格韋灌胃給藥10mg/kg組、甲強龍肌肉注射20mg/kg+德特格韋灌胃給藥25mg/kg組、甲強龍肌肉注射20mg/kg+德特格韋灌胃給藥50mg/kg組明顯減少ARDS模型大鼠的肺系數(shù)，降低肺病理評分(與模型組比較，p<0.01)；與甲強龍肌肉注射20mg/kg組比較，甲強龍肌肉注射20mg/kg+德特格韋灌胃給藥2.5mg/kg組、甲強龍肌肉注射20mg/kg+德特格韋灌胃給藥10mg/kg組、甲強龍肌肉注射20mg/kg+德特格韋灌胃給藥25mg/kg組、甲強龍肌肉注射20mg/kg+德特格韋灌胃給藥50mg/kg組明顯減少ARDS模型大鼠的肺系數(shù)，降低肺病理評分(與甲強龍組比較，p<0.05或p<0.01)，說明德特格韋與甲強龍聯(lián)合使用，明顯增強甲強龍的抗ARDS作用。甲強龍肌肉注射20mg/kg+德特格韋灌胃給藥25mg/kg組減少ARDS模型大鼠的肺系數(shù)，降低肺病理評分與甲強龍肌肉注射20mg/kg+德特格韋灌胃給藥50mg/kg組比較，無顯著性差異。表2德特格韋對ARDS模型大鼠肺系數(shù)和肺病理的影響(n＝10)組別肺系數(shù)肺病理評分對照組0.49±0.04---模型組1.04±0.080.83±0.07甲強龍組0.91±0.06*0.73±0.05*甲強龍+德特格韋2.5mg/kg組0.77±0.08**#0.61±0.06**#甲強龍+德特格韋10mg/kg組0.71±0.09**##0.53±0.11**##甲強龍+德特格韋25mg/kg組0.65±0.08**##0.38±0.08**##甲強龍+德特格韋50mg/kg組0.64±0.08**##0.37±0.07**##*，p<0.05，**，p<0.01，與模型組比較；#，p<0.05，##，p<0.01，與甲強龍組比較。當前第1頁1 2 3