本發(fā)明涉及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，進(jìn)一步涉及營養(yǎng)物在分子水平上的結(jié)構(gòu)改進(jìn)，具體涉及一種蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體制備方法。

背景技術(shù)：

鐵作為人體必需微量元素之一，是血紅蛋白、肌紅蛋白及多種酶系的重要組成部分，對維持機體正常代謝、提供營養(yǎng)和改善機體免疫具有重要作用。由于鐵缺乏所引起的缺鐵性貧血是世界范圍內(nèi)患病率較高的營養(yǎng)性疾病之一。應(yīng)用于補鐵的制劑有多種類型，而越來越多的學(xué)者已把注意力從傳統(tǒng)的無機鐵、有機酸鐵的研究轉(zhuǎn)移到氨基酸螯合鐵這一迅速發(fā)展起來的新型鐵制劑上來。蘇氨酸螯合鐵作為這新型鐵營養(yǎng)強化劑的一種有諸多優(yōu)點。在動物體內(nèi)，蘇氨酸螯合鐵可通過肽吸收通道在小腸內(nèi)被吸收，避免了通過離子吸收通道運轉(zhuǎn)時與其他礦物元素產(chǎn)生的拮抗作用；蘇氨酸螯合鐵能減輕鐵離子參與的氧化還原反應(yīng)，降低對食品中脂質(zhì)、維生素等敏感成分的破壞，進(jìn)而減少了營養(yǎng)物質(zhì)的損失；它還能在體內(nèi)形成緩沖體系，以減少無機鹽對胃腸道內(nèi)酸堿平衡的不良影響。由于蘇氨酸螯合鐵只有在絡(luò)合形態(tài)下才具有較高的生物學(xué)效價，而胃液的強酸環(huán)境會使部分蘇氨酸螯合鐵嚴(yán)重解離。因此，為了充分發(fā)揮蘇氨酸螯合鐵的補鐵效果，有必要采取措施提高其在胃部的強酸性環(huán)境中的穩(wěn)定性和較高的生物利用率。

脂質(zhì)體包埋技術(shù)為這一目的提供了可行的研發(fā)方向，如果能利用類脂質(zhì)雙分子層將蘇氨酸螯合鐵包封于其中形成微型泡囊體，則可有效緩解蘇氨酸螯合鐵與胃酸環(huán)境的直接接觸，在增進(jìn)其穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上提高生物利用率。

脂質(zhì)體是一種以蛋黃卵磷脂等兩性物質(zhì)為基礎(chǔ)制劑的仿生物膜結(jié)構(gòu)，具有制備簡單、無免疫原性、對機體無毒性以及良好的生物相容性等優(yōu)點。目前，常見的脂質(zhì)體常見的實驗室制法有乙醇注入法和反相蒸發(fā)法。在制備蘇氨酸螯合鐵脂質(zhì)體的過程中，由于在制備的反應(yīng)過程中亞鐵離子極易受到外界條件的影響而被氧化，致使亞鐵含量降低，造成最終產(chǎn)品的品質(zhì)受到影響。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體制備方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中鐵元素營養(yǎng)物的補鐵效果不佳的技術(shù)問題。

本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中蘇氨酸螯合鐵在強酸性環(huán)境下穩(wěn)定性較低。

本發(fā)明要解決的再一技術(shù)問題是當(dāng)利用脂質(zhì)體對蘇氨酸螯合鐵進(jìn)行包埋時，常規(guī)的脂質(zhì)體制備方法易導(dǎo)致亞鐵離子氧化，從而影響產(chǎn)品質(zhì)量。

為實現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體制備方法，包括以下步驟：

1)水相的制備：配制蘇氨酸的水溶液和氫氧化物的水溶液，將二者混合后在攪拌條件下于70～90℃反應(yīng)1h，混合物中蘇氨酸與氫氧化物的質(zhì)量比為3:1，反應(yīng)后利用酸性抗氧化劑調(diào)整混合物pH至7～8，而后以硫酸亞鐵與蘇氨酸摩爾比為1:2～1:3.5的比例向其中加入硫酸亞鐵溶液，而后向反應(yīng)體系所處容器環(huán)境中持續(xù)沖入惰性氣體，調(diào)整其pH至6～6.5，在攪拌條件于50～60℃反應(yīng)30～40min，而后降溫過濾，取濾液即為水相；

2)有機相的制備：取蛋黃卵磷脂和膽固醇溶解于無水乙醚中，得到有機相，所述有機相中蛋黃卵磷脂和膽固醇的摩爾比為5:1～2:1，所述有機相中蛋黃卵磷脂濃度為5～20mg/mL；

3)納米脂質(zhì)體的生成：以2:1～4:1的體積比將水相利用注射器一次性注入有機相中，混合后在冰浴狀態(tài)下超聲震蕩5～10min，得到油包水型乳狀液，將其在25～35℃水浴中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20～30min，而后將含有吐溫80的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液加入其中繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20～30min，將產(chǎn)物在冰浴狀態(tài)下超聲震蕩10～15min。在以上技術(shù)方案中，步驟1)作為水相的濾液呈墨綠色透明狀態(tài)；步驟1)中酸性抗氧化劑的加入能有效對抗體系中的氧化因素，同時降低體系pH，提高穩(wěn)定性；步驟3)第一次減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20～30min后瓶內(nèi)形成凝膠狀物，有機溶劑被蒸除，凝膠成膜狀；步驟3)加入含有吐溫80的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液后繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，可以起到充分水合并除去殘留有機溶劑的作用。

作為優(yōu)選，步驟1)所述蘇氨酸的水溶液中蘇氨酸的濃度為0.2～0.5g/mL；所述氫氧化物的水溶液中氫氧化物的濃度為0.033～0.07g/mL。

作為優(yōu)選，步驟1)所述氫氧化物是氫氧化鈣或氫氧化鋇。

作為優(yōu)選，步驟1)所述酸性抗氧化劑選自檸檬酸，抗壞血酸，蘋果酸，富馬酸，酒石酸，丙二酸的其中一種或多種。

作為優(yōu)選，步驟1)中酸性抗氧化劑的用量為蘇氨酸質(zhì)量的10～50％。

作為優(yōu)選，步驟1)沖入惰性氣體之前先利用雙排管排除反應(yīng)體系所處容器環(huán)境中的氧氣；所述惰性氣體是體積分?jǐn)?shù)高于99.99％的氮氣。

作為優(yōu)選，步驟1)所述調(diào)整其pH至6～6.5，是利用以下成分的其中一種實現(xiàn)的：氫氧化鈉溶液，碳酸氫鈉溶液，碳酸鈉溶液，氫氧化鉀溶液，碳酸氫鉀溶液，碳酸鉀溶液。

作為優(yōu)選，步驟3)中第一次超聲震蕩的強度為50～90％，每工作2秒間歇1秒。

作為優(yōu)選，步驟3)所述含有吐溫80的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液的加入量，滿足以下條件：體系中蛋黃卵磷脂的含量與所述含有吐溫80的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液的加入量之比為1:50～1:150(g:mL)。

作為優(yōu)選，步驟3)中第二次超聲震蕩是利用探頭式超聲震蕩器實現(xiàn)的，其超聲震蕩的強度為60～100％，每工作2秒間歇1秒。

同時，本發(fā)明還提供了上述蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體用于制備動物鐵元素補充強化劑的應(yīng)用。

作為優(yōu)選，所述鐵元素補充強化劑是口服制劑。

作為優(yōu)選，所述鐵元素補充強化劑是缺鐵性貧血治療藥物。

作為優(yōu)選，所述鐵元素補充強化劑是保健食品和普通食品、食品添加劑。

作為優(yōu)選，所述鐵元素補充強化劑是飼料添加劑。

在以上技術(shù)方案中，所述探頭式超聲震蕩器是指自身具有超聲波發(fā)生功能、通過插入的方式對所處環(huán)境執(zhí)行超聲震蕩的儀器；因此，凡具有以上功能特征的裝置均屬于本發(fā)明所述探頭式超聲震蕩器所限定的特征范圍。在以上技術(shù)方案中，蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體的包封率可采用透析法測定；產(chǎn)品的亞鐵含量可采用硫酸高鈰滴定法測定，總鐵含量可采用鄰菲啰啉比色法測定；納米脂質(zhì)體的粒徑分布可采用Nano-ZS型納米粒度及zeta電位分析儀測定；納米脂質(zhì)體的表征圖像可采用掃描電子顯微鏡(SEM)分析。

本發(fā)明提供了一種蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體制備方法，該技術(shù)方案利用具有納米粒徑的納米脂質(zhì)體作為運載系統(tǒng)，通過水相注入一步法制備蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體。具體來看，本發(fā)明以蘇氨酸為起始原料，先與氫氧化物和硫酸亞鐵在高純氮氣保護(hù)下反應(yīng)，過濾后得到的蘇氨酸螯合鐵水溶液作水相；同時，將適量蛋黃卵磷脂和膽固醇溶于無水乙醚中作有機相，將水相直接注入有機相中，并于冰浴中短時超聲，得到的乳狀液于一定溫度下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以除去有機溶劑。之后，將含有適量吐溫80的緩沖液加入混懸體系中繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，再將其于冰水浴中超聲處理得到蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體分散液。

本發(fā)明將蘇氨酸螯合鐵產(chǎn)品制備和納米脂質(zhì)體產(chǎn)品制備兩個獨立的過程結(jié)合成一步完整的過程，避免了制備蘇氨酸螯合鐵過程中的反復(fù)萃取、干燥、研磨、溶解等步驟，減少了反應(yīng)步驟與過程，優(yōu)化了反應(yīng)條件，操作更簡單，避免了反應(yīng)過程中可能使亞鐵含量及產(chǎn)品質(zhì)量受影響的多項操作，使蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體產(chǎn)品的亞鐵含量最大化且保持穩(wěn)定，所得產(chǎn)物平均粒徑小于100nm，亞鐵含量高于90％，包封率達(dá)70％-80％。本發(fā)明對于增強蘇氨酸螯合鐵在胃液強酸環(huán)境中的穩(wěn)定性，提高蘇氨酸螯合鐵的生物利用率和穩(wěn)定性有較好的效果。動物實驗表明，本發(fā)明所制備的蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體可顯著改善動物缺鐵性貧血癥狀，具有良好的推廣前景。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例1所制備蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體的SEM電鏡圖。

圖2是本發(fā)明實施例1所制備蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體的粒徑分布圖。

具體實施方式

以下將對本發(fā)明的具體實施方式進(jìn)行詳細(xì)描述。為了避免過多不必要的細(xì)節(jié)，在以下實施例中對屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進(jìn)行詳細(xì)描述。

以下實施例中所使用的近似性語言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情況下可允許數(shù)量有一定的變動。因此，用“大約”、“左右”等語言所修正的數(shù)值不限于該準(zhǔn)確數(shù)值本身。在一些實施例中，“大約”表示允許其修正的數(shù)值在正負(fù)百分之十(10％)的范圍內(nèi)變化，比如，“大約100”表示的可以是90到110之間的任何數(shù)值。此外，在“大約第一數(shù)值到第二數(shù)值”的表述中，大約同時修正第一和第二數(shù)值兩個數(shù)值。在某些情況下，近似性語言可能與測量儀器的精度有關(guān)。

除有定義外，以下實施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。

以下實施例中所用的試驗試劑耗材，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑；所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值；以下實施例中的％，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。

實施例1

將6g蘇氨酸于20mL水中微熱溶解后移入磁力攪拌反應(yīng)瓶中，同時向反應(yīng)瓶中加入40mL含2g氫氧化鈣的水溶液，于80℃攪拌反應(yīng)1h。停止反應(yīng)后，加入1.5g溶解的七水合檸檬酸，通過雙排管排除體系中的氧氣并充入高純N₂，再使用注射器通過橡皮塞將10mL含4.5g硫酸亞鐵的溶液逐滴加入反應(yīng)瓶中，并用1mol/L氫氧化鈉溶液逐滴加入反應(yīng)體系，調(diào)節(jié)體系pH至6.5，然后于60℃攪拌反應(yīng)30min，降溫過濾，得到墨綠色透明濾液作水相。稱取蛋黃卵磷脂3g和膽固醇0.5g完全溶解于180mL無水乙醚中得有機相。將水相用針管一次性注入有機相中，混合后于冰浴中短時超聲10min，超聲強度70％，2秒開，1秒停，得到均一的油包水(W/O)型乳狀液。將乳狀液移入圓底燒瓶中，于35℃水浴中進(jìn)行減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，30min后瓶內(nèi)形成凝膠膜狀物，有機溶劑被蒸除。再加入含有2g Tween80的200mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30min，得到脂質(zhì)體懸濁液。將充分水合后的脂質(zhì)體混懸液再次于冰浴中經(jīng)探頭式超聲10min，超聲強度80％，2秒開，1秒停，得到蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體分散液。

對所制備的蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體，先后利用透析法測定其包封率；利用硫酸高鈰滴定法測定其亞鐵含量；利用鄰菲啰啉比色法測定其總鐵含量；利用Nano-ZS型納米粒度及zeta電位分析儀測定其粒徑分布情況；掃描電子顯微鏡(SEM)觀察其微觀圖像。結(jié)果顯示，以上所制備的蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體，其包封率為76.2％，亞鐵占總鐵含量為92.5％，平均粒徑在100nm以下，粒徑分布情況如圖2所示；其微觀形態(tài)如圖1所示。

實施例2

將3g蘇氨酸于10mL水中微熱溶解后移入磁力攪拌反應(yīng)瓶中，同時向反應(yīng)瓶中加入15mL含1g氫氧化鈣的水溶液，于80℃攪拌反應(yīng)1h。停止反應(yīng)后，加入0.8g溶解的七水合檸檬酸，通過雙排管排除體系中的氧氣并充入高純N₂，再使用注射器通過橡皮塞將10mL含2.5g硫酸亞鐵的溶液逐滴加入反應(yīng)瓶中，并用1mol/L氫氧化鈉溶液逐滴加入反應(yīng)體系，調(diào)節(jié)體系pH至6.3，然后于50℃攪拌反應(yīng)40min，降溫過濾，得到墨綠色透明濾液作水相。稱取蛋黃卵磷脂1.5g和膽固醇0.3g完全溶解于100mL無水乙醚中得有機相。將水相用針管一次性注入有機相中，混合后于冰浴中短時超聲10min，超聲強度60％，2秒開，1秒停，得到均一的油包水(W/O)型乳狀液。將乳狀液移入圓底燒瓶中，于30℃水浴中進(jìn)行減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，30min后瓶內(nèi)形成凝膠膜狀物，有機溶劑被蒸除。再加入含有1g Tween80的100mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20min，得到脂質(zhì)體懸濁液。將充分水合后的脂質(zhì)體混懸液再次于冰浴中經(jīng)探頭式超聲10min，超聲強度80％，2秒開，1秒停，得到蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體分散液。經(jīng)測包封率為74.5％，亞鐵占總鐵含量為93.2％，平均粒徑在100nm以下。

實施例3

將2g蘇氨酸于10mL水中微熱溶解后移入磁力攪拌反應(yīng)瓶中，同時向反應(yīng)瓶中加入10mL含0.7g氫氧化鈣的水溶液，于80℃攪拌反應(yīng)1h。停止反應(yīng)后，加入0.5g溶解的七水合檸檬酸，通過雙排管排除體系中的氧氣并充入高純N₂，再使用注射器通過橡皮塞將5mL含1.5g硫酸亞鐵的溶液逐滴加入反應(yīng)瓶中，并用1mol/L氫氧化鈉溶液逐滴加入反應(yīng)體系，調(diào)節(jié)體系pH至6.0，然后于60℃攪拌反應(yīng)40min，降溫過濾，得到墨綠色透明濾液作水相。稱取蛋黃卵磷脂1g和膽固醇0.2g完全溶解于60mL無水乙醚中得有機相。將水相用針管一次性注入有機相中，混合后于冰浴中短時超聲10min，超聲強度80％，2秒開，1秒停，得到均一的油包水(W/O)型乳狀液。將乳狀液移入圓底燒瓶中，于35℃水浴中進(jìn)行減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，30min后瓶內(nèi)形成凝膠膜狀物，有機溶劑被蒸除。再加入含有0.5g Tween80的100mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30min，得到脂質(zhì)體懸濁液。將充分水合后的脂質(zhì)體混懸液再次于冰浴中經(jīng)探頭式超聲15min，超聲強度90％，2秒開，1秒停，得到蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體分散液。經(jīng)測包封率為75.2％，亞鐵占總鐵含量為91.5％，平均粒徑在100nm以下。

實施例4

將5g蘇氨酸于20mL水中微熱溶解后移入磁力攪拌反應(yīng)瓶中，同時向反應(yīng)瓶中加入35mL含1.7g氫氧化鈣的水溶液，于80℃攪拌反應(yīng)1h。停止反應(yīng)后，加入1.2g溶解的七水合檸檬酸，通過雙排管排除體系中的氧氣并充入高純N₂，再使用注射器通過橡皮塞將20mL含4g硫酸亞鐵的溶液逐滴加入反應(yīng)瓶中，并用1mol/L氫氧化鈉溶液逐滴加入反應(yīng)體系，調(diào)節(jié)體系pH至6.5，然后于60℃攪拌反應(yīng)30min，降溫過濾，得到墨綠色透明濾液作水相。稱取蛋黃卵磷脂3g和膽固醇1.2g完全溶解于200mL無水乙醚中得有機相。將水相用針管一次性注入有機相中，混合后于冰浴中短時超聲10min，超聲強度80％，2秒開，1秒停，得到均一的油包水(W/O)型乳狀液。將乳狀液移入圓底燒瓶中，于30℃水浴中進(jìn)行減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，30min后瓶內(nèi)形成凝膠膜狀物，有機溶劑被蒸除。再加入含有3g Tween80的150mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30min，得到脂質(zhì)體懸濁液。將充分水合后的脂質(zhì)體混懸液再次于冰浴中經(jīng)探頭式超聲10min，超聲強度90％，2秒開，1秒停，得到蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體分散液。經(jīng)測包封率為72.4％，亞鐵占總鐵含量為93.6％，平均粒徑在100nm以下。

實施例5

在裝有磁力攪拌的反應(yīng)瓶中，加入60mL水和2g氫氧化鈣，攪拌加熱至50℃，得到白色懸濁液。將6g蘇氨酸完全溶于30mL水中，再將蘇氨酸的水溶液加入白色懸濁液中，5min后體系呈半透明液，在80℃下繼續(xù)反應(yīng)1h，降至60℃。然后加入1.5g溶解的七水合檸檬酸，再立即加入5g七水合硫酸亞鐵和10mL水加熱至60℃的水溶液，并持續(xù)向體系充入氮氣，以注射器將1mol/L氫氧化鈉溶液逐滴加入反應(yīng)體系，調(diào)節(jié)體系pH至6.8，然后于50℃攪拌反應(yīng)0.5h，降至室溫，過濾，得到墨綠色透明濾液。然后向濾液加入200mL無水乙醇萃取，再次過濾，將所得粘稠油狀沉淀于50℃真空干燥2.5h，粉碎后得蘇氨酸螯合鐵成品，稱取100mg蘇氨酸螯合鐵溶解于8mL pH＝6.8的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中得水相。再稱取蛋黃卵磷脂500mg和膽固醇40mg完全溶解于24mL無水乙醚中得有機相。將有機相和水相按3:1的體積比均勻混合后于冰浴中超聲5min，超聲強度60％，2秒開，1秒停，得到均一的油包水(W/O)型乳狀液。將形成的乳狀液移入250mL圓底燒瓶中，于45℃水浴中進(jìn)行減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以除去有機溶劑，8min后形成凝膠狀物，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20min至凝膠塌陷。再將含有300mg Tween80的30mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液加入體系中于40℃繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)20min，以充分水合并除去殘留的有機溶劑，得到脂質(zhì)體混懸液。將充分水合后的脂質(zhì)體混懸液再次于冰浴中經(jīng)探頭式超聲10min，超聲強度70％，2秒開，1秒停，得到蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體分散液。經(jīng)測包封率為56.5％，平均粒徑在100nm以下。(說明：按實施例5制備的蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體分散液其包封率低于實施例1、2、3、4制備的產(chǎn)品，是由于水相注入一步法避免了制備蘇氨酸螯合鐵過程中的萃取、干燥、研磨、溶解等步驟，相比實施例5中蘇氨酸螯合鐵重新復(fù)水溶解于水中，實施例1、2、3、4中蘇氨酸螯合鐵其分子結(jié)構(gòu)和溶解狀態(tài)更加均一穩(wěn)定，磷脂雙分子層的包封效率得到提高。)

實施例6

將3g蘇氨酸于15mL水中微熱溶解后移入磁力攪拌反應(yīng)瓶中，同時向反應(yīng)瓶中加入20mL含1g氫氧化鈣的水溶液，于70℃攪拌反應(yīng)1h。停止反應(yīng)后，加入0.6g溶解的七水合檸檬酸，并向體系持續(xù)通氮氣，再將10mL含2.5g硫酸亞鐵的溶液逐滴加入反應(yīng)瓶中，并用1mol/L氫氧化鈉溶液逐滴加入反應(yīng)體系，調(diào)節(jié)體系pH至7.0，然后于70℃攪拌反應(yīng)60min，降溫過濾，得到墨綠色透明濾液作水相。稱取蛋黃卵磷脂2g和膽固醇0.1g完全溶解于100mL無水乙醚中得有機相。將水相用針管一次性注入有機相中，混合后于冰浴中短時超聲10min，超聲強度90％，1秒開，1秒停，得到均一的油包水(W/O)型乳狀液。將乳狀液移入圓底燒瓶中，于40℃水浴中進(jìn)行減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，20min后瓶內(nèi)形成凝膠膜狀物，有機溶劑被蒸除。再加入含有1g Tween80的100mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30min，得到脂質(zhì)體懸濁液。將充分水合后的脂質(zhì)體混懸液再次于冰浴中經(jīng)探頭式超聲10min，超聲強度80％，2秒開，1秒停，得到蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體分散液。經(jīng)測包封率為62.5％，亞鐵占總鐵含量為63.4％，平均粒徑在100nm以下。

實施例7

本實施例以實施例1所得蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體為對象，利用實驗方法評價其對動物缺鐵性貧血的改善作用。

1、試驗方法

1.1缺鐵性貧血(IDA)大鼠模型的建立

選用健康初斷乳SD大鼠，在實驗條件下飼予低鐵飼料(鐵含量<10mg/kg，以Fe計)。第5周時，發(fā)現(xiàn)多數(shù)大鼠均達(dá)到恢復(fù)試驗要求(即Hb<100mg/mL)，認(rèn)為建模成功，此時測定全部大鼠Hb并稱重。

1.2實驗動物分組及給藥方法

選取Hb<100g/L的大鼠30只作為實驗動物，并將當(dāng)天記為恢復(fù)試驗第1d。根據(jù)貧血大鼠Hb水平及體重將其隨機分為實例1蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體(Thr-Fe-Lip)組、蘇氨酸螯合鐵(Thr-Fe)組、陽性對照組和低鐵對照組，每組6只，各組均繼續(xù)給予低鐵飼料；空白對照組6只，一直給予普通飼料(鐵含量為260mg/kg，以Fe計)。試驗期間各組實驗動物連續(xù)灌胃，蘇氨酸鐵納米脂質(zhì)體組給予相應(yīng)的32mg/kg·bw的蘇氨酸鐵納米脂質(zhì)體，Thr-Fe組給予32mg/kg·bw的蘇氨酸螯合鐵，陽性對照組給予32mg/kg·bw硫酸亞鐵，低鐵對照組和空白對照組給予相應(yīng)蒸餾水，受試樣品給予時間為21d，每周測定兩次體重及Hb等指標(biāo)。

1.3測定指標(biāo)

采用雙抗體夾心法測定IDA大鼠血液的Hb水平。

恢復(fù)試驗結(jié)束后，在血液樣品采集后斷頸處死各組大鼠，取出各只動物肝臟、腎臟、脾臟并稱重。按照下列公式計算各只動物的各個臟器指數(shù)：

肝臟指數(shù)(％)＝(肝臟重量/動物體重)×100

腎臟指數(shù)(％)＝(腎臟重量/動物體重)×100

脾臟指數(shù)(％)＝(脾臟重量/動物體重)×100

2、實驗結(jié)果

2.1蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體對實驗動物一般狀況及體重的影響

在SD大鼠IDA模型建立期間，IDA模型組與空白對照組大鼠相比采食量下降，體重增加緩慢，活動能力降低，IDA模型組部分大鼠出現(xiàn)毛發(fā)成片脫落的現(xiàn)象，但精神狀態(tài)良好。

由實驗結(jié)果可知，IDA模型建立之前(第0d)，實例1Thr-Fe-Lip組、Thr-Fe組、陽性對照組、低鐵對照組和空白對照組的大鼠體重比較，各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。IDA恢復(fù)試驗過程中，各IDA模型組間實驗大鼠體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，與空白對照組相比，差異極顯著(P＜0.01)?；謴?fù)試驗結(jié)束時(第21d)，實例1Thr-Fe-Lip組大鼠體重與低鐵對照組相比，差異顯著(P＜0.05)。

計算各組試驗大鼠在恢復(fù)試驗期間的體重增量發(fā)現(xiàn)，空白對照組大鼠體重增量最高；各IDA模型組中實例1Thr-Fe-Lip組增量最高，增量比Thr-Fe組高7.67％，且與陽性對照組和低鐵對照組相比，體重增量的差異極顯著(P＜0.01)，與空白對照組相比差異不顯著(P＞0.05)。其他IDA模型組大鼠的體重增量無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，但與空白對照組相比，差異極顯著(P＜0.01)。

表1不同實驗組IDA大鼠體重情況表(n＝6,g)

注：同列肩標(biāo)中，@表示與陽性對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，@@表示與陽性對照組相比有極顯著性差異(P＜0.01)；#表示與低鐵對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，##表示與低鐵對照組相比有極顯著性差異(P＜0.01)；*表示與空白對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，**表示與空白對照組相比有極顯著性差異(P＜0.01)，下表同。

2.2蘇氨酸鐵對實驗動物血紅蛋白含量的影響

實驗動物在恢復(fù)試驗期間血紅蛋白含量變化見表2。

表2不同實驗組IDA大鼠血紅蛋白含量表(n＝6,mg/mL)

IDA模型建立之后(第1d)，各IDA模型組大鼠的Hb水平和空白對照組相比較，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且差異極顯著(P＜0.01)；而各IDA模型組大鼠之間相比，Hb含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，說明IDA模型建立成功。由實驗結(jié)果可知，實例1Thr-Fe-Lip組與陽性對照組大鼠的Hb含量隨著恢復(fù)試驗的進(jìn)行呈上升趨勢，且上升趨勢的速度為實例1Thr-Fe-Lip組＞Thr-Fe組＞陽性對照組。第21d時，實例1Thr-Fe-Lip組大鼠Hb水平與低鐵對照組相比增高了85.32％(P＜0.01)；與Thr-Fe組相比增高了18.13％。實例1Thr-Fe-Lip組大鼠的Hb含量于恢復(fù)試驗第15d與空白對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，且陽性對照組相比有顯著性提高(P＜0.05)。結(jié)果說明Thr-Fe納米脂質(zhì)體和Thr-Fe均具有提高IDA大鼠血紅蛋白含量的能力，且Thr-Fe納米脂質(zhì)體的作用效果強于Thr-Fe。

2.3蘇氨酸鐵對實驗動物臟器指數(shù)的影響

各組實驗動物的肝臟、腎臟、脾臟的臟器指數(shù)見表3。

表3不同實驗組IDA大鼠各臟器指數(shù)表(n＝6,g)

由表3可見，各實驗組與空白對照組相比，各臟器指數(shù)均無明顯差異(P＞0.05)。與低鐵對照組相比，Thr-Fe納米脂質(zhì)體組大鼠肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著增高(P<0.05)，且實例1Thr-Fe-Lip組的大鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)均高于Thr-Fe組。說明蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體具有一定改善IDA大鼠肝臟、腎臟和脾臟指數(shù)的能力。

綜上所述，使用水相注入一步法制備的蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體對IDA大鼠的生長性能有明顯的改善作用，能夠顯著提高IDA大鼠的體重、血液Hb含量，并有利于肝臟、腎臟和脾臟的生長和更新，其作用效果優(yōu)于蘇氨酸螯合鐵，極其優(yōu)于硫酸亞鐵。因此，可以認(rèn)為作為鐵營養(yǎng)強化添加到食物或制備藥劑時，采用本發(fā)明方法制備的蘇氨酸螯合鐵納米脂質(zhì)體具有更高的應(yīng)用性能，能保證蘇氨酸螯合鐵生物利用率的最大化發(fā)揮。

以上對本發(fā)明的實施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。