本發(fā)明涉及醫(yī)療材料領(lǐng)域，特別是涉及一種引導(dǎo)組織再生膜及其制備方法。

背景技術(shù)：

引導(dǎo)組織再生技術(shù)(Guided Tissue Regeneration，GTR)是目前能夠有效治療牙周病的一種最為先進(jìn)的治療方法，其技術(shù)關(guān)鍵是利用生物屏障膜即組織再生引導(dǎo)膜的空間隔離作用，防止牙齦上皮和結(jié)蹄組織細(xì)胞向根面遷移，同時(shí)選擇性地使牙周細(xì)胞和牙槽骨細(xì)胞粘附于根面并分化形成牙周新附著。因此引導(dǎo)膜的作用至關(guān)重要。隨著GTR技術(shù)在臨床越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，引導(dǎo)膜的類型及性能已成為制備其發(fā)展的關(guān)鍵因素。

傳統(tǒng)的臨床所用的引導(dǎo)膜主要分為可吸收和不可吸收兩類。由于不可吸收引導(dǎo)膜如膨化聚四氟乙烯植入后需要二次手術(shù)取出，給病人帶來(lái)不必要的痛苦和經(jīng)濟(jì)心理負(fù)擔(dān)，因此可吸收引導(dǎo)膜逐漸成為今后GTR發(fā)展的主要趨勢(shì)。膠原是結(jié)蹄組織的主要成分，作為引導(dǎo)組織再生膜，具有其他可吸收材料無(wú)法比擬的生物活性和生物相容性，但是其力學(xué)強(qiáng)度差、體內(nèi)降解速度過(guò)快成為是制約其應(yīng)用的一大難題。近年來(lái)隨著脫細(xì)胞生物技術(shù)的興起和發(fā)展，動(dòng)物脫細(xì)胞基質(zhì)具有天然組織的三維結(jié)構(gòu)，具有良好的力學(xué)性能和具有更適宜組織生長(zhǎng)的三維結(jié)構(gòu)，因而成為引導(dǎo)膜技術(shù)開(kāi)發(fā)新的研究熱點(diǎn)。

隨著臨床技術(shù)的不斷更新，對(duì)引導(dǎo)組織再生膜功能的要求也不斷提升。引導(dǎo)組織再生膜不僅只起到屏障隔離的作用，還是一種引導(dǎo)骨組織再生和修復(fù)的材料。因而，要求引導(dǎo)組織再生膜具有一定的骨誘導(dǎo)骨傳導(dǎo)功能，以促進(jìn)缺損骨的修復(fù)，縮短治療周期同時(shí)也減少病人的痛苦和經(jīng)濟(jì)心理負(fù)擔(dān)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，有必要提供一種具有骨誘導(dǎo)功能的引導(dǎo)組織再生膜及其制備方法。

一種引導(dǎo)組織再生膜的制備方法，包括如下步驟：

對(duì)哺乳動(dòng)物的皮膚進(jìn)行預(yù)處理后得到真皮層皮片；

對(duì)所述真皮層皮片依次進(jìn)行脫細(xì)胞處理、病毒滅活處理和致密收縮處理，得到引導(dǎo)組織再生膜前體，所述引導(dǎo)組織再生膜前體具有光滑面與粗糙面的兩面結(jié)構(gòu)，其中，所述脫細(xì)胞處理的操作為：對(duì)所述真皮層皮片依次進(jìn)行低滲-高滲鹽處理、酶處理以及去污劑處理；以及

將所述引導(dǎo)組織再生膜前體按照粗糙面朝上、光滑面朝下的方式設(shè)置在質(zhì)量百分濃度為0.5％～5％的可溶性鍶鹽的溶液中，4℃～8℃下活化1天～3天后取出，隨后轉(zhuǎn)入pH為7～8.5的模擬體液中礦化3天～7天，取出后洗凈，預(yù)冷后冷凍干燥得到引導(dǎo)組織再生膜。

在一個(gè)實(shí)施例中，所述對(duì)哺乳動(dòng)物的皮膚進(jìn)行預(yù)處理后得到真皮層皮片的操作為：用機(jī)械法對(duì)所述哺乳動(dòng)物的皮膚進(jìn)行初步脫脂及除毛，接著用取皮機(jī)將所述哺乳動(dòng)物的皮膚去掉0.1mm～0.4mm的表皮與皮下脂肪組織后制成厚度為0.2mm～1mm的真皮層皮片。

在一個(gè)實(shí)施例中，所述哺乳動(dòng)物的皮膚為豬、牛、羊或馬的皮膚。

在一個(gè)實(shí)施例中，還包括在對(duì)所述真皮層皮片依次進(jìn)行脫細(xì)胞處理、病毒滅活處理和致密收縮處理的操作之前，將所述真皮層皮片浸泡在0℃～8℃的抗生素溶液中過(guò)夜的操作；

所述抗生素溶液的溶質(zhì)為青霉素-鏈霉素、慶大霉素、妥布霉素、萬(wàn)古霉素或替考拉寧；

所述抗生素溶液的質(zhì)量百分濃度為0.001％～0.1％。

在一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)所述真皮層皮片依次進(jìn)行脫細(xì)胞處理、病毒滅活處理和致密收縮處理的操作中，所述脫細(xì)胞處理的操作具體為：將所述真皮層皮片分別在質(zhì)量百分濃度為0.1％～0.9％氯化鈉和質(zhì)量百分濃度為1.0％～10％氯化鈉溶液中循環(huán)浸泡1次～3次，每次浸泡的時(shí)間為4h～12h，再將所述真皮層皮片浸泡在質(zhì)量濃度為0.1％～1.0％的胰蛋白酶溶液或中性酶溶液中，置于5℃～37℃搖床中消化12h～48h，接著將所述真皮層皮片在質(zhì)量濃度為0.1％～1％的去污劑溶液中5℃～37℃洗滌2次～8次，每次洗滌的時(shí)間為2h～10h，最后用PBS或者生理 鹽水清洗所述真皮層皮片4次～10次，每次清洗的時(shí)間為2h～10h；其中，所述去污劑為十二烷基磺酸鈉、曲拉通或3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸。

在一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)所述真皮層皮片依次進(jìn)行脫細(xì)胞處理、病毒滅活處理和致密收縮處理的操作中，所述病毒滅活處理的操作具體為：將所述真皮層皮片浸入質(zhì)量百分濃度為0.5％～5％的過(guò)氧化氫的乙醇溶液或過(guò)氧乙酸的乙醇溶液中，室溫下浸泡30min～480min，隨后用純水清洗，并將所述真皮層皮片按照上表皮層朝上、下表皮真皮層朝下的方式固定后-80℃～-20℃預(yù)冷2h～12h，最后冷凍干燥24h～48h，其中，所述過(guò)氧化物為過(guò)氧化氫或過(guò)氧乙酸。

在一個(gè)實(shí)施例中，所述病毒滅活處理的操作具體為：將所述真皮層皮片按照上表皮層朝上、下表皮真皮層朝下的方式固定后-80℃～-20℃預(yù)冷2h～12h，接著冷凍干燥24h～48h，最后對(duì)冷凍干燥后的所述真皮層皮片進(jìn)行干熱滅活，所述干熱滅活的溫度為50℃～120℃，所述干熱滅活的時(shí)間為3h～48h。

在一個(gè)實(shí)施例中，對(duì)所述真皮層皮片依次進(jìn)行脫細(xì)胞處理、病毒滅活處理和致密收縮處理的操作中，所述致密收縮處理的操作具體為：將所述真皮層皮片按照上表皮層朝上、下表皮真皮層朝下的方式放置后以壓力為5MPa～50MPa保壓12h～48h，隨后將所述真皮層皮浸沒(méi)在丙酮中15min～600min，然后干燥。

在一個(gè)實(shí)施例中，所述可溶性鍶鹽為氯化鍶、硝酸鍶或氫氧化鍶；

所述模擬體液通過(guò)如下操作配制：將7.7g～8.3g的NaCl、0.32g～0.4g的NaHCO₃、0.2g～0.25g的KCl、0.2g～0.25g的K₂HPO₄·3H₂O、0.28g～0.34g的MgCl₂·6H₂O、0.27g～0.31g的CaCl₂、0.068g～0.076g的Na₂SO₄以及5.8g～6.4g的Tris溶解后用HCl溶液和Tris調(diào)節(jié)pH為7～8.5，最后定容至1L，得到模擬體液。

一種引導(dǎo)組織再生膜，采用上述的引導(dǎo)組織再生膜的制備方法制備得到。

這種引導(dǎo)組織再生膜的制備方法通過(guò)對(duì)真皮層皮片進(jìn)行脫細(xì)胞處理、病毒滅活處理和致密收縮處理，得到的引導(dǎo)組織再生膜前體具有光滑面和粗糙面，光滑面能夠有效阻擋牙齦上皮和結(jié)蹄組織在根面生長(zhǎng)，而粗糙面通過(guò)與可溶性鍶鹽的溶液中的鍶元素復(fù)合，接著在模擬體液中礦化后得到的引導(dǎo)組織再生膜具有較強(qiáng)的機(jī)械性能，同時(shí)，復(fù)合了鍶元素并礦化后的引導(dǎo)組織再生膜能夠向 周圍缺損的骨組織緩慢釋放Sr²⁺和Ca²⁺，具有良好的骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)功能，從而能夠有效地促進(jìn)周圍缺損骨組織的修復(fù)與再生。

附圖說(shuō)明

圖1為一實(shí)施方式的引導(dǎo)組織再生膜的制備方法的流程圖；

圖2是實(shí)施例1制得的制備引導(dǎo)組織再生膜前體的光滑面的掃描電子顯微鏡照片；

圖3是實(shí)施例1制得的制備引導(dǎo)組織再生膜前體的粗糙面的掃描電子顯微鏡照片。

具體實(shí)施方式

下面主要結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)引導(dǎo)組織再生膜及其制備方法作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。

如圖1所示的引導(dǎo)組織再生膜的制備方法，包括如下步驟：

S10、對(duì)哺乳動(dòng)物的皮膚進(jìn)行預(yù)處理后得到真皮層皮片。

對(duì)哺乳動(dòng)物的皮膚進(jìn)行預(yù)處理后得到真皮層皮片的操作為：用機(jī)械法對(duì)哺乳動(dòng)物的皮膚進(jìn)行初步脫脂及除毛，接著用取皮機(jī)將哺乳動(dòng)物的皮膚去掉0.1mm～0.4mm的表皮與皮下脂肪組織后制成厚度為0.2mm～1mm的真皮層皮片。

一般的，可以將真皮層皮片剪成3cm×6cm～5cm～10cm大小的皮片。

哺乳動(dòng)物的皮膚包括依次層疊的皮毛、表皮層、真皮層和皮下組織。

具體的，哺乳動(dòng)物的皮膚為豬、牛、羊或馬的皮膚。優(yōu)選的，哺乳動(dòng)物的皮膚為豬、牛、羊或馬的腹部皮膚。

得到的真皮層皮片可以低溫儲(chǔ)存?zhèn)溆谩＞唧w的，得到的真皮層皮片可以儲(chǔ)存在-20℃下備用。

S10還包括將預(yù)處理后的得到真皮層皮片浸泡在0℃～8℃的抗生素溶液中過(guò)夜的操作。

抗生素溶液的溶質(zhì)為青霉素-鏈霉素、慶大霉素、妥布霉素、萬(wàn)古霉素或替 考拉寧。其中，青霉素-鏈霉素為青霉素和鏈霉素按照質(zhì)量比為3：5形成的混合物。

抗生素溶液的質(zhì)量百分濃度為0.001％～0.1％。

S20、對(duì)S10得到的真皮層皮片依次進(jìn)行脫細(xì)胞處理、病毒滅活處理和致密收縮處理，得到引導(dǎo)組織再生膜前體。

得到的引導(dǎo)組織再生膜前體具有光滑面與粗糙面的兩面結(jié)構(gòu)。

脫細(xì)胞處理的操作為：對(duì)真皮層皮片依次進(jìn)行低滲-高滲鹽處理、酶處理以及去污劑處理。

具體的，脫細(xì)胞處理的操作為：將真皮層皮片分別在質(zhì)量百分濃度為0.1％～0.9％氯化鈉和質(zhì)量百分濃度為1.0％～10％氯化鈉溶液中循環(huán)浸泡1次～3次，每次浸泡的時(shí)間為4h～12h，再將真皮層皮片浸泡在質(zhì)量濃度為0.1％～1.0％的胰蛋白酶溶液或中性酶溶液中，置于5℃～37℃搖床中消化12h～48h，接著將真皮層皮片在質(zhì)量濃度為0.1％～1％的去污劑溶液中5℃～37℃洗滌2次～4次，每次洗滌的時(shí)間為2h～4h，最后用PBS或者生理鹽水清洗真皮層皮片4次～10次，每次清洗的時(shí)間為2h～6h。其中，去污劑為十二烷基磺酸鈉、曲拉通或3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸。

脫細(xì)胞處理的操作為：對(duì)真皮層皮片進(jìn)行滅活處理后，將經(jīng)過(guò)滅活處理的真皮層皮片按照上表皮層朝上、下表皮真皮層朝下的方式置于低溫冰箱中預(yù)冷后冷凍干燥。

具體的，病毒滅活處理的操作為：將真皮層皮片浸入質(zhì)量百分濃度為0.5％～5％的過(guò)氧化氫的乙醇溶液或過(guò)氧乙酸的乙醇溶液中，室溫下浸泡30min～480min，隨后用純水清洗，并將真皮層皮片按照上表皮層朝上、下表皮真皮層朝下的方式固定后-80℃～-20℃預(yù)冷2h～12h，最后冷凍干燥24h～48h。其中，過(guò)氧化物為過(guò)氧化氫或過(guò)氧乙酸。

或者，病毒滅活處理的操作具體為：將真皮層皮片按照上表皮層朝上、下表皮真皮層朝下的方式固定后-80℃～-20℃預(yù)冷2h～12h，接著冷凍干燥24h～48h，最后對(duì)冷凍干燥后的真皮層皮片進(jìn)行干熱滅活。其中，干熱滅活的溫度為50℃～120℃，干熱滅活的時(shí)間為3h～48h。

具體的，致密收縮處理的操作為：將真皮層皮片按照上表皮層朝上、下表皮真皮層朝下的方式放置后以壓力為5MPa～50MPa保壓12h～36h，隨后將真皮層皮浸沒(méi)在丙酮中15min～600min，最后干燥。

S30、將S20得到的引導(dǎo)組織再生膜前體按照粗糙面朝上、光滑面朝下的方式設(shè)置在質(zhì)量百分濃度為0.5％～5％的可溶性鍶鹽的溶液中，4℃～8℃下活化1天～3天后取出，隨后轉(zhuǎn)入pH為7～8.5的模擬體液中礦化3天～7天，取出后洗凈，預(yù)冷后冷凍干燥得到引導(dǎo)組織再生膜。

可溶性鍶鹽可以為氯化鍶、硝酸鍶或氫氧化鍶。

模擬體液(SBF)通過(guò)如下操作配制：將7.7g～8.3g的NaCl、0.32g～0.4g的NaHCO₃、0.2g～0.25g的KCl、0.2g～0.25g的K₂HPO₄·3H₂O、0.28g～0.34g的MgCl₂·6H₂O、0.27g～0.31g的CaCl₂、0.068g～0.076g的Na₂SO₄以及5.8g～6.4g的Tris溶解后用HCl溶液和Tris調(diào)節(jié)pH為7～8.5，最后定容至1L，得到模擬體液。

優(yōu)選的，模擬體液(SBF)通過(guò)如下操作配制：將8.035g的NaCl、0.355g的NaHCO₃、0.225g的KCl、0.231g的K₂HPO₄·3H₂O、0.311g的MgCl₂·6H₂O、0.292g的CaCl₂、0.072g的Na₂SO₄以及6.118g的Tris溶解后用HCl溶液調(diào)節(jié)pH為7.4，最后定容至1L，得到模擬體液。

S30中，預(yù)冷后冷凍干燥的操作為：-80℃～-20℃預(yù)冷2h～12h，接著冷凍干燥24h～48h。

這種引導(dǎo)組織再生膜的制備方法通過(guò)對(duì)真皮層皮片進(jìn)行脫細(xì)胞處理、病毒滅活處理和致密收縮處理，得到的引導(dǎo)組織再生膜前體具有光滑面和粗糙面，光滑面能夠有效阻擋牙齦上皮和結(jié)蹄組織在根面生長(zhǎng)，而粗糙面通過(guò)與可溶性鍶鹽的溶液中的鍶元素復(fù)合，接著在模擬體液中礦化后得到的引導(dǎo)組織再生膜具有較強(qiáng)的機(jī)械性能，同時(shí)，復(fù)合了鍶元素并礦化后的引導(dǎo)組織再生膜能夠向周圍缺損的骨組織緩慢釋放Sr²⁺和Ca²⁺，具有良好的骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)功能，從而能夠有效地促進(jìn)周圍缺損骨組織的修復(fù)與再生。

這種引導(dǎo)組織再生膜的制備方法采用低滲-高滲聯(lián)合酶處理工藝，具有脫細(xì)胞徹底、且對(duì)組織細(xì)胞外基質(zhì)天然結(jié)構(gòu)的損害輕，保持了膠原纖維支架的完整 性，有利于后期細(xì)胞的粘附與生長(zhǎng)。

這種引導(dǎo)組織再生膜的制備方法采用致密收縮處理工藝，制備得到的引導(dǎo)膜具有光滑面與粗糙面的兩面結(jié)構(gòu)，具有天然的三維空間結(jié)構(gòu)與良好的機(jī)械性能，能夠?yàn)樾律乐芙M織提供充足的空間。

一實(shí)施方式的引導(dǎo)組織再生膜，采用上述的引導(dǎo)組織再生膜的制備方法制備得到。

這種引導(dǎo)組織再生膜通過(guò)上述的方法制備而成，具有光滑面與粗糙面的兩面結(jié)構(gòu)；通過(guò)采用酶與表面活性劑交替處理，處理過(guò)程中對(duì)真皮的支架結(jié)構(gòu)破壞較小，能很好的保證纖維支架的完整性，有利于后期細(xì)胞的粘附與生長(zhǎng)。

這種引導(dǎo)組織再生膜通過(guò)上述的方法制備而成，具有光滑面和粗糙面，光滑面能夠有效阻擋牙齦上皮和結(jié)蹄組織在根面生長(zhǎng)，而粗糙面通過(guò)與可溶性鍶鹽的溶液中的鍶元素復(fù)合，接著在模擬體液中礦化后得到的引導(dǎo)組織再生膜具有較強(qiáng)的機(jī)械性能，同時(shí)，復(fù)合了鍶元素并礦化后的引導(dǎo)組織再生膜能夠向周圍缺損的骨組織緩慢釋放Sr²⁺和Ca²⁺，具有良好的骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)功能，從而能夠有效地促進(jìn)周圍缺損骨組織的修復(fù)與再生。

下面為具體實(shí)施例。

實(shí)施例1～3中出現(xiàn)的模擬體液通過(guò)如下操作配制：將8.035g的NaCl、0.355g的NaHCO₃、0.225g的KCl、0.231g的K₂HPO₄·3H₂O、0.311g的MgCl₂·6H₂O、0.292g的CaCl₂、0.072g的Na₂SO₄以及6.118g的Tris溶解后用HCl溶液調(diào)節(jié)pH為7.4，最后定容至1L，得到模擬體液。

實(shí)施例1

(1)真皮層皮片的制備

將健康豬的整張腹部皮用機(jī)械法進(jìn)行初步脫脂，用鑷子把毛剔除干凈，用電動(dòng)取皮機(jī)先將豬皮的皮下脂肪去掉，再去掉表皮0.4mm，制成厚度為0.3mm的真皮層皮片，再浸泡在質(zhì)量濃度為0.01％的青霉素-鏈霉素的水溶液中，置入 4℃冰箱過(guò)夜后轉(zhuǎn)入-25℃低溫冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)引導(dǎo)組織再生膜前體的制備

脫細(xì)胞處理：將解凍后的真皮層皮片依次用質(zhì)量濃度為0.1％氯化鈉(低滲鹽)和質(zhì)量濃度為1.0％氯化鈉(高滲鹽)溶液循環(huán)浸泡2次，6h/次，通過(guò)低滲溶液處理促使組織吸水膨脹，從而使組織中的細(xì)胞破裂，同時(shí)組織中的膠原纖維結(jié)構(gòu)松開(kāi)，從而使膠原束變得疏松，再通過(guò)高滲鹽溶液處理破碎細(xì)胞的DNA從組織蛋白中分離出來(lái)；再將真皮層皮片浸泡在質(zhì)量濃度為0.25％的胰蛋白酶溶液中，置于30℃搖床中消化24h，清洗掉組織中去除組織殘留的細(xì)胞碎片和細(xì)胞核；隨后將真皮層皮片在0.1％的十二烷基磺酸鈉溶液，35℃洗滌3次，2h/次，以去除組織中殘留的細(xì)胞和細(xì)胞核，徹底祛除組織的免疫原性，同時(shí)可以達(dá)到一定的去除組織中脂肪的效果；最后用PBS洗滌6次，2h/次。

病毒滅活處理：將脫細(xì)胞處理后的真皮層皮片浸入質(zhì)量濃度為2％過(guò)氧乙酸的乙醇溶液中，室溫下浸泡30min，隨后用純水清洗至PH7.4，最后將真皮層皮片平鋪于聚四氟乙烯模具中，其中上表皮層朝上，下表皮真皮層朝下，置于-80℃低溫冰箱預(yù)冷4h后立即轉(zhuǎn)入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥24h。

致密收縮處理：將凍干后的真皮層皮片按上表皮層朝上，下表皮真皮層朝下平鋪于不銹鋼平板上，置于壓片機(jī)中以壓力20MPa保壓24h，隨后將模壓后的引導(dǎo)膜先浸沒(méi)在丙酮中30min，然后干燥除去殘留的有機(jī)溶劑。

(3)引導(dǎo)組織再生膜的制備

將(2)制備的引導(dǎo)組織再生膜前體按光滑面朝下，粗糙面朝上放入模具中固定好，再將其一起浸入質(zhì)量百分濃度為2.5％的可溶性鍶鹽的溶液中，6℃下活化2天后取出，隨后轉(zhuǎn)入pH為7.4的模擬體液中礦化5天，取出后洗凈，預(yù)冷后冷凍干燥得到引導(dǎo)組織再生膜。

將實(shí)施例1制得的引導(dǎo)組織再生膜前體在掃描電子顯微鏡(SEM)下觀察，得到圖2和圖3。

由圖2和圖3可以看出，實(shí)施例1制得的引導(dǎo)組織再生膜前體具有良好的膠原纖維支架結(jié)構(gòu)，光滑面致密，粗糙面為多孔纖維結(jié)構(gòu)，有利于后期成骨細(xì)胞在粗糙面的粘附與生長(zhǎng)。

實(shí)施例2

(1)真皮層皮片的制備

將健康豬的整張腹部皮用機(jī)械法進(jìn)行初步脫脂，用鑷子把毛剔除干凈，用電動(dòng)取皮機(jī)先將豬皮的皮下組織去掉，再去掉表皮0.1mm，制成厚度為0.9mm的真皮層皮片，再浸泡在質(zhì)量濃度為0.1％的慶大霉素的水溶液中，置入4℃冰箱過(guò)夜后轉(zhuǎn)入-25℃低溫冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)引導(dǎo)組織再生膜前體的制備

脫細(xì)胞處理：將解凍后的真皮層皮片依次用質(zhì)量濃度為0.9％氯化鈉(低滲鹽)和質(zhì)量濃度為9.0％氯化鈉(高滲鹽)溶液循環(huán)浸泡3次，4h/次，通過(guò)低滲溶液處理促使組織吸水膨脹，從而使組織中的細(xì)胞破裂，同時(shí)組織中的膠原纖維結(jié)構(gòu)松開(kāi)，從而使膠原束變得疏松，再通過(guò)高滲鹽溶液處理破碎細(xì)胞的DNA從組織蛋白中分離出來(lái)；再將真皮層皮片浸泡在質(zhì)量濃度為0.1％的中性酶溶液中，置于35℃搖床中消化24h，清洗掉組織中去除組織殘留的細(xì)胞碎片和細(xì)胞核；隨后將真皮層皮片在0.1％的曲拉通溶液，35℃洗滌4次，4h/次，以去除組織中殘留的細(xì)胞和細(xì)胞核，徹底祛除組織的免疫原性，同時(shí)可以達(dá)到一定的去除組織中脂肪的效果；最后用生理鹽水洗滌4次，6h/次。

病毒滅活處理：將脫細(xì)胞處理后的真皮層皮片浸入質(zhì)量濃度為0.5％過(guò)氧乙酸的乙醇溶液中，室溫下浸泡240min，隨后用純水清洗后將真皮層皮片平鋪于聚四氟乙烯模具中，其中上表皮層朝上，下表皮真皮層朝下，置于-80℃低溫冰箱預(yù)冷4h后立即轉(zhuǎn)入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥24h。

致密收縮處理：將凍干后的真皮層皮片按上表皮層朝上，下表皮真皮層朝下平鋪于不銹鋼平板上，置于壓片機(jī)中以壓力5MPa保壓48h，隨后將模壓后的引導(dǎo)膜先浸沒(méi)在丙酮中300min，最后干燥除去殘留的有機(jī)溶劑。

(3)引導(dǎo)組織再生膜的制備

將(2)制備的引導(dǎo)組織再生膜前體按光滑面朝下，粗糙面朝上放入模具中固定好，再將其一起浸入質(zhì)量百分濃度為0.5％的可溶性鍶鹽的溶液中，8℃下活化3天后取出，隨后轉(zhuǎn)入pH為7.4的模擬體液中礦化7天，取出后洗凈，預(yù)冷 后冷凍干燥得到引導(dǎo)組織再生膜。

實(shí)施例3

(1)真皮層皮片的制備。

將健康豬的整張腹部皮用機(jī)械法進(jìn)行初步脫脂，用鑷子把毛剔除干凈，用電動(dòng)取皮機(jī)先將豬皮的皮下組織去掉，再去掉表皮0.2mm，制成厚度為0.5mm的真皮層皮片，再浸泡在質(zhì)量濃度為0.1％的妥布霉素的水溶液中，置入4℃冰箱過(guò)夜后轉(zhuǎn)入-25℃低溫冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)引導(dǎo)組織再生膜前體的制備

脫細(xì)胞處理：將解凍后的真皮層皮片依次用質(zhì)量濃度為0.5％氯化鈉(低滲鹽)和質(zhì)量濃度為5.0％氯化鈉(高滲鹽)溶液循環(huán)浸泡3次，12h/次，通過(guò)低滲溶液處理促使組織吸水膨脹，從而使組織中的細(xì)胞破裂，同時(shí)組織中的膠原纖維結(jié)構(gòu)松開(kāi)，從而使膠原束變得疏松，再通過(guò)高滲鹽溶液處理破碎細(xì)胞的DNA從組織蛋白中分離出來(lái)；再將真皮層皮片浸泡在質(zhì)量濃度為1％的胰蛋白酶溶液中，置于25℃搖床中消化36h，清洗掉組織中去除組織殘留的細(xì)胞碎片和細(xì)胞核；隨后將真皮層皮片在1％的3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸溶液，35℃洗滌3次，2h/次，以去除組織中殘留的細(xì)胞和細(xì)胞核，徹底祛除組織的免疫原性，同時(shí)可以達(dá)到一定的去除組織中脂肪的效果；最后用PBS洗滌6次，2h/次。

病毒滅活處理：將脫細(xì)胞處理后的真皮層皮片平鋪于聚四氟乙烯模具中，其中上表皮層朝上，下表皮真皮層朝下，置于-20℃低溫冰箱預(yù)冷12h后立即轉(zhuǎn)入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行干燥36h，然后在100℃干熱滅菌12h。

致密收縮處理：將凍干后的真皮層皮片按上表皮層朝上，下表皮真皮層朝下平鋪于不銹鋼平板上，置于壓片機(jī)中以壓力50MPa保壓12h，隨后將模壓后的引導(dǎo)膜先浸沒(méi)在丙酮中480min，最后真空干燥除去殘留的有機(jī)溶劑。

(3)引導(dǎo)組織再生膜的制備

將(2)制備的引導(dǎo)組織再生膜前體按光滑面朝下，粗糙面朝上放入模具中固定好，再將其一起浸入質(zhì)量百分濃度為5％的可溶性鍶鹽的溶液中，4℃下活 化1天后取出，隨后轉(zhuǎn)入pH為7.4的模擬體液中礦化3天，取出后洗凈，預(yù)冷后冷凍干燥得到引導(dǎo)組織再生膜。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。