本發(fā)明屬于抗凝血材料技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種抗凝血材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)每年心腦血管疾病死亡人數(shù)有數(shù)百萬(wàn)，并在逐年增加，因此，血液接觸材料是目前臨床上最為緊缺的生物材料(醫(yī)療器械)，尤其是人工血管移植，即便是得到臨床應(yīng)用的中、大口徑人工血管，在我國(guó)產(chǎn)品也非常稀少，國(guó)產(chǎn)產(chǎn)品每年的使用比例只有20％左右，而小口徑人工血管的移植還是臨床空白，其最大的問(wèn)題就是容易形成血栓，遠(yuǎn)期通暢率較差。
目前醫(yī)學(xué)上應(yīng)用的人工血管產(chǎn)品主要是由滌綸、膨體聚四氟乙烯等合成材料制成的，在大中口徑人工血管方面有臨床應(yīng)用，但這些合成材料細(xì)胞相容性差，不利于內(nèi)皮化，容易形成血栓，影響組織愈合。家蠶蠶絲是由家蠶合成與分泌的天然動(dòng)物蛋白，來(lái)源廣泛，其絲素蛋白具有良好的生物相容性，由20種人體可吸收的氨基酸組成，最終降解產(chǎn)物為氨基酸或小肽，易被細(xì)胞吸收或吞噬，不會(huì)引起明顯的免疫反應(yīng)。已有大量的文獻(xiàn)研究表明絲素蛋白材料能夠支持多種細(xì)胞的生長(zhǎng)，在組織工程材料研究方面越來(lái)越深入，并取得了突破性的進(jìn)展，近來(lái)，應(yīng)用于血管組織工程上也越來(lái)越受到關(guān)注。
雖然絲素蛋白材料本身具有細(xì)胞相容性和組織相容性的優(yōu)勢(shì)，但作為外源材料，在與血液接觸時(shí)都會(huì)刺激凝血系統(tǒng)，誘發(fā)溶血或凝血。為了提高絲素材料的抗凝血性能，國(guó)內(nèi)外一些研究人員也關(guān)注到了改善絲素蛋白材料的抗凝血性能研究。
目前，對(duì)絲素蛋白的抗凝血改性主要報(bào)導(dǎo)了接枝具有抗凝作用的高分子及硫酸化或肝素化方法。如She等將肝素在溫和的條件下加入絲素/殼聚糖支架中，增強(qiáng)了抗凝性(Polymer International,2010,59(1):55-61)；Liu等利用靜電紡絲技術(shù)將氯磺酸處理過(guò)的絲素蛋白制成絲素納米支架，硫酸化納米絲素支架的抗凝血性顯著增強(qiáng)(Biomaterials,2011,32(15):3784-3793)；Wang等利用靜電紡絲技術(shù)制備了肝素改性絲素納米材料，體外凝血測(cè)試結(jié)果表明改性后絲素納米材料的抗凝血性遠(yuǎn)高于純絲素(International Journal of Biological Macromolecules，2011，48(2):345-353)；用氯磺酸制備的硫酸化絲素蛋白的抗凝血活性要比硫酸制備的硫酸化絲素大大提高(Biomaterials,2004,25(3)：377-383)，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及肝素。肝素改性絲素蛋白材料抗凝血性研究已存在知識(shí)產(chǎn)權(quán)(如抗凝血真皮支架的制備，申請(qǐng)?zhí)枮镃N200910223207.4的中國(guó)專(zhuān)利；納米纖維人工血管及制備方法，申請(qǐng)?zhí)枮镃N200910228843.6的中國(guó)專(zhuān)利)，所以引入肝素是目前絲素材料抗凝血性改性的主要方法，但肝素屬于一種凝血酶間接抑制劑，抗凝作用要依賴(lài)抗凝血酶和特定的輔因子，所以即使材料中共混或鍵合的肝素不一定能或都能發(fā)揮抗凝作用。
水蛭素是一種凝血酶特異性抑制劑，可以直接抑制血栓形成，還可以對(duì)已形成的血栓有一定的溶栓作用。我們已經(jīng)研究開(kāi)發(fā)了一種水蛭素/絲素蛋白抗凝血材料(一種抗凝血絲素材料及其制備方法，申請(qǐng)?zhí)枮閆L201310250951.X的中國(guó)專(zhuān)利；一種抗凝血絲素膜及其制備方法，申請(qǐng)?zhí)枮閆L201310251819.0的中國(guó)專(zhuān)利；Journal of Biomedical Materials Research Part B,2015:103B:556–562)，但深入研究發(fā)現(xiàn)，將研究結(jié)果與水蛭素抑制凝血酶活性的機(jī)理結(jié)合起來(lái)分析，采用共價(jià)鍵結(jié)合的改性方法會(huì)降低水蛭素的活性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種抗凝血材料及其制備方法，該方法制備的抗凝血材料可抑制凝血酶活性、持續(xù)具有抗凝血功能。
本發(fā)明提供了一種抗凝血材料的制備方法，包括以下步驟：
S1)將絲素蛋白溶液、聚乙二醇二胺與交聯(lián)劑混合，反應(yīng)后，得到聚乙二醇二胺陽(yáng)離子化的絲素蛋白材料；
S2)將所述聚乙二醇陽(yáng)離子化的絲素蛋白材料用水浸泡，得到浸泡后的陽(yáng)離子化絲素蛋白材料；
S3)將所述浸泡后的陽(yáng)離子化絲素蛋白材料浸漬于水蛭素溶液中，得到抗凝血材料。
優(yōu)選的，所述絲素蛋白溶液的質(zhì)量濃度為3％～20％。
優(yōu)選的，所述聚乙二醇二胺的質(zhì)量與絲素蛋白溶液中絲素蛋白的質(zhì)量比為A，0＜A≤0.5。
優(yōu)選的，所述交聯(lián)劑選自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺、2-嗎啉乙磺酸、碳化二亞胺、京尼平與聚乙二醇甘油醚中的一種或多種。
優(yōu)選的，所述交聯(lián)劑的質(zhì)量為絲素蛋白溶液中絲素蛋白質(zhì)量的B％，B≥20。
優(yōu)選的，所述步驟S1)中反應(yīng)的時(shí)間為10～30min。
優(yōu)選的，所述步驟S2)具體為：
將所述聚乙二醇陽(yáng)離子化的絲素蛋白材料用水浸泡，每隔2～4h更換浸泡所用的水，浸泡1～3天后，得到浸泡后的陽(yáng)離子化絲素蛋白材料。
優(yōu)選的，所述水蛭素溶液中水蛭素的濃度為C U/ml，0＜C≤500。
優(yōu)選的，所述步驟S3)中浸漬的時(shí)間為2～10h。
本發(fā)明還提供了一種抗凝血材料，包括經(jīng)聚乙二醇二胺陽(yáng)離子化的絲素蛋白與水蛭素。
本發(fā)明提供了一種抗凝血材料的制備方法，包括以下步驟：S1)將絲素蛋白溶液、聚乙二醇二胺與交聯(lián)劑混合，反應(yīng)后，得到聚乙二醇二胺陽(yáng)離子化的絲素蛋白材料；S2)將所述聚乙二醇陽(yáng)離子化的絲素蛋白材料用水浸泡，得到浸泡后的陽(yáng)離子化絲素蛋白材料；S3)將將所述浸泡后的陽(yáng)離子化絲素蛋白材料浸漬于水蛭素溶液中，得到抗凝血材料。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的制備方法保護(hù)了與凝血酶結(jié)合區(qū)域的官能團(tuán)(-COOH、-NH2、-OH)不因被反應(yīng)而影響與凝血酶結(jié)合的結(jié)構(gòu)域、又能使水蛭素以較強(qiáng)結(jié)合力的離子鍵結(jié)合于聚乙二醇雙胺陽(yáng)離子化的絲素蛋白上，達(dá)到穩(wěn)定發(fā)揮抗凝的作用，從而使得到的抗凝血材料具有顯著抑制凝血酶活性的功能，尤其可應(yīng)用于防止如人工血管的新生內(nèi)膜增生和術(shù)后血栓的形成。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
本發(fā)明提供了一種絲素蛋白抗凝血材料，包括經(jīng)聚乙二醇二胺與交聯(lián)劑陽(yáng)離子化的絲素蛋白與水蛭素。
其中，所述聚乙二醇二胺與絲素蛋白的質(zhì)量比優(yōu)選為A，0＜A≤0.5，更優(yōu)選為0.01～0.5，再優(yōu)選為0.01～0.2，最優(yōu)選為0.05～0.1；在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，所述聚乙二醇二胺與絲素蛋白的質(zhì)量比優(yōu)選為0.005；在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，所述聚乙二醇二胺與絲素蛋白的質(zhì)量比優(yōu)選為0.05；在本發(fā)明提供的另一些實(shí)施例中，所述聚乙二醇二胺與絲素蛋白的質(zhì)量比優(yōu)選為0.1。
所述交聯(lián)劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的交聯(lián)劑即可，并無(wú)特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選為-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺、2-嗎啉乙磺酸、碳化二亞胺、京尼平與聚乙二醇甘油醚中的一種或多種；所述交聯(lián)劑的質(zhì)量?jī)?yōu)選為絲素蛋白質(zhì)量的B％，B≥20，更優(yōu)選為20％～50％。
本發(fā)明還提供了一種上述絲素蛋白抗凝血材料的制備方法，包括以下步驟：S1)將絲素蛋白溶液、聚乙二醇二胺與交聯(lián)劑混合，反應(yīng)后，得到聚乙二醇二胺陽(yáng)離子化的絲素蛋白材料；S2)將所述聚乙二醇陽(yáng)離子化的絲素蛋白材料用水浸泡，得到浸泡后的陽(yáng)離子化絲素蛋白材料；S3)將所述浸泡后的陽(yáng)離子化絲素蛋白材料浸漬于水蛭素溶液中，得到絲素蛋白抗凝血材料。
本發(fā)明對(duì)所有原料的來(lái)源并沒(méi)有特殊的限制，為市售或自制均可。
其中，所述絲素蛋白溶液中絲素蛋白的質(zhì)量濃度優(yōu)選為3％～20％；所述絲素蛋白為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的絲素蛋白即可，并無(wú)特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選為家蠶絲素蛋白；所述絲素蛋白溶液優(yōu)選按照以下方法制備：將蠶絲或蠶殼進(jìn)行脫膠、溶解后，灌注于透析袋內(nèi)，用去離子水透析，得到絲素蛋白溶液。
其中，所述脫膠的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法即可，并無(wú)特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選將蠶絲或蠶殼在碳酸鈉水溶液中加熱處理，水洗，拉松后，得到脫膠的絲素纖維；所述碳酸鈉水溶液為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的水溶液即可，并無(wú)特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選為濃度0.1％～1％的碳酸鈉水溶液，更優(yōu)選為0.1％～0.5％，再優(yōu)選為0.2％～0.3％；所述蠶絲或蠶殼與碳酸鈉水溶液的比例優(yōu)選為(0.1～10)g：50ml，更優(yōu)選為(0.5～5)g：50ml，再優(yōu)選為(0.5～2)g：50ml，最優(yōu)選為1g：50ml；所述加熱處理的溫度優(yōu)選為98℃～100℃；所述加熱處理的時(shí)間優(yōu)選為20～40min；所述加熱處理的次數(shù)優(yōu)選為2～4次。
將脫膠的絲素纖維溶解，得到絲素溶解液；所述溶解的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法即可，并無(wú)特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選為將脫膠的絲素纖維與于氯化鈣-乙醇的水溶液混合，加熱溶解后，得到絲素溶解液；所述脫膠的絲素纖維與氯化鈣-乙醇的水溶液的比例優(yōu)選為(0.1～5)g：10ml，更優(yōu)選為(0.5～3)g：10ml，再優(yōu)選為(1～2)g：10ml；所述氯化鈣與乙醇的摩爾比優(yōu)選為1：2；所述加熱溶解的溫度優(yōu)選為60℃～80℃，更優(yōu)選為65℃～75℃，最優(yōu)選為70℃；所述加熱溶解的時(shí)間優(yōu)選為1～3h，更優(yōu)選為2～3h。
將絲素溶解液灌注于透析袋內(nèi)，用去離子水透析，得到絲素蛋白溶液；所述透析袋為半透膜，其截留分子量?jī)?yōu)選為12.0～16.0kDa；透析時(shí)優(yōu)選每隔1～3h，更優(yōu)選每隔2h用新的去離子水或純凈水更換透析所用的去離子水；所述透析的時(shí)間優(yōu)選為3天。
將絲素蛋白溶液、聚乙二醇二胺與交聯(lián)劑混合，優(yōu)選先將絲素蛋白溶液與聚乙二醇二胺混合后，再加入交聯(lián)劑；所述聚乙二醇二胺的質(zhì)量與絲素蛋白溶液中絲素蛋白的質(zhì)量比優(yōu)選為A，0＜A≤0.5，更優(yōu)選為0.01～0.5，再優(yōu)選為0.01～0.2，最優(yōu)選為0.05～0.1；所述交聯(lián)劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的交聯(lián)劑即可，并無(wú)特殊的限制，本發(fā)明中優(yōu)選為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺、2-嗎啉乙磺酸、碳化二亞胺、京尼平與聚乙二醇甘油醚中的一種或多種，更優(yōu)選為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺與2-嗎啉乙磺酸；所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺與2-嗎啉乙磺酸的質(zhì)量比優(yōu)選為2:1:2；所述交聯(lián)劑的質(zhì)量?jī)?yōu)選為絲素蛋白溶液中絲素蛋白質(zhì)量的B％，B≥20，更優(yōu)選為20％～50％。
然后進(jìn)行反應(yīng)；所述反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選為10min～1h，更優(yōu)選為15～45min，再優(yōu)選為20min。
反應(yīng)后，優(yōu)選進(jìn)行干燥，得到聚乙二醇二胺陽(yáng)離子化的絲素蛋白材料；所述干燥可為加熱干燥，也可為冷凍干燥；干燥時(shí)優(yōu)選將聚乙二醇二胺陽(yáng)離子化的絲素蛋白溶液倒入平板內(nèi)，再進(jìn)行加熱干燥或冷凍干燥；所述平板優(yōu)選為聚苯乙烯板；所述加熱干燥的溫度優(yōu)選為50℃～70℃。
將所述聚乙二醇二胺陽(yáng)離子化的絲素蛋白材料用水浸泡；所述水優(yōu)選為去離子水；所述浸泡的時(shí)間優(yōu)選為1～3天，更優(yōu)選2～3天，再優(yōu)選為2天；在浸泡時(shí)，優(yōu)選每隔2～4h更換浸泡所用的水；浸泡后，優(yōu)選取出風(fēng)干或凍干后，得到浸泡后的陽(yáng)離子化絲素蛋白材料。
將所述浸泡后的陽(yáng)離子化絲素蛋白材料浸漬于水蛭素溶液中；所述水蛭素溶液中水蛭素的濃度優(yōu)選為C U/ml，0＜C≤500，更優(yōu)選為5～500U/ml，再優(yōu)選為5～300U/ml，再優(yōu)選為5～200U/ml，再優(yōu)選為5～100U/ml，再優(yōu)選為5～50U/ml，最優(yōu)選為5～20U/ml；所述浸泡后的陽(yáng)離子化絲素蛋白材料與水蛭素溶液的比例優(yōu)選為每毫克材料1～10ml水蛭素溶液，更優(yōu)選為每毫克材料1～8ml水蛭素溶液，再優(yōu)選為每毫克材料1～5ml水蛭素溶液，再優(yōu)選為每毫克材料2～5ml水蛭素溶液，最優(yōu)選為每毫克材料3ml水蛭素溶液；所述浸漬的時(shí)間優(yōu)選為2～10h，更優(yōu)選2～8h，再優(yōu)選為4～6h，最優(yōu)選為5h。
浸漬后，優(yōu)選取出風(fēng)干，再用緩沖液沖洗，風(fēng)干后，得到抗凝血材料；所述緩沖液優(yōu)選為磷酸鹽緩沖液(PBS)；所述沖洗的次數(shù)優(yōu)選為3～4次。
本發(fā)明提供的制備方法保護(hù)了與凝血酶結(jié)合區(qū)域的官能團(tuán)(-COOH、-NH2、-OH)不因被反應(yīng)而影響與凝血酶結(jié)合的結(jié)構(gòu)域、又能使水蛭素以較強(qiáng)結(jié)合力的離子鍵結(jié)合于聚乙二醇雙胺陽(yáng)離子化的絲素蛋白上，達(dá)到穩(wěn)定發(fā)揮抗凝的作用，從而使得到的抗凝血材料具有顯著抑制凝血酶活性的功能，尤其可應(yīng)用于防止如人工血管的新生內(nèi)膜增生和術(shù)后血栓的形成。
為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的一種抗凝血材料及其制備方法進(jìn)行詳細(xì)描述。
以下實(shí)施例中所用的試劑均為市售。
實(shí)施例1
1.1將家蠶生絲或烘干分層的繭殼按1:50(g/mL)的浴比放入濃度為0.2％的碳酸鈉水溶液中，于98℃～100℃處理三次，每次處理30分鐘，然后用去離子水將絲充分清洗干凈，拉松，置于60℃烘箱內(nèi)干燥，得到脫膠后的家蠶絲素纖維。
1.2稱(chēng)取脫膠后的家蠶絲素按1:10(g/mL)的浴比溶解于摩爾比1:2的氯化鈣-乙醇的水溶液(乙醇與水的摩爾比1:4)中，70℃溶解2小時(shí)得家蠶絲素溶解液。
1.3將家蠶絲素溶解液灌注于透析袋內(nèi)，透析袋壁是半透膜，截留分子量為12.0～16.0kDa范圍，將灌注了家蠶絲素溶解液的透析袋置于盛有去離子水的容器內(nèi)，每隔2小時(shí)用新的去離子水或純水更換容器內(nèi)的水，持續(xù)透析3天，得到純化后的家蠶絲素蛋白水溶液。調(diào)整透析后的絲素蛋白溶液濃度為4％。
1.4按質(zhì)量比100:5配置絲素蛋白與聚乙二醇雙胺的混合溶液、攪拌均勻，向上述混合溶液中添加質(zhì)量比為絲素蛋白20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺攪拌均勻、10％的N-羥基琥珀酰亞胺和20％的2-嗎啉乙磺酸，攪拌10分鐘后倒入一平整的聚苯乙烯平皿中60℃烘干，得到聚乙二醇二胺陽(yáng)離子化的絲素蛋白材料。
1.5將聚乙二醇二胺陽(yáng)離子化的絲素蛋白材料放入盛有去離子水的容器內(nèi)浸泡2天，每隔2～4小時(shí)更換一次容器內(nèi)的去離子水，2天后取出風(fēng)干，得到浸泡后的陽(yáng)離子化絲素蛋白材料。
1.6將浸泡后的陽(yáng)離子化絲素蛋白材料剪成一定質(zhì)量的小片，按照每毫克材料3ml水蛭素溶液的比例浸漬于10U/mL的水蛭素溶液，5h后取出靜置風(fēng)干后用PBS沖洗3～4次，最后風(fēng)干，得到抗凝血材料。
將實(shí)施例1中得到的抗凝血材料進(jìn)行抗凝血酶活性測(cè)試，檢測(cè)450nm處凝血酶活性的吸光度值為純凝血酶活性的吸光度值的50％，即實(shí)施例1得到的抗凝血材料能夠明顯地抑制凝血酶的活性，說(shuō)明水蛭素牢固地結(jié)合于絲素蛋白材料上了。
實(shí)施例2
2.1將家蠶生絲或烘干分層的繭殼按1:50(g/mL)的浴比放入濃度為0.2％的碳酸鈉水溶液中，于98℃～100℃處理三次，每次處理30分鐘，然后用去離子水將絲充分清洗干凈，拉松，置于60℃烘箱內(nèi)干燥，得到脫膠后的家蠶絲素纖維。
2.2稱(chēng)取脫膠后的家蠶絲素按1:10(g/mL)的浴比溶解于摩爾比1:2的氯化鈣-乙醇的水溶液(乙醇與水的摩爾比1:4)中，70℃溶解2小時(shí)得家蠶絲素溶解液。
2.3將家蠶絲素溶解液灌注于透析袋內(nèi)，透析袋壁是半透膜，截留分子量為12.0～16.0kDa范圍，將灌注了家蠶絲素溶解液的透析袋置于盛有去離子水的容器內(nèi)，每隔2小時(shí)用新的去離子水或純水更換容器內(nèi)的水，持續(xù)透析3天，得到純化后的家蠶絲素蛋白水溶液。調(diào)整透析后的絲素蛋白溶液濃度為5％。
2.4按質(zhì)量比100:10配置絲素蛋白與聚乙二醇雙胺的混合溶液、攪拌均勻，向上述混合溶液中添加質(zhì)量比為絲素蛋白20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺攪拌均勻、10％的N-羥基琥珀酰亞胺和20％的2-嗎啉乙磺酸，攪拌10分鐘后倒入一平整的聚苯乙烯平皿中冷凍干燥，得到聚乙二醇二胺陽(yáng)離子化的絲素蛋白材料。
2.5將聚乙二醇二胺陽(yáng)離子化的絲素蛋白材料放入盛有去離子水的容器內(nèi)浸泡2天，每隔2～4小時(shí)更換一次容器內(nèi)的去離子水，2天后取出風(fēng)干或凍干，得到浸泡后的陽(yáng)離子化絲素蛋白材料。
2.6將浸泡后的陽(yáng)離子化絲素蛋白材料剪成一定質(zhì)量的小片，按照每毫克材料3ml水蛭素溶液的比例浸漬于5U/mL的水蛭素溶液，5h后取出靜置風(fēng)干后用PBS沖洗3～4次，最后風(fēng)干，得到抗凝血材料。
將實(shí)施例2得到的抗凝血材料進(jìn)行抗凝血酶活性測(cè)試，檢測(cè)450nm處凝血酶活性的吸光度值為純凝血酶活性的吸光度值的52％，即實(shí)施例2中得到的抗凝血材料能夠明顯地抑制凝血酶的活性。說(shuō)明水蛭素牢固地結(jié)合于絲素蛋白材料上了。
實(shí)施例3
3.1將家蠶生絲或烘干分層的繭殼按1:50(g/mL)的浴比放入濃度為0.2％的碳酸鈉水溶液中，于98℃～100℃處理三次，每次處理30分鐘，然后用去離子水將絲充分清洗干凈，拉松，置于60℃烘箱內(nèi)干燥，得到脫膠后的家蠶絲素纖維。
3.2稱(chēng)取脫膠后的家蠶絲素按1:10(g/mL)的浴比溶解于摩爾比1:2的氯化鈣-乙醇的水溶液(乙醇與水的摩爾比1:4)中，70℃溶解2小時(shí)得家蠶絲素溶解液。
3.3將家蠶絲素溶解液灌注于透析袋內(nèi)，透析袋壁是半透膜，截留分子量為12.0～16.0kDa范圍，將灌注了家蠶絲素溶解液的透析袋置于盛有去離子水的容器內(nèi)，每隔2小時(shí)用新的去離子水或純水更換容器內(nèi)的水，持續(xù)透析3天，得到純化后的家蠶絲素蛋白水溶液。調(diào)整透析后的絲素蛋白溶液濃度為5％。
3.4按質(zhì)量比100:10配置絲素蛋白與聚乙二醇雙胺的混合溶液、攪拌均勻，向上述混合溶液中添加質(zhì)量比為絲素蛋白20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺攪拌均勻、10％的N-羥基琥珀酰亞胺和20％的2-嗎啉乙磺酸，攪拌10分鐘后倒入一平整的聚苯乙烯平皿中冷凍干燥，得到聚乙二醇二胺陽(yáng)離子化的絲素蛋白材料。
3.5將聚乙二醇二胺陽(yáng)離子化的絲素蛋白材料放入盛有去離子水的容器內(nèi)浸泡2天，每隔2～4小時(shí)更換一次容器內(nèi)的去離子水，2天后取出風(fēng)干或凍干，得到浸泡后的陽(yáng)離子化絲素蛋白材料。
3.6將浸泡后的陽(yáng)離子化絲素蛋白材料剪成一定質(zhì)量的小片，按照每毫克材料3ml水蛭素溶液的比例浸漬于20U/mL的水蛭素溶液，5h后取出靜置風(fēng)干后用PBS沖洗3～4次，最后風(fēng)干，得到抗凝血材料。
將實(shí)施例3中得到的抗凝血材料進(jìn)行抗凝血酶活性測(cè)試，檢測(cè)450nm處凝血酶活性的吸光度值為純凝血酶活性的吸光度值的15％，即實(shí)施例3中得到的抗凝血材料能夠顯著地抑制凝血酶的活性。說(shuō)明水蛭素牢固地結(jié)合于絲素蛋白材料上了。
比較例1
1.1將家蠶生絲或烘干分層的繭殼按1:50(g/mL)的浴比放入濃度為0.2％的碳酸鈉水溶液中，于98℃～100℃處理三次，每次處理30分鐘，然后用去離子水將絲充分清洗干凈，拉松，置于60℃烘箱內(nèi)干燥，得到脫膠后的家蠶絲素纖維。
1.2稱(chēng)取脫膠后的家蠶絲素按1:10(g/mL)的浴比溶解于摩爾比1:2的氯化鈣-乙醇的水溶液(乙醇與水的摩爾比1:4)中，70℃溶解2小時(shí)得家蠶絲素溶解液。
1.3將家蠶絲素溶解液灌注于透析袋內(nèi)，透析袋壁是半透膜，截留分子量為12.0～16.0kDa范圍，將灌注了家蠶絲素溶解液的透析袋置于盛有去離子水的容器內(nèi)，每隔2小時(shí)用新的去離子水或純水更換容器內(nèi)的水，持續(xù)透析3天，得到純化后的家蠶絲素蛋白水溶液。調(diào)整透析后的絲素蛋白溶液濃度為5％。
1.4向絲素蛋白水溶液中加入質(zhì)量比為絲素蛋白20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺攪拌均勻、10％的N-羥基琥珀酰亞胺和20％的2-嗎啉乙磺酸，攪拌10分鐘后倒入一平整的聚苯乙烯平皿中60℃烘干或冷凍干燥。再生絲素材料放入盛有去離子水的容器內(nèi)浸泡2天，每隔2～4小時(shí)更換一次容器內(nèi)的去離子水，2天后取出風(fēng)干(烘干膜)或凍干(多孔絲素)。
1.5將純的再生絲素多孔材料剪成一定面積的小片，按照每毫克材料3ml水蛭素溶液的比例浸漬于20U/mL的水蛭素溶液，5h后取出靜置風(fēng)干后用PBS沖洗3～4次，最后風(fēng)干，得到復(fù)合材料。
將比較例1中得到的復(fù)合材料進(jìn)行抗凝血酶活性測(cè)試，檢測(cè)450nm處凝血酶活性的吸光度值為純凝血酶活性的吸光度值的99％，即比較例1中得到的復(fù)合材料沒(méi)有能有效地抑制凝血酶的活性，說(shuō)明水蛭素沒(méi)有被牢固地加載到絲素蛋白材料上。
比較例2
2.1將家蠶生絲或烘干分層的繭殼按1:50(g/mL)的浴比放入濃度為0.2％的碳酸鈉水溶液中，于98℃～100℃處理三次，每次處理30分鐘，然后用去離子水將絲充分清洗干凈，拉松，置于60℃烘箱內(nèi)干燥，得到脫膠后的家蠶絲素纖維。
2.2稱(chēng)取脫膠后的家蠶絲素按1:10(g/mL)的浴比溶解于摩爾比1:2的氯化鈣-乙醇的水溶液(乙醇與水的摩爾比1:4)中，70℃溶解2小時(shí)得家蠶絲素溶解液。
2.3將家蠶絲素溶解液灌注于透析袋內(nèi)，透析袋壁是半透膜，截留分子量為12.0～16.0kDa范圍，將灌注了家蠶絲素溶解液的透析袋置于盛有去離子水的容器內(nèi)，每隔2小時(shí)用新的去離子水或純水更換容器內(nèi)的水，持續(xù)透析3天，得到純化后的家蠶絲素蛋白水溶液。調(diào)整透析后的絲素蛋白溶液濃度為4％。
2.4按質(zhì)量比100:0.5配置絲素蛋白與聚乙二醇雙胺的混合溶液、攪拌均勻，向上述混合溶液中添加質(zhì)量比為絲素蛋白20％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺攪拌均勻、10％的N-羥基琥珀酰亞胺和20％的2-嗎啉乙磺酸，攪拌10分鐘后倒入一平整的聚苯乙烯平皿中60℃烘干。聚乙二醇雙胺改性的陽(yáng)離子化再生絲素材料放入盛有去離子水的容器內(nèi)浸泡2天，每隔2～4小時(shí)更換一次容器內(nèi)的去離子水，2天后取出風(fēng)干。
2.5將陽(yáng)離子化的再生絲素膜剪成一定面積的小片，浸漬于10U/mL的水蛭素溶液，靜置風(fēng)干后用PBS沖洗3～4次，最后風(fēng)干。
將制備好的加載水蛭素的絲素膜進(jìn)行抗凝血酶活性測(cè)試，檢測(cè)450nm處凝血酶活性的吸光度值為純凝血酶活性的吸光度值的95％，即材料沒(méi)有明顯抑制凝血酶的活性，說(shuō)明水蛭素沒(méi)有被牢固地加載到絲素蛋白材料上。
由于絲素蛋白與聚乙二醇雙胺質(zhì)量比100:0.5的絲素蛋白上接枝的陽(yáng)離子NH3+數(shù)量極少，那么以離子鍵結(jié)合上去的水蛭素也極少，因而沒(méi)有明顯的抗凝血活性。